专利名称:洋葱伯克霍尔德氏菌sd7及其培养方法和应用的制作方法
技术领域:
本发明属于植物保护(微生物农药)领域,具体涉及一种洋葱伯克霍尔德氏菌SD7及其培养方法和应用。
背景技术:
植物病原菌(包括真菌、细菌、病毒等)引起的植物病害给农业生产造成了重大的经济损失。目前,防治水稻、香蕉等重要植物病害的主要方法是使用杀菌剂。杀菌剂的大量使用,会增大病原菌抗药性的风险,并且会对环境造成严重的污染,对人畜健康也构成威胁。生物防治是一种对环境友善的防治植物病害的新途径。
植物周围不仅存在病原菌,而且还存在着大量的非病原菌,其中有的还是病原菌的拮抗微生物。这些拮抗微生物可通过与病原菌的抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等机理来抑制病原菌,达到防治植物病害的目的。此外,拮抗微生物对环境安全,不像化学农药那样造成环境污染以及对人畜的毒害,同时拮抗微生物不易使病原菌产生耐药性,有些还具有 促进植物生长的作用,且实际生产工艺简单。因此,利用拮抗微生物来防治植物病害的研究正越来越受到国内外的重视。目前,人们已经分离到多种对各种不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物,其中有些己经进入实际应用阶段,产生了相当的社会效益和环境效益。
人们对伯克霍尔德氏菌属iBurkholderia)的研究较多,主要集中在应用该属内的菌株生产酶或用于治理环境污染,如以下专利文献:公开号1195373 (日本,中山美香等,
公开日2004/03/24)的降解卤代烃的微生物及其应用;公开号1484703 (日本,早出广司,
公开日2004/03/24)的葡萄糖脱氢酶和生产该脱氢酶的方法;公开号1867676 (日本,山口将宪等,
公开日2006/11/22)的鲨肌醇的制备方法;公开号101198695 (德国,贝赛林等,
公开日2008/06/11)的生产脂肪酶的方法;公开号101153272 (中国,盛下放等,
公开日2008/04/02)的一种铅镉抗性细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法;公开号102046778A (日本,古贺一治、增田绅吾,
公开日2011/05/04)的降低植物体中的重金属含量的细菌;公开号101671636 (中国,郭军康等,
公开日2010/03/17)的一种抗重金属植物促生菌制剂及其施用方法。以上文献中都没有涉及到植物病原菌生物防治的相关应用。
在植物病害的生物防治方面,任嘉红等发现吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对杨树溃疡病具有防治效果(任嘉红等.吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007抗菌蛋白的分离纯化.微生物学通报,2010-06-20 ;任嘉红等.吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的发酵条件及其对杨树溃疡病的防治效果.中国生物防治,2010-08-08 ;叶建仁等.一种吡咯伯克霍尔德氏菌及其在防治杨树溃疡病中的应用.中国专利,2009-10-14);查传勇等发现洋葱伯克霍尔德氏菌LulO-1能够产生抗菌活性物质(查传勇等.洋葱伯克霍尔德氏菌LulO-1产生抗菌活性物质的发酵培养基和发酵条件优化.蚕业科学,2009-06-15)。
林善海等发现伯克霍尔德氏菌对香蕉褐缘灰斑病具有防治效果(林善海等,拮抗伯克霍尔德氏菌对香蕉褐缘灰斑病的生物防治试验.中国植物病理学会2007年学术年会论文集,2007-08-01)。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术中各种植物病原真菌和细菌引起的植物病害化学药剂防治副作用大、生物防治药物缺乏的缺陷,提供一种可抑制包括香蕉炭疽病菌和水稻纹枯病菌在内的多种植物病原菌的广谱生防菌株。
本发明通过以下技术方案实现上述目的:
洋葱伯克霍尔德氏菌SD7,分类命名为:洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderiacepacia,于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号CGMCCN0.5384。该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种生物菌剂,该生物菌剂含有洋葱伯克霍尔德氏菌SD7或含有洋葱伯克霍尔德氏菌SD7发酵液(即培养液)经过滤后的无菌滤液,所述无菌滤液优选用洋葱伯克霍尔德氏菌SD7培养液经过离心取得的上清再经过细菌过滤器过滤获得。
该洋葱伯克霍尔德氏菌SD7的培养方法,其特征在于发酵条件如下:LB培养基(酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15 18 g、水1000 mL,pH 6.0 7.0),装液量100 mL,加入I mL 2 d龄的种子菌株(即每IOOmL LB培养基接种I mL 2 d龄的种子菌株),以180 r/min在25°C条件下培养3 d。
洋葱伯克霍尔德氏菌SD7在制备防治植物病原真菌和/或细菌引起的植物病害中菌剂的应用。所述植物病原真菌为水稻纹枯病菌香蕉炭疽病菌{CoIletotrichum musae)>稻痕病菌iPyricularia oryzae)>小麦赤霉病菌iGibberella zeae)、香蕉枯萎病菌oxysporum f.sp.cMeflse)、蒸枝霜疫霉菌iPeronophythora Iitchii)、甘鹿黑腐病菌iCeratocystis adiposum)和番爺叶霉病菌{Fulvia /1/7Ka);所述植物病原细菌为水稻白叶枯病菌CfefliAofflmas oryzae pv.0ryzae)和水稻细菌性条斑病菌(1.0ryzae pv.0ryzicola)0
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
经过实验证实,本发明的洋葱伯克霍尔德氏菌SD7的无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌菌丝的抑制率为88.79%,对菌核萌发的抑制率为90%。离体实验表明对水稻纹枯病的防效达90.0%,对苗期水稻纹枯病的防效为53.7%。同时,对香蕉果实炭疽病的室内生防效果也达52.12%。因此,该菌株是一种对多种植物病原菌都具有强烈抑制作用的广谱生防菌株,且具有对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不容易产生抗性等优点,能够进行商业开发,应用前景广阔。
图1.SD7菌株在LB培养基上的培养形态。
图2.SD7菌株的16S rDNA序列与相近菌株序列的系统发育树。
图3.洋葱伯克霍尔德氏菌SD7对香蕉果实炭疽病的防治效果,其中I为只接种炭疽病菌的对照组CKl,2飞为洋葱伯克霍尔 德氏菌SD7的无菌滤液处理后又接种炭疽病菌的实验组,6 7为仅加入洋葱伯克霍尔德氏菌SD7无菌滤液的对照组CK2。[0018]图4.洋葱伯克霍尔德氏菌SD7发酵液对水稻纹枯病的防效实验结果,其中I为SD7无菌液,2为SD7菌液,3为LB培养液,4为井R霉素,5为无菌水对照。
具体实施方式实施例1洋葱伯克霍尔德氏菌SD7的筛选及鉴定
1、菌株的筛选
(I) 土壤样品的采集
本实验从华南农业大学农场果园采集土样,根据采集地的地形等采用5点取样,取样深度为耕作层或地表以下15 cm,取量200 250 g,每个地点采集的5个样本均匀混合,装入灭菌的封口聚乙烯袋,带回实验室马上分离。
(2)样品悬浮液的制备
将土壤样品加入灭菌水中激烈震荡。样品:水=1:9 (质量与体积比),如:10 g 土壤加入装有90 mL灭菌水的三角瓶中所得悬浮液浓度为10'每种样品各准备5支装有9mL灭菌水的试管按10倍梯度稀释法,将上述浓度为KT1的悬浮液稀释成10_2 10_6的系列浓度悬浮液,即从I号试管中吸取I mL悬浮液放入2号试管(盛有9 mL灭菌水)中,充分震荡混匀,再从2号试管中吸取I mL悬浮液放入3号试管(盛有9 mL灭菌水)中,依此类推,直至第6支试管为止。
(3)分离方法
采用LB培养基( 酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15 18 g、水1000 mL)。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液0.5mL,滴加于培养基平板上(3平板/稀释度),用灭菌的L型玻棒涂布均匀,稍晾干,作好标记和日期,培养皿倒置,于25 28°C温箱中培养2 3 d,将平板上长出的单菌落挑出到新的培养基上纯化培养,对全部分离到的菌株(称为待测菌株)进行编号,然后对其拮抗活性进行初筛和复筛,以获得本专利菌株。
(4)拮抗菌的初筛和复筛
采用平板对峙培养法,检测上述各种待测菌株对水稻纹枯病菌和香蕉炭疽病菌等病原菌的抑菌活性。用打孔器在培养好的水稻纹枯病菌和香蕉炭疽病菌等病原菌的菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块,接种在PDA平板中央,再将已经活化的各种待测菌株接种在水稻纹枯病菌或香蕉炭疽病菌等病原菌的菌丝块四周2 3cm处,每个PDA平板接种4个待测菌株,设置不接种待测菌株的对照,每处理3次重复。在25 28°C下培养:T5 d,然后测量待测菌株与水稻纹枯病菌或香蕉炭疽病菌等病原菌之间的抑菌带宽度,作为拮抗活性强弱的指标。
经过上述初筛和复筛,获得一株对水稻纹枯病菌和香蕉炭疽病菌等多种病原菌具有强烈抑制作用的菌株,编号为SD7,保存备用。
、SD7菌株的形态学和分子鉴定
(I)形态学观察
在LB培养基上培养48 h,菌落为圆形,乳白色,半透明,粘质,边缘较整齐,随着培养时间增长,菌落变厚,中间隆起,且其菌体培养物较粘稠(图1);液体LB培养能丰富生长、菌液较浑浊。
(2)分子生物学和生理生化鉴定[0034]经PCR反应和特异片段的克隆测序,获得SD7菌株的16S rDNA序列(SEQ IDN0:1):
将SD7菌株的16S rDNA序列用Blast软件与从GenBank中搜索的已经登录 StJ Burkholderia cepacia (DQ387437)> Burkholderia vietnamiensis (AY741147)、Burkholderia anthina(AJ420880)'Burkholderia cenocepacia(FJ810079)'Burkholderiamultivorans ^Paenibacillus daeJeonensis (NRO25I7O)的 I6S rDNA 序列进行同源性比较,构建系统发育树(图2)。
根据《伯杰氏细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》,测得SD7菌株的生理生化性状,实验结果如下(表I)。
表I SD7菌株的生理生化注状
权利要求1.洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)SD7,于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC N0.5384。
2.
权利要求1所述洋葱伯克霍尔德氏菌SD7,其特征在于该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1 所示。
3.—种生物菌剂,其特征在于含有
权利要求1或2所述洋葱伯克霍尔德氏菌SD7或含有洋葱伯克霍尔德氏菌SD7发酵液经过滤后的无菌滤液。
4.
权利要求1或2所述洋葱伯克霍尔德氏菌SD7的扩大培养方法,其特征在于培养条件如下:每IOOmL LB培养基加入ImL 2天龄的种子菌株,以180 r/min在25°C条件下培养3 d; LB培养基配方为:酵母浸出粉5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g、琼脂粉15 18g、水1000mL, pH 6.0 7.0。
5.一种
权利要求1或2所述洋葱伯克霍尔德氏菌SD7的应用,其特征在于,洋葱伯克霍尔德氏菌SD7在制备防治植物病原真菌和/或植物病原细菌引起的植物病害菌剂中的应用,所述植物病原真菌为水稻纹枯病菌、香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌或番茄叶霉病菌;所述植物病原细菌为水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌 。
专利摘要本发明公开了洋葱伯克霍尔德氏菌SD7及其培养方法和应用,该菌株于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC No.5384。经研究发现,该菌株对水稻纹枯病菌、香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄叶霉病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌等均具有强烈的抑制作用,为广谱拮抗菌,可用于防治多种植物病害,尤其是对香蕉果实炭疽病和水稻纹枯病的防治效果较好,且具有对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不容易产生抗性等优点,能够进行商业开发,应用前景广阔。
文档编号A01P3/00GKCN102533593 B发布类型授权 专利申请号CN 201110423432
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月16日
发明者周而勋, 舒灿伟, 杨媚, 高艳丽, 张德涛, 彭正凯 申请人:华南农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan