专利名称:一种丝状真菌启动子和包含该启动子的质粒的制作方法
技术领域:
本发明涉及基因工程领域,尤其涉及一种丝状真菌启动子和包含该启动子的质粒。
背景技术:
稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)是一种研究植物病原真菌_寄主植物相互作用的丝状真菌模式生物,具有许多病原真菌共有的植物致病侵染循环,包括孢子产生、萌发、附着胞形成、侵染栓形成、侵入菌丝生长等致病过程。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界性的一种水稻上的毁灭性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻产量损失在10 30%之间;我国几乎每年都有稻瘟病菌的流行爆发。许多发达国家正在进行研究其致病分子机制,期望通过此类研究开发具有抗瘟特征的水稻品种,以及开发、设计新型抗真菌药物。
稻瘟病菌的致病过程是一个复杂的分子过程。目前已经克隆了许多与稻瘟病菌致病性相关的基因,如MPG1、CPKA, PMKU MAGB, PLSl、SMOl、PDEl、MPSl、PTHl1、CBPl、ICLl、BUFU ALBU ACRU RSYU HEXU ATGU MNH6等。尽管如此,稻瘟病菌的分子致病机制还不是很清楚,绝大多数的基因功能还未知。
鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因,尤其是与侵入过程相关的基因,可以为开发具有抗瘟特征的水稻品种,以及设计、筛选抗真菌药物提供有用的参考。目前根据稻瘟病菌无毒基因和水稻抗病基因的互作关 系,选育了很多水稻抗瘟品种;也已经在包括稻瘟病菌在内的一些真菌中证明了一些药物的靶点,如三环唑是一种很重要的稻瘟病菌杀菌剂,其作用是抑制黑色素的合成,靶点是稻瘟病菌的三羟萘还原酶;多肽杀菌剂sorphen A的作用靶点是青霉的脱甲基酶(CYP51)。
鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因,需要分析蛋白在细胞内的定位、蛋白过量表达对植物病原真菌的作用等,这都需要一种丝状真菌细胞内蛋白快速表达和高效表达的系统。在工业用丝状真菌中,开发了构巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpdA)的启动子、产黄青霉的异青霉N-合酶基因启动子、康氏木霉和微紫青霉的Cbhl启动子、产黄头孢的宽光谱脂肪酶基N(cesB)的启动子等各种启动子。但在丝状病原真菌中,目前每个基因研究还都需要各自建立一个基因表达系统(如NAR启动子;RP27启动子)。公开号为CN102154294A的发明专利申请公开了一种丝状真菌启动子、终止子和包含它们的质粒,但该启动子驱动蛋白在稻瘟病菌中的表达、定位效果仍不理想,需要探索更加高效、通用的丝状真菌蛋白表达系统。
发明内容本发明提供了一种丝状真菌启动子,利用该启动子可以在丝状真菌的菌丝、分生孢子、附着孢等各个阶段高丰度表达蛋白、DNA或RNA。
一种丝状真菌启动子,所述的丝状真菌启动子或其互补链具有如SEQ ID NO.1所示的碱基序列,该丝状真菌启动子命名为H3启动子。[0008]本发明提供了包含上述丝状真菌启动子的质粒。
优选地,所述质粒的原始载体为pCAMBIA1300,pCAMBIA1300载体含有卡那霉素抗性基因。以PCAMBIA1300载体作为基本构架,获得的穿梭表达载体可以通过农杆菌介导的方法直接转化丝状真菌,缩短了基因操作流程和时间,使用非常方便,具有较高的工作效率。
所述的质粒可以包含RP27终止子,RP27终止子或其互补链具有如SEQ ID NO. 2所示的碱基序列。公开号为CN102154294A的发明专利申请公开了该终止子的获得方法。
所述的质粒可以包含抗性基因,作为抗性筛选标记。所述的抗性基因为磺胺嘧啶抗性基因或新霉素抗性基因。
所述的质粒可以包含绿色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因。
本发明提供了所述质粒在丝状真菌中表达蛋白、DNA或RNA中的应用。试验结果显示,利用该质粒能实现蛋白、重组蛋白或融合蛋白在丝状真菌中的快速、高效表达或准确定位。
本发明还提供了包含所述质粒的转化子。
本发明提供的丝状真菌启动子是一个强启动子,在稻瘟病菌的菌丝、孢子和附着胞阶段都能高强度启动。该启动子基因属于表达强度在稻瘟病菌细胞内稳定在前100位以内的基因。该基因是组蛋白基因,对于维持细胞的正常运转具有重要作用。
利用本发明提供的丝状真菌启动子,能够构建在丝状真菌中快速、高效表达的系统,从而便于研究蛋白在病原真菌细胞内的定位、蛋白过量表达对病原真菌的影响等。
图1为pKD5穿梭表达载体的构建过程示意图。pKD5质粒具有H3启动子和RP27终止子,含有卡那霉素(Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性筛选标记。
图2为pKD5-GFP穿梭表达载体的构建过程示意图。pKD5_GFP质粒具有H3启动子和RP27终止子,含有卡那霉素(Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性筛选标记,含有eGFP绿色荧光蛋白基因。
图3为pKD5-RED穿梭表达载体的构建过程示意图。pKD5_RED质粒具有H3启动子和RP27终止子,含有卡那霉素(Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性筛选标记,含有DsRED2红色荧光蛋白基因。
图4为pKD7-RED穿梭表达载体的构建过程示意图。pKD7_RED质粒具有H3启动子和RP27终止子,含有卡那霉素(Kana)抗性和新霉素(Neo)抗性筛选标记,含有DsRED2红色荧光蛋白基因。
图5为H3启动子驱动的DsRED2蛋白在菌丝细胞质中表达。从左到右依次为暗视场下拍摄(红色荧光),明视场下拍摄,融合照片。
图6为H3或SODl启动子驱动的荧光蛋白在稻瘟病菌菌丝中表达的比较。
图7为H3启动子驱动的MgATG8基因编码蛋白在菌丝细胞中的定位。从左到右依次为暗视场下拍摄(红色荧光),明视场下拍摄,融合照片。
具体实施方式[0024]实施例1获得稻瘟病菌H3启动子序列
从稻痕病菌Guyll 菌株(Fungal Genetics Stock Center, University ofMissouri,Missouri,USA)的菌丝体中提取DNA并作为模板,根据稻瘟病菌70-15菌株的基因组数据库设计引物,利用高保真PCR方法扩增H3基因的启动子序列。
上游引物al :5,-TTgaattcAGTCATGTTGATTGAGGTGTTGT_3’
下游引物a2 :5’ -TGTCTAGACTTcccgggGATGGATCCGGCCATTGTGATTGATTTGTGATT_3’,
在上游引物中引入EcoRI位点;在下游引物中引入BamH1-Sma1-XbaI位点。
PCR体系为稻瘟病菌基因组DNA I μ 1,高保真DNA聚合酶O. 5 μ 1,dNTP(50mM)0.4y 1,上下游引物各 0·5μ l,10x PCR 缓冲液 5 μ 1,加水至 50 μ I。
PCR运行条件为94°C 3分钟,35个循环(94°C 30秒,58°C I分钟,72°C I分钟30 秒),72°C 10 分钟。
PCR产物经琼脂糖电泳,切下1. 5kb大小的目的条带,经胶回收纯化,连接到PGEM-T载体上,转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定,然后测序证实。经测序证实Η3启动子的DNA编码序列为SEQ ID NO.1所示。
实施例2构建携带Η3启动子和RP27终止子的重组表达载体
RP27终止子的DNA编码序列如SEQ ID NO. 2所示,其获得方法参见公开号CNl02154294Α的发明专利申请中公开的内容。
(I)重组表达载体pKD5的构建
利用抗性基因SUR的PCR引物从pCB1528经PCR获得SUR基因片段,
上游引物c1: 5 ’ -GTGCCAACGCCACAGTGCC-3 ’
下游引物c2 :5 ’ -GCGAATTCACTAGTGATTGTGAATCGTGAGAGCATGCAATTCCC-3,,
克隆到pGEM-T载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用XhoI和EcoRI酶切,2. Skb的酶切片段(SUR基因片段)插入pCAMBIA1300载体的XhoI和EcoRI位点;重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。鉴定正确的载体再用PstI和HinDIII双酶切后,与RP27终止子相连;重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。验证连接RP27终止子正确的载体用EcoRI和SalI酶切后,再与Η3启动子相连;重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为pKD5 (如图1所示)。
(2) eGFP蛋白重组表达载体pKD5_GFP的构建
利用eGFP的PCR引物从pGFP经PCR获得eGFP基因片段,
上游引物dl:5 ‘-AAcccgggATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3,
下游引物d2 :5 ‘ -AATCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3,,
克隆到pGEM-T载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用Small和XbaI酶切,eGFP基因片段插入表达载体PKD5的Small和XbaI位点;转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为PKD5-GFP (如图2所示)。
(3)红色荧光蛋白重组表达载体PKD5-RED的构建
利用DsRED2的PCR引物,从pDsRED2经PCR获得DsRED2基因片段,
上游引物el :5 ‘-AAcccgggATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATC-3’
下游引物e2 :5 ‘ -AATCTAGACAGGAACAGGTGGTGGCG-3,,
克隆到pGEM-T EASY载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用Small和XbaI酶切,DsRED2基因片段插入表达载体PKD5的Small和XbaI位点;转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为PKD5-RED(如图3所示)。
(4)红色荧光蛋白重组表达载体PKD7-RED的构建
利用抗性基因NEO的PCR引物,从pSilent-Duall PCR扩增获得NEO基因片段,
上游引物h1:5,-GCactagtGAGGTCAACACATCAATGC-3,
下游引物h2 :5’ -TTctcgagTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3’,
克隆到pGEM-T载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用SpeI和XhoI酶切,NEO基因片段插入表达载体pKD5-RED的SpeI和XhoI位点;转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为PKD7-RED (如图4所示)。
实施例3 Η3启动子驱动DsRED2在稻瘟病菌菌丝中的强表达
ATMT法转化pKD5-RED载体到稻瘟病菌将载体pKD5_RED通过冻融法转化到农杆菌菌株AGLl。然后ATMT法转化稻瘟病菌萌发孢子中从新鲜培养的LB平板(含50mg/ml卡那霉素)上挑选一农杆菌单菌落接种于5ml LB液体培养基(含50mg/ml卡那霉素),200rpm/min,28°C过夜培养;第二天将200-400 μ I培养液转移到5ml含50mg/ml卡那霉素的诱导液体培养基(頂)中,OD值约O. 15,28°C培养5 6个小时使0D600达到O. 5 O. 6 ;稻瘟病菌分生孢子的收集用IOml灭菌蒸馏水从培养大约10天的CM平板上洗下稻瘟病菌的分生孢子,三层擦镜纸过滤后用血球计数板计数,并用无菌水稀释孢子浓度为106个/ml ;取100 μ I培养好的农杆菌AGL-1 (含载体)菌液和100 μ I稀释好的稻瘟病菌分生孢子悬浮液混合,混合液(200 μ I)均匀涂于頂平板上的硝酸纤维素膜表面,頂平板含200ymol/L乙酰丁香酮(AS)或不含AS作为对照,22°C共培养48小时;然后将硝酸纤维素膜转移到含真菌抗生素(磺胺嘧啶)与抗生素的选择平板(DCM)上,选择性培养基中含100 μ g/ml磺胺嘧啶、400mg/ml头孢霉素、60mg/ml链霉素,将平皿置于28°C下培养到转化子出现;将转化子接种到含100 μ g/ml磺胺嘧啶DCM平板上再次鉴定。挑取具有磺胺嘧啶(SUR)抗性的转化子在荧光显微镜下检测。结果表明H3启动子驱动DsRED2荧光蛋白在稻瘟病菌菌丝细胞质中的强烈表达,见图5。
转pKD5-RED稻瘟病菌的转化子在CM培养基平板上培养5天,Trizol法提取RNA。DNase I处理RNA,然后RNA逆转录成cDNA,用Real Time定量PCR检测H3启动子驱动的DsRED2基因的表达量,以β -tubulin的表达量作为对照。
对比例1-2将实施例3中含有H3启动子的表达载体pKD5-RED用含有SODl启动子的表达载体PKD6-GFP、pKD6-RED替换,其余步骤相同,驱动荧光蛋白在稻瘟病菌菌丝中表达。其中,含有SODl启动子的表达载体pKD6-GFP、pKD6-RED的构建方法参见公开号CN102154294A的发明专利申请中公开的部分。
对比实施例3和对比例1-2,使用Real Time PCR方法检测转化子菌丝的H3启动子驱动的荧光蛋白表达载体(PKD5-RED)或SODl启动子驱动的荧光蛋白表达载体(pKD6_GFP和pKD6-RED)的eGFP或DsRED2表达量(β -tubulin作为对照)。BAR为标准差。
DsRED2 的 Real Time qPCR 的引物为
上游引物i1: 5,-AAGGCCCTGAAGCTGAAG-3 ’
下游引物i 2 :5 ’ -GATGGTGTAGTCCTCGTTGTG-3,;
eGFP 的 Real Time qPCR 的引物为
上游引物kl :5’ -GACAACCACTACCTGAGCAC-3’
下游引物k2 :5’ -CAGGACCATGTGATCGCG-3’ ;
β -tubulin 的 Real Time qPCR 的引物为
上游引物j1: 5,-TCCCATCAACATCAGAATCCG-3,
下游引物j2 :5 ’ -GTTGTAAACTCCATTGCTGTCG-3 ’。
Real Time定量PCR结果显示H3启动子驱动的DsRED2的基因表达量是β -tubulin 的 20. 8倍(8. 8-34. 2倍)^SODl 启动子指导下的 eGFP mRNA是 β -tubulin 的5. 4倍(pKD6-GFP),SODl 启动子指导下的DsRED2 mRNA是 β -tubulin 的 2. 5倍(pKD6_RED);H3启动子的驱动效果比SODl启动`子强烈(如图6所示)。
实施例4 MgATG8蛋白在稻瘟病菌细胞内的亚细胞定位
荧光融合蛋白载体的构建根据MgATG8的cDNA序列设计合成PCR引物,
上游引物ml :5’ -taTCTAGAATGCGCTCCAAGTTCAAGGACGA-3’
下游引物m2 :5 ’ -taGTCGACTCACTCGACTTCCTCAAACAGGT-3,
PCR扩增包含整个基因编码区在内的MgATG8基因cDNA,然后克隆到pGEM_T载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α,挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养,提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用XbaI和SalI酶切,MgATG8基因片段插入pKD5_RED载体的XbaI和SalI位点。
ATMT法将荧光融合蛋白载体转化到丝状真菌。挑取具有磺胺嘧啶(SUR)抗性的转化子在荧光显微镜下观察DsRED2-MgATG8融合蛋白在稻瘟病菌细胞中的分布。利用PKD5-RED载体构建的DsRED2-MgATG8融合蛋白在稻瘟病菌中的表达结果表明如图7所示,DsRED2-MgATG8融合蛋白在细胞内成点状分布,分布于细胞质中的小泡边缘;其结果跟利用SODl启动子启动的DsRED2-MgATG8融合蛋白在稻瘟病菌细胞中的分布结果一致。
权利要求1.一种丝状真菌启动子,其特征在于,所述的丝状真菌启动子的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种包含
权利要求1所述丝状真菌启动子的质粒。
3.根据
权利要求2所述的质粒,其特征在于,所述质粒的原始载体为pCAMBIA1300。
4.根据
权利要求2所述的质粒,其特征在于,包含RP27终止子,所述的RP27终止子的碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。
5.根据
权利要求2所述的质粒,其特征在于,包含抗性基因。
6.根据
权利要求5所述的质粒,其特征在于,所述的抗性基因为磺胺嘧啶抗性基因或新霉素抗性基因。
7.根据
权利要求2所述的质粒,其特征在于,包含绿色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因。
8.如
权利要求2-7任一所述质粒在稻瘟病菌中表达蛋白中的应用。
9.一种包含
权利要求2-7任一所述质粒的转化子。
专利摘要本发明公开了一种丝状真菌启动子和包含该启动子的质粒。所述的丝状真菌启动子或其互补链具有如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。本发明提供的丝状真菌启动子是一个强启动子,在稻瘟病菌的菌丝、孢子和附着胞阶段都能高强度启动。该启动子基因属于表达强度在稻瘟病菌细胞内稳定在前100位以内的基因。该基因是组蛋白基因,对于维持细胞的正常运转具有重要作用。利用本发明提供的丝状真菌启动子,能够构建在丝状真菌中快速、高效表达的系统,从而便于研究蛋白在病原真菌细胞内的定位、蛋白过量表达对病原真菌的影响。
文档编号C12N15/80GKCN102559678 B发布类型授权 专利申请号CN 201110440901
公开日2013年4月17日 申请日期2011年12月26日
发明者卢建平, 张莉林, 李海娇, 林福呈 申请人:浙江大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan