专利名称:重组葡萄糖氧化酶的优化基因及其表达载体和应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种密码子经过优化的突变基因,尤其涉及按照巴斯德毕赤酵母偏爱密码子对葡萄糖氧化酶基因进行改造后的优化基因以及含有该优化基因的重组表达载体和重组宿主细胞,本发明进一步涉及它们在生产葡萄糖氧化酶中的应用,属于重组葡萄糖氧化酶领域。
背景技术:
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,简称GOD)学名为P _D_葡萄糖氧化还原酶(EC1.1.3.4),它能专一地将P-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢(Pluschkell S,Hellmuth K and Rinas U, Kinetics of glucose oxidase excretion by recombinantAspergillus niger.Biotechnology and bioengineering,1996,51:215-220) oG0D广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域(Bankar SB,Bule MV, Singhal RS,et al.,Glucoseoxidase-An overview.Biotechnol Adv,2009,27:489-501)。
葡萄糖氧化酶在食品工业中主要作用在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。目前,许多国家已将葡萄糖氧化酶作为公认的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中,例如:用于酒类除氧、蛋白脱糖、食品包装、果蔬及制品的保鲜等(Malherbe D, Du Toit M, Cordero Otero R, et al., Expression of theAspergillus niger glucose oxidase gene in Saccharomyces cerevisiae and itspotential applications in wine production,Appl Microbiol Biotechno,2003,61,(5-6):502-511)o
葡萄糖氧化酶还可作为绿色面粉改良剂及添加剂并逐渐替代化学添加剂在面粉及制品的改良行业中发挥重要作用。溴酸钾在焙烤业中已有八十多年的应用历史,它作为氧化剂成功地赋予焙烤制品所必需的面筋强度及弹性,但是溴酸钾对人体具有很大的危害作用,所以有必要寻找一种安全的、可以替代溴酸钾功能的添加剂。葡萄糖氧化酶在氧化过程中产生的过氧化氢能够氧化面筋蛋白中的巯基形成二硫键,进而改善面团的网络结果,增强了面团弹性,从而能够起到化学添加剂(溴酸钾等)相同的效果,避免了化学添加剂对人体造成的损害。目前已经在小麦粉和玉米粉中通过添加葡萄糖氧化酶而提高了面粉的筋力,改善了面包等食品的手感和形状,提高了产品质量(中国发明专利申请公开号:CN1748515A ;黄卫宁,贾春利;发明名称:一种含有葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的抗冻发酵冷冻面团及其生产方法)。
在医药方面,葡萄糖氧化酶作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析;葡萄糖氧化酶制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成,防止口腔疾病和牙病的发生。此外,由于葡萄糖氧化酶可以催化生成H2O2,其还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗(Vodopivec M, Berovi M, Jan ar J, etal.,Application of Convective Interaction Media disks with immobilised glucoseoxidase for on-line gl ucose measurements.Analytica Chimica Acta,2000,407:105-110.)。
近几年,作为一种新型的酶饲料添加剂,葡萄糖氧化酶已被农业部列为12种允许使用的饲料酶制剂添加剂之一,开始在畜牧、饲料行业上得到应用。在饲料中添加葡萄糖氧化酶能够清除牲畜肠道上皮细胞大量自由基,保护肠道上皮细胞的完整。葡萄糖氧化酶通过不断的催化葡萄糖生成葡萄糖酸,降低胃肠道的PH值,偏酸性环境有利于益生菌的生长增殖,从而抑制了病原微生物的存活,提高了牲畜的自身免疫力。除此之外,由于葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖过程中会产生过氧化氢,当过氧化氢积累到一定浓度时,可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、弧菌等病原菌的生长繁殖,并且这种抑菌作用不会产生菌体抗药性。随着葡萄糖氧化酶制备提纯工艺的不断发展完善,使用成本的不断降低,葡萄糖氧化酶将在饲料行业中发挥越来越重要的作用(李焰,葡萄糖氧化酶饲养肉鸡效果试验.龙岩师专学报,2004,22:77-78)。
葡萄糖氧化酶的应用已扩展到纺织品行业。纺织品在生产过程中需要用到大量的双氧水(即过氧化氢),葡萄糖氧化酶在作用过程中产生的过氧化氢可以用于纺织工业的漂白处理。采用具有高回收率的固定化的葡萄糖氧化酶生产过氧化氢,过氧化氢浓度可达
3.5g/L,处理时不需添加双氧水稳定剂,处理后织物手感柔软、丰满。并且处理后固定化葡萄糖氧化酶可以回收,再用到下批产品的处理中,因而可以有效降低纺织工业的生产成本,并提高纺织物的品质。中国作为纺织品生产和消费大国,葡萄糖氧化酶在此行业中的应用具有很好的前景(中国专利申请公开号:CN 1884682A;陈坚,阎贺静,堵国成,华兆哲;发明名称:一种应用葡萄糖氧化酶制剂的棉织物酶法煮炼的方法)。
葡萄糖氧化酶在生物界分布广泛,最先于1904年在黑曲霉和灰绿青霉中发现了葡萄糖氧化酶。目前研究的葡萄糖氧化酶主要来源于霉菌类微生物和昆虫体内,在细菌如弱氧化醋酸菌中也存在(Murray FR, Llewellyn DJ,Peacock WJ, et al., Isolation of theglucose oxidase gene from Talaromyces flavus and characterisation of its rolein the biocontrol of Verticillium dahliae.Curr Genet, 1997, 32:367-375.)。工业上一般采用黑曲霉和青霉属菌株作生产菌,但黑曲霉和青霉菌天然菌株在发酵过程中会产生过氧化氢酶、纤维素酶和淀粉酶等其它多种副产物和大量的杂蛋白(Frederick K,Tung J,Emerick R,et al.,Glucose oxidase from Aspergillus niger.Cloning,gene sequence,secretion from Saccharomyces cerevisiae and kinetic analysis of a yeast-derivedenzyme.Journal of Biological Chemistry, 1990, 265:3793-3802),大量的杂蛋白对后期的分离纯化工作造成很大的困难,也增加了成本。此外,天然霉菌生产过程中酶蛋白的生物合成受葡萄糖的诱导和高浓度葡萄糖的分解代谢产物的阻遏,而发酵过程中产生的葡萄糖氧化酶能氧化培养基中的葡萄糖生成葡萄糖酸,葡萄糖酸对酶的合成也具有抑制作用。为了解决这一问题,近年来利用基因工程菌重组表达葡萄糖氧化酶受到研究人员的青睐。周亚凤和张先恩等人将黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中进行了重组表达,诱导后发酵液中酶活为 30_40U/ml (Zhou YF, Zhang XE, Liu H, et al., Cloning andexpression of Aspergillus niger glucose oxidase gene in methylotrophic yeast.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2001,17:400-405) ;Silvia Crognale 也在毕赤酵母中成功表达青霉来源的葡萄糖氧化酶 ,产量为50U/ml (Silvia Crognale, Valentina Pulciand Brozzoli V, Expression of Penicillium variabile P16 glucose oxidase genein Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme.Enzyme andMicrobial Technology.39,2006,1230-1235)。
从上述文献可知,虽然目前采用基因工程的手段实现了葡萄糖氧化酶的异源表达,表达量在原始菌株基础上得到了提高,特别是利用毕赤酵母异源分泌表达葡萄糖氧化酶具有高细胞密度发酵、蛋白可分泌到胞外表达且杂蛋白少;具有翻译后加工修饰系统,糖蛋白的免疫原性较低;遗传和表达稳定性好等诸多优点(Macauley-Patrick S,FazendaM, McNeil B, et al., Heterologous protein production using the Pichia pastorisexpression system.Yeast, 2005,22:249-270.),但其分泌表达量通常在 50_100U/ml 左右,不同程度的存在着分泌表达量较低的缺陷,导致酶制剂价格昂贵,限制了其广泛使用。
提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量通常有密码子优化、mRNA 二级结构改造、GC含量调整等策略。所谓密码子优化即是:由于密码子的简并性,每个氨基酸对应的密码子可以有多个。研究发现不同物种对密码子的使用频率是不同的,那些不经常使用甚至从不使用的密码子称为稀有密码子或非偏爱型密码子。对于不同的表达系统如毕赤酵母和大肠杆菌,其密码子偏好性是不同的。若外源基因含有较多的宿主菌非偏爱型密码子,尤其是连续出现的话,将会严重影响其在宿主菌中的表达量。为了消除稀有密码子对蛋白表达量的影响,可采用对异源基因的密码子进行优化来实现,即在不改变外源基因氨基酸序列的情况下,将外源基因中的稀有密码子替换为宿主常用的密码子。该方法具有简单易行,重复性好的特点,得到了广泛的使用(Sharp P,Tuohy T and Mosurski K,Codon usagein yeast:cluster analysis clearly differentiates highly and lowly expressedgenes.Nucleic Acids Research, 1986,14:5125.)。以前的密码子优化研究往往全部使用最优的密码子,这造成了蛋白质翻译系统负担过重,表达效果不理想等问题。如果能综合考虑毕赤酵母中各种tRNA的存在比例并据此均衡分布各个密码子的使用次数和位点,就能够最大限度地利用重组细胞的翻译系统,能更高效的表达外源蛋白(De Schutter K, etal.Genome sequence of the recombinant protein production host Pichiapastoris.Nat Biotech,2009,27:·561-566)。
不同来源的酶蛋白外源基因经密码子优化后其在毕赤酵母中的表达量提高程度差别很大,例如=Teng等通过优化¢-1,3-1,4葡聚糖酶的密码子组成,使其在毕赤酵母中的表达量提高 10 倍(Teng D, Fan Y, Yang YL, et al., Codon optimization ofBacillus licheniformis beta—1,3—1,4—glucanase gene and its expression in Pichiapastoris.Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74:1074-1083) ;Chang将来源于假丝酵母的脂肪酶密码子进行优化后,在毕赤酵母中的表达量提高4.6倍(Chang Sff,Lee GC and ShawJF, Codon optimization of Candida rugosa Iipl gene for improving expression inPichia pastoris and biochemical characterization of the purified recombinantLIPl lipase.J Agric Food Chem,2006,54:815-822.)。本发明人通过密码子优化方式将青霉来源的葡萄糖氧化酶的基因在毕赤酵母中的表达量由原来的130U/ml提高到614U/ml (中国发明专利申请公开号:CN101955953A ;张伟,姚斌,范云六,张宇宏;发明名称:葡萄糖氧化酶突变基因及其应用)。
外源蛋白表达过程中,外源基因转录出的mRNA 二级结构与蛋白的合成有很大关系,也是影响表达效率的重要因素。在转录过程中,目的基因的mRNA 二级结构复杂度和自由能显著影响转录的效率。当目的基因的mRNA 二级结构自由能非常低时会延缓转录进程,进而降低蛋白质的表达量,尤其是在转录起始和终止处,这种影响更为明显。在目的基因密码子优化过程中如果同时考虑目的基因的mRNA 二级结构的复杂度和自由能,将能有效降低转录能量屏障,提高转录效率,进而提高蛋白表达量(Huang,H.Q.,P.L Yang,et al.High-level expression of a truncated 1,3—1,4_3—D—glucanasefrom Fibrobacter succinogenes in Pichia pastoris by optimization of codons andfermentation.Applied Microbiology and Biotechnology,2008,78 (I):95-103)。
发明内容本发明目的之一是提供一种密码子经过改造且mRNA 二级结构稳定性高的重组葡萄糖氧化酶的优化基因,该优化基因在宿主细胞中的分泌表达量呈显著提高;
本发明目的之二是提供含有该重组葡萄糖氧化酶的优化基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞;
本发明目的之三是将所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因以及含有该优化基因的重组表达载体和重组宿主细胞应用于生产重组葡萄糖氧化酶;
为实现上述目的,本发明首先提供了一种重组葡萄糖氧化酶的优化基因,其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。
本发明将克隆获得的点青霉(Penicillium notatum)葡萄糖氧化酶基因(god_w)(SEQ ID N0.3所示的序列)在不改变其蛋白质氨基酸序列的前提下,综合考虑密码子使用频率,GC含量的调整,不稳定序列的删除、mRNA 二级结构等影响因素,按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子对该序列进行改造,其中,改变了 453个碱基,涉及391个氨基酸,优化后葡萄糖氧化酶基因(god-h) (SEQ ID N0.1)的GC含量由55.6%降为47.8%,此外,mRNA 二级结构自由能也得到了较大幅度的提高,降低了转录能量屏障,提高了转录效率,有效提高了其在毕赤酵母中的分泌表 达量。
本发明另一方面提供了含有所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞;优选的,所述重组表达载体是重组真核表达载体,更优选为重组酵母表达载体,最优选为重组毕赤酵母表达载体。
将所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因可操作的与酵母的表达调控序列相连就可得到在酵母细胞中分泌表达葡萄糖氧化酶的重组酵母表达载体,进一步的,将所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因可操作的与毕赤酵母的表达调控序列相连就可得到在毕赤酵母细胞中分泌表达重组葡萄糖氧化酶的重组毕赤酵母表达载体。
用于酵母表达载体的表达调控序列对于所属领域的普通技术人员是众所周知的,包括但不限于来自诸如以下基因的启动子区域:醇脱氢酶(ADH)、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶和丙酮酸激酶(PYK)。其它用于酵母宿主的合适启动子序列包括用于 3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.,J.B10L.CHEM.(1980)255:2073)及其它诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡糖异构酶的糖解酶(Holland et al.,BIOCHEMISTRY(1978) 17:4900 ;Hess et al., J.ADV.ENZYME REG.(1968)7:149)的启动子。具有由生长条件控制的转录的额外优点的可诱导酵母启动子可包括用于醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域等。酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。此外,合成启动子也可起到酵母启动子的作用。此外,酵母启动子可包括具有结合酵母RNA聚合酶和起始转录的能力的天然产生的非酵母来源的启动子,可包含部分酵母表达载体的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇化酶基因的终止子。用于酵母中的合适选择基因是存在于酵母质粒中的trpl基因,所述trpl基因提供用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株的选择标记。
本发明所述的酵母包括能够表达编码葡萄糖氧化酶的优化基因的各种酵母中的任一种。选择用于表达重组葡萄糖氧化酶的合适酵母是在所属领域的普通技术人员的能力范围之内。在选择用于表达的酵母宿主中,合适的宿主可包括展示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好的可溶蛋白产生和总体稳固的酵母。这些酵母包括但不限于产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母和属于半知菌(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。所述产子囊酵母分为两科,即蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科,Schizosaccharomycoideae (例如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、Nadsonioideae> Lipomycoideae 和 Saccharomycoideae (例如毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括Leucosporidium属、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、Filobasidium 属和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两科,即掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒弹抱酵母属(Bullera)和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如假丝酵母属(Candida)。优选的,本发明所述的酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)。
本发明还提供了一种生产葡萄糖氧化酶的方法,包括^fSEQ ID N0.1所示的重组葡萄糖氧化酶的优化基因可操作性的与表达载体相连接得到重组表达载体;将所述重组表达载体转化宿主细胞,得到重组菌株;培养重组菌株,诱导重组葡萄糖氧化酶的表达,回收并纯化所表达的重组葡萄糖氧化酶,即得。上述方法中,所述的重组表达载体优选为重组真核表达载体,更优选为重组毕赤酵母表达载体;所述的宿主细胞优选为酵母,更优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。
·[0023]将重组葡萄糖氧化酶的优化基因引入到酵母宿主中的方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的。举例而言,酵母转化可根据以下文献中描述的方法进行=Hsiaoet al.,PROC.NATL.ACAD.SC1.USA(1979)76:3829 和 Van Solingen et al., J.BACT.(1977) 130:946。然而,也可如通常在 SAMBROOK et al., Molecular Cloning:A LabManual (2001)中所述,使用诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合等方式,将外源DNA引入细胞。一旦建立重组宿主细胞菌株(即将重组酵母表达载体引入酵母细胞中并分离具有合适表达载体的重组酵母宿主细胞),则在适于产生重组葡萄糖氧化酶的条件下培养重组宿主细胞菌株,培养重组宿主细胞菌株的方法依赖于所用表达载体的性质和宿主细胞的特性,这对所属领域的普通技术人员来说属于常规的技术手段,其包括但不限于发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、空心纤维生物反应器、转瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统;这些方法的每一种都可以采用分批、补料或连续模式等方法进行,同时以分批或连续型式采集细胞或采集培养物上清液。在含有碳、氮和无机盐的可吸收源和视情况含有维生素、氨基酸、生长因子及其它众所周知的蛋白培养补充物的液体培养基中培养重组宿主细胞。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不希望的微生物生长和/或含有包括但不限于抗生素的化合物以选择含有表达载体的宿主细胞。
用于在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的。可在扩增阶段使用所属领域的普通技术人员众所周知的标准补料发酵法(standard feed batch fermentation method)使酵母宿主菌株在发酵罐内生长。所述发酵法可经调适以解决特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式中的差异。举例而言,酵母属酵母宿主的发酵可能需要单个葡萄糖、复合氮源(例如酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。举例而言,通常为碳的生长限制营养素可在扩增阶段加入发酵罐中以允许最大生长。另外,发酵法通常应用设计为含有足够量的碳、氮、基本盐、磷及其它次要营养素(例如维生素、微量矿物质和盐等)的发酵培养基。
本发明的重组葡萄糖氧化酶蛋白于重组系统中表达之后进行纯化,可以采用多种所属领域中已知的方法从宿主细胞中纯化或浓缩重组葡萄糖氧化酶。任何以下方法或手段都可用于纯化本发明重组葡萄糖氧化酶,例如:亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱(使用包括但不限于DEAE SEPHAR0SE)、硅胶色谱、反相HPLC、凝胶过滤(使用包括但不限于SEPHADEX G-75)、疏水相互作用色谱、大小排除色谱、金属螯合色谱、超滤/透滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦、置换色谱、电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)、差别溶解性(包括但不限于硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取。举例而言,可离心或过滤发酵培养液以去除细胞碎片,将上清液浓缩或稀释到所要体积或透滤入合适缓冲液中以调节制剂以用于进一步纯化。更优选的,可以将发酵后的上清液离心去除菌体沉淀,将上清酶液过滤,弃去滤过液,即得到浓缩的酶液;其中,所述的过滤可分为两次,第一次过滤采用0.1 微滤膜进行过滤,以除去上清酶液中残留的细胞碎片和可能存在的杂质,收集滤过液;第二次过滤是将第一次的滤过液再经过截留分子量为IOkDa的超滤膜进行过滤。
除非另外定义,否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料,但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的接受体的酵母。所述术语包括已经接收重组载体或其他转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解,由于偶然或有意的突变,单个亲本细胞的后代可不必在形态上或与原始亲本互补的基因组或总DNA上完全一致。特征为诸如存在编码4HB多肽的核苷酸序列的相关特性的充分类似于亲本的亲本细胞后代包括于这一定义所意指的后代中。
术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包括外源性多核苷酸的细胞,而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞,例如直接摄取、转导、f 配对或所属领域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制,否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制,否则所述术语也意指寡核苷酸类似物,其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的 DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定,否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言,可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991) ;Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608 (1985);和 Cassol et al., (1992) ;Rossolini et al., Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。SP,针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用,所述术语涵盖任何长度的氨基酸链,其包括全长蛋白(即抗原),其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
术语“表达”指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。
术语“转化”指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。
术语“外源基因”指对特定的宿主细胞而言,该基因序列是属于外来的来源,或是来自相同的来源但其原始序列进行了修饰或改造。
图1葡萄糖氧化酶(god-w)原基因密码子使用频率。
图2本发明优化后的葡萄糖氧化酶基因(god-h)的密码子使用频率。
图3酵母重组表达质粒pPIC9-god_h的构建不意图。
图4酵母转化子的PCR鉴定电泳图;1:阴性对照,2-18:转god_h基因的PCR结果;M:marker。
图5平板法筛选有葡萄糖氧化酶活性的酵母转化子。
图6 转 god_w(53#)、转 god_m (DG-16#)和转 god_h (Ghl68#、Gh459#)的酵母菌株 3
升发酵罐中葡萄糖氧化酶酶活结果。
图7发酵罐中葡萄糖氧化酶经甲醇诱导不同时间内的表达量的SDS-PAGE ;M:蛋白分子量marker ;1_3:转god-w的重组酵母(53#)经甲醇诱导48h、96h、132h的发酵液上清;4-6:转god-m的重组酵母(DG-16#)经甲醇诱导48h、96h、132h的发酵液上清;7_9:转god-h的重组酵母(Ghl68#)经甲醇诱导48h、96h、132h的发酵液上清。
图8本发明重组葡萄糖氧化酶添加到面包中的应用效果试验结果。
具体实施方式下面结合
具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
说明:以下
具体实施例中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术,均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行,包括:Sambrook 等人,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版.2001);Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);和 CurrentProtocols in Molecular Biology (Ausubel 等人编,1994)。
实施例1葡萄糖氧化酶基因的优化设计和合成
1.1菌株和质粒
点青霉(Penicillium notatum)由本发明人实验室保存;
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株T0P10和克隆载体pSP72购自北京全式金生物技术有限公司;god_h全基因片段由北京奥科生物技术公司合成。
1.2葡萄糖氧化酶基因的优化设计
本发明首先对从点青霉(Penicillium notatum)中克隆获得的葡萄糖氧化酶原始基因(god-w)的序列进行分析(基因的克隆请参考:李卓夫(硕士论文),葡萄糖氧化酶基因的克隆及闻效表达.长春理工大学,2008),在不改变蛋白质氣基酸序列的如提下,综合考虑密码子使用频率,GC含量的调整,不稳定序列的删除、mRNA 二级结构稳定性等影响因素,按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子对葡萄糖氧化酶基因序列进行改造。点青霉来源的葡萄糖氧化酶原基因全长1815bp,共编码604个氨基酸和一个终止密码子。其中前54个碱基编码的18个氨基酸为信号肽序列,在毕赤酵母中表达时需去除自带的信号肽序列,以表达载体PPIC9上的a因子为信号肽。因此去除自身信号肽的葡萄糖氧化酶基因(god-w)由1761个碱基组成,编码586个氨基酸和一个终止密码子(SEQ ID N0.3)。在不改变氨基酸序列的前提下对god-w基因进行优化后的葡萄糖氧化酶基因(god-h)序列为SEQ ID N0.1所示,共改变了 453个碱基,涉及391个氨基酸,GC含量由55.6%降为47.8% (表I)。GOD基因优化前后的密码子使用情况如图1、2所示。而且,优化后的基因(god-h) (SEQ ID N0.1)通过软件预测(RNA structure 4.5),其mRNA 二级结构自由能相比god_w乃至god-m均得至IJ 了较大幅度 的提高,这样有利于降低转录能量屏障,提高转录效率,进而提高蛋白表达量(表 2)。
表I葡萄糖氧化酶基因优化前后GC含量的变化
>god-wgod-mgod-h
减基
_数目百分比_数目百分比_数目百分比
A385 21.9% 439 24.9% 453 25.7%
C53630.4%43024.4%42524.2%
G44325.2%42324.0%41823.6%
T39722.5%46926.6%46526.5%
G+C97955.6%85348.4%84347.9%
注:god-m为中国专利申请公开号CN101955953A(发明名称:葡萄糖氧化酶突变基因及其应用)的专利申请中所公开的葡萄糖氧化酶突变基因;
表2god-w、god-m和god_h的mRNA 二级结构自由能比较
权利要求1.重组葡萄糖氧化酶的优化基因,其特征在于:其核苷酸序列为SEQID N0.1所示。
2.含有
权利要求1所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因的重组表达载体。
3.按照
权利要求2所述的重组表达载体,其特征在于:所述重组表达载体是重组真核表达载体。
4.按照
权利要求3所述的重组表达载体,其特征在于:所述重组真核表达载体是重组毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体。
5.含有
权利要求2-4任何一项所述重组表达载体的宿主细胞。
6.按照
权利要求5所述的宿主细胞,其特征在于:所述的宿主细胞为酵母细胞。
7.按照
权利要求6所述的宿主细胞,其特征在于:所述的酵母细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞。
8.
权利要求1所述重组葡萄糖氧化酶的优化基因在生产葡萄糖氧化酶中的应用。
9.按照
权利要求8所述的应用,其特征在于,包括:将
权利要求1所述的优化基因可操作的与表达载体相连接得到重组表达载体;将重组表达载体转化宿主细胞,获得重组宿主菌株;培养重组宿主菌株,诱导重组葡萄糖氧化酶的表达,回收并纯化所表达的重组葡萄糖氧化酶。
10.按照
权利要求9所述的应用,其特征在于:所述的重组表达载体为重组真核表达载体;所述的宿主细胞为酵母细胞。
11.按照
权利要求10所述的应用,其特征在于:所述的重组真核表达载体为毕赤酵母表达载体;所述的酵母细胞为毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)。
专利摘要本发明公开了重组葡萄糖氧化酶的优化基因及其表达载体和应用。本发明在不改变葡萄糖氧化酶氨基酸序列的前提下,综合考虑密码子使用频率,GC含量的调整,不稳定序列的删除、mRNA二级结构等影响因素,按照巴斯德毕赤酵母偏爱密码子对葡萄糖氧化酶基因序列进行了优化,优化后的葡萄糖氧化酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本发明进一步提供了含有所述葡萄糖氧化酶优化基因的表达载体以及重组宿主菌株。本发明将优化后的基因转入到毕赤酵母中进行表达,试验结果表明,相比于优化前,该优化基因在毕赤酵母中的分泌表达量有显著提高。葡萄糖氧化酶应用效果试验表明,所表达的重组葡萄糖氧化酶具有与商业化酶制剂相同的使用效果。
文档编号C12N1/19GKCN102517304 B发布类型授权 专利申请号CN 201110424247
公开日2013年8月28日 申请日期2011年12月16日
发明者张伟, 张宇宏, 范云六, 姚斌, 刘波 申请人:中国农业科学院生物技术研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (5),