专利名称:一种基于海洋青鳉卵黄蛋白原的水体雌激素污染检测方法
技术领域:
本发明属于环境污染检测领域,涉及一种基于新型广盐性模式鱼类卵黄蛋白原的水体环境雌激素污染检测方法,可广泛运用于滨海城市内湖,河流入海口,海水等区域的环境雌激素污染程度评估。
背景技术:
目前,针对环境雌激素的污染问题主要采用化学检测的方法,如液相色谱和质谱联用法(HPLC-MS)等。这些方法的优点是灵敏度高,但这些方法所需的分析仪器价格昂贵,成本非常高,难以进行推广和普及。另外,这些方法对样品的要求较高。环境样品与一般样品不同,具有化合物种类繁多、含量低、样品组成复杂、具有流动性和不稳定性等特点。当待测污染物浓度低于现有方法的检出限或者样品复杂,机体干扰严重的情况下,直接测定是不可能的。与化学方法相比,生物检测可以避开成分检测,直接分析污染样品引起的生物学效应,可更直观的反映环境污染的危害程度。但目前的生物检测法尚处于初始发展阶段,极少有海水小型模式动物运用生物学检测。因而有必要开发基于海水生物活体模型的检测技术,从海水的综合生物学和毒理学活性来直接评估海水污染的健康危害程度。我们选择了新兴模式生物一海洋青鏘鱼。
.海;輿着纖iOryzias melastigma 或 Oryzias又名印度马达卡(Indianmedaka),黑点青鏘,原产于巴基斯坦、印度、緬甸和泰国沿海及淡水水域。在分类学上,海洋青鏘与日本青鏘同属脊索动物门辐鳍鱼纲颚针鱼目怪颌鏘科青鏘属。海洋青鏘鱼作为近海海洋环境雌激素活体检测模型具有以下优势:1.体型较小,耐受力较强,很容易在实验室大规模饲养。2.性别差异可通过鱼鳍形态的不同而快速辨别。3.雌鱼产卵量大,世代周期短,繁殖代数多。4.对盐度的适应范围宽泛,可开发成有别于淡水斑马鱼模型的活体检测模型,在各种盐度的环境条件下进行推广应用。
鱼类卵黄蛋白原特异性产生于雌性动物肝脏中,正常条件下,雄鱼或者幼鱼体内很难检测到表达,但在雌激素暴露下,雄性也会产生应激而表达卵黄蛋白原。因而,雄鱼卵黄蛋白原的诱导可以指示环境中雌激素污染(S umpter, J.P.and Jobling, S.Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquaticenvironment.Environ Health Perspect)。目前国内外已针对卵黄蛋白原开发出类雌激素检测方法,但所选择的鱼类模型均为淡水鱼类,包括鲤科和鲟科鱼类(如专利公开号:CN101519650和CN1763090)。通过查阅文献(中国期刊网、中华人民共和国专利局专利检索、Science Direct、ISI Web of Science、Springer Journal、NCBI,等),未见海水鱼类用于环境雌激素的检测方面的专利报道。本研究选用广盐性海洋青鏘鱼作为活体模型,建立了针对卵黄蛋白原的活体环境雌激素检测技术,具有较高的创新性和实用性。
发明内容本发明的目标是提供一种检测各盐度条件下的环境雌激素污染的检测技术,并运用于海域的环境雌激素污染检测。我们首次将新型模式物种一海洋青鏘鱼melastigma )作为该项技术的鱼类模型。方法上采用实时荧光定量PCR方法,检测性成熟雄鱼在环境样品暴露下,卵黄蛋白原(vitellogenin, VTGl) mRNA表达水平的变化情况,进而指示样品的雌激素污染。
采用SYBR实时定量PCR方法检测VTGl的表达,并以18S核糖体RNA (18Sribosomal RNA)为内参基因,建立了 VTGl转录水平的检测体系,包括引物的设计,主要采用primer3.0初步设计引物,用01igo6.0进一步筛选引物,进行PCR实验,对引物的特异性和扩增效率进行评估,最终优化获得VTGl和内参基因18S的定量PCR用引物各一对,序列如下:
VTGl荧光定量PCR引物:
F: 5’ -TTGGCAGAGATGCAGCAGCGGT-3’ ;
R: 5, -GGAAATGCAGGACACCCCAGTAGCC-3,;
18S荧光定量PCR引物 5’ -AACGCTGTGCTGCGTAGCCTCAATT-3’ ;
R: 5’ -AGAAGAAGCCCCACTTTTCCTCGCA-3’。
进一步优化PCR反应体系,最终确定为二步法反应程序:95 V 30秒预变性,95V 5秒变性,60 V 20秒复性、延伸和收集荧光信号,40个循环。数据分析采用最大二阶导数法,获得Ct值(cycle threshold,荧光信号到达设定阈值所需的反应循环数),采用2 “ ^法进行相对定量分析。
选择性成熟的海洋青鏘鱼雄鱼,MilliQ水人工配置35 %。盐度的洁净水样,进行暴露,作为阴性对照,阴性水样加入17-β-雌二醇(Ε2,100 ng/L),作为阳性暴露,8小时后处死鱼,提取肝脏RNA,检测VTGl的表达量,分别作为阴性和阳性对照。
采集水样,进行三次平行暴露,分析VTGl的表达水平,与阴性和阳性对照组比较,从而分析水样的环境雌激素污染程度。
图1是18S基因和VTGl基因定量PCR产物熔解曲线图。该图表明PCR体系具有良好的特异性。
图2是环境样品诱导海洋青鏘鱼VTGl基因表达相对水平图。是将成年海洋青鏘鱼进行各水样暴露,8小时后停止暴露,获取肝脏组织,检测18S和VTGl基因表达水平,以洁净人工海水暴露鱼的VTGl表达水平为参照,阴性对照样品为洁净海水,三个样品分别来自厦门三个海域,阳性对照样品为包含100 ng/L 17-β-雌二醇(E2)的洁净人工海水。每个样品设三个重复,每个重复包含三条鱼,* ρ〈0.05,显著性上升,》ρ〈0.01,极显著性上升。
具体实施方式1.样品采集与 预处理
在所需检测水域采集海水,采集表层下海水。采集的海水样品过夜澄清,采用虹吸法获得澄清海水,弃掉底部固体沉积物。[0013]2.暴露实验
选择3-4个月大的雄性海洋青鏘鱼为暴露对象,设立阴性和阳性对照。采用MilliQ水人工配置35 %。盐度的洁净水样为阴性对照用水,加入100 ng/L 17-β -雌二醇(E2),为阳性对照用水。设置三个平行样,每个平行样包含3条随机获取的雄鱼。采集样品与对照同时暴露,暴露时间为8小时,暴露期间无需喂食和换水。鱼暴露8小时后,捞出小鱼,用冰水浴处死鱼,解剖,获取肝脏组织,迅速收入-80 °C冰箱中保存。
3.鱼样品处理
采用Trizol法提取肝脏RNA,分光光度法鉴定RNA质量和检测RNA浓度,取I μ g RNA,采用Takara公司反转录试剂盒PrimeScripteRT Master Mix (产品目录号DRR036A)反转录成 cDNA, 20 μ I 反应体系包含 4 μ I 5 X PrimeScript RT Master Mix, 10-100 ng 总RNA。反应程序为37 °C, 15分钟;85 °C,5秒。反转录获得第一链cDNA,用于下一步实验。
4.进行荧光定量PCR实验
在实时荧光定量PCR仪LightCycler Roche480仪器上进行PCR反应,采用Takara公司荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq II (产品目录号DRR081A)进行反应,20 μ I PCR体系组分如下表:
权利要求1.一种用于检测海水环境雌激素污染的新技术,其特征在于它是以新型海水模式鱼种一海洋青鏘鱼雄鱼(Orjzia1S me I as t i gma) %受成坑售-,以暴露后的生物学效应来评估环境雌激素的污染程度。
2.根据
权利要求1所述的检测技术,其特征在于根据卵黄蛋白原(VTGl)和18S编码基因序列,设计VTGl荧光定量PCR引物(序列为:F: 5’ -TTGGCAGAGATGCAGCAGCGGT-3’ ;R: 5 ’ -GGAAATGCAGGACACCCCAGTAGCC-3 ’)和内参基因18S荧光定量PCR引物(序列为:5’ -AACGCTGTGCTGCGTAGCCTCAATT-3’ ;R: 5’-AGAAGAAGCCCCACTTTTCCTCGCA-3’)。
3.根据
权利要求1所述的检测技术,其特征在于建立相对定量PCR法,分析环境样品诱导鱼VTGl表达水平的差异。
4.根据
权利要求3所述的检测技术,其特征在于对海洋青鏘鱼进行环境样品暴露,以8小时为暴露时长,并设立阴性和阳性对照,阴性对照为洁净人工海水暴露,阳性对照为100ng/L 17-beta-雌二醇(E2)暴露,该体系用于评估样品的环境雌激素污染程度。
专利摘要本发明涉及一种基于海洋青鳉卵黄蛋白原的水体雌激素污染检测方法,属于环境污染检测领域。目前尚未有海水鱼类用于环境雌激素的生物检测,海水雌激素污染的生物检测技术缺乏。本发明选择适应能力强的广盐性动物海洋青鳉鱼雄鱼(Oryziasmelastigma)作为活体模型,设计引物,采用实时定量PCR方法检测卵黄蛋白原(vitellogenin,VTG1)的表达,并以18S核糖体RNA(18S)为内参基因,建立了VTG1转录水平的检测体系。对雄鱼进行17-β-雌二醇暴露和洁净人工海水暴露,摸索合适的暴露时间,分别作为体系的阳性和阴性对照。该检测方法可用于海水,河流入海口和盐水内湖水样的环境雌激素污染程度。
文档编号C12Q1/68GKCN103184276SQ201110452160
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月30日
发明者黄乾生, 方超, 伍辛泷, 董四君 申请人:中国科学院城市环境研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan