专利名称:枯草芽孢杆菌nb12及其培养方法和应用的制作方法
技术领域:
本发明属于植物保护(微生物农药)领域,具体涉及一种枯草芽孢杆菌NB12及其培养方法和应用。
背景技术:
植物病原菌(包括真菌、细菌、病毒等)引起的植物病害给农业生产造成了重大的经济损失。立枯丝核菌solani Kiihn)是一种经济上非常重要的植物病原真菌。在我国,由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病已居水稻三大病害之首。该病菌除了可引起水稻、玉米等纹枯病外,还可引起其它很多植物(蔬菜、果树、林木、花卉等)的苗期立枯病。目前对该病的防治主要是使用化学农药(杀菌剂),而杀菌剂多是单作用位点的内吸性药剂,长期使用会使病原菌产生抗药性,并且会污染环境,而残留的杀菌剂会影响到食品安全。
植物周围不仅存在病原菌,而且还存在着大量的非病原菌,其中有的还是病原菌的拮抗微生物。这些拮抗微生物可通过与病原菌的抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等机理来抑制病原菌,达到防治植物病害的目的。此外,拮抗微生物对环境安全,不像化学农药那样造成环境污染以及对人畜的毒害,同时拮抗微生物不易使病原菌产生耐药性,有些还具有促进植物生长的作用,且实际生产工艺简单。因此,利用拮抗微生物来防治植物病害的研究正越来越受到国内外的重视。目前,人们已经分离到多种对各种不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物,其中有些己经进入实际应用阶段,产生了相当的社会效益和环境效益。
人们对枯草芽孢杆菌spp.)的研究较多,该菌可产生多种生物活性物质,如枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素和短杆菌肽等,对病原菌具有明显的抑制作用,自身还可以合成α -淀粉酶、脂肪酶和 纤维素酶等,可用于动物饲料添加剂,在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用;同时该菌种还可以刺激植物生长发育。
关于枯草芽孢杆菌)在防治水稻纹枯病和其它病害方面也有报道,如中国专利申请号200410014484.1 (公开号CN1590535)公开了一种枯草芽孢杆菌JA,对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌等多种植物病原菌都具有抑制作用;中国专利申请号200910212779.2 (公开号CN101697737A)公开了将枯草芽孢杆菌和三环唑复配后作为杀菌剂用于防治水稻稻瘟病,防治效果最高达84.67%;中国专利申请号201010175797.0 (公开号CN101857848A)公开了一种水稻纹枯病生防菌枯草芽孢杆菌WJ-1及菌剂与应用,该菌剂对水稻纹枯病室内活体接种防治效果明显,最高可达95.74% ;此外,相关的文献还有:陈志谊等.枯草芽孢杆菌Β-916防治水稻纹枯病的田间试验.中国生物防治,1997 ;陈志谊等.水稻纹枯病拮抗细菌Β-916培养条件与发酵配方的研究.西南农业学报,1999 ;陈卫良等.拮抗细菌feci77心subtilis A30对水稻病原菌的抑制作用.浙江农业大学学报,1997 ;徐汉虹等.枯草杆菌BS04菌株抑真菌素的初步研究.农药,2007 ;张_霞等.枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化,植物病理学报,2005。
发明内容本发明的目的在于,提供一株具有可抑制包括水稻纹枯病菌和豆角苗期立枯病菌在内的多种植物病原菌的广谱拮抗菌菌株。
本发明通过以下技术方案实现上述目的:
枯草芽孢杆菌NB12,该菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌subtilis,于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号CGMCC N0.5383。该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种生物菌剂,该生物菌剂含有枯草芽孢杆菌NB12或含有枯草芽孢杆菌NB12发酵液(即培养液)经过滤后的无菌滤液,所述无菌滤液优选用枯草芽孢杆菌NB12培养液经过离心取得的上清再经过细菌过滤器过滤获得。
该枯草芽孢杆菌iB.subtilis) NB12的培养方法,发酵(培养)条件如下:培养基为LB (酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15 18 g、水1000 mL)或BPY培养基(牛肉膏5g、酵母膏5g、葡萄糖5g、蛋白胨IOg、NaCl 5g、琼脂20g蒸懼水IOOOml,调pH至7.2),在30°C、转速180 r/min条件下培养48h即可。优选初始pH值为7.0,40 mL/250 mL (种子/培养基)装液量。
枯草芽孢杆菌(汉NB12在制备防治植物病原菌引起的植物病害菌剂中的应用。所述植物病原菌为立枯丝核菌iRhizoctonia solani)、香蕉炭疽病菌iColletotrichum musae、、稻痕病菌iPyricularia oryzae)> 小麦赤霉病菌iGibberella zeae)、香蕉枯萎病菌oxysporum f.sp.cMeflse)、蒸枝霜疫霉菌iPeronophythora Iitchii)、甘鹿黑腐病菌iCeratocystis ai/i/705 )、番爺叶霉病菌{Fulvia ZWFa)、水稻白叶枯病菌CfefliAofflmas oryzae pv.0rjzae)和水稻细菌性条斑病菌(Z oryzae pv.0ryzicola)。
枯草芽孢杆菌(汉)NB12在防治立枯丝核菌0 .引起的植物病害中的应用,尤其对水稻纹枯病和豆角苗期立枯病防治效果较好。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明公布的枯草芽孢杆菌(汉subtilis) NB12菌株对水稻纹枯病的防效较高,特别是对于水稻纹枯病菌菌核的萌发有明显的抑制作用,这在以往的文献中未见报道。菌核是水稻纹枯病初侵染的重要来源,抑制菌核的萌发能有效地控制该病害的发生,这是本发明的特点之一。同时,本发明的枯草芽孢杆菌iB.)NB12菌株对其它多种植物病原菌也有很好的抑制作用,与中国专利公开的其它枯草芽孢杆菌菌株的防治对象不一样,尤其是能够用于蔬菜上防治苗期立枯病0 .具有广泛的应用前景和价值。这在以往的文献中未见报道。
经过实验证实,本发明的枯草芽孢杆菌(B,subtilis) NB,12发酵液(菌剂)对水稻纹枯病和豆角苗期立枯病均表现出良好的防治效果,其中对离体水稻叶片纹枯病的防效达86.2%,对该病菌菌核萌发抑制率达84.52%,对盆栽水稻纹枯病的防效为57.51%,对豆角苗期立枯病的防效为65.38%。由此可见,该生防细菌NB12菌株在防治立枯丝核菌病害方面具有巨大的应用前景。其菌剂的制备方法成熟,可开发成微生物农药,是化学农药的替代品,可用于水稻纹枯病等立枯丝核菌病害和其它植物病害的防治,对减少化学农药残留和污染、保护生态环境具有重要意义,是绿色农业和有机农业倡导的发展方向,符合我国现代农业发展的要求。因此,在工业生产中,只需较简单的微生物发酵和制剂设备,就能进行规模化推广应用,其市场前景是广阔的,将带来巨大的生态效益、社会效益和经济效益。
图1.菌株NB12的序列与相近菌株序列的系统发育树。
图2.枯草芽孢杆菌NB12对水稻纹枯病的防治效果,其中接种GD-118对照为不防治对照,CK为正常水稻对照。
具体实施方式实施例1枯草芽孢杆菌NB12的筛选及鉴定
1、菌株的筛选
( I) 土壤样品的采集
本实验从华南农业大学农场果园采集土样,根据采集地的地形等采用5点法取样,每个点取样深度为耕作层或地表以下15 cm,取量200 250 g,每个地点采集的5个样本均匀混合,装入灭菌的封口聚乙烯袋,带回实验室马上分离。
(2)样品悬浮液的制备
将土壤样品加入灭菌水中激烈震荡。样品:水=1:9 (质量与体积比),如:10 g 土壤加入装有90 mL灭菌水的三角瓶中 所得悬浮液浓度为ΚΓ1,每种样品各准备5支装有9mL灭菌水的试管按10倍梯度稀释法,将上述浓度为KT1的悬浮液稀释成10_2 10_6的系列浓度悬浮液,即从I号试管中吸取I mL悬浮液放入2号试管(盛有9 mL灭菌水)中,充分震荡混匀,再从2号试管中吸取I mL悬浮液放入3号试管(盛有9 mL灭菌水)中,依此类推,直至第6支试管为止。
(3)分离方法
采用LB培养基(酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15 18 g、水1000 mL)。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液0.5mL,滴加于培养基平板上(每个稀释度做3个重复),用灭菌的L型玻棒涂布均匀,稍晾干,作好标记和日期,培养皿倒置,于25 28°C温箱中培养2 3 d,把平板上长出的单菌落挑出到新的培养基上纯化培养,对全部分离到的菌株(称为待测菌株)进行编号,然后对其拮抗活性进行初筛和复筛,以获得本专利菌株。
(4)拮抗菌的初筛和复筛
