一种防治缺血性脑损伤的药物及其制备方法

专利名称：：一种防治缺血性脑损伤的药物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及中药领域，具体涉及一种防治缺血性脑损伤的中药组合物及其制备方法。
背景技术：
：缺血性中风相当于现代医学称谓的急性缺血性脑血管病，具有发病率高、病死率高、致残率高、复发率高等特点，严重地危害着人类的健康，防治本病研究已成为社会和医学界关注的重要课题之一。中医药防治本病具有一定优势，但本病治法研究大多集中在活血化瘀或益气活血等方药，具有一定疗效，但还有许多不良作用也有待解决，且疗效有待提高，迫切需要开拓本病治疗思路，寻求防治本病具有确切疗效的治疗药物和方法，特别是具有中医药理论基础和临床经验的中药新药，提高临床疗效。
发明内容本发明的目的是提供一种能有效防治缺血性脑损伤的中药组合物。本发明的另一个目的是提供该中药组合物的制备方法。根据《黄帝内经》，如《素问调经论》曰"血之与气，并走于上，则为大厥"，《灵枢剌节真邪》曰"虚邪偏客于身半，…邪气独留，发为偏枯"，《素问生气通天论》曰"阳气者，大怒则形气绝，而血菀于上，使人薄厥"，《素问*通评虚实论》曰"…仆击，偏枯…肥贵人则高粱之疾也"，及集以上对气虚、血瘀、瘀毒等理论的探讨，综中医各家之言，结合临床实践，提出气虚血瘀、毒瘀阻络是缺血性中风的重要病机之一，认为气虚血瘀、毒瘀阻络证是缺血性中风的重要证型，是以气虚为本，毒瘀为标，气虚不能行血，则血瘀，瘀血日久化热成毒，或素有痰火、瘀热，又时逢劳倦、内伤、饮食不慎等诱因，致气虚血钝，毒瘀互结，阻损脑络，卒发为中风，临床表现为口眼歪斜，语言不清，口角流涎或半身不遂，舌暗红，或苔黄腻，脉弱或涩等。针对本证宜采用益气通络，清热解毒法"辨证求因"治之，使补气以治其本，促进血行，通络疏理血脉，清除病理因素，清热解毒有利于消散毒瘀互结。方中以黄芪为君，益气通络，气行血行，以葛根、三七为臣，通络舒筋，兼养阴生津，清热，黄芩、栀子为佐使，清热解毒，三者相伍具有益气通络，清热解毒的功效，适用于缺血性中风中经络之气虚血瘀、毒瘀阻络证。本发明中药组合物具有下述特点方中二温二寒一甘凉，寒热互济，共奏益气通络，清热解毒之功。本发明提供的中药组合物能弥补现有技术中的不足，开拓新的治疗思路。本发明药物用于脑梗死恢复期的治疗具有明显治疗效果。本发明公开的防治缺血性脑损伤的中药组合物是以生黄芪、三七、葛根、黄芩和栀子的提取物为主要活性成分与药用辅料制成的口服制剂。本发明提供的中药组合物是由下述重量配比的原料制成的口服制剂生黄芪7-20份、三七3-12份、葛根7-20份。优选的重量份比例为生黄芪15份、三七5份、葛根15份。本发明药物还可是由下述重量配比的原料制成的口服制剂生黄芪7-20份、三七3-12份、葛根7-20份、黄芩5-15份、栀子5-15份。优选的重量份比例为生黄芪15份、三七5份、葛根15份、黄芩10份、栀子10份。本发明所述的口服制剂是指医学上可接受的各种口服剂型，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液。本发明公开的中药组合物的制备方法包括下列步骤1)有效成分制备a)将配比量的生黄芪加8-12倍量的质量浓度为90_95%的乙醇浸渍10_15小时后，回流提取2次，合并提取液，离心，滤液真空60-70°C回收乙醇，浓縮至50-60°C时相对密度1.13，得提取液I。将生黄芪药渣加水浸泡1.5-3小时后，提取3次，提取液离心，浓縮至50-6(TC时相对密度1.16，得提取液II。b)将配比量的葛根和黄芩加8-12倍量的质量浓度为30-80%的乙醇浸渍10_15小时后，回流提取2次，合并提取液，离心，滤液真空60-70°C回收乙醇，浓縮至50-60°C时相对密度l.15，得提取液ni。2)制剂制备合并提取液I、II、III，按常规方法与药用辅料制成液体口服制剂；或将合并后的提取液进行喷雾干燥，按常规方法与药用辅料制成固体口服制剂。如果加入黄芩和栀子，本发明药物的制备方法为1)有效成分制备a)将配比量的生黄芪加8-12倍量的质量浓度为90_95%的乙醇浸渍10_15小时后，回流提取2次，合并提取液，离心，滤液真空60-70°C回收乙醇，浓縮至50-60°C时相对密度1.13，得提取液I。将生黄芪药渣加水浸泡1.5-3小时后，提取3次，提取液离心，浓縮至50-6(TC时相对密度1.16，得提取液II。b)将配比量的葛根和黄芩加8-12倍量的质量浓度为30-80%的乙醇浸渍10_15小时后，回流提取2次，合并提取液，离心，滤液真空60-70°C回收乙醇，浓縮至50-60°C时相对密度l.15，得提取液ni。c)将配比量的三七和栀子加8-12倍量的质量浓度为30-80%的乙醇浸渍10_15小时后，回流提取2次，合并提取液，离心，滤液真空60-70°C回收乙醇，浓縮至50-60°C时相对密度l.15，，得提取液IV。2)制剂制备合并提取液I、II、III、IV，按常规方法与药用辅料制成液体口服制剂；或将合并后的提取液进行喷雾干燥，按常规方法与药用辅料制成固体口服制剂。本发明提供的中药组合物的提取物中含黄芪以黄芪甲苷(C41H68014)计，含量大于0.130%，含葛根以葛根素(C21H2。09)计，含量大于7%，含黄芩以黄芩苷(C21H18On)计，含量大于13%，均以HPLC法测定。用本发明治疗脑梗死恢复期的中药组合物进行有关药效实验—、对大鼠大脑中动脉局灶性缺血再灌注损伤的保护作用采用大脑中动脉局灶性栓塞(MCAO)模型，开展本发明制剂对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能缺损的改善和脑梗死体积的改变等作用的实验研究。1.动物清洁级SD大鼠，雄性，体重280±10g，2.分组与给药将60只SD大鼠随机分为6组。即假手术组(正常组)、脑缺血再灌注组(模型组)、本发明制剂胶囊按倍数梯度分高、中、低剂量三组(4g/kg/24h、2g/kg/24h、lg/kg/24h)、阳性药对照组(即尼莫地平组，10mg/kg/24h)。将各药临用前用生理盐水配成混悬液，分别于再灌0h、6h及23h各灌胃给药一次，假手术组与模型组灌服等量生理盐水。3.脑缺血再灌注动物模型_大脑中动脉局灶性栓塞(MCAO)模型的制作大鼠称重后用10%水合氯醛(0.4mL/100g体重)腹腔注射麻醉，按照LudmilaBelayev的方法(XudmilaBelayev，OfeliaFA，RaulB，etal.MiddleCerebralCorteryOcclusionintheratbyintraluminal,suturestroke，1996，27(9):1616-1612.)进行大脑中动脉局灶性栓塞(MCAO)，在颈正中部切开并暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，以及颈外动脉和颈内动脉的分支，结扎并剪断颈外动脉分支。用动脉夹暂时阻断颈总动脉，在距颈总动脉分叉0.81.Ocm处用双重丝线结扎颈外动脉，在颈外动脉近心端剪一小口，将多聚赖氨酸处理的4-0(直径0.26mm)尼龙线从小口轻轻插入，经分叉处轻轻推入颈内动脉，当将尼龙线插入距颈总动脉分叉1.82.Ocm处并有轻微阻力，表明尼龙线已插至Willie's环大脑前动脉起始处，阻塞了大脑中动脉主干的起始部。随后，在颈外动脉尼龙线插入的近心端用丝线结扎。假手术组尼龙线只插入0.5cm左右。经60min缺血后，将尼龙线轻轻抽出，扎紧切口，并松开颈总动脉的动脉夹，进行再灌注。手术过程中保持大鼠肛温在3738°C，并一直维持至动物麻醉苏醒。模型成功的标志是动物苏醒后出现同侧Horner征和对侧以前肢为重的偏瘫(组织学证实，梗死灶位于同侧额顶叶皮质及尾状核与壳核外侧部)。4.检测指标(1)神经功能症状观察参照Bederson对MCA区梗塞后的神经缺损程度进行03分的等级记分标准(BedersonJB，PittsLH，Tsujim，etal.Ratmiddlecerebralarteryocclusion:evalimtionofthemodelanddevelopmentofaneurologicexamination[J]Stroke,1986，17(3):472.)。分别在大鼠再灌注24h时观察并记录神经功能缺失症状，大鼠手术过程中死亡或死亡后解剖发现为颅底出血者剔除。(2)脑梗死体积计算在大鼠再灌注24h后分别断头取脑，生理盐水冲洗残血，置于-2(TC低温冰箱快速冷冻1015min，待一定硬度取出，始于前図点前1mm每隔2mm切取冠状组织6片，将脑片置2%TTC染色液中，37t:孵育30min待显色完全。最后置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，将固定的脑片按切片顺序排列，用数码相机照相后输入计算机，用图像分析的方法计算每一片的缺血面积(苍白区)。将每个脑片的缺血面积乘以厚度(2mm)，再将各脑片数值相加后得到脑梗死灶体积的近似值，除以总体积得到梗死体积百分率。5.结果(1)本发明制剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能的影响结果(表1)可见模型组与假手术组相比具有显著差异(p<0.01)，尼莫地平组与模型组相比具有显著差异(P<0.05)，本发明制剂高、中、低剂量组与模型组相比具有显著差异(p<0.01)。表明本发明制剂能使大鼠的神经功能缺损症状减轻，促进神经功能缺损症状的恢复。表l本发明制剂对大鼠脑缺血后神经功能缺损症状的影响(文士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较Ap<0.05，AAp<0.01。(2)本发明制剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗塞体积的影响结果(见表2)可见模型组与假手术组相比具有显著差异(p<0.01)，与模型组比较，本发明制剂高、中、低剂量及尼莫地平均能显著地縮小大鼠MCAO后脑组织梗死体积，降低脑梗死体积百分率。本发明制剂高、中、低剂量组的作用均较显著。表2本发明制剂对大鼠脑缺血后脑梗死体积百分率的影响(文士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较△p<0.05，△△p<0.01。二、对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织病理、Bcl-2和Bax蛋白表达等的影响采用大脑中动脉局灶性栓塞(MCAO)模型，开展本发明制剂对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织病理、尼氏小体、及Bcl-2和Bax蛋白表达等的影响，观察本发明制剂对脑缺血性损伤的保护作用及作用机理。1.动物、分组与给药、大脑中动脉局灶性栓塞(MCAO)模型的制作同前。2.检测指标大鼠于再灌注2处后处死大鼠，立即取脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片。进行病理组织观察和免疫组化。3.结果:(1)本发明制剂对脑缺血大鼠脑组织病理学的影响脑组织标本石蜡切片经HE染色，光镜下检测组织病理学的改变。假手术组大鼠大脑皮质脑组织形态学结构基本正常，可见大型的锥体细胞，形态较完整，结构清楚，核圆形，核仁明显；模型组大鼠大脑皮质脑组织形态学结构发生改变，锥体细胞体积变小，胞核固縮，染色加深，胞体核分界不清，有神经元纤维聚集现象，并出现散在的胶质细胞增生；本发明制剂高、中、低剂量组和尼莫地平组大鼠大脑皮质锥体细胞病变减轻，体积变小、核固縮的锥体细胞数目比模型组减少，固縮坏死的细胞数量减少。(2)本发明制剂对脑缺血大鼠脑组织神经元尼氏小体的影响甲苯胺蓝是一种碱性染料，可特异性地对神经元进行染色，将存在于神经元胞浆和大树突内的尼氏体染成蓝色，而细胞核为无色或浅蓝色。脑组织标本石蜡切片经甲苯胺蓝染色后，光镜下检测尼氏小体数量的改变。结果正常组神经元体积较大，形态规则，尼氏体致密；模型组尼氏体稀疏，部分缺失，有较明显的空泡变性，胞核呈皱縮状，形态不一，有凹陷、三角及不规则形；本发明制剂高、中、低剂量组和尼莫地平组尼氏体较致密，无明显缺失和空泡变性。选择梗塞区域周围脑组织4个视野，在MIAS-2000图像分析仪检测相应神经细胞浆内尼氏小体，结果见表3。表3本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠脑组织神经元尼氏小体的影响(文士S，n=10)组别剂量n尼氏小体数(个/400倍)假手术组NS10151.3±12.8模型组NS1055.6±15.3**本发明制剂高剂量组4g/kg10136.1±21.5AA本发明制剂中剂量组2g/kg10107.9土23.4AA本发明制剂低剂量组lg/kg1086.0±17.6A尼莫地平组10mg/kg1099.6土23.0AA注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较△p<0.05，△△p<0.01。从表3可见假手术组大脑尼氏小体的数量较多、密集；模型组大鼠尼氏小体的数量较少、有的甚至消失；本发明制剂高、中、低剂量组和尼莫地平组大鼠尼氏小体的数量明显比模型组增加，具显著差异(p<0.01或p<0.05)。(3)本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠脑组织中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响采用SABC法进行Bcl-2和Bax免疫组化染色，显微镜下观察，脑组织神经元细胞胞质中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，反之为阴性细胞。每张免疫组化切片中采集io个具有代表性的400X互不重叠视野，计数Bcl-2、Bax蛋白染色阳性细胞个数，取其平均值作为该标本的染色强度_阳性细胞数，结果见表4。表4本发明制剂对脑缺曲再灌注大鼠脑组织中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响(文士S，n=10)组别剂量Bel-2阳性细胞(个/400倍)Bax阳性细胞(个/400倍)Bel-2/Bax假手术组NS5.91±3.036.97±4.280.86±0.14模型组NS26.51±7.35**40.17±5.46**0.60±0.ll林本发明制剂高剂it组4g/kg51.52±8.21AA17.60±5.98AA2.70±0.26AA本发明制剂中剂ii组2g/kg45.52±10.50"23.42±7.06AA1.88±0.17AA本发明制剂低剂lt组lg/kg39.41±8.03A31.48±5.08A1.03±0.13AA尼莫地平组10mg/kg44.61±7.36AA25.57±4.91A△1.71±0.11AA注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较△p<0.05，△△p<0.01。从表4可见模型组Bcl-2、Bax蛋白染色阳性细胞数明显增多，本发明制剂高、中、低剂量组与模型组相比，Bcl-2蛋白染色阳性细胞数明显增多，Bax蛋白染色阳性细胞数明显降低(P<0.01)，上调Bcl-2蛋白及下调Bax蛋白的表达，恢复二者的比例，调节抗凋亡和促凋亡作用。三、对大鼠脑缺血损伤脑含水量和脑指数的影响采用颈总动脉结扎致大鼠不完全性脑缺血模型，观察本发明制剂对大鼠脑缺血后脑含水量和脑指数等的影响。1.动物同前。2.模型制作、分组与给药将60只SD大鼠随机分为6组，即假手术组(正常组)、脑缺血组(模型组)、本发明制剂胶囊高、中、低剂量组(4g/kg/24h、2g/kg/24h、1g/kg/24h)、尼莫地平组(10mg/kg/24h)，假手术组与模型组灌服等量生理盐水。将本发明制剂胶囊和尼莫地平临用前用生理盐水配成混悬液，每日1次，连续给药3d，末次给药后30min后，结扎SD大鼠双侧颈总动脉形成急性实验性不完全性脑缺血模型。假手术组除不行颈总动脉结扎外，余手术过程相同。3.检测指标脑含水量和脑指数测定双侧颈总动脉结扎3小时以后，快速断头，开颅取脑，生理盐水冲洗残血，以万分之一电子分析天平称取脑湿重，从断头至称重在5分钟内完成。计算脑指数(脑指数=脑湿重/体重X100%)。然后在IO(TC烤箱中烘烤至恒重(即两次测量重量相同)时称取脑干重，计算脑含水量％=(湿重-干重)/湿重X100%。4.结果:结果(表5)可见脑缺血模型组的脑指数和脑含水量与假手术组相比具有显著差异(P<0.01)，提示脑含水量显著增加；本发明制剂各剂量组和尼莫地平与脑缺血模型组相比脑含水量均显著减少。本发明制剂量效关系呈正相关，大剂量组与脑缺血模型相比，其脑含水量和脑指数均显著降低。表5本发明制剂对大鼠脑缺血后脑指数和脑含水量的影响(文士S)组别剂量n脑指数(％)脑含水量(％)假手术组NS100.578±0.01375,145土0.692模型组NS100.719±0.037**80.468±0.597**本发明制剂高剂量组4g/kg100.632土0.025AA78.382士0.219AA本发明制剂中剂量组2g/kg100.688±0.03379.546±0.262A本发明制剂低剂量组lg/kg100.702±0.03279.605±0.508△尼莫地平组10mg/kg100.677±0.01679.559土0.244A注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较△p<0.05，△△p<0.01。四、对大鼠脑缺血再灌注损伤血清和脑组织中各项生化指标的影响采用大鼠四血管阻断法(4V0法)，开展本发明制剂对大鼠脑缺血再灌注损伤后血清和脑组织中超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)丙二醛(MaleicDialdehyde，MDA)、一氧化氮(NitricOxide，NO)、一氧化氮合酶(NitricOxideSynthase,N0S)等生化指标的影响，观察本发明制剂对脑缺血损伤的保护作用。1.动物、分组同实验"一"。2.给药将各药用生理盐水制成口服液，每日早晚各一次，连续3天，并于手术前lh追加一次。假手术对照组、模型组按同样方法灌服等量生理盐水。3.模型制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型采用改良的Pulsinelli四血管阻断法(4V0法)。大鼠用10%水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉，腹卧位固定，无菌枕部切口，暴露第一颈椎横突翼小孔，用尖端约0.5mm电针电凝闭双侧翼小孔内的椎动脉。然后改为背部固定，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用。次日在清醒的状态下，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉。假手术组除不行椎动脉凝闭和颈总动脉夹闭外，余手术过程相同。模型成功的标准实验动物意识丧失，四肢瘫痪，角膜反射及翻正反射消失；EEG描记的脑电波频率减慢，波幅降低以至出现脑电波几乎成一条直线。脑缺血再灌注组于颈总动脉夹闭后30min放开动脉夹，使血流再通30min后迅速断头取脑，以备检测有关指标。假手术组于手术后60mim迅速断头取脑。4.检测指标由腹主动脉抽取46ml血液，静置60min后，4000r/min，离心10min，取血清，置-S(TC冰箱保存待测；断头取脑，低温下取出脑组织，称重后按重量体积比加生理盐水制备成10X的组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清，-S(rC冰箱保存待测。分别按照各试剂盒说明书测定血清和脑组织匀浆中各生化指标。5.结果(1)本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织匀浆中SOD活力的影响结果见表6可知脑缺血再灌注组血清和脑组织匀浆中SOD的活力与假手术组相比具有显著差异(P<0.01)，本发明制剂高、中、低剂量与脑缺血再灌注组相比均具有显著差异，本发明制剂各组量效成正相关。提示本发明制剂可显著提高脑缺血再灌注损伤大鼠血清和脑组织中SOD的活力(p<0.01或p<0.05)。表6本发明制剂对大鼠脑缺血再灌注后血清和脑组织中SOD活力的影响(文士S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较Ap<0.05，AAp<0.01。(2)本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织匀桨中MDA含量的影响结果见表7可知脑缺血再灌注组血清和脑组织匀浆中MDA的含量与假手术组相比具有显著差异(P<0.01)，本发明制剂高、中、低剂量组与尼莫地平组与脑缺血再灌注组相比均具有显著差异。提示本发明制剂能显著降低脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织中MDA的含量(p<0.01或p<0.05)。表7本发明制剂对大鼠脑缺血再灌注后血清和脑组织中MDA含量的影响(X士S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较Ap<0.05，AAp<0.01。(3)本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织匀浆中NO含量的影响结果见表8可知模型组血清和脑组织匀浆中NO的含量与假手术组相比具有显著差异(p<0.01)，本发明制剂高、中剂量组和尼莫地平组可明显降低血清和脑组织中NO的含量(p<0.01或p<0.05)。表8本发明制剂对大鼠脑缺血再灌注后血清和脑组织中NO含量的影响(文士S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>0101]注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较△p<0.05，△△p<0.01。(4)本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织匀浆中NOS活力的影响结果见表9可知模型组血清和脑组织匀浆中NOS的活力与假手术组相比具有显著差异(P<0.01)，本发明制剂高、中剂量组和尼莫地平组可明显降低血清和脑组织中NOS的活力(p<0.01或p<0.05)。表9本发明制剂对大鼠脑缺血再灌注后血清和脑组织中NOS活力的影响(文士S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较Ap<0.05，AAp<0.01。五、对大鼠脑缺血再灌注损伤血清和脑组织中炎症因子及炎症基因表达的影响采用大脑中动脉局灶性栓塞(MCAO)模型，开展本发明制剂对大鼠脑缺血再灌注损伤后血清和脑组织中IL-113、IL-6、TNFa的炎症因子水平，以及脑组织中IL_1PmRNA，IL-6mRNA等炎症基因表达的影B向，从分子水平阐述脑缺血后炎症损伤的分子机制，观察本发明制剂对脑缺血损伤的保护作用。1.动物、分组与给药、大脑中动脉局灶性栓塞(MCAO)模型的制作同实验"一"。2.检测指标于再灌注24h后用10%水合氯醛(0.4mL/100g体重)腹腔注射麻醉，由腹主动脉抽取46ml血液，静置60min后，4000r/min，离心10min，取血清，置-80"冰箱保存待测。断头取脑，低温下取出缺血侧脑组织，近额极1/3立即投入液氮中保存，备用，作进一步的RT-PCR实验；后2/3称重后按重量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清，_801:冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附试验方法(ELISA法)的试剂盒检测血清和脑组织匀浆中IL-113、IL-6、TNFa。3.结果(1)本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织中IL-113、IL-6、TNFa炎症细胞因子含量的影响表10本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠曲清和脑组织中IL-113含量的影响(文士S，n=10)组<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较△p<0.05，△△p<0.01。表11本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织中IL-6含量的影响(X±S，n=10)组别剂量IL-6(血清，ng/ml)IL-6(脑组织，ng/ml)假手术组NS1,541±0.2855.202±0.338模型组NS3.590±0.402**12.070±0.471**本发明制剂高剂量组4g/kg2.044±0.288AA8.629±0.580AA本发明制剂中剂量组2g/kg2.762±0.309A△9.080±0.299△A本发明制剂低剂量组lg/kg3.211±0.35011.273±0.524A尼莫地平组lOmg/kg3.102±0.28210.031±0.538AA注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较△p<0.05，△△p<0.01。表12本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织中TNFa含量的影响(文士S，n=10)组别齐廿量TNFa(血清，ng/ml)TNFa(脑组织，ng/ml)假手术组NS0.381±Q.0722.780±0.134模型组NS0.600±0.075林5.718±0.311**本发明制剂高剂量组4g/kg0.413±0.099△A4.102±0.204AA本发明制剂中剂量组2g/kg0.461±0.093A4.993±0.199AA本发明制剂低剂量组lg/kg0.512±0.0605.229±0.299△尼莫地平组lOmg/kg0.480±0.0845.147±0.329△注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较Ap<0.05，AAp<0.01。结果从表10、表11、表12可知，脑缺血再灌注模型组血清和脑组织中IL-IP、IL-6、TNFa的含量均明显升高(p<0.01)，本发明制剂高、中、低剂量可明显降低血清和脑组织中IL-113、IL-6、TNFa的含量(与模型组比p<0.01或p<0.05)，表明本发明制剂能显著地抗脑缺血引起的炎症反应，消除炎症因子。(2)本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠脑组织中炎症基因表达的影响大鼠脑组织经Trizol—步法抽提总RNA，RT-PCR扩增，电泳分离后成像，用图像分析软件分析凝胶图像以检测显色条带的灰度值，与内参P-actin之比值即表示IL-1PmRNA、IL-6mRNA表达水平。结果见表13可知，模型组脑组织IL-113mRNA、IL_6mRNA表达水平均比假手术组明显增加(P〈0.01)，本发明制剂高、中、低剂量可明显降低脑缺血再灌注大鼠脑组织中IL-1PmRNA、IL-6mRNA的表达(与模型组比p<0.01或p<0.05)。表13本发明制剂对脑缺血再灌注大鼠脑组织中IL-1PmRNA、IL_6mRNA表达水平的影响a±S，n=10)组别剂量IHPmRNAIL-6mRNA假手术组NS0.■906±0.2521.546±0.224模型组NS1.729±0.185**8.938±0.643**本发明制剂高剂量组4g/kg1.,130±0.166AA5.553±0.319AA本发明制剂中剂量组2g/kg1.,305±0.212A△6.871±0.402A△本发明制剂低剂量组lg/kg1.425±0.215A7.957±0.556△尼莫地平组10mg/kg1.,302±0.332A7.161±0.319A△注与假手术组比较*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较△p<0.05，△△p<0.01。六、对小鼠减压缺氧耐力影响的实验研究观察本发明制剂对小鼠缺氧耐力的影响，给健康ICR小鼠灌服不同剂量本发明制剂和尼莫地平一定时间后，采用小鼠减压缺氧耐力实验方法，记录动物死亡时间来观察其作用。1.动物清洁级ICR小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g。2.分组与给药将50只ICR小鼠按雌雄随机分为5组。即缺氧模型组；本发明制剂高、中、低剂量组(28mg/20g/24h、56mg/20g/24h、112mg/20g/24h);尼莫地平组(lmg/20g/24h)。将本发明制剂和尼莫地平临用前用生理盐水配成混悬液，灌胃给药，每日早晚各一次，连续7天，并于实验前lh追加一次。模型组灌服等量的生理盐水。3.小鼠减压缺氧耐力实验将ICR小鼠放入密闭真空玻璃瓶中，每次两只，打开真空泵减压至0.08Mpa后，开始记录动物死亡时间，并将真空泵减压衡定在0.08Mpa水平。4.结果:小鼠减压缺氧耐力试验结果见表14。(本发明制剂高、中、低剂量组、尼莫地平组与模型组相比均具有显著差异(p<0.01或p<0.05);本发明制剂各组量效呈正相关；本发明制剂各组与尼莫地平组相比无显著差异。表14本发明制剂对小鼠减压缺氧耐力的影响(文士S，n=10)(mg;g24h)、瞎漏司(秒、)S§172,03±5.12模型组NS172,03±5.12本发明制剂高剂lt组28.0215.12±7,64AA本发明制剂中剂』t组56.0207.11±8.54AA本发明制剂低剂i魏.112.0187.47±8.74A尼莫地平组1.0210,27±9.43△△注与模型组比较△p<0.05，△△p<0.01。七、急性毒性试验利用急性毒性实验，观察本发明制剂对小鼠的急性毒性表现或最大耐受剂量。考察本发明制剂的安全性。1.动物清洁级ICR小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g。2.药品本发明制剂胶囊临用时取107.lg，加蒸馏水至lOOml，浓度107.lg/100ml。3.试验方法将小鼠实验室适应性喂养一周，实验前禁食不禁水12h，灌胃给予107.lg/100ml的本发明制剂胶囊40ml/kg，隔6小时后同样剂量灌胃给药1次，共2次，总剂量为85.68g/kg，相当于生药226.7g/kg。观察给药后小鼠的反应和7天内的死亡情况，并于给药第3天和第7天称重。4.结果:小鼠在给药后活动减少，行动迟缓，在6小时以后可见大便呈棕黑色，稍软。在给药后24小时后小鼠一般状况和大便均恢复正常，在7天的观察期内未见有小鼠死亡，雌雄小鼠的体重均略有增长，见表15。表15本发明制剂对小鼠体重的影响(文士S，g)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结论分别采用大鼠大脑中动脉局灶性栓塞(MCAO)模型，急性不完全性脑缺血模型，四血管阻断法(4V0法)，以及小鼠减压缺氧耐力实验和急性毒性实验，开展本发明制剂对大鼠脑缺血和再灌注损伤后神经功能，病理改变，以及血清、脑组织中各项指标等的影响，探讨本发明制剂对脑缺血性损伤的保护作用。实验结果发现本发明制剂可以显著地减轻MCAO模型大鼠的神经功能缺损症状，促进神经功能缺损症状的恢复；显著地縮小大鼠MCAO后脑组织梗死体积，降低脑梗死体积百分率；明显改善脑缺血及再灌注对脑组织的病理损害，抑制尼氏小体数量减少或消失；显著地降低脑缺血模型大鼠的脑指数和脑含水量；显著地提高缺血再灌注后大鼠血清和脑组织中SOD活性、明显降低MDA含量、NO含量和NOS活性等，减轻自由基对脑的损伤；显著延长减压缺氧小鼠存活时间，提高其生存能力。表明本发明制剂对脑缺血损伤具有明显的保护作用。同时本发明制剂能明显降低脑缺血及再灌注大鼠血清和脑组织中IL-IP、IL-6和TNFa的含量，降低缺血性损伤脑组织中IL-1PmRNA、IL_6mRNA的表达水平，减轻缺血区炎症反应；显著增加缺血再灌注后Bcl-2蛋白表达，降低Bax蛋白的表达，上调Bcl_2蛋白及下调Bax蛋白的表达，恢复二者的比例，调节它们抗凋亡和促凋亡作用。表明本发明制剂可通过抑制炎症因子和炎症级联反应，抑制神经元凋亡等机制，发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。根据临床实际和中国药典等记载，结合急性毒性实验研究，本发明制剂胶囊的小鼠口服最大耐受剂量是人临床用量的340倍，表明采用本发明制剂抗脑缺血性损伤具有安全等特点。具体实施例方式实施例1、颗粒剂制备a)将900g生黄芪加10倍量的质量浓度为90%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.13，得提取液I。将生黄芪药渣加水浸泡2小时后，提取3次，提取液离心(15000转/分)，分离后上清液浓縮至50-6(TC时相对密度1.16，得提取液II。b)将900g葛根、600g黄芩加IO倍量的质量浓度为60%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.15，得提取液III。c)将300g三七、600g栀子加10倍量的质量浓度为70%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.15，，得提取液IV。d)合并提取液I、II、III、IV进行喷雾干燥(进液速度6000ml/min，进风温度140°C)，得干燥粉，对喷雾干燥粉称重，加入150g糊精，干挤制粒(主压力6MPa，侧压力0.6MPa)，整粒，分装于铝箔袋中，每包6g，灭菌，即得。用HPLC法测定含黄芪以黄芪甲苷(C41H68014)计2.257mg/包，含葛根以葛根素(C21H2。09)计0.135g/包，含黄芩以黄芩苷(C21H18On)计O.303g/包。实施例2、颗粒剂制备a)将750g生黄芪加10倍量的质量浓度为90X的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.13，得提取液I。将生黄芪药渣加水浸泡2小时后，提取3次，提取液离心(15000转/分)，分离后上清液浓縮至50-6(TC时相对密度1.16，得提取液II。b)将750g葛根、500g黄芩加10倍量的质量浓度为60%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.15，得提取液III。c)将250g三七、500g栀子加10倍量的质量浓度为70%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.15，，得提取液IV。d)合并提取液I、II、III、IV进行喷雾干燥(进液速度6000ml/min，进风温度140°C)，得干燥粉，对喷雾干燥粉称重，加入150g糊精，干挤制粒(主压力6MPa，侧压力0.6MPa)，整粒，分装于铝箔袋中，每包6g，灭菌，即得。用HPLC法测定含黄芪以黄芪甲苷(C41H68014)计1.881mg/包，含葛根以葛根素(C21H2。09)计0.113g/包，含黄芩以黄芩苷(C21H18On)计O.253g/包。实施例3、胶囊剂制备a)将900g生黄芪加10倍量的质量浓度为90X的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.13，得提取液I。将生黄芪药渣加水浸泡2小时后，提取3次，提取液离心(15000转/分)，分离后上清液浓縮至50-6(TC时相对密度1.16，得提取液II。b)将900g葛根、600g黄芩加IO倍量的质量浓度为60%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.15，得提取液III。c)将300g三七、600g栀子加10倍量的质量浓度为70%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.15，，得提取液IV。d)合并提取液I、II、III、IV进行喷雾干燥(进液速度6000ml/min，进风温度140°C)，得干燥粉，对喷雾干燥粉称重，加入10%喷雾干燥乳糖，干挤制粒(主压力6MPa，侧压力0.6MPa)，加入5%硬脂酸镁，混匀，灌胶囊，每粒0.5g，灭菌，即得。用HPLC法测定含黄芪以黄芪甲苷(C41H68014)计O.457mg/g，含葛根以葛根素(C21H2。09)计27mg/g，含黄芩以黄芩苷(C21H18Ou)计61mg/g。实施例4、胶囊剂制备a)将750g生黄芪加10倍量的质量浓度为90X的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.13，得提取液I。将生黄芪药渣加水浸泡2小时后，提取3次，提取液离心(15000转/分)，分离后上清液浓縮至50-6(TC时相对密度1.16，得提取液II。b)将750g葛根、500g黄芩加10倍量的质量浓度为60%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.15，得提取液III。c)将250g三七、500g栀子加10倍量的质量浓度为70%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.15，，得提取液IV。d)合并提取液I、II、III、IV进行喷雾干燥(进液速度6000ml/min，进风温度140°C)，得干燥粉，对喷雾干燥粉称重，加入10%喷雾干燥乳糖，干挤制粒(主压力6MPa，侧压力0.6MPa)，加入5%硬脂酸镁，混匀，灌胶囊，每粒0.5g，灭菌，即得。用HPLC法测定含黄芪以黄芪甲苷(C41H68014)计O.449mg/g，含葛根以葛根素(C21H2。09)计25mg/g，含黄芩以黄芩苷(C21H18Ou)计59mg/g。实施例5、口服液制备a)将900g生黄芪加10倍量的质量浓度为90X的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.13，得提取液I。将生黄芪药渣加水浸泡2小时后，提取3次，提取液离心(15000转/分)，分离后上清液浓縮至50-6(TC时相对密度1.16，得提取液II。b)将900g葛根、600g黄芩加IO倍量的质量浓度为60%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.15，得提取液III。c)将300g三七、600g栀子加10倍量的质量浓度为70%的乙醇浸渍12小时后，回流提取2次，合并提取液，离心(15000转/分)，上清液60-7(TC减压回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.15，，得提取液IV。d)合并提取液I、II、III、IV，加3倍量95^乙醇，搅匀，冷藏24小时，取上清液减压回收乙醇，加水稀释至4.25L，静置，取上清液滤过，灌装，每支10ml，灭菌，即得。用HPLC法测定含黄芪以黄芪甲苷(C41H68014)计O.145mg/ml，含葛根以葛根素(C21H2。09)计8.57mg/ml，含黄芩以黄芩苷(C21H18Ou)计20.3mg/ml。权利要求一种防治缺血性脑损伤的药物，由下述重量配比的原料制成的口服制剂生黄芪7-20份、三七3-12份、葛根7-20份。2.根据权利要求l所述的防治缺血性脑损伤的药物，其中，原料药的重量配比为生黄芪15份、三七5份、葛根15份。3.权利要求1或2所述的防治缺血性脑损伤的药物的制备方法，包括如下步骤1)有效成分制备a)将配比量的生黄芪加8-12倍量的质量浓度为90-95%的乙醇浸渍10-15小时后，回流提取2次，合并提取液，离心，滤液真空60-7(TC回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.13，得提取液I。将生黄芪药渣加水浸泡1.5-3小时后，提取3次，提取液离心，浓縮至50-6(TC时相对密度1.16，得提取液II。b)将配比量的葛根和黄芩加8-12倍量的质量浓度为30-80%的乙醇浸渍10-15小时后，回流提取2次，合并提取液，离心，滤液真空60-70°C回收乙醇，浓縮至50-60°C时相对密度l.15，得提取液ni。2)制剂制备合并提取液I、II、III，按常规方法与药用辅料制成液体口服制剂；或将合并后的提取液进行喷雾干燥，按常规方法与药用辅料制成固体口服制剂。4.根据权利要求1所述的防治缺血性脑损伤的药物，其中原料药还包括黄芩5-15份、栀子5-15份。5.根据权利要求4所述的防治缺血性脑损伤的药物，其中原料药的重量配比为生黄芪15份、三七5份、葛根15份、黄芩10份、栀子10份。6.根据权利要求4或5所述的防治缺血性脑损伤的药物的制备方法，包括如下步骤1)有效成分制备a)将配比量的生黄芪加8-12倍量的质量浓度为90-95%的乙醇浸渍10-15小时后，回流提取2次，合并提取液，离心，滤液真空60-7(TC回收乙醇，浓縮至50-6(TC时相对密度1.13，得提取液I。将生黄芪药渣加水浸泡1.5-3小时后，提取3次，提取液离心，浓縮至50-6(TC时相对密度1.16，得提取液II。b)将配比量的葛根和黄芩加8-12倍量的质量浓度为30-80%的乙醇浸渍10-15小时后，回流提取2次，合并提取液，离心，滤液真空60-70°C回收乙醇，浓縮至50-60°C时相对密度l.15，得提取液ni。c)将配比量的三七和栀子加8-12倍量的质量浓度为30-80%的乙醇浸渍10-15小时后，回流提取2次，合并提取液，离心，滤液真空60-70°C回收乙醇，浓縮至50-60°C时相对密度1.15，，得提取液IV。2)制剂制备合并提取液I、II、III、IV，按常规方法与药用辅料制成液体口服制剂；或将合并后的提取液进行喷雾干燥，按常规方法与药用辅料制成固体口服制剂。7.根据权利要求4或5所述的防治缺血性脑损伤的药物，其特征在于，所述口服制剂为医学上可接受的口服剂型。8.根据权利要求7所述的防治缺血性脑损伤的药物，其特征在于，所述药物为胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液中的一种。全文摘要本发明涉及中药领域，具体涉及一种防治缺血性脑损伤的中药组合物及其制备方法。本发明公开的防治缺血性脑损伤的中药组合物是以生黄芪、三七、葛根、黄芩和栀子的提取物为主要活性成分与药用辅料制成的口服制剂。该制剂对临床表现为口眼歪斜，语言不清，口角流涎或半身不遂，舌暗红，或苔黄腻，脉弱或涩等脑梗死恢复期症状具有明显治疗效果。文档编号A61K36/488GK101732402SQ201010104499公开日2010年6月16日申请日期2010年1月27日优先权日2010年1月27日发明者万海同,张宇燕,杨洁红申请人:浙江中医药大学