脑膜炎球菌fHBP多肽的制作方法
专利名称：脑膜炎球菌fHBP多肽的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫领域，具体地说，属于对奈瑟球菌属致病菌，如脑膜炎奈瑟球菌 (N. meningitidis)所导致疾病的免疫。
背景技术：
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰阴性荚膜菌，其寄居于约 10%人群的上呼吸道中。虽然已有针对血清群(serogroupM、C、W135和Y的多糖和偶联疫苗，但是该方法不能用于血清群B，因为其荚膜多糖多聚唾液酸聚合物是人类的一种自身抗原。为了开发针对血清群B的疫苗，业已采用了其外膜囊泡(OMV)中所含的表面暴露蛋白质。这些疫苗可以引发血清杀菌抗体应答并保护机体抵抗疾病，但不能诱导菌株间交叉保护力[1]。于是一些研究者将注意力集中到脑膜炎球菌特异性抗原在疫苗中的用途[2]。 一种这样的抗原是脑膜炎球菌H因子结合蛋白(fHBP)，也称为“741”蛋白[参考文献3中的 SEQ ID 25；35 和 2536，本文中的 SEQ IDl]，“NMB1870”、“GNA1870”[参考文献 2 之后的参考文献4-6]，“P2086”、“LP2086”或“0RF2086” [7-9]。该脂蛋白在所有的脑膜炎球菌血清群中均有表达，已发现其存在于多种脑膜炎球菌菌株中。fHBP序列可分为三个家族[4](本文中称为家族I、II和III)，已发现抗某给定家族的血清对同一家族菌株具有杀菌作用，但对表达其它两个家族之一的菌株无活性，即在家族内有交叉保护作用，而家族间无交叉保护作用。因此，为了用fHBP来获得菌株间交叉保护作用，采用了一个以上的家族。为了避免表达和纯化各自蛋白质的需要，已提议将不同的家族蛋白质表达为杂合蛋白质[10-12]， 将两个或三个家族包括在单个多肽链中。参考文献13和14描述了多种基于突变修饰fHBP 序列的方法，以增强其对家族I、II和III之间的覆盖度。本发明的目的之一是为克服fHBP所赋予保护作用的家族特异性提供进一步的改进方法，以及用这些方法提供对脑膜炎球菌疾病和/或感染，特别是对血清群B的免疫力。
发明内容
菌株MC58的全长fHBP具有以下氨基酸序列(SEQ ID N0:1)MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ成熟的该脂蛋白缺少SEQ ID NO 1的前19个氨基酸，fHBP的AG形式缺少前沈
个氨基酸。MC58序列(SEQ ID NO 1)属于fHBP家族I。采用MC58序列引发的抗体对MC58 菌株有高杀菌活性，但对表达家族II或III fHBP菌株的活性则低得多。在一些实施方式中，本发明涉及fHBP的修饰形式，其中的修饰作用增强了该蛋白引发家族间交叉杀菌抗体的能力。在其它实施方式中，本发明涉及能天然引发家族间交叉杀菌抗体的fHBP形式。因此本发明提供了一种多肽，其包含一段选自以下SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77的氨基酸序列。这些氨基酸序列起始于与MC58序列Val27匹配的残基，但在下游位点包含各种氨基酸修饰。两个优选的序列是SEQ ID NO 20和23。也优选SEQ ID NO :76。所述多肽给予宿主动物后具有诱导杀菌性抗脑膜炎球菌抗体的能力，在优选的实施方式中，可以诱导对fHBP I-III三个家族各自菌株的杀菌性抗体。关于杀菌应答的其它信息在下文中给出。本发明也提供了一种多肽，包含一段与SEQ ID NO :76具有至少相同性的氨基酸序列。k 值可选自 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或更高。本发明也提供了一种多肽，包含含有SEQ ID NO :76的第一片段和第二片段的氨基酸序列，其中所述第一片段包括SEQ ID N0:76第89-1M位氨基酸形成的一个表位，所述第二片段包括SEQ ID NO :76第187-248位氨基酸形成的一个表位。通常该第一和第二片段独立地长至少 7 个氨基酸，例如，8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、沘、30、32、24、洸、28、
40、45、50、55、60个氨基酸或更多。本发明也提供了一种多肽，包含以下氨基酸序列(i)与SEQ ID N0:76具有至少相同性和(ii)包含所述SEQ ID NO :76的第一和第二片段。本发明还提供了一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:取代可发生在SEQ ID NO 2相应位置的氨基酸。所述多肽可以引发能与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 二者结合的抗体。本发明还提供了一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:取代可以发生在SEQ ID NO :2相应位置的氨基酸。所述多肽可引发能与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 二者结合的抗体。本发明还提供了一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:取代可发生在SEQ ID NO 2相应位置的氨基酸。所述多肽可引发能与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 二者结合的抗体。多月太可以通过各种方法制备本发明的多肽，例如，(至少部分)化学合成、用蛋白酶消化较长多肽、翻译RNA、纯化细胞培养物(例如，重组表达或脑膜炎奈瑟球菌培养物)等。在大肠杆菌(宿主中异源表达是一种优选的表达途径。fHBP是脑膜炎奈瑟球菌的天然脂蛋白。已发现其在大肠杆菌中表达时被脂化并带有天然的前导序列。本发明的多肽可含有可被脂化的N末端半胱氨酸残基，例如，可含棕榈酰基团，通常会形成三棕榈酰-S-甘油-半胱氨酸。在其它实施方式中，所述多肽不被脂化。本发明优选多肽的一个特征是给予宿主动物后具有诱导杀菌性抗脑膜炎球菌抗体的能力。制备的多肽优选为基本纯或基本分离的形式(即基本上不含奈瑟球菌或宿主细胞的其它多肽)或基本分离的形式。一般来说，在非天然产生环境中提供所述多肽，例如，将其与天然产生的环境分离。在某些实施方式中，与对照相比本发明多肽存在于富含所述多肽的组合物中。如此提供纯化多肽，其中纯化指所述多肽存在于基本上不含其它表达多肽的组合物中，基本上不含指组成所述组合物的其它表达多肽少于90%、通常少于60%、 更通常少于50%。多肽可有各种形式(例如，天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、二硫桥等)。SEQ ID NO 4_76不包括N末端甲硫氨酸。如果通过在宿主生物中翻译产生本发明的多肽，需要起始密码子，在大多数宿主中需提供N末端甲硫氨酸。因此本发明多肽至少在新生阶段包含位于所述SEQ ID NO序列上游的甲硫氨酸残基。在一些实施方式中，所述多肽在N末端具有单个甲硫氨酸，其后紧接着所述SEQ ID NO序列；在其它实施方式中，可采用更长的上游序列。这种上游序列可以较短(例如，40 个或更少，即 39、38、37、36、；35、34、33、32、31、30、四、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。例子包括指导蛋白质运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标签，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、 8、9、10或更多)。其它合适的N-末端氨基酸序列是本领域技术人员显而易见的。本发明的多肽也可以包括位于所述SEQ ID NO序列最末氨基酸下游的氨基酸。这种C末端延伸段可以较短(例如，40个或更少，即39、38、37、36、35、；34、33、32、31、30、29、 28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 个氨基酸)。例子包括指导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(如包含组氨酸标签，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或能提高蛋白质稳定性的序列。其它合适的C末端氨基酸序列是本领域技术人员显而易见的。术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性或支链聚合物， 可以包含经修饰的氨基酸，可以被非氨基酸阻断。该术语也包括天然或人工介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记组分偶联的氨基酸聚合物。该定义还包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。产生的多肽可以是单链或缔合链。可将本发明的多肽连接于或固定于固体支持物。本发明的多肽可包含可检测标记，例如，放射性标记、荧光标记或生物素标记)。这在免疫测定技术中特别有用。如参考文献13所述，fHBP可以被分割为三个结构域，称为A、B和C。以SEQ ID NO 1 为例，所述三个结构域为(A) 1-119、(B) 120-183 和(C) 184-274。MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ结构域“A”的成熟形式从N末端的Cys-20起到Lys-119，称为“A成熟”。已知多个fHBP序列，不难用标准方法进行比对。通过这样的比对，技术人员可以 (a)与MC58序列的坐标比较来识别任何给定fHBP序列中的结构域“A” (和Aj5ia)、“B”和
5“C”，和(b)识别多个fHBP序列中的单个残基，例如，识别是否被取代。然而，为方便参考， 所述结构域定义如下-某给定fHBP序列的结构域“A”是采用逐对比对算法与SEQID N0:1进行比对时，以与SEQ ID NO 1的Met-I比对的氨基酸开始且以与SEQ IDNO 1的Lys-119比对的氨基酸结束的该序列片段。-某给定fHBP序列的结构域"Ajtss”是采用逐对比对算法与SEQIDNO 1进行比对时，以与SEQ ID NO 1的Cys-20比对的氨基酸开始且以与SEQ ID NO 1的Lys-119比对的氨基酸结束的该序列片段。-某给定fHBP序列的结构域“B”是采用逐对比对算法与SEQID N0:1进行比对时，以与SEQ ID NO 1的Gln-120比对的氨基酸开始且以与SEQID NO 1的Gly-183比对的氨基酸结束的该序列片段。-某给定fHBP序列的结构域“C”是采用逐对比对算法与SEQID N0:1进行比对时，以与SEQ ID NO 1的Lys-184比对的氨基酸开始且以与SEQID NO 1的Gln-274比对的氨基酸结束的该序列片段。定义所述结构域的优选逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[15]， 采用默认参数(例如，缺口开放罚分=10. 0，缺口延伸罚分=0. 5，采用EBL0SUM62评分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具可方便地执行这种算法[16]。在一些实施方式中，本发明多肽被截短以去除其结构域A，即将结构域A从SEQ ID 中删除。在一些实施方式中，多肽包含以上所述的氨基酸序列，除了最多有10个N末端氨基酸(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)和/或最多有10个C末端氨基酸(即1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10)缺失外。因此本发明提供了一种多肽，包含含有选自以下氨基酸序列片段SEQID NO 4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76 和 77 的氨基酸序列，其中所述片段是所述SEQ ID的氨基酸a-b，其中a是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，b是j、 j-1、j-2、j-3、j-4、j-5、j-6、j-7、j-8、j-9 或 j-10, j 是所述 SEQ ID 的长度。也可采用更长的截短(例如，最多15个氨基酸，最多20个氨基酸等)。核酸本发明提供了编码上文所定义的本发明多肽的核酸。可采用多种方式制备本发明的核酸，例如，完全或部分化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成)、用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(例如采用连接酶或聚合酶)、从基因组或cDNA文库制备等。本发明的核酸可采取各种形式，例如，单链、双链、载体、引物、探针、标记、未标记寸。本发明的核酸优选为分离的或基本分离的形式。术语“核酸”包括DNA和RNA，还有其类似物，如含有修饰主链的类似物，以及肽核酸(PNA)等。
本发明的核酸可以被标记，例如，用放射性或荧光标记。本发明还提供了包含本发明核苷酸序列的载体(如质粒)(例如克隆或表达载体， 如适合核酸免疫的载体)和用这样的载体转化的宿主细胞。杀菌应答本发明的优选多肽可引发对脑膜炎球菌的杀菌抗体应答。可以方便地测定小鼠的杀菌抗体应答，作为疫苗功效的标准指标[例如，见参考文献2的尾注14]。本发明的多肽可优选引发对以下三组菌株至少两组各自至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌抗体应答(I)MC58, gbl85( = M01-240185)， m4030, m2197, m2937, isslOOl, NZ394/98, 67/00,93/114，bzl98, ml390, nge28, lnpl7592，00-241341，f6124, 205900, ml98/172, bzl33, gbl49( = M01-240149)， nm008, nm092，30/00，39/99，72/00，95330， bzl69, bz83, cu385, h44/76, ml590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89,14847。(11)961-5945,2996,96217,312294,11327, a22, gb013( = M01-240013)， e32, ml090, m4287,860800, 599,95N477,90-18311, cll,m986,m2671,1000，ml096，m3279，bz232， dk353, m3697, ngh38, L93/4286。(III)M1239,16889，gb355 ( = M01-240355)，m3369, m3813, ngpl65。例如，多肽可以引发对血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58、961-5945和M1239中的两种或三种菌株的有效杀菌应答。所述多肽可优选引发对至少50% (例如，60%、70%、80%、90%、95%或更多)的临床相关脑膜炎球菌血清群B菌株的杀菌抗体应答。所述多肽可引发对血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株和血清群A、C、W135和Y中的至少一种菌株的杀菌抗体应答。所述多肽可引发对淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)和灰色奈瑟球菌(N. cinerea)菌株的杀菌抗体应答。所述多肽可引发对参考文献4图5所示系统树的三条主分枝中至少两条分枝菌株的杀菌应答。所述多肽可引发对超毒力谱系ET-37、ET_5、A4簇、谱系3、亚组I、亚组III和亚组 IV-I中至少2(例如，2、3、4、5、6、7)种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌抗体应答[17，18]。多肽还可诱导对一种或多种高侵袭性谱系的杀菌抗体应答。多肽可引发对以下多基因座序列类型=STU ST4、ST5、ST8、STlU ST32和ST41中至少2(例如，2、3、4、5、6、7)种的脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌抗体应答[19]。所述多肽还可引发对ST44菌株的杀菌抗体应答。所述多肽不需要诱导对指定谱系或MLST中各个和每个MenB菌株的杀菌抗体；相反，对某特定超毒力谱系或MLST中血清群B脑膜炎球菌多个菌株的四个的任何给定群而言，所述组合物诱导的抗体优选对所述组的至少50 % (例如，60 %、70 %、80 %、90 %或更多)具有杀菌作用。优选的菌株组包括从至少四个以下国家英国(GB)、澳大利亚(AU)、 加拿大(CA)、挪威(N0)、意大利(IT)、美国(US)、新西兰(NZ)、荷兰(NL)、巴西(BR)和古巴 (CU)分离的菌株。所述血清的杀菌效价优选为至少1024 (例如，21(1、2"、212、213、214、215、216、 217、218或更高，优选至少214)，即所述血清在1 10M稀释后能杀死某特定菌株的至少50% 测试细菌，如参考文献2的尾注14所述。优选的嵌合多肽可在小鼠中引发抗体应答，甚至在血清1 4096稀释或更稀时仍保持杀菌性。免疫接种
7
本发明的多肽可用作免疫原性组合物的活性成分，所以本发明提供了包含本发明多肽的免疫原性组合物。本发明也提供了一种在哺乳动物中产生抗体应答的方法，包含将本发明的免疫原性组合物给予哺乳动物。所述抗体应答优选为保护性和/或杀菌性抗体应答。本发明也提供了本发明多肽在这类方法中的应用。本发明还提供了一种保护哺乳动物免受奈瑟球菌(例如脑膜炎球菌)感染的方法，包含给予哺乳动物本发明的免疫原性组合物。本发明提供了本发明多肽作为药物(例如，免疫原性组合物或疫苗)或诊断试剂的用途。本发明还提供了本发明的核酸、多肽或抗体制备预防奈瑟球菌(例如脑膜炎球菌) 感染哺乳动物的药物的用途。所述哺乳动物优选人。所述人可以是成人，或优选儿童。在疫苗用于预防用途时， 所述人优选儿童(例如，幼童或婴儿)；在疫苗用于治疗用途时，所述人优选成人。用于儿童的疫苗也可以给予成人，例如，以评估其安全性、剂量、免疫原性等。所述用途和方法特别适用于预防/治疗疾病，包括但不限于脑膜炎(特别是细菌性脑膜炎，如脑膜炎球菌性脑膜炎)和菌血症。治疗性处理的功效可以通过监测给予本发明组合物后的奈瑟球菌感染来测试。预防性处理的功效可以通过监测给予所述组合物后对fHBP的免疫应答来测试。本发明组合物的免疫原性的测定可通过给予受试对象(例如，12-16月龄儿童，或动物模型[20])，然后测定标准参数，包括血清杀菌抗体(SBA)和ELISA效价(GMT)来进行。通常在给予所述组合物后约4周时测定这些免疫反应，并与给予所述组合物之前测得的值作比较。优选SBA 增高至少4倍或8倍。给予一个以上剂量的组合物时，可以进行一次以上的给药后测定。本发明的优选组合物赋予患者的抗体效价优于可接受百分比的人对象对各抗原组分血清保护力的标准。众所周知抗原的抗体效价高于相关抗体效价，就认为宿主对所述抗原已发生了血清转化，这种效价已由如WHO组织公布。优选高于80%，更优选高于90%， 还要优选高于93%，最优选96-100%的具有统计学显著性的对象样品发生血清转化。通常直接给予患者本发明的组合物。可经肠胃外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内注射或注射到组织间隙)，或经直肠、口服、阴道、外用、透皮、鼻内、经眼、经耳、经肺或其它粘膜给药完成直接递送。优选在大腿或上臂进行肌肉内给药。可通过针头(例如皮下针头)注射，但也可以采用无针注射。通常肌肉内的剂量为约0.5ml。可用本发明来引发全身和/或粘膜免疫。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案后可进行加强剂量方案。可常规确定初次剂量之间(例如 4-16周)以及初次与加强剂量之间的适当时机。本发明的免疫原性组合物通常会包括药学上可接受的运载体，其可以是本身不会诱导产生对接受所述组合物的患者有害抗体的任何物质，且给予后无不当毒性。药学上可接受的运载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质，如湿润剂或乳化剂、PH缓冲物质等也可存在于这种运载体中。关于合适载运体的充分讨论见参考文献21。奈瑟球菌感染影响到机体的多个区域，因此可将本发明的组合物制备成各种剂型。例如，可将所述组合物制备成液体溶液或悬浮液等可注射剂型。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体运载体的固体剂型。可将所述组合物制备成外用给药剂型，例如，油膏、 乳膏或粉末。可将所述组合物制备成口服剂型，例如，片剂或胶囊，或糖浆(任选调味)。可将所述组合物制备成肺部给药剂型，如采用细粉或喷雾的吸入剂。可将所述组合物制备成栓剂或阴道栓。可将所述组合物制成经鼻、经耳或经眼给药的剂型，例如滴剂。所述组合物优选无菌。优选无热原。优选用缓冲液处理使其处于例如PH 6到pH 8之间，通常为约pH 7。在组合物包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[22]。本发明的组合物可与人体等张力。免疫原性组合物包含免疫有效量的免疫原，以及任何其它所需的其它特定组分。 “免疫有效量”指一次剂量或作为一系列剂量的一部分，给予个体的对治疗或预防有效的量。该用量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组别(例如，非人灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而不同。预计该用量位于通过常规试验测定的相对较宽范围内。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(例如，包括加强剂量)。所述组合物可与其它免疫调节剂联合给药。可用于本发明组合物中的佐剂包括但不限于A.含矿物质组合物本发明中适合用作佐剂的含矿物质组合物包括无机盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括无机盐，如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如见参考文献23的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物，其可为任何合适的形式(例如，凝胶、晶体、无定形等)，优选具有吸附性。也可将含矿物质的组合物制成金属盐颗粒[24]。一种有用的磷酸铝佐剂是无定形羟基磷酸铝，PO4Al摩尔比为0. 84-0. 92，包含0. 6mg AI3Vml0B.油乳液适合用作本发明佐剂的油乳液组合物包含水包角鲨烯乳液，如MF59 [参考文献23 第10章；也见参考文献25] (5%角鲨烯、0.5%吐温80和0. 5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可采用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。有用的水包油乳液通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。所述乳液的油滴直径通常小于1 μ m，用微流化床实现这种小尺寸以提供稳定的乳液。优选小于220nm的液滴，因为其可过滤除菌。所述乳液可包含如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见可得的花生油、大豆油、 椰子油和橄榄油是坚果油的代表例子。可采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最易于得到的是玉米油，但也可采用其它谷类，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草(teff)、黑小麦(triticale)等的油。尽管甘油和1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯不是天然产生的种籽油，但也可以从坚果和种籽油开始，通过对合适原料的水解、分离和酯化而制备。哺乳动物奶中的脂肪和油可代谢，因此可用于实施本发明。由动物来源获得纯化油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的步骤是本领域熟知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和如鲸蜡的鲸油是可用于本发明的几种鱼油的代表例子。许多支链油可通过生化方法以5-碳异戊二烯单元合成，通常称为萜类化合物。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物2，6，10，15，19，23-六甲基-2,6,10，14，18，22- 二十四碳六烯，为本文特别优选。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。鱼油，包括角鲨烯和角鲨烷，易于从商业来源获得，或可用本领域已知的方法获得。其它优选油是生育酚(见下文)。可采用油的混合物。可通过其“HLB” (亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类。本发明优选表面活性剂的HLB至少为10，优选至少15，更优选至少16。本发明可采用的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ；以商品名D0WFAX 出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；含重复乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇， 特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-IOO,或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘8 和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85 (脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。可采用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚9和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性剂的优选用量(重量％ )为聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如吐温 80)0. 01-1%,特别是约0. 1 %；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通x-100或曲通系列的其它去污剂)0. 001-0. 1%，特别是0. 005-0. 02%;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%, 优选0. 1-10%，特别是0. 1-1%或约0.5%。优选基本上所有(例如至少90%数量)的油滴直径均小于1 μ m,例如，^ 750nm、 (500nm、彡 400nm、彡 300nm、彡 250nm、彡 220nm、彡 200nm 或更小。一种特别有用的乳液是角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。该乳液的体积组成可以是约5%角鲨烯、约0. 5%聚山梨酯80和约0. 5%司盘85。以重量计，这些比例变为4. 3%角鲨烯、0. 5%聚山梨酯80和0. 48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59，[2618]，参考文献四的第10章和参考文献30的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，例如IOmM柠檬酸钠缓冲液。C.皂苷制剂[参考文献23的第22章]皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、 根甚至花中发现的留醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的得自皂皮树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可商品化获自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM0 QS21以商标Mimulon 出售。已用HPLC和RP-HPLC法纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术专门纯化的组分， 包括037、0517、0518、0521、0!^、0!1-8和朋-(。优选的皂苷是QS21。制备QS21的方法参见参考文献31。皂苷制剂也可包含留醇，如胆固醇[32]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献23的第23章]。ISCOM通常也包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献 32-34进一步描述了 ISC0M。任选地，ISCOM可以不含其它洗涤剂[35]。关于开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献36和37。D.病毒体和病毒样颗粒病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可以用作本发明的佐剂。这些结构通常包含任选与磷脂组合或一起配制的一种或多种病毒蛋白。它们通常无致病性，不能复制，且通常不含任何天然的病毒基因组。可用重组方法产生或从全病毒分离得到所述病毒蛋白质。这些适合用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qi3 -噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty (例如反转录转座子Ty蛋白pi)的蛋白质。VLP在参考文献38-43中有进一步描述。病毒体在例如参考文献44中有进一步描述。E.细菌或微生物衍生物适合用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌的脂多糖(LPQ的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A (MPL)和3_0_脱酰基MPL (3dMPL)。3dMPL是 3脱-0-酰基单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-0-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献45中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以通过0. 22 μ m膜过滤除菌W5]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-5^ [46，47]。脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A衍生物，如0M-174。例如参考文献48和49 中描述了 0M-174。适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文或聚(dG)序列的双链 RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。CpG可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献50、51和52公开了可能的类似物取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献53-58中进一步讨论了 CpG寡核苷酸的佐剂作用。所述CpG序列可以导向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[59]。CpG序列可特异性诱导Thl免疫应答，如CpG-A 0DN，或更特异地诱导B细胞应答，如CpG-B ODN0参考文献 60-62 中讨论了 CpG-A 和 CpG-B ODN0 优选的 CpG 是 CpG-A 0DN。优选将CpG寡核苷酸构建成其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献59和63-65。基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂称为IC31 W6]。因此，本发明使用的佐剂可包含(i)和(ii)的混合物(i)含有至少一个(优选多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷相连形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少一个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚体序列5' -(1013-3' (SEQ ID NO 81)的脱氧核苷酸。所述聚阳离子聚合物可以是含有11-聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO :82)的肽。细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选所述蛋白衍生自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。参考文献67描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献68描述了将其用作肠胃外佐剂。所述毒素和类毒素优选包含A和B亚单位的全毒素形式。A亚单位优选含有脱毒突变；B亚单位优选不突变。优选的佐剂是脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和 LT-G192。参考文献69-76描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63 和LT-R72用作佐剂。有用的CT突变体是CT-E^H[77]。优选根据参考文献78中提出的 ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的比对，对氨基酸取代进行编号，特别通过引用将其全文纳入本文。F.人类免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人类免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-l、IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[79]等)[80]、干扰素(如干扰素-Y )、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。G.生物粘着剂和粘膜粘着剂生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化的透明质酸微球[81]或粘膜粘着剂，如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可以用作本发明的佐剂[82]。H.微粒微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径 IOOnm至 150μπι，更优选 200nm至 30 μ m,最优选 500nm至 10 μ m的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如聚 (α -羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚(丙交酯-共-乙交酯共聚物)，并任选经处理而含有带负电荷的表面(例如用SDS处理)或带正电荷的表面 (例如用阳离子去污剂处理，如CTAB)。I.脂质体(参考文献23的第13和14章)适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献83-85所述。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[86]。该类制剂还包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇[87]的组合，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[88]的组合。优选的聚氧乙烯醚选自以下聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。K.聚磷腈(PCPP) PCPP制剂参见例如参考文献89和90。L.胞壁酰肽适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞
12壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’ -2’ - 二棕榈酰-sn-甘油_3_羟基磷酰氧基)_乙胺MTP-PE)。M.咪唑并喹诺酮Gmidazoquinolone)化合物适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物 (例如，“雷西莫特3M” )，见参考文献91和92中的进一步描述。本发明也包括以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明(1)皂苷和水包油乳液[93] ； (2)皂苷(例如QS21) +无毒LPS衍生物(例如3dMPL) [94] ； (3)皂苷(例如QS21) +无毒LPS衍生物(如3dMPL) +胆固醇；⑷皂苷(例如QS21) +3dMPL+IL-12 (任选+固醇)[95] ； (5) 3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳液的组合[96] ； (6)SAF，含有10%角鲨烯、0.4%吐温80TM、5%普鲁罗尼克-嵌段聚合物L121和 thr-MDP，经微流体化形成亚微米乳液或经涡旋震荡产生粒度较大的乳液。(7)Ribi 佐剂系统(RAS) (Ribi免疫化学公司)，含有2%角鲨烯、0. 2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分有单磷酰脂质A (MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWQ，优选 MPL+CWS (Detox )；以及(8) —种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。用作免疫刺激剂的其它物质参见参考文献23的第7章。特别优选采用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂，抗原通常可吸附于这些铝盐。其它优选的佐剂组合包括Thl和Th2佐剂的组合，如CpG和明矾或雷西莫特和明矾的组合。可采用磷酸铝和3dMPL的组合。其它抗原组分本发明的组合物包含经修饰的fHPB序列。所述组合物不含复杂的或未明确的抗原混合物是有益的，例如，优选该组合物中不含外膜囊泡。本发明的多肽优选在异源宿主中重组表达然后纯化。除包含fHBP序列外，本发明的组合物还可包含一种或多种其它奈瑟球菌抗原，因为靶向每种细菌一种以上抗原的疫苗可以降低产生选择性逃逸突变体的可能性。因此，组合物可包含第二种多肽，当给予哺乳动物时可以引发对脑膜炎球菌的杀菌抗体应答。所述第二种多肽不是脑膜炎球菌fHBP，但可以是例如287序列、NadA序列、953序列、936序列等。包含在所述组合物中的抗原包括含有一个或多个以下序列的多肽(a)参考文献97公开的446个偶数SEQ ID (即2、4、6、……>890,892)序列；(b)参考文献98公开的45个偶数SEQ ID (即2、4、6、……、88、90)序列；(c)参考文献3公开的SEQ ID 2-3020的偶数序列、SEQ ID3040-3114的偶数序列和SEQID 3115-3241的所有序列，共1674个序列；(d)参考文献2公开的ΝΜΒ0001到NMB2160的2160个氨基酸序列；(e)任何亚型的脑膜炎球菌PorA蛋白，优选重组表达的蛋白；(f) (a)到(e)所述序列的变体、同源物、直向同源物、旁系同源物、突变体；或(g)脑膜炎奈瑟球菌的外膜囊泡制备物[例如见参考文献160]。除奈瑟球菌多肽抗原外，所述组合物可包含对其它疾病或感染的免疫用抗原。例如，所述组合物可包含一种或多种以下其它抗原-脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献99所述的血清群C糖抗原[也见参考文献100]或参考文献101所述的糖抗原。-肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的糖抗原[例如102，103，104]。-甲肝病毒如灭活病毒的抗原[例如105，106]。-乙肝病毒抗原，如表面和/或核心抗原[例如106，107]。-白喉抗原，如白喉类毒素[例如参考文献108的第3章]，例如CRM197突变体[例如 109]。-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如参考文献108的第4章]。-百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原 2和3组合[例如参考文献110和111]。-流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)B 的糖抗原[如 100]。-脊髓灰质炎病毒抗原[例如112，113]，如IPV。-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[例如参考文献108的第9、10和11章]。-流感抗原[例如参考文献108的第19章]，如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。-粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)抗原[例如 114]。-无乳链球菌(Sti^ptococcusagalactiae) (B型链球菌)的蛋白抗原[例如115， 116]。-无乳链球菌(B型链球菌)的糖抗原。-酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes) (Α 型链球菌)抗原[例如 116，117， 118]。-金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)抗原[例如 119]。所述组合物可包含一种或多种这些其它抗原。必要时，可使毒性蛋白质抗原脱毒(例如，通过化学和/或遗传方法使百日咳毒素脱毒[111])。在所述组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地， 在包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。糖抗原优选为偶联形式。下文中更详细地讨论了所述偶联物的载体蛋白。所述组合物中各抗原的浓度一般是至少1 μ g/ml。一般来说，任何给定抗原的浓度应足以引发针对该抗原的免疫应答。本发明的免疫原性组合物可用于治疗(即治疗已有的感染)或预防(即防止将来的感染)。作为在本发明免疫原性组合物中所用蛋白质抗原的替代方式，可采用编码该抗原的核酸(优选DNA，例如质粒形式的DNA)。在一些实施方式中，本发明的组合物除含fHBP序列外，还包含脑膜炎球菌血清群 A、C、W135和Y中的1、2、3或4组的偶联荚膜糖抗原。在其它实施方式中，本发明的组合物除含fHBP序列外，还包含至少一种偶联的肺炎球菌荚膜糖抗原。脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A
现有的血清群C 疫苗(Menjugate [120，99]，Meningitec 和 NeisVac-C )包含偶联糖。Men jugate 和Meningitec 含有与CRM197载体偶联的寡糖抗原，而NeisVac-C 采用与破伤风类毒素载体偶联的完整多糖(脱-0-乙酰化)。Menactra 疫苗含有血清群Y、 W135、C和A各自的偶联荚膜糖抗原。本发明的组合物可包含脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A中的一组或多组的荚膜糖抗原，其中所述抗原与载体蛋白和/或寡糖偶联。例如，所述组合物可包含血清群C ；血清群A和C ；血清群A、C和W135 ；血清群A、C和Y ；血清群C、W135和Y ；或所有四个血清群 A、C、W135和Y的荚膜糖抗原。每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的通常用量为1 μ g到20 μ g，例如，约1 μ g、约 2. 5yg、约4yg、约5yg或约10yg(以糖表示)。在混合物包含血清群A和C的荚膜糖时，MenA糖MenC糖的比例(w/w)可以大于1(例如，2 1、3 1、4 1、5 1、10 1或更高)。在混合物包含血清群Y与血清群 C和W135之一或两者的荚膜糖时，MenY糖MenW135糖的比例(w/w)可以大于1(例如， 2 1、3 1、4 1、5 UlO 1或更高)，和/或MenY糖MenC糖的比例(w/w)可以小于1(例如，1 2、1 3、1 4、1 5或更低)。血清群A C W135 Y糖的优选比例 (w/w)为1 1 1 1、1 1 1 2、2 1 1 1、4 2 1 1、8 4 2 1、 4 2 1 2、8 4 1 2、4 2 2 1、2 2 1 1、4 4 2 1、2 2 1 2、 4 4 1 2 和 2 2 2 1。血清群 C W135 Y 糖的优选比例(w/w)为1 1 1、 1 1 2、1 1 1、2 1 1、4 2 1、2 1 2、4 1 2、2 2 1和2 1 1。 优选采用质量基本相等的各种糖。可采用的荚膜糖是寡糖形式。通过使纯化荚膜多糖片段化(例如通过水解)可以方便地形成这些寡糖，片段化后通常要纯化所需大小的片段。优选进行多糖的片段化，使寡糖的平均聚合程度(DP)最终小于30个单糖(例如， 血清群A为10-20个，优选约10个；血清群W135和Y为15-25个，优选约15-20个；血清群 C为12-22之间等)。可用离子交换色谱或比色试验方便地测定DP[121]。如果进行水解，通常要对水解产物进行筛分，以去除短链寡糖[100]。可用各种方法，如超滤后离子交换色谱实现此目的。对血清群A而言，优选去除聚合程度小于或等于约 6个单糖的寡糖；对血清群W135和Y而言，优选去除聚合程度小于约4个单糖的寡糖。参考文献120描述了用于Men jugate 中的优选MenC糖抗原。所述糖抗原可以经化学修饰。这对降低血清群A(抗原)的水解特别有用[122， 见下文]。可以进行脑膜炎球菌糖的脱-ο-乙酰化。对寡糖的修饰可发生在解聚之前或之后。本发明的组合物包含MenA糖抗原时，优选所述抗原为天然糖上有一个或多个羟基被封闭基团取代的修饰糖[122]。这种修饰可以改善对水解的耐受性。共价偶联本发明组合物中的荚膜糖通常与载体蛋白偶联。通常，偶联可增强糖的免疫原性， 因为偶联可将糖从T-非依赖性抗原转变为T-依赖性抗原，因而可引发免疫记忆。偶联对儿科疫苗特别有用，是一项熟知的技术。典型的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素，或其类毒素或突变体。可采用CRM197白喉毒素突变体[123]，它是PREVNAR 产品中的载体。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白复合物[1 ]、合成肽[125,1 ]、热激蛋白[127,1 ]、百日咳蛋白[129，130]、细胞因子[131]、淋巴因子[131]、激素[131]、生长因子[131]、包含各种病原体衍生抗原的多个人CD4+T细胞表位的人造蛋白质[132]，如N19 [133]、流感嗜血杆菌蛋白D[134-136]、肺炎球菌溶血素[137]或其无毒衍生物[138]、肺炎球菌表面蛋白 PspA[139]、摄铁蛋白[140]、艰难梭菌(C. difficile)的毒素A或B[141]、重组铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)胞外蛋白 A(rEPA) [142]等。可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。一般在偶联前活化或官能化所述糖。活化可包括例如用氰化试剂，如CDAP(例如 1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶It [143、144等])。其它合适的技术采用碳二亚胺、 酰胼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU等。可用任何已知方法通过接头基团进行连接，例如参考文献145和146所述的方法。一种连接类型包括多糖的还原胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联到该己二酸接头基团的另一端[147，148]。其它接头包括B-丙酰胺基 [149]、硝基苯基-乙基胺[150]、卤代酰基卤化物[151]、糖苷键[152]、6_氨基己酸[153]、 ADH[154]、C4-C12部分[155]等。作为采用接头的替代方法，可采用直接连接。直接连接蛋白质可包括氧化多糖，然后与蛋白质还原胺化，例如参考文献156和157所述。优选包括以下步骤的方法将氨基引入到糖中(例如用-NH2取代末端=0基团)， 然后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生，再与载体蛋白反应。另一种优选的反应利用CDAP与蛋白D载体的活化，例如对MenA或MenC。外膜囊泡优选本发明组合物不含复杂的或未明确的抗原混合物，此为OMV的典型特征。然而，本发明可以与OMV联合使用，因为已发现fHBP能增强其功效W]，特别是通过在用于制备OMV的菌株中过表达本发明的多肽。通常用该方法来改善脑膜炎奈瑟球菌血清群B微囊泡[158]、“天然0MV” [159]、 小泡和外膜囊泡[例如参考文献160-165等]的制备。这些可从经遗传操作处理的细菌制备得到[166-169]，例如，以增加免疫原性(例如高表达免疫原)、降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调PorA表达等。这些可从高发泡菌株制备得到[170-173]。可包括非病原性奈瑟球菌的囊泡[174]。制备OMV可以不用洗涤剂[175，176]。它们可以在其表面表达非奈瑟球菌蛋白[177]。它们可以缺失LPS。它们可以与重组抗原混合[160，178]。可采用具有不同I类外膜蛋白亚型的细菌的囊泡，例如，采用两种不同的遗传工程改造的囊泡群，每种显示三种亚型的六种不同亚型；或采用三种不同的遗传工程改造的囊泡群，每种显示三种亚型的九种不同亚型等。有用的亚型包括=P 1. 7，16 ；P 1. 5-1，2-2 ；Pl. 19,15-1 ；Pl. 5-2,10 ； Pl. 12-1，13 ；Pl. 7-2,4 ；Pl. 22，14 ；Pl. 7-1,1 ；Pl. 18_1，3，6。更多的细节在下文中给出。蛋白质表达细菌表达技术是本领域已知的。细菌启动子是任何能够结合细菌RNA聚合酶并启动下游(3’ )编码序列(例如结构基因)转录为mRNA的DNA序列。启动子含有通常位于靠近编码序列5’末端处的转录起始区域。该转录起始区域通常包含RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可包含称为操纵基因的第二结构域，其可以与相邻的RNA 合成起始的RNA聚合酶结合位点重叠。所述操纵基因允许负调节(诱导性)转录，因为基因阻抑蛋白可结合操纵基因，从而抑制特定基因的转录。组成性表达可在缺乏负调节元件如操纵基因时发生。此外，正调节可以通过(如果存在)通常位于靠近(5’)RNA聚合酶结合序列的基因激活蛋白结合序列而实现。基因激活蛋白的一个例子是分解代谢物激活蛋白 (CAP)，它有助于启动大肠杆菌(E. coli)乳糖操纵子的转录[Raibaud等(1984) Armu. Rev. Genet. 18 :173]。因此，受调节的表达可以是正调节或负调节，从而增强或减弱转录。编码代谢途径酶的序列可以提供特别有用的启动子序列。例子包括衍生自糖代谢酶，如半乳糖、乳糖(lac) [Chang等(1977)Nature 198:1056]和麦芽糖代谢酶的启动子序列。其它例子包括衍生自生物合成酶，如色氨酸(trp)合成酶的启动子序列 [Goeddel 等(1980)Nuc. Acids Res. 8 4057 ；Yelverton 等(1981)Nucl. Acids Res. 9 731 ；美国专利 4，738，921 ；EP-A-0036776 和 EP-A-0121775]。β -内酰胺酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981) “干扰素的克隆和其它错误”(〃 The cloning of interferon and othermistakes.‘‘)干Ij于 Interferon 3 (I. Gresser 编)]、哩菌体 λ PL[Shimatake 等 (1981)Nature 292 128]和T5[美国专利4，689，406]启动子系统也提供了有用的启动子序列。另一个感兴趣的启动子是诱导型阿拉伯糖启动子(PBAD)。此外，自然界不存在的合成启动子也具有和细菌启动子一样的功能。例如，可将一种细菌或噬菌体启动子的转录激活序列与另一种细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接， 生成合成的杂合启动子[美国专利4，551，433]。例如，tac启动子是杂合trp-lac启动子， 包含trp启动子和受Iac阻抑蛋白调节的Iac操纵子序列二者[Amarm等(198;3)Gene 25 167 ；de Boer等(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. 80 21] 此外，细菌启动子可包括非细菌来源的天然产生的启动子，其具有结合细菌RNA聚合酶和启动转录的能力。也可将非细菌来源的天然产生的启动子与相容的RNA聚合酶偶联，以在原核生物中产生一些基因的高水平表达。噬菌体T7的RNA聚合酶/启动子系统是偶联启动子系统的一个例子[Studier等 (1986) J. Mol. Biol. 189 :113 ；Tabor 等(1985)Proc Natl. Acad. Sci. 82 :1074]。此外，杂合启动子也可以包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区域(EP-A-(^67851)。除功能性启动子序列外，有效的核糖体结合位点对原核生物表达外源基因也有用。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称为Siine-Dalgarno(SD)序列，包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长3-9个核苷酸的序列。认为所述 SD序列可通过SD序列与大肠杆菌16SrRNA 3’端之间的碱基配对，促进mRNA与核糖体结合Bteitz等(1979) “信使RNA中的遗传信号与核苷酸序列”("Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA.")干丨J 于 Biological Regulation and Development =Gene Expression (R. F. Goldberger编)]，为表达含弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[]。可将启动子序列直接与DNA分子连接，在这种情况下，N末端的第一个氨基酸永远是由起始密码子ATG编码的甲硫氨酸。如果需要，可通过与溴化氰体外培育或与细菌甲硫氨酸N末端肽酶体内或体外培育，将N末端的甲硫氨酸从蛋白质上切割下来。通常，细菌识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3’侧的调控区域，与启动子一起侧接编码序列。这些序列可指导mRNA的转录，翻译为DNA编码多肽。转录终止序列
17通常包含能够形成有助于终止转录的茎-环结构的约50个核苷酸的DNA序列。例子包括源自含强启动子的基因，如大肠杆菌的trp基因以及其它生物合成基因的转录终止序列。通常，以上描述的组分包含启动子、信号序列(如果需要)、感兴趣的编码序列和转录终止序列，一起组成表达构建物。表达构建物通常保持在复制子，如能够在宿主如细菌中稳定保持的染色体外元件(例如质粒)中。所述复制子含有复制系统，允许其保持在原核宿主中进行表达或克隆及扩增。此外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数质粒。高拷贝数质粒一般具有约5个到约200个，通常约10个到约150个拷贝数。包含高拷贝数质粒的宿主优选包含至少约10个质粒，更优选至少约20个质粒。根据载体和外源蛋白对宿主的作用，可以选择高拷贝数或低拷贝数载体。或者，可用整合载体将表达构建物整合入细菌基因组中。整合载体通常包含至少一条细菌染色体同源序列，从而允许该载体整合。整合看来是由该载体与细菌染色体同源 DNA之间的重组产生的。例如，将用各种杆菌菌株的DNA构建的整合载体整合入杆菌染色体中(EP-A-01273^)。整合载体也可以包含噬菌体或转座子序列。通常，染色体外表达和整合表达的构建物可包含选择性标记，以选择被转化的细菌菌株。选择性标记基因可以在细菌宿主中表达，可包括赋予细菌对药物，如氨苄青霉素、 氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环霉素等产生抗性的基因Navies等(1978) Annu. Rev. Microbiol. 32 :469]。选择性标记基因也可包括生物合成基因，如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成通路中的基因。或者，可以将一些上述组分一起连入转化载体中。转化载体所含的选择性标记基因通常保持在复制子中或构建入以上所述的整合载体中。已开发出用于转化许多细菌的表达和转化载体，或是染色体外复制子，或是整合载体。例如，已开发出用于以下细菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) [Palva等(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 :5582 ；EP-A-0036259 和 EP-A-0063953 ；W084/04541]、大肠杆菌[Shimatake 等(1981) Nature292 :128 ；Amann 等(1985) Gene 40 :183 ；Studier 等(1986) J. Mol. Biol. 189 :113 ；EP-A-0036776、EP-A-O 136 829 和 ΕΡ-Α-0 136 907]、乳脂链球菌 [Powell 等(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 :655]、变铅青链球菌[Powell 等(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 :655]、变铅青链霉菌[美国专利4，745，056]的表达载体。将外源DNA引入细菌宿主的方法是本领域熟知的，通常包括转化经CaCl2或其它试剂，如二价阳离子和DMSO处理过的细菌。也可通过电穿孔将DNA引入细菌细胞。转化步骤通常随被转化细菌的种类而不同。参见例如，[Masson等(1989)FEMS Microbiol. Lett. 60 273 ；Palva 等(1982)Proc. Natl. Acad. ki. USA 79 5582 ；EP-A-0036259 和 EP-A-0063953 ；W084/04541,杆菌属(Bacillus)]，[Miller 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 856 ；Wang ^ (1990)J. Bacteriol. 172 :949,弯曲杆菌属(Campylobacter)], [Cohen 等(1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69 :2110 ；Dower 等(1988) Nucleic Acids Res. 16 6127 ；Kushner (1978) “用ColEl衍生质粒转化大肠杆菌的改进方法”(〃 An improved method for transformation of Escherichia coli withColEl-derived plasmids.") 刊于 Genetic Engineering-Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering(H. W. Boyer 和 S. Nicosia 编)；Mandel 等(1970) J. Mol. Biol. 53 159 ； Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949 :318 ；埃希氏菌属(Escherichia)], [ Chassy φ(1987)FEMS Microbiol. Lett. 44 173 乳酸杆菌属(Lactobacillus)], [Fiedler 等(1988) Anal. Biocheml70 :38，假单胞菌属(Pseudomonas) ], [Augustin 等(1990) FEMS Microbiol. Lett. 66 :203，葡萄球菌属(Staphylococcus)], [Barany 等(1980) J. Bacteriol. 144 698 ； Harlander (1987) “通过电穿孔转化乳酸链球菌”(〃 Transformationof Streptococcus lactis by electroporation“),干丨J于Streptococcal Genetics(J. Ferretti 禾口 R. Curtiss III 编)；Perry 等(1981) Infect. Immun. 32 1295 ；Powell 等(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 655 ；Somkuti 等(1987)Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1 -A\2,WtM 属(Streptococcus)].宿主细胞本发明提供了一种表达本发明多肽的细菌。所述细菌可以是脑膜炎球菌。所述细菌可组成性表达所述多肽，但是在一些实施方式中，表达处于诱导型启动子调控下。所述细菌可以高表达所述多肽(参见参考文献181)。所述多肽的表达不是相可变的。本发明也提供了从本发明细菌制备的外膜囊泡。还提供从本发明细菌产生囊泡的方法。从这些菌株制备的囊泡优选包含本发明多肽，多肽在囊泡中应为免疫可及形式，即可以结合本发明纯化多肽的抗体也应能结合存在于囊泡中的多肽。这些外膜囊泡包括任何通过破坏脑膜炎球菌外膜或使之发泡形成包含外膜蛋白组分的囊泡，而获得的蛋白脂质体囊泡。因此该术语包括OMV (有时称为“小泡”)、微囊泡 (MV[182])和“天然 0MV" ( “N0MV，，[183]))。MV和NOMV是天然产生的膜囊泡，在细菌生长时自发形成，释放到培养基中。可通过以下方法获得MV:在肉汤培养基中培养奈瑟球菌，将全细胞与肉汤培养基中较小的MV分离(例如，通过过滤或低速离心，只沉淀细胞而不沉淀较小的囊泡)，然后收集细胞除尽培养基中的MV (例如，通过过滤、差速沉淀或MV聚集，高速离心沉淀MV)。一般可根据培养基中产生的MV量来选择用于生产MV的菌株，例如，参考文献184和185描述了 MV产量高的奈瑟球菌。人工制备细菌的0MV，可利用洗涤剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或非洗涤剂方法 (例如参见参考文献186)制备。形成OMV的技术包括用胆酸盐洗涤剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，优选用脱氧胆酸钠[187和188] 处理奈瑟球菌)在不会沉淀洗涤剂的足够高PH下[189]处理细菌。可实行的其它技术基本上不用洗涤剂[186]，而采用如超声、均化、微流化、空化、渗透压休克、研磨、法式压制、混合等技术。不用或采用低浓度洗涤剂的方法可以保留有用的抗原，如NspA[186]。因此一种方法可采用含有0. 5%或更低如约0. 2%、约0. 1%、< 0. 05%或O浓度的脱氧胆酸盐的 OMV提取缓冲液。参考文献190描述了一种制备OMV的有用方法，涉及超滤粗提OMV物，而非替代高速离心。该方法包括超滤后进行超离心步骤。可从任何脑膜炎球菌菌株制备本发明所用的囊泡。所述囊泡通常得自血清群B菌株，但也可从B以外的，如A、C、W135或Y血清群菌株制备(例如，参考文献189描述了血清群A的方法)。所述菌株可以属于任何血清型(例如，1、23、213、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(例如，Ll ；L2 ；L3 ；L3，3，7 ;L10等)。所述脑膜炎球菌可以来自任何合适的谱系，包括高侵袭性和超毒力谱系，例如以下7种超毒力谱系亚组I、亚组III、亚组IV-U ET-5复合物、ET-37复合物、A4簇、谱系3中的任何一种。除编码本发明多肽外，本发明的细菌可含有一个或多个进一步的修饰。例如，它们可以含有经修饰的fur基因[191]。参考文献199教导，随着porA和cps的敲除nspA的表达应上调，可利用这些修饰。参考文献199-201描述了用于生产OMV的脑膜炎奈瑟球菌进一步敲除突变株。参考文献192描述了经修饰能表达6种不同PorA亚型的菌株的囊泡构建。也可采用通过敲除参与LPS生物合成的酶所获得的内毒素水平低的奈瑟球菌突变株 [193，194]。这些或其它突变株均可用于本发明。因此在一些实施方式中本发明所用的菌株可以表达一种以上的PorA亚型。之前已构建了 6价和9价PorA菌株。所述菌株可表达PorA亚型=Pl. 7,16 ；Pl. 5-1,2-2 ；Pl. 19， 15-1 ；Pl. 5-2,10 ；Pl. 12-1,13 ；Pl. 7-2,4 ；P 1. 22,14 ；P 1.7_1，1 和 / 或 P 1. 18-1,3,6 ψ 的2、3、4、5、6、7、8或9种。在其它实施方式中，可以下调菌株中的PorA表达，例如，PorA 的表达量相对于野生型水平(例如相对于Η44/76菌株)减少了至少20% (例如，^ 30%, 彡40%、彡50%、彡60%、彡70%、彡80%、彡90%、彡95%等)，或甚至被敲除。在一些实施方式中，菌株可以高表达(相对于相应的野生型菌株)某些蛋白质。例如，菌株可以高表达NspA、蛋白287 [195]、fHBP[181] ,TbpA和/或TbpB [196]、铜、锌超氧化物歧化酶[196]、HmbR等。可将编码本发明多肽的基因整合入细菌染色体中，或以游离形式存在，例如在质粒中。对囊泡生产而言，宜对脑膜炎球菌进行遗传工程改造，以确保多肽的表达不会发生相变。参考文献197描述了减少或消除脑膜炎球菌基因表达相变的方法。例如，可将基因置于组成型或诱导型启动子的控制下，或去除或取代负责相变的DNA基序。在一些实施方式中，菌株可以包含一个或多个敲除和/或参考文献198-201描述的高表达突变。优选的下调和/或敲除基因包括(a) Cps、CtrA, CtrB, CtrC、CtrD, FrpB, GalE、HtrB/MsbB、LbpA, LbpB, LpxK、Opa, Opc、PilC、PorB, SiaA, SiaB, SiaC、SiaD, TbpA 和 / 或 TbpB [198] ； (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa, Opc、PhoP, PilC、PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC、SiaD, TbpA 和 / 或 TbpB[199] ； (c)ExbB、 ExbD> rmpM、CtrA> CtrB> CtrD、GalE、LbpA> LpbB> Opa> Opc、PilC、PorB> SiaA> SiaB> SiaC、 SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB [200]以及(d) CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、 SynA, SynB 和 / 或 SynC [201]。采用突变菌株时，在一些实施方式中，菌株可以具有一个或多个或所有以下特征 ⑴下调或敲除LgtB和/或(ialE以截短脑膜炎球菌的LOS ； (ii)上调TbpA ； (iii)上调 NhhA ； (iv)上调 0mp85 ； (ν)上调 LbpA ； (vi)上调 NspA ； (vii)敲除 PorA ； (viii)下调或敲除FrpB ； (ix)下调或敲除Opa ； (χ)下调或敲除Opc ； (xii) cps缺失基因复合体。截短的LOS 可以不包含唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，可以是半乳糖缺陷型L0S。所述LOS可以没有α链。根据用于制备囊泡的脑膜炎球菌菌株，它们可包含或不含该菌株的天然fHBP抗原[202]。如果LOS存在于囊泡中，可处理囊泡，使之连接其LOS和蛋白质组分(“内泡”偶联[201])。
概述术语“包括”包括“包含”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X 组成或可以包括其它物质，例如X+Y。与数值χ相关的术语“约”表示例如，x± 10%。术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含” Y的组合物可以完全不含Y。必要时，可以从本发明定义中删去术语“基本上”。优选用MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))执行 Smith-Waterman同源性检索算法，利用仿射缺口检索测定“序列相同性”，参数为缺口开放罚分=12，缺口延伸罚分=1。血清群之后，脑膜炎球菌的分类包括血清型、血清亚型和免疫型，标准命名法列单为血清群、血清型、血清亚型和免疫型，彼此之间由冒号隔开，例如B :4:P1. 15 :L3，7，9。在血清群B中，一些谱系常引起疾病(高侵袭性)，一些谱系引起比其它谱系更严重形式的疾病(超毒力)，其余的很少引起疾病。识别了 7个超毒力谱系，即亚组I、III*IV-l、ET-5 复合体、ET-7复合体、A4簇和谱系3。通过多基因座酶电泳(MLEE)对这些谱系进行了定义， 但也采用了多基因座序列分型(MLST)对脑膜炎球菌分类[参考文献19]。4种主要的超毒力簇是ST32、ST44、ST8和STll复合体。一般来说，本发明不包括参考文献4、5、7、8、9、10、11、12、13、14和203特定描述的各种fHBP序列本发明实施方式以野生型MC58序列(SEQ ID NO 1)作为基线，制备了 72个修饰fHBP序列。这些序列见序列表中SEQ ID NO 4-75所示。大肠杆菌表达的多肽含有N末端甲硫氨酸，紧接SEQ ID NO氨基酸序列。将所述多肽与完全弗氏佐剂、MF59或氢氧化铝佐剂结合，然后用于免疫小鼠。在对一组10个脑膜炎球菌菌株的杀菌试验中检测了小鼠抗血清。该组包括三个fHBP家族各自的菌株。也制备了野生型MC58多肽。表达和纯化的两种多肽是SEQ ID NO 79 ( "PATCH 9C”)禾口 80 ( "PATCH 10A”)，分别包含SEQ ID N0:20和23。所有的测试多肽都引发了显示对该组至少两个菌株(通常多个)有杀菌活性的血清(SBA效价彡128)，但是9C和IOA多肽值得注意，因为其血清显示对全组菌株组都有良好的杀菌活性，包括对M1239菌株也有效。9C和IOA的SBA效价如下
权利要求
1.一种多肽，其包含选自以下的氨基酸序列SEQ ID NO 20、23、76、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74 和 75。
2.如权利要求1所述的多肽，其包含氨基酸序列SEQID N0:20。
3.如权利要求2所述的多肽，其包含SEQID N0:79。
4.如权利要求1所述的多肽，其包含氨基酸序列SEQID N0:23。
5.如权利要求4所述的多肽，其包含SEQID N0:80。
6.如权利要求1所述的多肽，其包含氨基酸序列SEQID NO :76。
7.如权利要求6所述的多肽，其包含SEQID NO :77。
8.一种多肽，其包含以下氨基酸序列(i)与SEQ ID NO :76至少90%相同和/或(ii) 包含SEQ ID NO :76的第一片段和第二片段的氨基酸序列，其中所述第一片段包括SEQ ID NO 76的89-1M位氨基酸内的表位，所述第二片段包括SEQ ID NO 76的187-248位氨基酸内的表位。
9.编码如以上任一项权利要求所述多肽的核酸。
10.一种包含编码如权利要求1-8中任一项所述多肽的核酸的质粒。
11.一种用如权利要求10所述质粒转化的宿主细胞。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是脑膜炎球菌。
13.从权利要求12所述宿主细胞制备的膜囊泡，其特征在于，所述囊泡包含权利要求 1-8中任一项所述的多肽。
14.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的多肽或权利要求13所述的囊泡。
15.如权利要求14所述的组合物，包含佐剂。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述佐剂包含铝盐。
17.如权利要求14-16中任一项所述的组合物，还包含第二多肽，在给予哺乳动物时， 所述第二多肽引发对脑膜炎球菌具有杀菌作用的抗体应答，条件是所述第二多肽不是脑膜炎球菌fHBP。
18.如权利要求14-17中任一项所述的组合物，还包含脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、 W135和/或Y的偶联荚膜糖。
19.如权利要求14-18中任一项所述的组合物，还包含偶联的肺炎球菌荚膜糖。
20.一种引发哺乳动物抗体应答的方法，包括给予权利要求14-19中任一项所述的免疫原性组合物。
全文摘要
fHBP是脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的一种蛋白质。已知fHBP有三个家族。为增强fHBP蛋白引发家族间交叉反应性抗体的能力，对fHBP进行选择和工程改造，使其具有的序列在给予宿主动物后可引发广谱杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
文档编号A61K39/095GK102356089SQ200980110581
公开日2012年2月15日 申请日期2009年2月20日 优先权日2008年2月21日
发明者M·M·朱利亚尼, M·斯卡塞利, M·皮扎, M·阿科, R·拉普奥里 申请人:诺华有限公司
技术领域：
本发明属于免疫领域，具体地说，属于对奈瑟球菌属致病菌，如脑膜炎奈瑟球菌 (N. meningitidis)所导致疾病的免疫。
背景技术：
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰阴性荚膜菌，其寄居于约 10%人群的上呼吸道中。虽然已有针对血清群(serogroupM、C、W135和Y的多糖和偶联疫苗，但是该方法不能用于血清群B，因为其荚膜多糖多聚唾液酸聚合物是人类的一种自身抗原。为了开发针对血清群B的疫苗，业已采用了其外膜囊泡(OMV)中所含的表面暴露蛋白质。这些疫苗可以引发血清杀菌抗体应答并保护机体抵抗疾病，但不能诱导菌株间交叉保护力[1]。于是一些研究者将注意力集中到脑膜炎球菌特异性抗原在疫苗中的用途[2]。 一种这样的抗原是脑膜炎球菌H因子结合蛋白(fHBP)，也称为“741”蛋白[参考文献3中的 SEQ ID 25；35 和 2536，本文中的 SEQ IDl]，“NMB1870”、“GNA1870”[参考文献 2 之后的参考文献4-6]，“P2086”、“LP2086”或“0RF2086” [7-9]。该脂蛋白在所有的脑膜炎球菌血清群中均有表达，已发现其存在于多种脑膜炎球菌菌株中。fHBP序列可分为三个家族[4](本文中称为家族I、II和III)，已发现抗某给定家族的血清对同一家族菌株具有杀菌作用，但对表达其它两个家族之一的菌株无活性，即在家族内有交叉保护作用，而家族间无交叉保护作用。因此，为了用fHBP来获得菌株间交叉保护作用，采用了一个以上的家族。为了避免表达和纯化各自蛋白质的需要，已提议将不同的家族蛋白质表达为杂合蛋白质[10-12]， 将两个或三个家族包括在单个多肽链中。参考文献13和14描述了多种基于突变修饰fHBP 序列的方法，以增强其对家族I、II和III之间的覆盖度。本发明的目的之一是为克服fHBP所赋予保护作用的家族特异性提供进一步的改进方法，以及用这些方法提供对脑膜炎球菌疾病和/或感染，特别是对血清群B的免疫力。
发明内容
菌株MC58的全长fHBP具有以下氨基酸序列(SEQ ID N0:1)MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ成熟的该脂蛋白缺少SEQ ID NO 1的前19个氨基酸，fHBP的AG形式缺少前沈
个氨基酸。MC58序列(SEQ ID NO 1)属于fHBP家族I。采用MC58序列引发的抗体对MC58 菌株有高杀菌活性，但对表达家族II或III fHBP菌株的活性则低得多。在一些实施方式中，本发明涉及fHBP的修饰形式，其中的修饰作用增强了该蛋白引发家族间交叉杀菌抗体的能力。在其它实施方式中，本发明涉及能天然引发家族间交叉杀菌抗体的fHBP形式。因此本发明提供了一种多肽，其包含一段选自以下SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77的氨基酸序列。这些氨基酸序列起始于与MC58序列Val27匹配的残基，但在下游位点包含各种氨基酸修饰。两个优选的序列是SEQ ID NO 20和23。也优选SEQ ID NO :76。所述多肽给予宿主动物后具有诱导杀菌性抗脑膜炎球菌抗体的能力，在优选的实施方式中，可以诱导对fHBP I-III三个家族各自菌株的杀菌性抗体。关于杀菌应答的其它信息在下文中给出。本发明也提供了一种多肽，包含一段与SEQ ID NO :76具有至少相同性的氨基酸序列。k 值可选自 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或更高。本发明也提供了一种多肽，包含含有SEQ ID NO :76的第一片段和第二片段的氨基酸序列，其中所述第一片段包括SEQ ID N0:76第89-1M位氨基酸形成的一个表位，所述第二片段包括SEQ ID NO :76第187-248位氨基酸形成的一个表位。通常该第一和第二片段独立地长至少 7 个氨基酸，例如，8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、沘、30、32、24、洸、28、
40、45、50、55、60个氨基酸或更多。本发明也提供了一种多肽，包含以下氨基酸序列(i)与SEQ ID N0:76具有至少相同性和(ii)包含所述SEQ ID NO :76的第一和第二片段。本发明还提供了一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:取代可发生在SEQ ID NO 2相应位置的氨基酸。所述多肽可以引发能与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 二者结合的抗体。本发明还提供了一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:取代可以发生在SEQ ID NO :2相应位置的氨基酸。所述多肽可引发能与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 二者结合的抗体。本发明还提供了一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO:取代可发生在SEQ ID NO 2相应位置的氨基酸。所述多肽可引发能与SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2 二者结合的抗体。多月太可以通过各种方法制备本发明的多肽，例如，(至少部分)化学合成、用蛋白酶消化较长多肽、翻译RNA、纯化细胞培养物(例如，重组表达或脑膜炎奈瑟球菌培养物)等。在大肠杆菌(宿主中异源表达是一种优选的表达途径。fHBP是脑膜炎奈瑟球菌的天然脂蛋白。已发现其在大肠杆菌中表达时被脂化并带有天然的前导序列。本发明的多肽可含有可被脂化的N末端半胱氨酸残基，例如，可含棕榈酰基团，通常会形成三棕榈酰-S-甘油-半胱氨酸。在其它实施方式中，所述多肽不被脂化。本发明优选多肽的一个特征是给予宿主动物后具有诱导杀菌性抗脑膜炎球菌抗体的能力。制备的多肽优选为基本纯或基本分离的形式(即基本上不含奈瑟球菌或宿主细胞的其它多肽)或基本分离的形式。一般来说，在非天然产生环境中提供所述多肽，例如，将其与天然产生的环境分离。在某些实施方式中，与对照相比本发明多肽存在于富含所述多肽的组合物中。如此提供纯化多肽，其中纯化指所述多肽存在于基本上不含其它表达多肽的组合物中，基本上不含指组成所述组合物的其它表达多肽少于90%、通常少于60%、 更通常少于50%。多肽可有各种形式(例如，天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、二硫桥等)。SEQ ID NO 4_76不包括N末端甲硫氨酸。如果通过在宿主生物中翻译产生本发明的多肽，需要起始密码子，在大多数宿主中需提供N末端甲硫氨酸。因此本发明多肽至少在新生阶段包含位于所述SEQ ID NO序列上游的甲硫氨酸残基。在一些实施方式中，所述多肽在N末端具有单个甲硫氨酸，其后紧接着所述SEQ ID NO序列；在其它实施方式中，可采用更长的上游序列。这种上游序列可以较短(例如，40 个或更少，即 39、38、37、36、；35、34、33、32、31、30、四、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。例子包括指导蛋白质运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标签，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、 8、9、10或更多)。其它合适的N-末端氨基酸序列是本领域技术人员显而易见的。本发明的多肽也可以包括位于所述SEQ ID NO序列最末氨基酸下游的氨基酸。这种C末端延伸段可以较短(例如，40个或更少，即39、38、37、36、35、；34、33、32、31、30、29、 28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 个氨基酸)。例子包括指导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(如包含组氨酸标签，即Hisn，其中η = 3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或能提高蛋白质稳定性的序列。其它合适的C末端氨基酸序列是本领域技术人员显而易见的。术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性或支链聚合物， 可以包含经修饰的氨基酸，可以被非氨基酸阻断。该术语也包括天然或人工介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记组分偶联的氨基酸聚合物。该定义还包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。产生的多肽可以是单链或缔合链。可将本发明的多肽连接于或固定于固体支持物。本发明的多肽可包含可检测标记，例如，放射性标记、荧光标记或生物素标记)。这在免疫测定技术中特别有用。如参考文献13所述，fHBP可以被分割为三个结构域，称为A、B和C。以SEQ ID NO 1 为例，所述三个结构域为(A) 1-119、(B) 120-183 和(C) 184-274。MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ结构域“A”的成熟形式从N末端的Cys-20起到Lys-119，称为“A成熟”。已知多个fHBP序列，不难用标准方法进行比对。通过这样的比对，技术人员可以 (a)与MC58序列的坐标比较来识别任何给定fHBP序列中的结构域“A” (和Aj5ia)、“B”和
5“C”，和(b)识别多个fHBP序列中的单个残基，例如，识别是否被取代。然而，为方便参考， 所述结构域定义如下-某给定fHBP序列的结构域“A”是采用逐对比对算法与SEQID N0:1进行比对时，以与SEQ ID NO 1的Met-I比对的氨基酸开始且以与SEQ IDNO 1的Lys-119比对的氨基酸结束的该序列片段。-某给定fHBP序列的结构域"Ajtss”是采用逐对比对算法与SEQIDNO 1进行比对时，以与SEQ ID NO 1的Cys-20比对的氨基酸开始且以与SEQ ID NO 1的Lys-119比对的氨基酸结束的该序列片段。-某给定fHBP序列的结构域“B”是采用逐对比对算法与SEQID N0:1进行比对时，以与SEQ ID NO 1的Gln-120比对的氨基酸开始且以与SEQID NO 1的Gly-183比对的氨基酸结束的该序列片段。-某给定fHBP序列的结构域“C”是采用逐对比对算法与SEQID N0:1进行比对时，以与SEQ ID NO 1的Lys-184比对的氨基酸开始且以与SEQID NO 1的Gln-274比对的氨基酸结束的该序列片段。定义所述结构域的优选逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[15]， 采用默认参数(例如，缺口开放罚分=10. 0，缺口延伸罚分=0. 5，采用EBL0SUM62评分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具可方便地执行这种算法[16]。在一些实施方式中，本发明多肽被截短以去除其结构域A，即将结构域A从SEQ ID 中删除。在一些实施方式中，多肽包含以上所述的氨基酸序列，除了最多有10个N末端氨基酸(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)和/或最多有10个C末端氨基酸(即1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10)缺失外。因此本发明提供了一种多肽，包含含有选自以下氨基酸序列片段SEQID NO 4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76 和 77 的氨基酸序列，其中所述片段是所述SEQ ID的氨基酸a-b，其中a是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，b是j、 j-1、j-2、j-3、j-4、j-5、j-6、j-7、j-8、j-9 或 j-10, j 是所述 SEQ ID 的长度。也可采用更长的截短(例如，最多15个氨基酸，最多20个氨基酸等)。核酸本发明提供了编码上文所定义的本发明多肽的核酸。可采用多种方式制备本发明的核酸，例如，完全或部分化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成)、用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(例如采用连接酶或聚合酶)、从基因组或cDNA文库制备等。本发明的核酸可采取各种形式，例如，单链、双链、载体、引物、探针、标记、未标记寸。本发明的核酸优选为分离的或基本分离的形式。术语“核酸”包括DNA和RNA，还有其类似物，如含有修饰主链的类似物，以及肽核酸(PNA)等。
本发明的核酸可以被标记，例如，用放射性或荧光标记。本发明还提供了包含本发明核苷酸序列的载体(如质粒)(例如克隆或表达载体， 如适合核酸免疫的载体)和用这样的载体转化的宿主细胞。杀菌应答本发明的优选多肽可引发对脑膜炎球菌的杀菌抗体应答。可以方便地测定小鼠的杀菌抗体应答，作为疫苗功效的标准指标[例如，见参考文献2的尾注14]。本发明的多肽可优选引发对以下三组菌株至少两组各自至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌抗体应答(I)MC58, gbl85( = M01-240185)， m4030, m2197, m2937, isslOOl, NZ394/98, 67/00,93/114，bzl98, ml390, nge28, lnpl7592，00-241341，f6124, 205900, ml98/172, bzl33, gbl49( = M01-240149)， nm008, nm092，30/00，39/99，72/00，95330， bzl69, bz83, cu385, h44/76, ml590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89,14847。(11)961-5945,2996,96217,312294,11327, a22, gb013( = M01-240013)， e32, ml090, m4287,860800, 599,95N477,90-18311, cll,m986,m2671,1000，ml096，m3279，bz232， dk353, m3697, ngh38, L93/4286。(III)M1239,16889，gb355 ( = M01-240355)，m3369, m3813, ngpl65。例如，多肽可以引发对血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58、961-5945和M1239中的两种或三种菌株的有效杀菌应答。所述多肽可优选引发对至少50% (例如，60%、70%、80%、90%、95%或更多)的临床相关脑膜炎球菌血清群B菌株的杀菌抗体应答。所述多肽可引发对血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株和血清群A、C、W135和Y中的至少一种菌株的杀菌抗体应答。所述多肽可引发对淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)和灰色奈瑟球菌(N. cinerea)菌株的杀菌抗体应答。所述多肽可引发对参考文献4图5所示系统树的三条主分枝中至少两条分枝菌株的杀菌应答。所述多肽可引发对超毒力谱系ET-37、ET_5、A4簇、谱系3、亚组I、亚组III和亚组 IV-I中至少2(例如，2、3、4、5、6、7)种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌抗体应答[17，18]。多肽还可诱导对一种或多种高侵袭性谱系的杀菌抗体应答。多肽可引发对以下多基因座序列类型=STU ST4、ST5、ST8、STlU ST32和ST41中至少2(例如，2、3、4、5、6、7)种的脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌抗体应答[19]。所述多肽还可引发对ST44菌株的杀菌抗体应答。所述多肽不需要诱导对指定谱系或MLST中各个和每个MenB菌株的杀菌抗体；相反，对某特定超毒力谱系或MLST中血清群B脑膜炎球菌多个菌株的四个的任何给定群而言，所述组合物诱导的抗体优选对所述组的至少50 % (例如，60 %、70 %、80 %、90 %或更多)具有杀菌作用。优选的菌株组包括从至少四个以下国家英国(GB)、澳大利亚(AU)、 加拿大(CA)、挪威(N0)、意大利(IT)、美国(US)、新西兰(NZ)、荷兰(NL)、巴西(BR)和古巴 (CU)分离的菌株。所述血清的杀菌效价优选为至少1024 (例如，21(1、2"、212、213、214、215、216、 217、218或更高，优选至少214)，即所述血清在1 10M稀释后能杀死某特定菌株的至少50% 测试细菌，如参考文献2的尾注14所述。优选的嵌合多肽可在小鼠中引发抗体应答，甚至在血清1 4096稀释或更稀时仍保持杀菌性。免疫接种
7
本发明的多肽可用作免疫原性组合物的活性成分，所以本发明提供了包含本发明多肽的免疫原性组合物。本发明也提供了一种在哺乳动物中产生抗体应答的方法，包含将本发明的免疫原性组合物给予哺乳动物。所述抗体应答优选为保护性和/或杀菌性抗体应答。本发明也提供了本发明多肽在这类方法中的应用。本发明还提供了一种保护哺乳动物免受奈瑟球菌(例如脑膜炎球菌)感染的方法，包含给予哺乳动物本发明的免疫原性组合物。本发明提供了本发明多肽作为药物(例如，免疫原性组合物或疫苗)或诊断试剂的用途。本发明还提供了本发明的核酸、多肽或抗体制备预防奈瑟球菌(例如脑膜炎球菌) 感染哺乳动物的药物的用途。所述哺乳动物优选人。所述人可以是成人，或优选儿童。在疫苗用于预防用途时， 所述人优选儿童(例如，幼童或婴儿)；在疫苗用于治疗用途时，所述人优选成人。用于儿童的疫苗也可以给予成人，例如，以评估其安全性、剂量、免疫原性等。所述用途和方法特别适用于预防/治疗疾病，包括但不限于脑膜炎(特别是细菌性脑膜炎，如脑膜炎球菌性脑膜炎)和菌血症。治疗性处理的功效可以通过监测给予本发明组合物后的奈瑟球菌感染来测试。预防性处理的功效可以通过监测给予所述组合物后对fHBP的免疫应答来测试。本发明组合物的免疫原性的测定可通过给予受试对象(例如，12-16月龄儿童，或动物模型[20])，然后测定标准参数，包括血清杀菌抗体(SBA)和ELISA效价(GMT)来进行。通常在给予所述组合物后约4周时测定这些免疫反应，并与给予所述组合物之前测得的值作比较。优选SBA 增高至少4倍或8倍。给予一个以上剂量的组合物时，可以进行一次以上的给药后测定。本发明的优选组合物赋予患者的抗体效价优于可接受百分比的人对象对各抗原组分血清保护力的标准。众所周知抗原的抗体效价高于相关抗体效价，就认为宿主对所述抗原已发生了血清转化，这种效价已由如WHO组织公布。优选高于80%，更优选高于90%， 还要优选高于93%，最优选96-100%的具有统计学显著性的对象样品发生血清转化。通常直接给予患者本发明的组合物。可经肠胃外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内注射或注射到组织间隙)，或经直肠、口服、阴道、外用、透皮、鼻内、经眼、经耳、经肺或其它粘膜给药完成直接递送。优选在大腿或上臂进行肌肉内给药。可通过针头(例如皮下针头)注射，但也可以采用无针注射。通常肌肉内的剂量为约0.5ml。可用本发明来引发全身和/或粘膜免疫。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案后可进行加强剂量方案。可常规确定初次剂量之间(例如 4-16周)以及初次与加强剂量之间的适当时机。本发明的免疫原性组合物通常会包括药学上可接受的运载体，其可以是本身不会诱导产生对接受所述组合物的患者有害抗体的任何物质，且给予后无不当毒性。药学上可接受的运载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质，如湿润剂或乳化剂、PH缓冲物质等也可存在于这种运载体中。关于合适载运体的充分讨论见参考文献21。奈瑟球菌感染影响到机体的多个区域，因此可将本发明的组合物制备成各种剂型。例如，可将所述组合物制备成液体溶液或悬浮液等可注射剂型。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体运载体的固体剂型。可将所述组合物制备成外用给药剂型，例如，油膏、 乳膏或粉末。可将所述组合物制备成口服剂型，例如，片剂或胶囊，或糖浆(任选调味)。可将所述组合物制备成肺部给药剂型，如采用细粉或喷雾的吸入剂。可将所述组合物制备成栓剂或阴道栓。可将所述组合物制成经鼻、经耳或经眼给药的剂型，例如滴剂。所述组合物优选无菌。优选无热原。优选用缓冲液处理使其处于例如PH 6到pH 8之间，通常为约pH 7。在组合物包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[22]。本发明的组合物可与人体等张力。免疫原性组合物包含免疫有效量的免疫原，以及任何其它所需的其它特定组分。 “免疫有效量”指一次剂量或作为一系列剂量的一部分，给予个体的对治疗或预防有效的量。该用量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组别(例如，非人灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而不同。预计该用量位于通过常规试验测定的相对较宽范围内。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(例如，包括加强剂量)。所述组合物可与其它免疫调节剂联合给药。可用于本发明组合物中的佐剂包括但不限于A.含矿物质组合物本发明中适合用作佐剂的含矿物质组合物包括无机盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括无机盐，如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如见参考文献23的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物，其可为任何合适的形式(例如，凝胶、晶体、无定形等)，优选具有吸附性。也可将含矿物质的组合物制成金属盐颗粒[24]。一种有用的磷酸铝佐剂是无定形羟基磷酸铝，PO4Al摩尔比为0. 84-0. 92，包含0. 6mg AI3Vml0B.油乳液适合用作本发明佐剂的油乳液组合物包含水包角鲨烯乳液，如MF59 [参考文献23 第10章；也见参考文献25] (5%角鲨烯、0.5%吐温80和0. 5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可采用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。有用的水包油乳液通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。所述乳液的油滴直径通常小于1 μ m，用微流化床实现这种小尺寸以提供稳定的乳液。优选小于220nm的液滴，因为其可过滤除菌。所述乳液可包含如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见可得的花生油、大豆油、 椰子油和橄榄油是坚果油的代表例子。可采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最易于得到的是玉米油，但也可采用其它谷类，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草(teff)、黑小麦(triticale)等的油。尽管甘油和1，2_丙二醇的6-10碳脂肪酸酯不是天然产生的种籽油，但也可以从坚果和种籽油开始，通过对合适原料的水解、分离和酯化而制备。哺乳动物奶中的脂肪和油可代谢，因此可用于实施本发明。由动物来源获得纯化油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的步骤是本领域熟知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和如鲸蜡的鲸油是可用于本发明的几种鱼油的代表例子。许多支链油可通过生化方法以5-碳异戊二烯单元合成，通常称为萜类化合物。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物2，6，10，15，19，23-六甲基-2,6,10，14，18，22- 二十四碳六烯，为本文特别优选。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。鱼油，包括角鲨烯和角鲨烷，易于从商业来源获得，或可用本领域已知的方法获得。其它优选油是生育酚(见下文)。可采用油的混合物。可通过其“HLB” (亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类。本发明优选表面活性剂的HLB至少为10，优选至少15，更优选至少16。本发明可采用的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ；以商品名D0WFAX 出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；含重复乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇， 特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-IOO,或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘8 和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85 (脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。可采用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚9和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性剂的优选用量(重量％ )为聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如吐温 80)0. 01-1%,特别是约0. 1 %；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通x-100或曲通系列的其它去污剂)0. 001-0. 1%，特别是0. 005-0. 02%;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%, 优选0. 1-10%，特别是0. 1-1%或约0.5%。优选基本上所有(例如至少90%数量)的油滴直径均小于1 μ m,例如，^ 750nm、 (500nm、彡 400nm、彡 300nm、彡 250nm、彡 220nm、彡 200nm 或更小。一种特别有用的乳液是角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。该乳液的体积组成可以是约5%角鲨烯、约0. 5%聚山梨酯80和约0. 5%司盘85。以重量计，这些比例变为4. 3%角鲨烯、0. 5%聚山梨酯80和0. 48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59，[2618]，参考文献四的第10章和参考文献30的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，例如IOmM柠檬酸钠缓冲液。C.皂苷制剂[参考文献23的第22章]皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、 根甚至花中发现的留醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的得自皂皮树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可商品化获自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM0 QS21以商标Mimulon 出售。已用HPLC和RP-HPLC法纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术专门纯化的组分， 包括037、0517、0518、0521、0!^、0!1-8和朋-(。优选的皂苷是QS21。制备QS21的方法参见参考文献31。皂苷制剂也可包含留醇，如胆固醇[32]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献23的第23章]。ISCOM通常也包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献 32-34进一步描述了 ISC0M。任选地，ISCOM可以不含其它洗涤剂[35]。关于开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献36和37。D.病毒体和病毒样颗粒病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可以用作本发明的佐剂。这些结构通常包含任选与磷脂组合或一起配制的一种或多种病毒蛋白。它们通常无致病性，不能复制，且通常不含任何天然的病毒基因组。可用重组方法产生或从全病毒分离得到所述病毒蛋白质。这些适合用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qi3 -噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty (例如反转录转座子Ty蛋白pi)的蛋白质。VLP在参考文献38-43中有进一步描述。病毒体在例如参考文献44中有进一步描述。E.细菌或微生物衍生物适合用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌的脂多糖(LPQ的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A (MPL)和3_0_脱酰基MPL (3dMPL)。3dMPL是 3脱-0-酰基单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-0-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献45中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以通过0. 22 μ m膜过滤除菌W5]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-5^ [46，47]。脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A衍生物，如0M-174。例如参考文献48和49 中描述了 0M-174。适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文或聚(dG)序列的双链 RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。CpG可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献50、51和52公开了可能的类似物取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献53-58中进一步讨论了 CpG寡核苷酸的佐剂作用。所述CpG序列可以导向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[59]。CpG序列可特异性诱导Thl免疫应答，如CpG-A 0DN，或更特异地诱导B细胞应答，如CpG-B ODN0参考文献 60-62 中讨论了 CpG-A 和 CpG-B ODN0 优选的 CpG 是 CpG-A 0DN。优选将CpG寡核苷酸构建成其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献59和63-65。基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂称为IC31 W6]。因此，本发明使用的佐剂可包含(i)和(ii)的混合物(i)含有至少一个(优选多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷相连形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少一个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚体序列5' -(1013-3' (SEQ ID NO 81)的脱氧核苷酸。所述聚阳离子聚合物可以是含有11-聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO :82)的肽。细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选所述蛋白衍生自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。参考文献67描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献68描述了将其用作肠胃外佐剂。所述毒素和类毒素优选包含A和B亚单位的全毒素形式。A亚单位优选含有脱毒突变；B亚单位优选不突变。优选的佐剂是脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和 LT-G192。参考文献69-76描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63 和LT-R72用作佐剂。有用的CT突变体是CT-E^H[77]。优选根据参考文献78中提出的 ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的比对，对氨基酸取代进行编号，特别通过引用将其全文纳入本文。F.人类免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人类免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-l、IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[79]等)[80]、干扰素(如干扰素-Y )、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。G.生物粘着剂和粘膜粘着剂生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化的透明质酸微球[81]或粘膜粘着剂，如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可以用作本发明的佐剂[82]。H.微粒微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径 IOOnm至 150μπι，更优选 200nm至 30 μ m,最优选 500nm至 10 μ m的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如聚 (α -羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚(丙交酯-共-乙交酯共聚物)，并任选经处理而含有带负电荷的表面(例如用SDS处理)或带正电荷的表面 (例如用阳离子去污剂处理，如CTAB)。I.脂质体(参考文献23的第13和14章)适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献83-85所述。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[86]。该类制剂还包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇[87]的组合，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[88]的组合。优选的聚氧乙烯醚选自以下聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。K.聚磷腈(PCPP) PCPP制剂参见例如参考文献89和90。L.胞壁酰肽适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞
12壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’ -2’ - 二棕榈酰-sn-甘油_3_羟基磷酰氧基)_乙胺MTP-PE)。M.咪唑并喹诺酮Gmidazoquinolone)化合物适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物 (例如，“雷西莫特3M” )，见参考文献91和92中的进一步描述。本发明也包括以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明(1)皂苷和水包油乳液[93] ； (2)皂苷(例如QS21) +无毒LPS衍生物(例如3dMPL) [94] ； (3)皂苷(例如QS21) +无毒LPS衍生物(如3dMPL) +胆固醇；⑷皂苷(例如QS21) +3dMPL+IL-12 (任选+固醇)[95] ； (5) 3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳液的组合[96] ； (6)SAF，含有10%角鲨烯、0.4%吐温80TM、5%普鲁罗尼克-嵌段聚合物L121和 thr-MDP，经微流体化形成亚微米乳液或经涡旋震荡产生粒度较大的乳液。(7)Ribi 佐剂系统(RAS) (Ribi免疫化学公司)，含有2%角鲨烯、0. 2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分有单磷酰脂质A (MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWQ，优选 MPL+CWS (Detox )；以及(8) —种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。用作免疫刺激剂的其它物质参见参考文献23的第7章。特别优选采用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂，抗原通常可吸附于这些铝盐。其它优选的佐剂组合包括Thl和Th2佐剂的组合，如CpG和明矾或雷西莫特和明矾的组合。可采用磷酸铝和3dMPL的组合。其它抗原组分本发明的组合物包含经修饰的fHPB序列。所述组合物不含复杂的或未明确的抗原混合物是有益的，例如，优选该组合物中不含外膜囊泡。本发明的多肽优选在异源宿主中重组表达然后纯化。除包含fHBP序列外，本发明的组合物还可包含一种或多种其它奈瑟球菌抗原，因为靶向每种细菌一种以上抗原的疫苗可以降低产生选择性逃逸突变体的可能性。因此，组合物可包含第二种多肽，当给予哺乳动物时可以引发对脑膜炎球菌的杀菌抗体应答。所述第二种多肽不是脑膜炎球菌fHBP，但可以是例如287序列、NadA序列、953序列、936序列等。包含在所述组合物中的抗原包括含有一个或多个以下序列的多肽(a)参考文献97公开的446个偶数SEQ ID (即2、4、6、……>890,892)序列；(b)参考文献98公开的45个偶数SEQ ID (即2、4、6、……、88、90)序列；(c)参考文献3公开的SEQ ID 2-3020的偶数序列、SEQ ID3040-3114的偶数序列和SEQID 3115-3241的所有序列，共1674个序列；(d)参考文献2公开的ΝΜΒ0001到NMB2160的2160个氨基酸序列；(e)任何亚型的脑膜炎球菌PorA蛋白，优选重组表达的蛋白；(f) (a)到(e)所述序列的变体、同源物、直向同源物、旁系同源物、突变体；或(g)脑膜炎奈瑟球菌的外膜囊泡制备物[例如见参考文献160]。除奈瑟球菌多肽抗原外，所述组合物可包含对其它疾病或感染的免疫用抗原。例如，所述组合物可包含一种或多种以下其它抗原-脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献99所述的血清群C糖抗原[也见参考文献100]或参考文献101所述的糖抗原。-肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的糖抗原[例如102，103，104]。-甲肝病毒如灭活病毒的抗原[例如105，106]。-乙肝病毒抗原，如表面和/或核心抗原[例如106，107]。-白喉抗原，如白喉类毒素[例如参考文献108的第3章]，例如CRM197突变体[例如 109]。-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如参考文献108的第4章]。-百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原 2和3组合[例如参考文献110和111]。-流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)B 的糖抗原[如 100]。-脊髓灰质炎病毒抗原[例如112，113]，如IPV。-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[例如参考文献108的第9、10和11章]。-流感抗原[例如参考文献108的第19章]，如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。-粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)抗原[例如 114]。-无乳链球菌(Sti^ptococcusagalactiae) (B型链球菌)的蛋白抗原[例如115， 116]。-无乳链球菌(B型链球菌)的糖抗原。-酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes) (Α 型链球菌)抗原[例如 116，117， 118]。-金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)抗原[例如 119]。所述组合物可包含一种或多种这些其它抗原。必要时，可使毒性蛋白质抗原脱毒(例如，通过化学和/或遗传方法使百日咳毒素脱毒[111])。在所述组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地， 在包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。糖抗原优选为偶联形式。下文中更详细地讨论了所述偶联物的载体蛋白。所述组合物中各抗原的浓度一般是至少1 μ g/ml。一般来说，任何给定抗原的浓度应足以引发针对该抗原的免疫应答。本发明的免疫原性组合物可用于治疗(即治疗已有的感染)或预防(即防止将来的感染)。作为在本发明免疫原性组合物中所用蛋白质抗原的替代方式，可采用编码该抗原的核酸(优选DNA，例如质粒形式的DNA)。在一些实施方式中，本发明的组合物除含fHBP序列外，还包含脑膜炎球菌血清群 A、C、W135和Y中的1、2、3或4组的偶联荚膜糖抗原。在其它实施方式中，本发明的组合物除含fHBP序列外，还包含至少一种偶联的肺炎球菌荚膜糖抗原。脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A
现有的血清群C 疫苗(Menjugate [120，99]，Meningitec 和 NeisVac-C )包含偶联糖。Men jugate 和Meningitec 含有与CRM197载体偶联的寡糖抗原，而NeisVac-C 采用与破伤风类毒素载体偶联的完整多糖(脱-0-乙酰化)。Menactra 疫苗含有血清群Y、 W135、C和A各自的偶联荚膜糖抗原。本发明的组合物可包含脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A中的一组或多组的荚膜糖抗原，其中所述抗原与载体蛋白和/或寡糖偶联。例如，所述组合物可包含血清群C ；血清群A和C ；血清群A、C和W135 ；血清群A、C和Y ；血清群C、W135和Y ；或所有四个血清群 A、C、W135和Y的荚膜糖抗原。每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的通常用量为1 μ g到20 μ g，例如，约1 μ g、约 2. 5yg、约4yg、约5yg或约10yg(以糖表示)。在混合物包含血清群A和C的荚膜糖时，MenA糖MenC糖的比例(w/w)可以大于1(例如，2 1、3 1、4 1、5 1、10 1或更高)。在混合物包含血清群Y与血清群 C和W135之一或两者的荚膜糖时，MenY糖MenW135糖的比例(w/w)可以大于1(例如， 2 1、3 1、4 1、5 UlO 1或更高)，和/或MenY糖MenC糖的比例(w/w)可以小于1(例如，1 2、1 3、1 4、1 5或更低)。血清群A C W135 Y糖的优选比例 (w/w)为1 1 1 1、1 1 1 2、2 1 1 1、4 2 1 1、8 4 2 1、 4 2 1 2、8 4 1 2、4 2 2 1、2 2 1 1、4 4 2 1、2 2 1 2、 4 4 1 2 和 2 2 2 1。血清群 C W135 Y 糖的优选比例(w/w)为1 1 1、 1 1 2、1 1 1、2 1 1、4 2 1、2 1 2、4 1 2、2 2 1和2 1 1。 优选采用质量基本相等的各种糖。可采用的荚膜糖是寡糖形式。通过使纯化荚膜多糖片段化(例如通过水解)可以方便地形成这些寡糖，片段化后通常要纯化所需大小的片段。优选进行多糖的片段化，使寡糖的平均聚合程度(DP)最终小于30个单糖(例如， 血清群A为10-20个，优选约10个；血清群W135和Y为15-25个，优选约15-20个；血清群 C为12-22之间等)。可用离子交换色谱或比色试验方便地测定DP[121]。如果进行水解，通常要对水解产物进行筛分，以去除短链寡糖[100]。可用各种方法，如超滤后离子交换色谱实现此目的。对血清群A而言，优选去除聚合程度小于或等于约 6个单糖的寡糖；对血清群W135和Y而言，优选去除聚合程度小于约4个单糖的寡糖。参考文献120描述了用于Men jugate 中的优选MenC糖抗原。所述糖抗原可以经化学修饰。这对降低血清群A(抗原)的水解特别有用[122， 见下文]。可以进行脑膜炎球菌糖的脱-ο-乙酰化。对寡糖的修饰可发生在解聚之前或之后。本发明的组合物包含MenA糖抗原时，优选所述抗原为天然糖上有一个或多个羟基被封闭基团取代的修饰糖[122]。这种修饰可以改善对水解的耐受性。共价偶联本发明组合物中的荚膜糖通常与载体蛋白偶联。通常，偶联可增强糖的免疫原性， 因为偶联可将糖从T-非依赖性抗原转变为T-依赖性抗原，因而可引发免疫记忆。偶联对儿科疫苗特别有用，是一项熟知的技术。典型的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素，或其类毒素或突变体。可采用CRM197白喉毒素突变体[123]，它是PREVNAR 产品中的载体。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白复合物[1 ]、合成肽[125,1 ]、热激蛋白[127,1 ]、百日咳蛋白[129，130]、细胞因子[131]、淋巴因子[131]、激素[131]、生长因子[131]、包含各种病原体衍生抗原的多个人CD4+T细胞表位的人造蛋白质[132]，如N19 [133]、流感嗜血杆菌蛋白D[134-136]、肺炎球菌溶血素[137]或其无毒衍生物[138]、肺炎球菌表面蛋白 PspA[139]、摄铁蛋白[140]、艰难梭菌(C. difficile)的毒素A或B[141]、重组铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)胞外蛋白 A(rEPA) [142]等。可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。一般在偶联前活化或官能化所述糖。活化可包括例如用氰化试剂，如CDAP(例如 1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶It [143、144等])。其它合适的技术采用碳二亚胺、 酰胼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU等。可用任何已知方法通过接头基团进行连接，例如参考文献145和146所述的方法。一种连接类型包括多糖的还原胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联到该己二酸接头基团的另一端[147，148]。其它接头包括B-丙酰胺基 [149]、硝基苯基-乙基胺[150]、卤代酰基卤化物[151]、糖苷键[152]、6_氨基己酸[153]、 ADH[154]、C4-C12部分[155]等。作为采用接头的替代方法，可采用直接连接。直接连接蛋白质可包括氧化多糖，然后与蛋白质还原胺化，例如参考文献156和157所述。优选包括以下步骤的方法将氨基引入到糖中(例如用-NH2取代末端=0基团)， 然后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生，再与载体蛋白反应。另一种优选的反应利用CDAP与蛋白D载体的活化，例如对MenA或MenC。外膜囊泡优选本发明组合物不含复杂的或未明确的抗原混合物，此为OMV的典型特征。然而，本发明可以与OMV联合使用，因为已发现fHBP能增强其功效W]，特别是通过在用于制备OMV的菌株中过表达本发明的多肽。通常用该方法来改善脑膜炎奈瑟球菌血清群B微囊泡[158]、“天然0MV” [159]、 小泡和外膜囊泡[例如参考文献160-165等]的制备。这些可从经遗传操作处理的细菌制备得到[166-169]，例如，以增加免疫原性(例如高表达免疫原)、降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调PorA表达等。这些可从高发泡菌株制备得到[170-173]。可包括非病原性奈瑟球菌的囊泡[174]。制备OMV可以不用洗涤剂[175，176]。它们可以在其表面表达非奈瑟球菌蛋白[177]。它们可以缺失LPS。它们可以与重组抗原混合[160，178]。可采用具有不同I类外膜蛋白亚型的细菌的囊泡，例如，采用两种不同的遗传工程改造的囊泡群，每种显示三种亚型的六种不同亚型；或采用三种不同的遗传工程改造的囊泡群，每种显示三种亚型的九种不同亚型等。有用的亚型包括=P 1. 7，16 ；P 1. 5-1，2-2 ；Pl. 19,15-1 ；Pl. 5-2,10 ； Pl. 12-1，13 ；Pl. 7-2,4 ；Pl. 22，14 ；Pl. 7-1,1 ；Pl. 18_1，3，6。更多的细节在下文中给出。蛋白质表达细菌表达技术是本领域已知的。细菌启动子是任何能够结合细菌RNA聚合酶并启动下游(3’ )编码序列(例如结构基因)转录为mRNA的DNA序列。启动子含有通常位于靠近编码序列5’末端处的转录起始区域。该转录起始区域通常包含RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可包含称为操纵基因的第二结构域，其可以与相邻的RNA 合成起始的RNA聚合酶结合位点重叠。所述操纵基因允许负调节(诱导性)转录，因为基因阻抑蛋白可结合操纵基因，从而抑制特定基因的转录。组成性表达可在缺乏负调节元件如操纵基因时发生。此外，正调节可以通过(如果存在)通常位于靠近(5’)RNA聚合酶结合序列的基因激活蛋白结合序列而实现。基因激活蛋白的一个例子是分解代谢物激活蛋白 (CAP)，它有助于启动大肠杆菌(E. coli)乳糖操纵子的转录[Raibaud等(1984) Armu. Rev. Genet. 18 :173]。因此，受调节的表达可以是正调节或负调节，从而增强或减弱转录。编码代谢途径酶的序列可以提供特别有用的启动子序列。例子包括衍生自糖代谢酶，如半乳糖、乳糖(lac) [Chang等(1977)Nature 198:1056]和麦芽糖代谢酶的启动子序列。其它例子包括衍生自生物合成酶，如色氨酸(trp)合成酶的启动子序列 [Goeddel 等(1980)Nuc. Acids Res. 8 4057 ；Yelverton 等(1981)Nucl. Acids Res. 9 731 ；美国专利 4，738，921 ；EP-A-0036776 和 EP-A-0121775]。β -内酰胺酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981) “干扰素的克隆和其它错误”(〃 The cloning of interferon and othermistakes.‘‘)干Ij于 Interferon 3 (I. Gresser 编)]、哩菌体 λ PL[Shimatake 等 (1981)Nature 292 128]和T5[美国专利4，689，406]启动子系统也提供了有用的启动子序列。另一个感兴趣的启动子是诱导型阿拉伯糖启动子(PBAD)。此外，自然界不存在的合成启动子也具有和细菌启动子一样的功能。例如，可将一种细菌或噬菌体启动子的转录激活序列与另一种细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接， 生成合成的杂合启动子[美国专利4，551，433]。例如，tac启动子是杂合trp-lac启动子， 包含trp启动子和受Iac阻抑蛋白调节的Iac操纵子序列二者[Amarm等(198;3)Gene 25 167 ；de Boer等(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. 80 21] 此外，细菌启动子可包括非细菌来源的天然产生的启动子，其具有结合细菌RNA聚合酶和启动转录的能力。也可将非细菌来源的天然产生的启动子与相容的RNA聚合酶偶联，以在原核生物中产生一些基因的高水平表达。噬菌体T7的RNA聚合酶/启动子系统是偶联启动子系统的一个例子[Studier等 (1986) J. Mol. Biol. 189 :113 ；Tabor 等(1985)Proc Natl. Acad. Sci. 82 :1074]。此外，杂合启动子也可以包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区域(EP-A-(^67851)。除功能性启动子序列外，有效的核糖体结合位点对原核生物表达外源基因也有用。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称为Siine-Dalgarno(SD)序列，包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长3-9个核苷酸的序列。认为所述 SD序列可通过SD序列与大肠杆菌16SrRNA 3’端之间的碱基配对，促进mRNA与核糖体结合Bteitz等(1979) “信使RNA中的遗传信号与核苷酸序列”("Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA.")干丨J 于 Biological Regulation and Development =Gene Expression (R. F. Goldberger编)]，为表达含弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[]。可将启动子序列直接与DNA分子连接，在这种情况下，N末端的第一个氨基酸永远是由起始密码子ATG编码的甲硫氨酸。如果需要，可通过与溴化氰体外培育或与细菌甲硫氨酸N末端肽酶体内或体外培育，将N末端的甲硫氨酸从蛋白质上切割下来。通常，细菌识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3’侧的调控区域，与启动子一起侧接编码序列。这些序列可指导mRNA的转录，翻译为DNA编码多肽。转录终止序列
17通常包含能够形成有助于终止转录的茎-环结构的约50个核苷酸的DNA序列。例子包括源自含强启动子的基因，如大肠杆菌的trp基因以及其它生物合成基因的转录终止序列。通常，以上描述的组分包含启动子、信号序列(如果需要)、感兴趣的编码序列和转录终止序列，一起组成表达构建物。表达构建物通常保持在复制子，如能够在宿主如细菌中稳定保持的染色体外元件(例如质粒)中。所述复制子含有复制系统，允许其保持在原核宿主中进行表达或克隆及扩增。此外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数质粒。高拷贝数质粒一般具有约5个到约200个，通常约10个到约150个拷贝数。包含高拷贝数质粒的宿主优选包含至少约10个质粒，更优选至少约20个质粒。根据载体和外源蛋白对宿主的作用，可以选择高拷贝数或低拷贝数载体。或者，可用整合载体将表达构建物整合入细菌基因组中。整合载体通常包含至少一条细菌染色体同源序列，从而允许该载体整合。整合看来是由该载体与细菌染色体同源 DNA之间的重组产生的。例如，将用各种杆菌菌株的DNA构建的整合载体整合入杆菌染色体中(EP-A-01273^)。整合载体也可以包含噬菌体或转座子序列。通常，染色体外表达和整合表达的构建物可包含选择性标记，以选择被转化的细菌菌株。选择性标记基因可以在细菌宿主中表达，可包括赋予细菌对药物，如氨苄青霉素、 氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环霉素等产生抗性的基因Navies等(1978) Annu. Rev. Microbiol. 32 :469]。选择性标记基因也可包括生物合成基因，如组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成通路中的基因。或者，可以将一些上述组分一起连入转化载体中。转化载体所含的选择性标记基因通常保持在复制子中或构建入以上所述的整合载体中。已开发出用于转化许多细菌的表达和转化载体，或是染色体外复制子，或是整合载体。例如，已开发出用于以下细菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) [Palva等(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 :5582 ；EP-A-0036259 和 EP-A-0063953 ；W084/04541]、大肠杆菌[Shimatake 等(1981) Nature292 :128 ；Amann 等(1985) Gene 40 :183 ；Studier 等(1986) J. Mol. Biol. 189 :113 ；EP-A-0036776、EP-A-O 136 829 和 ΕΡ-Α-0 136 907]、乳脂链球菌 [Powell 等(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 :655]、变铅青链球菌[Powell 等(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 :655]、变铅青链霉菌[美国专利4，745，056]的表达载体。将外源DNA引入细菌宿主的方法是本领域熟知的，通常包括转化经CaCl2或其它试剂，如二价阳离子和DMSO处理过的细菌。也可通过电穿孔将DNA引入细菌细胞。转化步骤通常随被转化细菌的种类而不同。参见例如，[Masson等(1989)FEMS Microbiol. Lett. 60 273 ；Palva 等(1982)Proc. Natl. Acad. ki. USA 79 5582 ；EP-A-0036259 和 EP-A-0063953 ；W084/04541,杆菌属(Bacillus)]，[Miller 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 856 ；Wang ^ (1990)J. Bacteriol. 172 :949,弯曲杆菌属(Campylobacter)], [Cohen 等(1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69 :2110 ；Dower 等(1988) Nucleic Acids Res. 16 6127 ；Kushner (1978) “用ColEl衍生质粒转化大肠杆菌的改进方法”(〃 An improved method for transformation of Escherichia coli withColEl-derived plasmids.") 刊于 Genetic Engineering-Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering(H. W. Boyer 和 S. Nicosia 编)；Mandel 等(1970) J. Mol. Biol. 53 159 ； Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949 :318 ；埃希氏菌属(Escherichia)], [ Chassy φ(1987)FEMS Microbiol. Lett. 44 173 乳酸杆菌属(Lactobacillus)], [Fiedler 等(1988) Anal. Biocheml70 :38，假单胞菌属(Pseudomonas) ], [Augustin 等(1990) FEMS Microbiol. Lett. 66 :203，葡萄球菌属(Staphylococcus)], [Barany 等(1980) J. Bacteriol. 144 698 ； Harlander (1987) “通过电穿孔转化乳酸链球菌”(〃 Transformationof Streptococcus lactis by electroporation“),干丨J于Streptococcal Genetics(J. Ferretti 禾口 R. Curtiss III 编)；Perry 等(1981) Infect. Immun. 32 1295 ；Powell 等(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 655 ；Somkuti 等(1987)Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1 -A\2,WtM 属(Streptococcus)].宿主细胞本发明提供了一种表达本发明多肽的细菌。所述细菌可以是脑膜炎球菌。所述细菌可组成性表达所述多肽，但是在一些实施方式中，表达处于诱导型启动子调控下。所述细菌可以高表达所述多肽(参见参考文献181)。所述多肽的表达不是相可变的。本发明也提供了从本发明细菌制备的外膜囊泡。还提供从本发明细菌产生囊泡的方法。从这些菌株制备的囊泡优选包含本发明多肽，多肽在囊泡中应为免疫可及形式，即可以结合本发明纯化多肽的抗体也应能结合存在于囊泡中的多肽。这些外膜囊泡包括任何通过破坏脑膜炎球菌外膜或使之发泡形成包含外膜蛋白组分的囊泡，而获得的蛋白脂质体囊泡。因此该术语包括OMV (有时称为“小泡”)、微囊泡 (MV[182])和“天然 0MV" ( “N0MV，，[183]))。MV和NOMV是天然产生的膜囊泡，在细菌生长时自发形成，释放到培养基中。可通过以下方法获得MV:在肉汤培养基中培养奈瑟球菌，将全细胞与肉汤培养基中较小的MV分离(例如，通过过滤或低速离心，只沉淀细胞而不沉淀较小的囊泡)，然后收集细胞除尽培养基中的MV (例如，通过过滤、差速沉淀或MV聚集，高速离心沉淀MV)。一般可根据培养基中产生的MV量来选择用于生产MV的菌株，例如，参考文献184和185描述了 MV产量高的奈瑟球菌。人工制备细菌的0MV，可利用洗涤剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或非洗涤剂方法 (例如参见参考文献186)制备。形成OMV的技术包括用胆酸盐洗涤剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，优选用脱氧胆酸钠[187和188] 处理奈瑟球菌)在不会沉淀洗涤剂的足够高PH下[189]处理细菌。可实行的其它技术基本上不用洗涤剂[186]，而采用如超声、均化、微流化、空化、渗透压休克、研磨、法式压制、混合等技术。不用或采用低浓度洗涤剂的方法可以保留有用的抗原，如NspA[186]。因此一种方法可采用含有0. 5%或更低如约0. 2%、约0. 1%、< 0. 05%或O浓度的脱氧胆酸盐的 OMV提取缓冲液。参考文献190描述了一种制备OMV的有用方法，涉及超滤粗提OMV物，而非替代高速离心。该方法包括超滤后进行超离心步骤。可从任何脑膜炎球菌菌株制备本发明所用的囊泡。所述囊泡通常得自血清群B菌株，但也可从B以外的，如A、C、W135或Y血清群菌株制备(例如，参考文献189描述了血清群A的方法)。所述菌株可以属于任何血清型(例如，1、23、213、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(例如，Ll ；L2 ；L3 ；L3，3，7 ;L10等)。所述脑膜炎球菌可以来自任何合适的谱系，包括高侵袭性和超毒力谱系，例如以下7种超毒力谱系亚组I、亚组III、亚组IV-U ET-5复合物、ET-37复合物、A4簇、谱系3中的任何一种。除编码本发明多肽外，本发明的细菌可含有一个或多个进一步的修饰。例如，它们可以含有经修饰的fur基因[191]。参考文献199教导，随着porA和cps的敲除nspA的表达应上调，可利用这些修饰。参考文献199-201描述了用于生产OMV的脑膜炎奈瑟球菌进一步敲除突变株。参考文献192描述了经修饰能表达6种不同PorA亚型的菌株的囊泡构建。也可采用通过敲除参与LPS生物合成的酶所获得的内毒素水平低的奈瑟球菌突变株 [193，194]。这些或其它突变株均可用于本发明。因此在一些实施方式中本发明所用的菌株可以表达一种以上的PorA亚型。之前已构建了 6价和9价PorA菌株。所述菌株可表达PorA亚型=Pl. 7,16 ；Pl. 5-1,2-2 ；Pl. 19， 15-1 ；Pl. 5-2,10 ；Pl. 12-1,13 ；Pl. 7-2,4 ；P 1. 22,14 ；P 1.7_1，1 和 / 或 P 1. 18-1,3,6 ψ 的2、3、4、5、6、7、8或9种。在其它实施方式中，可以下调菌株中的PorA表达，例如，PorA 的表达量相对于野生型水平(例如相对于Η44/76菌株)减少了至少20% (例如，^ 30%, 彡40%、彡50%、彡60%、彡70%、彡80%、彡90%、彡95%等)，或甚至被敲除。在一些实施方式中，菌株可以高表达(相对于相应的野生型菌株)某些蛋白质。例如，菌株可以高表达NspA、蛋白287 [195]、fHBP[181] ,TbpA和/或TbpB [196]、铜、锌超氧化物歧化酶[196]、HmbR等。可将编码本发明多肽的基因整合入细菌染色体中，或以游离形式存在，例如在质粒中。对囊泡生产而言，宜对脑膜炎球菌进行遗传工程改造，以确保多肽的表达不会发生相变。参考文献197描述了减少或消除脑膜炎球菌基因表达相变的方法。例如，可将基因置于组成型或诱导型启动子的控制下，或去除或取代负责相变的DNA基序。在一些实施方式中，菌株可以包含一个或多个敲除和/或参考文献198-201描述的高表达突变。优选的下调和/或敲除基因包括(a) Cps、CtrA, CtrB, CtrC、CtrD, FrpB, GalE、HtrB/MsbB、LbpA, LbpB, LpxK、Opa, Opc、PilC、PorB, SiaA, SiaB, SiaC、SiaD, TbpA 和 / 或 TbpB [198] ； (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa, Opc、PhoP, PilC、PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC、SiaD, TbpA 和 / 或 TbpB[199] ； (c)ExbB、 ExbD> rmpM、CtrA> CtrB> CtrD、GalE、LbpA> LpbB> Opa> Opc、PilC、PorB> SiaA> SiaB> SiaC、 SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB [200]以及(d) CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、 SynA, SynB 和 / 或 SynC [201]。采用突变菌株时，在一些实施方式中，菌株可以具有一个或多个或所有以下特征 ⑴下调或敲除LgtB和/或(ialE以截短脑膜炎球菌的LOS ； (ii)上调TbpA ； (iii)上调 NhhA ； (iv)上调 0mp85 ； (ν)上调 LbpA ； (vi)上调 NspA ； (vii)敲除 PorA ； (viii)下调或敲除FrpB ； (ix)下调或敲除Opa ； (χ)下调或敲除Opc ； (xii) cps缺失基因复合体。截短的LOS 可以不包含唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，可以是半乳糖缺陷型L0S。所述LOS可以没有α链。根据用于制备囊泡的脑膜炎球菌菌株，它们可包含或不含该菌株的天然fHBP抗原[202]。如果LOS存在于囊泡中，可处理囊泡，使之连接其LOS和蛋白质组分(“内泡”偶联[201])。
概述术语“包括”包括“包含”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X 组成或可以包括其它物质，例如X+Y。与数值χ相关的术语“约”表示例如，x± 10%。术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含” Y的组合物可以完全不含Y。必要时，可以从本发明定义中删去术语“基本上”。优选用MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))执行 Smith-Waterman同源性检索算法，利用仿射缺口检索测定“序列相同性”，参数为缺口开放罚分=12，缺口延伸罚分=1。血清群之后，脑膜炎球菌的分类包括血清型、血清亚型和免疫型，标准命名法列单为血清群、血清型、血清亚型和免疫型，彼此之间由冒号隔开，例如B :4:P1. 15 :L3，7，9。在血清群B中，一些谱系常引起疾病(高侵袭性)，一些谱系引起比其它谱系更严重形式的疾病(超毒力)，其余的很少引起疾病。识别了 7个超毒力谱系，即亚组I、III*IV-l、ET-5 复合体、ET-7复合体、A4簇和谱系3。通过多基因座酶电泳(MLEE)对这些谱系进行了定义， 但也采用了多基因座序列分型(MLST)对脑膜炎球菌分类[参考文献19]。4种主要的超毒力簇是ST32、ST44、ST8和STll复合体。一般来说，本发明不包括参考文献4、5、7、8、9、10、11、12、13、14和203特定描述的各种fHBP序列本发明实施方式以野生型MC58序列(SEQ ID NO 1)作为基线，制备了 72个修饰fHBP序列。这些序列见序列表中SEQ ID NO 4-75所示。大肠杆菌表达的多肽含有N末端甲硫氨酸，紧接SEQ ID NO氨基酸序列。将所述多肽与完全弗氏佐剂、MF59或氢氧化铝佐剂结合，然后用于免疫小鼠。在对一组10个脑膜炎球菌菌株的杀菌试验中检测了小鼠抗血清。该组包括三个fHBP家族各自的菌株。也制备了野生型MC58多肽。表达和纯化的两种多肽是SEQ ID NO 79 ( "PATCH 9C”)禾口 80 ( "PATCH 10A”)，分别包含SEQ ID N0:20和23。所有的测试多肽都引发了显示对该组至少两个菌株(通常多个)有杀菌活性的血清(SBA效价彡128)，但是9C和IOA多肽值得注意，因为其血清显示对全组菌株组都有良好的杀菌活性，包括对M1239菌株也有效。9C和IOA的SBA效价如下
权利要求
1.一种多肽，其包含选自以下的氨基酸序列SEQ ID NO 20、23、76、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74 和 75。
2.如权利要求1所述的多肽，其包含氨基酸序列SEQID N0:20。
3.如权利要求2所述的多肽，其包含SEQID N0:79。
4.如权利要求1所述的多肽，其包含氨基酸序列SEQID N0:23。
5.如权利要求4所述的多肽，其包含SEQID N0:80。
6.如权利要求1所述的多肽，其包含氨基酸序列SEQID NO :76。
7.如权利要求6所述的多肽，其包含SEQID NO :77。
8.一种多肽，其包含以下氨基酸序列(i)与SEQ ID NO :76至少90%相同和/或(ii) 包含SEQ ID NO :76的第一片段和第二片段的氨基酸序列，其中所述第一片段包括SEQ ID NO 76的89-1M位氨基酸内的表位，所述第二片段包括SEQ ID NO 76的187-248位氨基酸内的表位。
9.编码如以上任一项权利要求所述多肽的核酸。
10.一种包含编码如权利要求1-8中任一项所述多肽的核酸的质粒。
11.一种用如权利要求10所述质粒转化的宿主细胞。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是脑膜炎球菌。
13.从权利要求12所述宿主细胞制备的膜囊泡，其特征在于，所述囊泡包含权利要求 1-8中任一项所述的多肽。
14.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的多肽或权利要求13所述的囊泡。
15.如权利要求14所述的组合物，包含佐剂。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述佐剂包含铝盐。
17.如权利要求14-16中任一项所述的组合物，还包含第二多肽，在给予哺乳动物时， 所述第二多肽引发对脑膜炎球菌具有杀菌作用的抗体应答，条件是所述第二多肽不是脑膜炎球菌fHBP。
18.如权利要求14-17中任一项所述的组合物，还包含脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、 W135和/或Y的偶联荚膜糖。
19.如权利要求14-18中任一项所述的组合物，还包含偶联的肺炎球菌荚膜糖。
20.一种引发哺乳动物抗体应答的方法，包括给予权利要求14-19中任一项所述的免疫原性组合物。
全文摘要
fHBP是脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的一种蛋白质。已知fHBP有三个家族。为增强fHBP蛋白引发家族间交叉反应性抗体的能力，对fHBP进行选择和工程改造，使其具有的序列在给予宿主动物后可引发广谱杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
文档编号A61K39/095GK102356089SQ200980110581
公开日2012年2月15日 申请日期2009年2月20日 优先权日2008年2月21日
发明者M·M·朱利亚尼, M·斯卡塞利, M·皮扎, M·阿科, R·拉普奥里 申请人:诺华有限公司
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