采用平板对峙培养法,检测上述各种待测菌株对立枯丝核菌等病原菌的抑菌活性。用打孔器在培养好的立枯丝核菌等病原菌的菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块,接种在PDA平板中央,再将已经活化的各种待测菌株接种在立枯丝核菌等病原菌的菌丝块四周2^3cm处,每个PDA平板接种4个待测菌株,设置不接种待测菌株的对照,每处理3次重复。在25 28°C下培养3 5 d,然后测量待测菌株与立枯丝核菌等病原菌之间的抑菌带宽度,作为拮抗活性强弱的指标。
经过上述初筛和复筛,获得一株对立枯丝核菌等多种病原菌具有强烈抑制作用的菌株,编号为NB12,保存备用。[0029]、NB12菌株的形态学、分子生物学和生理生化鉴定
(I) NB12菌株的形态学鉴定
NB12菌株在LB培养基上培养3 d后观察,其单菌落圆形或不规则形,乳白色,表面粗糙有褶皱状突起,不透明,无光泽,粘质,不易乳化;在LB液体培养基中,轻度浑浊,色暗,表面形成完整白色粘质膜。
(2) NB12菌株的分子生物学鉴定
经克隆和测序,得到NB12菌株的16S rDNA序列长度为1044bp,其序列如SEQ IDNO:1所示。
将NB12菌株的16S rDNA序列用Blast软件与GenBank中已登陆的Bacillus subtilis (FJ595878.1) > Bacillus amyloliquefaciens (FJ641035.1)、Bacillus polyfermenticus (EF178464.1) > Bacillus pumilus (EF178456.1) > Bacilluslicheniformis (FJ713021.1)取 Bacillus velezensis (AB245422.1)的 16SrDNA 序列进行同源性比较,构建系统发育树(图1)和相似系数表(表I)。
表I菌株NB12和其它不同菌株间16S rDNA序列相似系数的比较
权利要求1.枯草芽孢杆菌(ifeci77i/5.)NB12,于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC N0.5383。
2.
权利要求1所述枯草芽孢杆菌NB12,其特征在于该菌株的16SrDNA序列如SEQ IDNO:1所示。
3.—种生物菌剂,其特征在于含有
权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌NB12或含有枯草芽孢杆菌NB12发酵液经过滤后的无菌滤液。
4.
权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌NB12的扩大培养方法,其特征在于培养条件如下:以LB培养基或者BPY培养基为培养基,在30°C、转速180 r/min条件下培养48h ; LB培养基配方:酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15 18 g、水1000mL ; BPY培养基配方:牛肉膏5g、酵母膏5g、葡萄糖5g、蛋白胨IOg、NaCl 5g、琼脂20g、蒸馏水1000 mL,调节pH至7.2。
5.
权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌NB12在制备防治植物病原真菌或植物病原细菌引起的植物病害菌剂中的应用; 所述植物病原真菌为立枯丝核菌、香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌或番茄叶霉病菌; 所述植物病原细菌 为水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。
专利摘要本发明公开了枯草芽孢杆菌NB12及其培养方法和应用,该菌株于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCCNo.5383。经研究发现,该菌株对立枯丝核菌、香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄叶霉病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌均具有强烈的抑制作用,为广谱拮抗菌,可用于多种植物病害的防治,尤其是对水稻纹枯病和豆角苗期立枯病的防治效果较好,且具有对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不容易产生抗性等优点,能够进行商业开发,应用前景广阔。
文档编号A01P1/00GKCN102433282 B发布类型授权 专利申请号CN 201110423435
公开日2013年5月1日 申请日期2011年12月16日
发明者周而勋, 舒灿伟, 杨媚, 周登博, 张德涛, 曹琦琦 申请人:华南农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan