一种含CpGODN和polyI:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制备方法
专利名称：一种含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种含CpG 0DN和poly I:C佐剂的喷 鼻型流感疫苗的制备方法。
背景技术：
流感是由流感病毒引起的全球流行的呼吸道传播疾病，接种流感疫苗是预防流感 的有效手段。 传统的流感病毒疫苗包括流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗和流感亚单位 疫苗，这些流感疫苗均采用肌肉注射方式。在俄罗斯和美国已经批准流感减毒活疫苗，该 疫苗采用冷适应的流感重组株经鼻腔喷雾给药，但该疫苗未被批准用于3岁以下婴幼儿使 用。 CpG ODN(oligodeoxynucleotides, 0DN)是一种含有非甲基化CpG 二核苷酸序 列的单链寡核苷酸，CpG ()I)N可以被免疫细胞上To:l.l样受体-9(Toll-like rec印tor 9， TLR-9)所识别，并增强免疫反应。美国Dynavax公司以CpG ODN为佐剂的重组乙肝疫苗在 三期临床研究中显示了优于普通乙肝疫苗的免疫效果，接种两针后抗体阳转率达到95%， 而普通乙肝疫苗接种三针阳转率为81%。Poly I:C,即聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosine-po:l.ycytidy:l.ic acid,poly ]::C)
是-一种合成的双链RNA，Poly I:C可被免疫细胞上的Toll样受体-3 (Toll-like rec印tor
3， TLR-3)所识别，并增强免疫反应。目前以Polyl :C主要作为免疫剌激剂、肿瘤治疗药物
使用，使用Poly I:C作为佐剂的狂犬病疫苗和流感疫苗尚处于临床前研究阶段。 传统的流感病毒疫苗为流感病毒灭活全病毒疫苗或流感病毒裂解疫苗，成人剂量
含每型血凝素15微克，儿童剂量含每型血凝素7. 5微克，由于传统疫苗使用肌肉注射方式
进行接种，而利用本专利制备的含CpG ODN和poly I: C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗采用喷
鼻给药方式，接种方式更方便,并可以降低抗原用量，增加疫苗供应能力。 以CpG ODN和Po :1.yI: C两种佐剂制备喷鼻型流感疫苗目前国内外未见文献报道。
发明内容
本发明克服了传统流感疫苗的缺陷，提供了一种免疫效果好、可以降低流感病毒
抗原用量，方便使用的喷鼻型流感疫苗,且可以应付流感大流行之下。 本发明的技术方案及步骤 (1)将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿 囊腔增殖流感病毒； (2)收获流感病毒,用截留分子量100 75()kD的超滤膜进行超滤浓縮； (3)将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于充分平衡的S印harose 4FF柱，收集第
一个洗脱峰为纯化的流感病毒；
(4)经脱氧胆酸钠裂解的流感病毒样品，上样于S印harose 6FF柱，纯化获得流感 病毒疫苗原液； (5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合； (6)按照每剂含HIN1流感病毒血凝素和:H3N2流感病毒血凝素和B型流感病毒血
凝素1 10微克、CpG 0DN佐剂50 1000微克、poly I :C佐剂100 2000微克的配比，
分装到喷鼻注射器即获得含CpG 0DN和poly I: C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗。 其中流感病毒浓縮过程中使用的超滤膜截留分子量可以为300 750kD ;疫苗含
每型流感病毒血凝素可以为2 7. 5微克/剂，CpG ()DN佐剂可以为100 500微克/剂、
polyl:C佐剂可以为200 1000微克/齐U，疫苗不含有硫柳汞。 实施例1 1)增殖流感病毒 将H1N1、 H:3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34t:培养72小时； 将鸡胚置于4。C冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml ，于2-8"C灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4()0()g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量100kD的超滤膜浓縮 至150毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于().()lraol/L :PBS (pH:7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50,Zl00柱，柱体积1850ml),收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度().5% (g/ral)振摇下裂解6()分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱体积1830ml)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ml。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1、 H3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含 H1N1和H3N2和B型每型血凝素10微克、含CpG ODN佐剂50微克、含Polyl :C佐剂100微 克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗。 实施例2 1)增殖流感病毒 将H1N1、 H:3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34t:培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4。C冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml ，于2-8"C灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4()0()g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量300kD的超滤膜浓縮 至148毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于().()lraol/L :PBS (pH:7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50,Zl00柱，柱体积1850ml),收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度().5% (g/ral)振摇下裂解6()分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱体积1830ml)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ml。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1、 H3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素7. 5微克、含CpG ODN佐剂100微克、含Polyl :C佐剂200
微克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I: C佐剂的喷鼻型流
感病毒疫苗。 实施例3 1)增殖流感病毒 将H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34。C培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4t:冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8"C灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4000g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量75()k:[)的超滤膜浓縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5()/1(K)柱，柱体积185(Ml)，收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度O. 5% (g/ml)振摇下裂解60分钟，裂解液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱体积1830ml)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ml 。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1、 H3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含 H1N1和H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ODN佐剂250微克、含Polyl :C佐剂500微 克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感
病毒疫苗。 实施例4 1)增殖流感病毒 将II1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34。C培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4t:冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8"C灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经棚g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量30()k:[)的超滤膜浓縮 至155毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5()/1(K)柱，柱体积185(Ml)，收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度O. 5% (g/ml)振摇下裂解60分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK5()/1()()柱，柱体积183()ni:l.)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ml。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1 、 H:3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素2微克、含CpG ODN佐剂500微克、含Polyl: C佐剂1000微
克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和polyl :C佐剂的喷鼻型流感
病毒疫苗。 实施例5 1)增殖流感病毒 将H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34。C培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4t:冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8t:灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4000g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量750kD的超滤膜浓縮至155毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5()/1(K)柱，柱体积1850ml)，收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 250ml 。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度O. 5% (g/ml)振摇下裂解60分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK5()/1()()柱，柱体积183()ni:l.)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ml。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1 、 H:3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素1微克、含CpG ODN佐剂1000微克、含Polyl :C佐剂2000
微克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I: C佐剂的喷鼻型流
感病毒疫苗。 实施例6 1)增殖流感病毒 将H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34。C培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4t:冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8t:灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4000g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量300kD的超滤膜浓縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50/100柱，柱体积1850ml),收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 25()ni:l-。4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度0. 5% (g/ml)振摇下裂解60分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱体积1830ml)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ral。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1、 H3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含 HlNl和:H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ODN佐剂500微克、含Polyl :C佐剂500微 克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感
病毒疫苗。 实施例7
1)增殖流感病毒 将H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34。C培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4t:冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8t:灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4000g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量300kD的超滤膜浓縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50/100柱，柱体积1850ml),收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 25()ni:l-。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度0. 5% (g/ml)振摇下裂解60分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱体积1830ml)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ral。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1、 H3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含 H:1N1和:H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ()DN佐剂100微克、含Poly:l: :C佐剂500微 克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感
病毒疫苗。 实施例8 流感病毒疫苗的动物免疫原性检测 采用健康家兔作为动物模型，对实施例1 实施例7制备的喷鼻型流感病毒疫苗 与市售流感裂解疫苗进行了免疫原性比较，实验设计如下 实施例1-实施例7制备的喷鼻流感疫苗对家兔采用喷鼻免疫接种方式，每组5只 家兔，每次喷鼻().2ral， 0、 14天各免疫一次,第二次免疫后7天采血分离血清，测定免前免后 血清中对H1N1型、H3N2型、B型流感病毒的血凝抑制抗体滴度，计算每只家兔(免后血凝抑 制抗体/免前血凝抑制抗体)的比值，并计算每组家兔(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑 制抗体)比值的几何平均数。 流感病毒裂解疫苗分为喷鼻和肌肉注射两组，每组5只家兔，每次免疫0. 2ml，()、 14天各免疫一次，第二次免疫后7天采血分离血清，测定免前免后血清中对H1N1型、H3N2 型、B型流感病毒的血凝抑制抗体滴度，计算每只家兔(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制 抗体)的比值,并计算每组家兔(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)比值的几何平 均数。 免疫结果如下表所示本发明制备的喷鼻型流感疫苗与现有流感病毒疫苗的比较
免疫组别(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)几何平均数H1N1型H3N2型B型
流感病毒裂解疫 苗(注射)6.965.274.59
流感病毒裂解疫 苗(喷鼻)1.321.521.15
实施例1 (喷鼻)10.5686.96
实施例2 (喷鼻)13.9310.568
实施例3 (喷鼻)21.111613.92
实施例4 (喷鼻)12.1210.568
实施例5(喷鼻)9.199.19
实施例6 (喷鼻)21.1118.3816
实施例7 (喷鼻)〗2.1210.559.19 从上表可以看出，本发明制备的喷鼻型流感病毒疫苗经喷鼻途径免疫的免疫原性 均优于市售流感疫苗经注射途径、喷鼻途径免疫的免疫原性,说明本发明制备的含CpG0DN 和Poly I: C佐剂喷鼻型流感疫苗适宜于预防流行性感冒。
权利要求
一种含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制备方法，其步骤是(1)将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔增殖流感病毒；(2)收获流感病毒，用截留分子量100～750kD的超滤膜进行超滤浓缩；(3)将超滤浓缩后的流感病毒样品上样于充分平衡的Sepharose 4 FF柱，收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒；(4)经脱氧胆酸钠裂解的流感病毒样品，上样于Sepharose 6FF柱，纯化获得流感病毒疫苗原液；(5)将以上步骤分别得到的H1N1、H3N2、B型流感病毒疫苗原液混合；(6)按照每剂含H1N1流感病毒血凝素和H3N2流感病毒血凝素和B型流感病毒血凝素1～10微克、CpG ODN佐剂50～1000微克、poly I:C佐剂100～2000微克的配比，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗。
2. 根据权利要求1所述的一种含CpG ()DN和poly I: C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制 备方法，其特征是所述流感病毒浓縮过程中使用的超滤膜截留分子量为300 750kD。
3. 根据权利要求l所述的一种含CpG 0DN和poly I: C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制 备方法，其特征是所述疫苗含每型流感病毒血凝素2 7. 5微克/剂，CpG 0DN佐剂100 250微克/齐U、 poly I :C佐齐[J 200 500微克/剂。
全文摘要
本发明一种含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制备方法，属于生物技术领域，其步骤为，采用鸡胚培养增殖流感病毒，经超滤浓缩、柱层析后获得纯化的流感病毒，经裂解后获得流感疫苗原液，将所需型别流感疫苗原液与CpG ODN佐剂、polyI:C佐剂配比后制备而成。本发明提供了一种可以降低流感病毒抗原用量，方便免疫接种的新型喷鼻型流感病毒疫苗制备方法，适宜于在全球大流感流行威胁下迅速提高流感疫苗供应能力。
文档编号A61K39/39GK101745109SQ201010103470
公开日2010年6月23日 申请日期2010年2月1日 优先权日2010年2月1日
发明者代云波, 向左云, 张翊 申请人:云南沃森生物技术股份有限公司
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种含CpG 0DN和poly I:C佐剂的喷 鼻型流感疫苗的制备方法。
背景技术：
流感是由流感病毒引起的全球流行的呼吸道传播疾病，接种流感疫苗是预防流感 的有效手段。 传统的流感病毒疫苗包括流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗和流感亚单位 疫苗，这些流感疫苗均采用肌肉注射方式。在俄罗斯和美国已经批准流感减毒活疫苗，该 疫苗采用冷适应的流感重组株经鼻腔喷雾给药，但该疫苗未被批准用于3岁以下婴幼儿使 用。 CpG ODN(oligodeoxynucleotides, 0DN)是一种含有非甲基化CpG 二核苷酸序 列的单链寡核苷酸，CpG ()I)N可以被免疫细胞上To:l.l样受体-9(Toll-like rec印tor 9， TLR-9)所识别，并增强免疫反应。美国Dynavax公司以CpG ODN为佐剂的重组乙肝疫苗在 三期临床研究中显示了优于普通乙肝疫苗的免疫效果，接种两针后抗体阳转率达到95%， 而普通乙肝疫苗接种三针阳转率为81%。Poly I:C,即聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosine-po:l.ycytidy:l.ic acid,poly ]::C)
是-一种合成的双链RNA，Poly I:C可被免疫细胞上的Toll样受体-3 (Toll-like rec印tor
3， TLR-3)所识别，并增强免疫反应。目前以Polyl :C主要作为免疫剌激剂、肿瘤治疗药物
使用，使用Poly I:C作为佐剂的狂犬病疫苗和流感疫苗尚处于临床前研究阶段。 传统的流感病毒疫苗为流感病毒灭活全病毒疫苗或流感病毒裂解疫苗，成人剂量
含每型血凝素15微克，儿童剂量含每型血凝素7. 5微克，由于传统疫苗使用肌肉注射方式
进行接种，而利用本专利制备的含CpG ODN和poly I: C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗采用喷
鼻给药方式，接种方式更方便,并可以降低抗原用量，增加疫苗供应能力。 以CpG ODN和Po :1.yI: C两种佐剂制备喷鼻型流感疫苗目前国内外未见文献报道。
发明内容
本发明克服了传统流感疫苗的缺陷，提供了一种免疫效果好、可以降低流感病毒
抗原用量，方便使用的喷鼻型流感疫苗,且可以应付流感大流行之下。 本发明的技术方案及步骤 (1)将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿 囊腔增殖流感病毒； (2)收获流感病毒,用截留分子量100 75()kD的超滤膜进行超滤浓縮； (3)将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于充分平衡的S印harose 4FF柱，收集第
一个洗脱峰为纯化的流感病毒；
(4)经脱氧胆酸钠裂解的流感病毒样品，上样于S印harose 6FF柱，纯化获得流感 病毒疫苗原液； (5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合； (6)按照每剂含HIN1流感病毒血凝素和:H3N2流感病毒血凝素和B型流感病毒血
凝素1 10微克、CpG 0DN佐剂50 1000微克、poly I :C佐剂100 2000微克的配比，
分装到喷鼻注射器即获得含CpG 0DN和poly I: C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗。 其中流感病毒浓縮过程中使用的超滤膜截留分子量可以为300 750kD ;疫苗含
每型流感病毒血凝素可以为2 7. 5微克/剂，CpG ()DN佐剂可以为100 500微克/剂、
polyl:C佐剂可以为200 1000微克/齐U，疫苗不含有硫柳汞。 实施例1 1)增殖流感病毒 将H1N1、 H:3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34t:培养72小时； 将鸡胚置于4。C冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml ，于2-8"C灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4()0()g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量100kD的超滤膜浓縮 至150毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于().()lraol/L :PBS (pH:7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50,Zl00柱，柱体积1850ml),收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度().5% (g/ral)振摇下裂解6()分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱体积1830ml)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ml。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1、 H3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含 H1N1和H3N2和B型每型血凝素10微克、含CpG ODN佐剂50微克、含Polyl :C佐剂100微 克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗。 实施例2 1)增殖流感病毒 将H1N1、 H:3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34t:培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4。C冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml ，于2-8"C灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4()0()g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量300kD的超滤膜浓縮 至148毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于().()lraol/L :PBS (pH:7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50,Zl00柱，柱体积1850ml),收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度().5% (g/ral)振摇下裂解6()分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱体积1830ml)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ml。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1、 H3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素7. 5微克、含CpG ODN佐剂100微克、含Polyl :C佐剂200
微克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I: C佐剂的喷鼻型流
感病毒疫苗。 实施例3 1)增殖流感病毒 将H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34。C培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4t:冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8"C灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4000g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量75()k:[)的超滤膜浓縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5()/1(K)柱，柱体积185(Ml)，收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度O. 5% (g/ml)振摇下裂解60分钟，裂解液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱体积1830ml)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ml 。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1、 H3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含 H1N1和H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ODN佐剂250微克、含Polyl :C佐剂500微 克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感
病毒疫苗。 实施例4 1)增殖流感病毒 将II1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34。C培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4t:冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8"C灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经棚g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量30()k:[)的超滤膜浓縮 至155毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5()/1(K)柱，柱体积185(Ml)，收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度O. 5% (g/ml)振摇下裂解60分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK5()/1()()柱，柱体积183()ni:l.)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ml。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1 、 H:3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素2微克、含CpG ODN佐剂500微克、含Polyl: C佐剂1000微
克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和polyl :C佐剂的喷鼻型流感
病毒疫苗。 实施例5 1)增殖流感病毒 将H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34。C培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4t:冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8t:灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4000g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量750kD的超滤膜浓縮至155毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5()/1(K)柱，柱体积1850ml)，收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 250ml 。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度O. 5% (g/ml)振摇下裂解60分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK5()/1()()柱，柱体积183()ni:l.)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ml。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1 、 H:3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素1微克、含CpG ODN佐剂1000微克、含Polyl :C佐剂2000
微克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I: C佐剂的喷鼻型流
感病毒疫苗。 实施例6 1)增殖流感病毒 将H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34。C培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4t:冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8t:灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4000g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量300kD的超滤膜浓縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50/100柱，柱体积1850ml),收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 25()ni:l-。4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度0. 5% (g/ml)振摇下裂解60分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱体积1830ml)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ral。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1、 H3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含 HlNl和:H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ODN佐剂500微克、含Polyl :C佐剂500微 克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感
病毒疫苗。 实施例7
1)增殖流感病毒 将H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊
腔，置34。C培养72小时； 2)收获流感病毒，超滤浓縮 将鸡胚置于4t:冷库过夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收获液12500毫升。流感 病毒收获液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8t:灭活振摇灭活24小时。灭活的病毒液经4000g 离心30分钟，经0. 8微米中空纤维系统澄清过滤后，采用截留分子量300kD的超滤膜浓縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱纯化 将超滤浓縮后的流感病毒样品上样于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50/100柱，柱体积1850ml),收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒，共 25()ni:l-。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱纯化 纯化的流感病毒加入脱氧胆酸钠至终浓度0. 5% (g/ml)振摇下裂解60分钟，裂解 液分两次上样于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱体积1830ml)，纯化获得流感病毒单价 疫苗原液420ral。 5)将以上步骤分别得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分装 根据H1N1、 H3N2、 B型流感病毒单价疫苗原液的血凝素浓度测定值，按照每剂含 H:1N1和:H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ()DN佐剂100微克、含Poly:l: :C佐剂500微 克的配方配制半成品，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感
病毒疫苗。 实施例8 流感病毒疫苗的动物免疫原性检测 采用健康家兔作为动物模型，对实施例1 实施例7制备的喷鼻型流感病毒疫苗 与市售流感裂解疫苗进行了免疫原性比较，实验设计如下 实施例1-实施例7制备的喷鼻流感疫苗对家兔采用喷鼻免疫接种方式，每组5只 家兔，每次喷鼻().2ral， 0、 14天各免疫一次,第二次免疫后7天采血分离血清，测定免前免后 血清中对H1N1型、H3N2型、B型流感病毒的血凝抑制抗体滴度，计算每只家兔(免后血凝抑 制抗体/免前血凝抑制抗体)的比值，并计算每组家兔(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑 制抗体)比值的几何平均数。 流感病毒裂解疫苗分为喷鼻和肌肉注射两组，每组5只家兔，每次免疫0. 2ml，()、 14天各免疫一次，第二次免疫后7天采血分离血清，测定免前免后血清中对H1N1型、H3N2 型、B型流感病毒的血凝抑制抗体滴度，计算每只家兔(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制 抗体)的比值,并计算每组家兔(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)比值的几何平 均数。 免疫结果如下表所示本发明制备的喷鼻型流感疫苗与现有流感病毒疫苗的比较
免疫组别(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)几何平均数H1N1型H3N2型B型
流感病毒裂解疫 苗(注射)6.965.274.59
流感病毒裂解疫 苗(喷鼻)1.321.521.15
实施例1 (喷鼻)10.5686.96
实施例2 (喷鼻)13.9310.568
实施例3 (喷鼻)21.111613.92
实施例4 (喷鼻)12.1210.568
实施例5(喷鼻)9.199.19
实施例6 (喷鼻)21.1118.3816
实施例7 (喷鼻)〗2.1210.559.19 从上表可以看出，本发明制备的喷鼻型流感病毒疫苗经喷鼻途径免疫的免疫原性 均优于市售流感疫苗经注射途径、喷鼻途径免疫的免疫原性,说明本发明制备的含CpG0DN 和Poly I: C佐剂喷鼻型流感疫苗适宜于预防流行性感冒。
权利要求
一种含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制备方法，其步骤是(1)将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作毒种分别接种于1000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔增殖流感病毒；(2)收获流感病毒，用截留分子量100～750kD的超滤膜进行超滤浓缩；(3)将超滤浓缩后的流感病毒样品上样于充分平衡的Sepharose 4 FF柱，收集第一个洗脱峰为纯化的流感病毒；(4)经脱氧胆酸钠裂解的流感病毒样品，上样于Sepharose 6FF柱，纯化获得流感病毒疫苗原液；(5)将以上步骤分别得到的H1N1、H3N2、B型流感病毒疫苗原液混合；(6)按照每剂含H1N1流感病毒血凝素和H3N2流感病毒血凝素和B型流感病毒血凝素1～10微克、CpG ODN佐剂50～1000微克、poly I:C佐剂100～2000微克的配比，分装到喷鼻注射器即获得含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗。
2. 根据权利要求1所述的一种含CpG ()DN和poly I: C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制 备方法，其特征是所述流感病毒浓縮过程中使用的超滤膜截留分子量为300 750kD。
3. 根据权利要求l所述的一种含CpG 0DN和poly I: C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制 备方法，其特征是所述疫苗含每型流感病毒血凝素2 7. 5微克/剂，CpG 0DN佐剂100 250微克/齐U、 poly I :C佐齐[J 200 500微克/剂。
全文摘要
本发明一种含CpG ODN和poly I:C佐剂的喷鼻型流感病毒疫苗制备方法，属于生物技术领域，其步骤为，采用鸡胚培养增殖流感病毒，经超滤浓缩、柱层析后获得纯化的流感病毒，经裂解后获得流感疫苗原液，将所需型别流感疫苗原液与CpG ODN佐剂、polyI:C佐剂配比后制备而成。本发明提供了一种可以降低流感病毒抗原用量，方便免疫接种的新型喷鼻型流感病毒疫苗制备方法，适宜于在全球大流感流行威胁下迅速提高流感疫苗供应能力。
文档编号A61K39/39GK101745109SQ201010103470
公开日2010年6月23日 申请日期2010年2月1日 优先权日2010年2月1日
发明者代云波, 向左云, 张翊 申请人:云南沃森生物技术股份有限公司
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