一种禽流感灭活疫苗及其制造方法
专利名称：一种禽流感灭活疫苗及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种禽流感灭活疫苗及其制造方法，属于动物用生物制品技术的领 域。
背景技术：
禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是由禽流感病毒引起的一种急性传染 病，也能感染人类，人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的 肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为 33%。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，区域间的人员和车 辆往来是传播本病的重要途径。禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流 感病毒)引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按 病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。非致病性 禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类 出现轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发 病率和死亡率均高，人感染高致病性禽流感死亡率约是60%，家禽鸡感染的死亡率几乎是 100%，无一幸免。禽流感是世界范围分布的，1994年、1997年、1999年和2003年分别在澳大利亚、
意大利、中国香港、荷兰等地爆发，2005年则主要在东南亚和欧洲爆发。除鸡群中的禽流感 主要发生在冬、春季节外，没有其他明显的规律性。高致病性禽流感疫情的蔓延引起世界关注。禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA 病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些亚型也可感 染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类。甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径80 120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(HA)/和神经氨酸酶 (NA)蛋白抗原性的不同，目前可分为15个H亚型(Hl H15)和9个N亚型(附 N9)。有研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株(H5N2、H7N7、H9N2)，可经6 9个月 禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株(H5m)。这种现象的出现正是由于甲型流感病毒 所具有的HA和NA 二者的遗传性或抗原性漂移及遗传性或抗原性转移导致的抗原性变异所 致(陆承平主编.兽医微生物学第四版.中国农业出版社，1980.)。1997年在香港发现H9N2禽流感病毒也可以由禽直接传染给人。1992年在我国华 南地区已发现H9亚型，1994年分离的代表株为A/chicken/Beijingl/94(H9N2)，直到1998 年前后，才在河北及京津地区的鸡群造成广泛流行。研究表明，流行的病毒是从1994年的 分离株进化而来，具有气溶胶传播的新特点，因此传播率大大提高(陆承平主编.兽医微生 物学第四版.中国农业出版社，1980.)。
发明内容
本发明的目的是利用本发明人分离的一株H9亚型禽流感病毒制备出灭活疫苗用 于鸡预防H9亚型禽流感。本发明所涉及的禽流感灭活疫苗系用本发明人由我国分离到并经过系统鉴定的 一株H9亚型禽流感病毒接种鸡胚培养，收获感染胚液，用甲醛溶液灭活、混合，加常规油佐 剂乳化制成。本发明的详细描述1病毒株来源H9亚型HN307株禽流感病毒是本发明人由我国一个发病鸡场的发病鸡群采集的 病料中分离到，经本发明人实验室检验和鉴定，后经国家禽流感研究中心进行了鉴定，确诊 为禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)H9亚型，命名为HN307株，本病毒已于2010 年02月02日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号 CGMCC No. 3598。2病毒株特性(1)血凝抑制试验按“中国兽药典”HI试验方法，配制4单位HN307株病毒液， 然后用四种阳性血清进行交叉试验。该病毒凝集红细胞的特性能被禽流感H9阳性血清特 异性中和，不能被ND、EDS及H5阳性血清中和。HN307株病毒第1代HA价为71og2，传至第 2代HAHA彡81og2上升为81og2 (AIV H9及H5阳性血清购自哈尔滨兽医研究所)。(2)回归试验将HN307株病毒E2代用灭菌生理盐水10倍稀释后，静脉接种5只 6周龄SPF鸡(SPF鸡胚由北京梅里亚维通试验动物技术有限公司提供，SPF鸡由本厂采用 SPF鸡胚孵化获得)，接种剂量为0. 2ml/羽，接种后第5天，分别取喉头及泄殖腔棉拭子分 离病毒。将分离毒接种SPF鸡后第14天，5只鸡中有1只有轻微呼吸道症状，未见死亡。5 只鸡的喉头及泄殖腔棉拭子，尿囊液HA检验均有血凝性，且能被H9阳性血清中和。(3)毒种传代将AIV HN307株E2代毒种用灭菌生理盐水做10000倍稀释，尿囊 腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0. 1ml，置37°C继续孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去不计， 在24 96小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，装于灭菌容器内，注明收获日期、毒种代 次等，此代毒为E3代毒。按上述方法，将HN307株毒可在鸡胚上复制传代。(4)纯净性1)无菌检验将E3 E10代毒种分别按“中国兽药典”规定的方法进行，利用硫 乙醇酸盐培养基(T. G)、酪胨琼脂斜面(G. A)和葡萄糖蛋白胨汤(G. P)进行无菌检验(中国 兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五年版三部.中国农业出版社，2005，本发 明中简称“中国兽药典”)。2)支原体检验将AIV HN307 E3 E10代毒种分别接种改良Frey氏培养基，按 “中国兽药典”规定方法进行检验。3)外源病毒检验采用鸡检验法。3周龄SPF雏鸡30只，分成2组，每组15只， 分别滴鼻接种1 10稀释的毒种，肌肉注射1 10稀释的毒种，免疫21日后，用上述方 法重复免疫一次，设相同条件SPF鸡对照5只。第一次免疫42日后采血，进行有关疫病的 血清抗体检验，检验项目有传染性法氏囊病(IBD)、禽腺病毒I型(Adeno)、产蛋下降综合征 (EDS)、禽脑脊髓炎(AE)、禽流感(AI)H9和H5亚型、禽呼肠孤(RE0)、鸡痘(FP)、传染性喉气管炎(ILT)、鸡传染性支气管炎(IB)、禽白血病(AL)、鸡马立克氏病(MD)、鸡新城疫(ND)、网 状内皮增生病(RE)。结果表明，AIV HN307 E3至E10代毒种无细菌、支原体、外源病毒污染。结果见表 1，表明本发明所涉及的病毒是纯净的。(5)红细胞凝集试验按“中国兽药典”规定方法进行检验，HA效价为8 10 log2。结果见表1.(6)病毒含量测定将AIV HN307毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10_6、 10_7、10_8、10_94个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0. 1ml，置37°C继续 孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去不计，在24 96小时死亡的鸡胚随时取出，置2 8°C保 存，至96小时，取出所有鸡胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价> 61og2者 判为感染，按Reed-Muench法计算EID5(i。结果为病毒含量为107 83 108_32。(见表1)试验结果见表1。表1 AIV HN307株E3 E10代病毒纯净、HA效价及病毒含量检测结果 (7)免疫原性将AIV HN307 E3、E6、E10代毒种分别接种10 11日龄SPF鸡 胚，收获鸡胚液，用甲醛溶液灭活，按水相油相(1 3)的比例制成油乳剂灭活疫苗，按每 羽份0. 5ml颈部皮下注射3周龄的SPF雏鸡10只，同时设条件相同的对照SPF鸡5只，免 疫后3周，各静脉注射AIV HN307病毒液0.2ml (含2X106_°EID5(1)。攻毒后第5日，采集每 只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，置于含有青、链霉素的生理盐水中，无菌检验合格后分别尿囊腔 接种9 11日龄SPF鸡胚5个，每胚0. 2ml，37°C孵育96小时，检测所有鸡胚尿囊液HA效 价。每只鸡棉拭子样品接种的鸡胚中，只要有1枚鸡胚的尿囊液HA效价> 41og2,即可判为 病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。攻毒试验结果见表2。使用AIV HN307 E3、E6和E10代毒种繁殖的病毒源制备 的灭活疫苗免疫3周龄SPF鸡，免疫后3周用AIV HN307攻毒，免疫组病毒分离均为阴性，100%保护，对照组病毒分离阳性率100%。表2 AIV HN307株E3、E6和E10代免疫原性检测结果 (8)特异性将E3、E6、E10代毒种用新城疫、减蛋综合征、禽流感H5、H9亚型特异 性抗血清进行HI试验。HI试验表明，E3、E6和E10代毒种对禽流感病毒H9亚型抗血清为 阳性反应，对新城疫、减蛋综合征、禽流感H5亚型等其它血清均为阴性反应。(9)对鸡胚的毒力将E3、E6、E10代毒种分别用灭菌生理盐水作1000倍稀释，尿 囊腔接种10 11日龄SPF鸡胚10个，每胚0. 1ml，96小时内，E3代毒致死2枚鸡胚，E6代 毒致3枚鸡胚，E10代毒致死2枚鸡胚。所有鸡胚均有明显充血、出血病痕。3疫苗制造(1)制苗材料的选择选发育良好的10 11日龄的健康易感鸡胚(母源抗体检 测禽流感血凝抑制价< 21og2)作为制苗材料。(2)AIV HN307制苗用毒液的制备1)接种将AIV HN307株生产用毒种用灭菌生理盐水作10_3稀释，每胚尿囊腔内 接种0. 1ml。接种后密封针孔，置36 37°C继续孵育，不必翻蛋。2)孵育和观察鸡胚接种后24小时照蛋1次，死亡的鸡胚弃去。此后，每6 8 小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96h，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，立 即置于2 8°C冷却12 24小时。3)收获将冷却后的鸡胚取出，用碘酊、后以75%酒精消毒气室部位的卵壳，然 后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸 取鸡胚液。在收获胚液前，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃 去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚的胚液混为一组。收获后的胚液置于灭菌瓶 中，每组抽样进行检验。留样后，_15°C结冻保存。检验对收获的病毒样品进行无菌检验、红细胞凝集试验和病毒含量测定，应无菌 生长，HA价彡81og2，每0. lml中病毒含量应彡107 5EID5(1。(4)病毒液的灭活1)将AIV病毒液用适当方法(通过数层灭菌纱布)澄清，除去毒液中的大颗粒杂 质，使其成为透明或半透明溶液。2)病毒灭活将检验合格的AIV病毒液，分别加入10%甲醛溶液，使其甲醛溶液的 终浓度均为0. 2 %，边加边摇，使其充分混合，然后放37°C条件下灭活，从抗原液温度升至 37°C开始计时，灭活16小时。灭活完毕后，分别对灭活后的病毒液取样，进行无菌检验及灭 活检验，取样后置2 8°C保存应不超过1个月。5)半成品检验
无菌检验按现行《中国兽药典》附录，分别对浓缩及灭活后的AIV HN307病毒液进 行无菌检验，应无菌生长。灭活检验取灭活后的病毒原液，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0. 2ml，36 37°C下继续孵育，弃去24小时内死亡鸡胚，观察至96小时，非特异性死亡鸡胚应不超过2 个，收获所有鸡胚的胚液，逐个收获的鸡胚液并检测HA效价，应为阴性。如有可疑，应将可 疑的鸡胚液盲传1代，逐个收获的鸡胚液并检测HA效价，应全部为阴性。6)油佐剂灭活疫苗的制备1)油相制备取注射用白油(按现行《中国兽药典》附录)94份，加硬脂酸铝2份， 边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 6份，混合后，高压灭菌备用。2)水相制备将灭活的AIV病毒液96份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分摇动，直到 吐温-80完全溶解。3)乳化将3份油相注入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入1份水相，加完后，中速 混合，然后高速乳化。在乳化终止前加入硫柳汞液，使其终浓度为0.01%。乳化后，取 疫苗5ml加入离心管中，以3500r/min离心15min，应不出现分层，若有分层现象，应重复搅 拌一次。制成禽流感灭活疫苗。4成品检验(1)性状外观白色均勻乳剂。剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。黏度用lml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗 1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0. 4ml所需时间，应在8s以内。稳定性用长度为100mm、直径为10mm的小圆底试管，加入5ml疫苗，以3500r/min 离心15min，应不出现明显分层。(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。(3)安全检验用3 5周龄SPF鸡10只，每只颈背部皮下或胸部肌肉注射疫苗2 羽份(1.0ml)，观察14日，应不出现由疫苗引起的局部和全身反应。(4)效力检验下列方法任择其一。1)血清学方法取3 6周龄SPF鸡10只，各颈部皮下注射待检成品1羽份 (0. 5ml)。接种21日后，连同5只SPF对照鸡，采血，测定HI抗体效价。免疫鸡HI抗体几 何平均效价应彡6. 51og2 ；对照鸡HI抗体效价应< 21og2。2)免疫攻毒法取3 6周龄SPF鸡10只，各颈部皮下注射待检成品0. 5ml。接种 21日后，连同5只SPF对照鸡，各静脉注射AIV HN307病毒液0. 2ml (含2X 106EID5(1)。攻 毒后第5日，采集每只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，置于含青、链霉素的生理盐水中，分别尿囊 腔接种9 11日龄SPF鸡胚5个，每胚0. 2ml，37°C孵育96小时，检测所有鸡胚尿囊液HA 效价。每个棉拭子样品接种的鸡胚中只要有1个鸡胚的尿囊液HA效价> 41og2,即可判为 病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。免疫鸡中应至少9只 鸡病毒分离阴性，对照鸡应至少4只病毒分离为阳性。
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5作用与用途用于预防H9亚型禽流感。免疫接种后14 21日产生免疫力。免疫 期为6个月。6用法与用量开产前(16 20周龄)产蛋鸡，颈部皮下或肌肉注射，每只0. 5ml。本发明的积极意义本发明涉及一种禽流感灭活疫苗及其制造方法。本发明所涉及的疫苗含有经灭活 的H9亚型禽流感病毒液和常规油佐剂；本发明是用H9亚型HN307株禽流感病毒分别接种 鸡胚培养，收获感染胚液，经甲醛溶液灭活，加常规油佐剂乳化制成。用本发明方法制备的 疫苗接种鸡能安全有效的预防H9亚型禽流感。
实施例本发明的实施例为进一步说明本发明，但这些实施例不构成对本发明的限制。实施例1疫苗安全性研究用本发明人制备的四批鸡禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HN307株)产品(批号分 别为01、02、03和04)进行安全检验。SPF鸡由山东某SPF鸡场提供；普通产蛋鸡，由山东 某种鸡场提供。(1)最小日龄鸡安全试验将不同批次鸡禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HN307株) 分别接种1日龄、5日龄SPF鸡，每组10只，颈部皮下注射0. 5ml/只(1羽份)，设相同条件 SPF鸡对照5只。观察2周，检查注射部位和全身反应情况。试验结果表明1日龄和5日 龄SPF鸡通过颈部皮下途径注射0. 5ml疫苗后，全身无任何不良反应，注射部位无红肿、溃 烂等现象，吸收良好，见表3。表31最小日龄SPF鸡疫苗安全性检验结果
注分子表示安全检验有异常反应的试验鸡数量，分母为试验鸡数量。
(2)不同接种途径的安全试验将不同批次鸡禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HN307
8株)分别以颈部皮下和胸部肌肉两种接种途径，接种5周龄SPF鸡，每组10只，每只1ml，设 相同条件SPF鸡对照5只。观察2周，检查注射部位和全身反应情况。试验表明，两种免疫 途径均具有较好的安全性，见表4。表4疫苗不同接种途径安全性检验结果
疫苗批号 接种途径 全身反应 注射部位 注分子表示安全检验有异常的试验鸡数量，分母为试验鸡数量。(3)单剂量重复接种安全试验将不同批次鸡禽流感(Η9亚型)灭活疫苗(ΗΝ307 株)分别接种4周龄SPF鸡，颈部皮下注射0. 5ml/只，每组10只，免疫2周后颈部皮下注 射0. 5ml/只，间隔2周后再颈部皮下注射0. 5ml/只，观察鸡只反应。设非免疫对照5只。 接种鸡精神、饮水和采食均无异常反应，观察2周，解剖观察注射部位，疫苗基本完全吸收， 无坏死或硬结。详细结果见表5。 表5单剂量重复接种安全性检验结果 注分子表示安全检验有异常的试验鸡数量，分母为试验鸡数量。(4)不同接种剂量安全性试验取3周龄SPF鸡，分别以不同剂量(0.5ml、lml、1. 5ml和2ml)颈部皮下注射鸡禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HN307株)，每组接种10只鸡， 观察14日，解剖观察注射部位有无异常。设非免疫对照5只。试验结果表明鸡只无全身不 良反应，注射部位吸收较好，结果见表6。表6疫苗不同接种剂量安全性检验结果 注分子表示安全检验有异常的试验鸡数量，分母为试验鸡只数。(5)疫苗对产蛋鸡生产性能的影响试验将不同批次疫苗分别接种28周龄高产蛋 鸡各500只，每只肌肉注射0. 5ml。另设空白对照组各500只，在相同条件下饲养，观察2 周，记录每组每天产蛋量和临床表现。产蛋率结果见表7，接种疫苗和对照(不注射疫苗)， 各组在注射疫苗后的各种生产性能指标无明显差异，表明疫苗接种鸡群对疫苗的应激反应很小。表7疫苗对产蛋鸡安全性试验 5 结论(1)疫苗对1日龄和5日龄SPF鸡接种是安全的。(2)通过颈部皮下和肌肉注射接种5周龄SPF鸡，每只2羽份，证实疫苗是安全的。(3)疫苗单剂量重复接种3次，接种鸡精神、采食和饮水均无异常反应，说明单剂 量重复接种本疫苗也是安全的。(4)以1 4个羽份疫苗剂量接种SPF我’结果表明是安全的。(5)通过对高产期蛋鸡接种，证实该疫苗对高产期蛋鸡是安全的。实施例2疫苗最小免疫剂量研究1. 6疫苗最小免疫剂量试验每批次的疫苗取4周龄SPF鸡50只，每组10只分别接种不同的免疫剂量(0. 05ml/ 羽，0. Iml/羽，0. 3ml/羽和0. 5ml/羽)，同时设SPF鸡对照5只。免疫21日后，每只鸡采血 0. 5ml,HI方法检测禽流感(H9亚型)抗体效价，然后分别各静脉注射10倍稀释的AIVHN307 毒液0. 2ml (含2X IO6EID5tl)。攻毒后第5日，采集每只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，置于2ml的 含有青链霉素的灭菌生理盐水中，分别接种10日龄SPF鸡胚5个，进行病毒分离，检测HA 效价，HA检测为阴性的样品需盲传一代。抗体检测结果见表8。表8不同剂量接种后HI抗体几何平均效价(log2)及攻毒试验 *注分子表示发病/病毒分离阳性鸡数量，分母表示攻毒鸡数量。血清抗体效价与免疫剂量成正相关。禽流感Η9亚型抗体效价有2批低于6. 01og2， 随着免疫剂量的增加，0. Iml 0. 5ml免疫剂量均可达到较好的免疫效果。AIV HN307株攻 毒后，10只鸡均保护9只以上，而对照组病毒分离均为阳性。结论通过对不同免疫剂量所产生的疫苗抗体水平和攻毒保护效果综合分析， 0. Iml/羽为最小免疫剂量，推荐的常规免疫剂量为0. 5ml/羽。实施例3疫苗免疫持续期研究疫苗的应用对象主要是产蛋鸡，试验选用开产前蛋鸡。每批次疫苗免疫100只，每只0. 5ml，胸部肌肉注射，同时设同条件下饲养的未免疫对照鸡30只。免疫前及免疫后1、3、6、8个月测定HI抗体效价(检测用H9亚型禽流感 血凝抗原购自哈尔滨兽医研究所)；免疫后3个月、6个月和8个月，每组各取10只免疫鸡， 同时取相近日龄的SPF鸡5只，进行H9亚型禽流感病毒强毒(HN307株)攻毒，病毒液用生 理盐水进行10倍稀释后，每只静脉注射0. 2ml (约含2 X IO6EID50)。接种疫苗后禽流感H9抗体检测结果见表9。表9HI抗体几何平均效价(log2)
…n免疫后时间(月) 不同批次疫苗产生的H9抗体水平基本一致，免疫后1个月抗体上升至高峰，为 10. 0 10. 31og2 ；免疫后3个月，为8. 0 8. 31og2 ；免疫后6个月，为6. 5 6. 91og2 ；免 疫后8个月，为5. 5 6. 01og2。而对照组抗体为逐渐下降趋势。接种后AIV HN307攻毒试验结果见表10。表10AIV HN307 攻毒结果
不同时间(月)攻毒病毒分离率
疫苗批次 .............................................................................................
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010/100/100/10020/100/101/10
030/100/102/10
040/100/100/10
SPF 鸡对照5/55/55/5注分子表示攻毒后病毒分离阳性鸡数量，分母为攻毒鸡数。对照鸡攻毒后病毒分离全部为阳性，免疫后6个月内免疫鸡保护率为100%，免疫 后8个月03批疫苗保护效果降低为8/10。通过对接种所产生的抗体水平和攻毒保护效果综合分析，使用剂量0. 5ml/羽，开 产前免疫一次，禽流感H9亚型免疫期可达6个月。
权利要求
一种禽流感灭活疫苗灭活疫苗，其特征在于本品含有经灭活的H9亚型HN307株禽流感病毒，本病毒已于2010年02月02日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号CGMCC No.3598，病毒液和常规油佐剂。
2.一种禽流感灭活疫苗的制造方法，其特征在于本品系用接种鸡胚培养，收获感染胚 液，经甲醛溶液灭活，加常规油佐剂乳化制成。
全文摘要
本发明涉及一种禽流感灭活疫苗及其制造方法，本发明所涉及的疫苗含有经灭活的H9亚型禽流感病毒液和常规油佐剂；本发明是用H9亚型HN307株禽流感病毒(CGMCCNo.3598)分别接种鸡胚培养，收获感染胚液，经甲醛溶液灭活，加常规油佐剂乳化制成。用本发明方法制备的疫苗接种鸡能安全有效的预防H9亚型禽流感。
文档编号A61P31/16GK101843900SQ20101010594
公开日2010年9月29日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者丰素兰, 何海蓉, 刘莉, 周建民, 岳建新, 彭平, 李吉轩, 杨培豫, 梅忠 申请人:乾元浩生物股份有限公司
技术领域：
本发明涉及一种禽流感灭活疫苗及其制造方法，属于动物用生物制品技术的领 域。
背景技术：
禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是由禽流感病毒引起的一种急性传染 病，也能感染人类，人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的 肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为 33%。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，区域间的人员和车 辆往来是传播本病的重要途径。禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流 感病毒)引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按 病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。非致病性 禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类 出现轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发 病率和死亡率均高，人感染高致病性禽流感死亡率约是60%，家禽鸡感染的死亡率几乎是 100%，无一幸免。禽流感是世界范围分布的，1994年、1997年、1999年和2003年分别在澳大利亚、
意大利、中国香港、荷兰等地爆发，2005年则主要在东南亚和欧洲爆发。除鸡群中的禽流感 主要发生在冬、春季节外，没有其他明显的规律性。高致病性禽流感疫情的蔓延引起世界关注。禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA 病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些亚型也可感 染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类。甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径80 120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(HA)/和神经氨酸酶 (NA)蛋白抗原性的不同，目前可分为15个H亚型(Hl H15)和9个N亚型(附 N9)。有研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株(H5N2、H7N7、H9N2)，可经6 9个月 禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株(H5m)。这种现象的出现正是由于甲型流感病毒 所具有的HA和NA 二者的遗传性或抗原性漂移及遗传性或抗原性转移导致的抗原性变异所 致(陆承平主编.兽医微生物学第四版.中国农业出版社，1980.)。1997年在香港发现H9N2禽流感病毒也可以由禽直接传染给人。1992年在我国华 南地区已发现H9亚型，1994年分离的代表株为A/chicken/Beijingl/94(H9N2)，直到1998 年前后，才在河北及京津地区的鸡群造成广泛流行。研究表明，流行的病毒是从1994年的 分离株进化而来，具有气溶胶传播的新特点，因此传播率大大提高(陆承平主编.兽医微生 物学第四版.中国农业出版社，1980.)。
发明内容
本发明的目的是利用本发明人分离的一株H9亚型禽流感病毒制备出灭活疫苗用 于鸡预防H9亚型禽流感。本发明所涉及的禽流感灭活疫苗系用本发明人由我国分离到并经过系统鉴定的 一株H9亚型禽流感病毒接种鸡胚培养，收获感染胚液，用甲醛溶液灭活、混合，加常规油佐 剂乳化制成。本发明的详细描述1病毒株来源H9亚型HN307株禽流感病毒是本发明人由我国一个发病鸡场的发病鸡群采集的 病料中分离到，经本发明人实验室检验和鉴定，后经国家禽流感研究中心进行了鉴定，确诊 为禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)H9亚型，命名为HN307株，本病毒已于2010 年02月02日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号 CGMCC No. 3598。2病毒株特性(1)血凝抑制试验按“中国兽药典”HI试验方法，配制4单位HN307株病毒液， 然后用四种阳性血清进行交叉试验。该病毒凝集红细胞的特性能被禽流感H9阳性血清特 异性中和，不能被ND、EDS及H5阳性血清中和。HN307株病毒第1代HA价为71og2，传至第 2代HAHA彡81og2上升为81og2 (AIV H9及H5阳性血清购自哈尔滨兽医研究所)。(2)回归试验将HN307株病毒E2代用灭菌生理盐水10倍稀释后，静脉接种5只 6周龄SPF鸡(SPF鸡胚由北京梅里亚维通试验动物技术有限公司提供，SPF鸡由本厂采用 SPF鸡胚孵化获得)，接种剂量为0. 2ml/羽，接种后第5天，分别取喉头及泄殖腔棉拭子分 离病毒。将分离毒接种SPF鸡后第14天，5只鸡中有1只有轻微呼吸道症状，未见死亡。5 只鸡的喉头及泄殖腔棉拭子，尿囊液HA检验均有血凝性，且能被H9阳性血清中和。(3)毒种传代将AIV HN307株E2代毒种用灭菌生理盐水做10000倍稀释，尿囊 腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0. 1ml，置37°C继续孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去不计， 在24 96小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，装于灭菌容器内，注明收获日期、毒种代 次等，此代毒为E3代毒。按上述方法，将HN307株毒可在鸡胚上复制传代。(4)纯净性1)无菌检验将E3 E10代毒种分别按“中国兽药典”规定的方法进行，利用硫 乙醇酸盐培养基(T. G)、酪胨琼脂斜面(G. A)和葡萄糖蛋白胨汤(G. P)进行无菌检验(中国 兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五年版三部.中国农业出版社，2005，本发 明中简称“中国兽药典”)。2)支原体检验将AIV HN307 E3 E10代毒种分别接种改良Frey氏培养基，按 “中国兽药典”规定方法进行检验。3)外源病毒检验采用鸡检验法。3周龄SPF雏鸡30只，分成2组，每组15只， 分别滴鼻接种1 10稀释的毒种，肌肉注射1 10稀释的毒种，免疫21日后，用上述方 法重复免疫一次，设相同条件SPF鸡对照5只。第一次免疫42日后采血，进行有关疫病的 血清抗体检验，检验项目有传染性法氏囊病(IBD)、禽腺病毒I型(Adeno)、产蛋下降综合征 (EDS)、禽脑脊髓炎(AE)、禽流感(AI)H9和H5亚型、禽呼肠孤(RE0)、鸡痘(FP)、传染性喉气管炎(ILT)、鸡传染性支气管炎(IB)、禽白血病(AL)、鸡马立克氏病(MD)、鸡新城疫(ND)、网 状内皮增生病(RE)。结果表明，AIV HN307 E3至E10代毒种无细菌、支原体、外源病毒污染。结果见表 1，表明本发明所涉及的病毒是纯净的。(5)红细胞凝集试验按“中国兽药典”规定方法进行检验，HA效价为8 10 log2。结果见表1.(6)病毒含量测定将AIV HN307毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10_6、 10_7、10_8、10_94个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0. 1ml，置37°C继续 孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去不计，在24 96小时死亡的鸡胚随时取出，置2 8°C保 存，至96小时，取出所有鸡胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价> 61og2者 判为感染，按Reed-Muench法计算EID5(i。结果为病毒含量为107 83 108_32。(见表1)试验结果见表1。表1 AIV HN307株E3 E10代病毒纯净、HA效价及病毒含量检测结果 (7)免疫原性将AIV HN307 E3、E6、E10代毒种分别接种10 11日龄SPF鸡 胚，收获鸡胚液，用甲醛溶液灭活，按水相油相(1 3)的比例制成油乳剂灭活疫苗，按每 羽份0. 5ml颈部皮下注射3周龄的SPF雏鸡10只，同时设条件相同的对照SPF鸡5只，免 疫后3周，各静脉注射AIV HN307病毒液0.2ml (含2X106_°EID5(1)。攻毒后第5日，采集每 只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，置于含有青、链霉素的生理盐水中，无菌检验合格后分别尿囊腔 接种9 11日龄SPF鸡胚5个，每胚0. 2ml，37°C孵育96小时，检测所有鸡胚尿囊液HA效 价。每只鸡棉拭子样品接种的鸡胚中，只要有1枚鸡胚的尿囊液HA效价> 41og2,即可判为 病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。攻毒试验结果见表2。使用AIV HN307 E3、E6和E10代毒种繁殖的病毒源制备 的灭活疫苗免疫3周龄SPF鸡，免疫后3周用AIV HN307攻毒，免疫组病毒分离均为阴性，100%保护，对照组病毒分离阳性率100%。表2 AIV HN307株E3、E6和E10代免疫原性检测结果 (8)特异性将E3、E6、E10代毒种用新城疫、减蛋综合征、禽流感H5、H9亚型特异 性抗血清进行HI试验。HI试验表明，E3、E6和E10代毒种对禽流感病毒H9亚型抗血清为 阳性反应，对新城疫、减蛋综合征、禽流感H5亚型等其它血清均为阴性反应。(9)对鸡胚的毒力将E3、E6、E10代毒种分别用灭菌生理盐水作1000倍稀释，尿 囊腔接种10 11日龄SPF鸡胚10个，每胚0. 1ml，96小时内，E3代毒致死2枚鸡胚，E6代 毒致3枚鸡胚，E10代毒致死2枚鸡胚。所有鸡胚均有明显充血、出血病痕。3疫苗制造(1)制苗材料的选择选发育良好的10 11日龄的健康易感鸡胚(母源抗体检 测禽流感血凝抑制价< 21og2)作为制苗材料。(2)AIV HN307制苗用毒液的制备1)接种将AIV HN307株生产用毒种用灭菌生理盐水作10_3稀释，每胚尿囊腔内 接种0. 1ml。接种后密封针孔，置36 37°C继续孵育，不必翻蛋。2)孵育和观察鸡胚接种后24小时照蛋1次，死亡的鸡胚弃去。此后，每6 8 小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96h，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，立 即置于2 8°C冷却12 24小时。3)收获将冷却后的鸡胚取出，用碘酊、后以75%酒精消毒气室部位的卵壳，然 后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸 取鸡胚液。在收获胚液前，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃 去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚的胚液混为一组。收获后的胚液置于灭菌瓶 中，每组抽样进行检验。留样后，_15°C结冻保存。检验对收获的病毒样品进行无菌检验、红细胞凝集试验和病毒含量测定，应无菌 生长，HA价彡81og2，每0. lml中病毒含量应彡107 5EID5(1。(4)病毒液的灭活1)将AIV病毒液用适当方法(通过数层灭菌纱布)澄清，除去毒液中的大颗粒杂 质，使其成为透明或半透明溶液。2)病毒灭活将检验合格的AIV病毒液，分别加入10%甲醛溶液，使其甲醛溶液的 终浓度均为0. 2 %，边加边摇，使其充分混合，然后放37°C条件下灭活，从抗原液温度升至 37°C开始计时，灭活16小时。灭活完毕后，分别对灭活后的病毒液取样，进行无菌检验及灭 活检验，取样后置2 8°C保存应不超过1个月。5)半成品检验
无菌检验按现行《中国兽药典》附录，分别对浓缩及灭活后的AIV HN307病毒液进 行无菌检验，应无菌生长。灭活检验取灭活后的病毒原液，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0. 2ml，36 37°C下继续孵育，弃去24小时内死亡鸡胚，观察至96小时，非特异性死亡鸡胚应不超过2 个，收获所有鸡胚的胚液，逐个收获的鸡胚液并检测HA效价，应为阴性。如有可疑，应将可 疑的鸡胚液盲传1代，逐个收获的鸡胚液并检测HA效价，应全部为阴性。6)油佐剂灭活疫苗的制备1)油相制备取注射用白油(按现行《中国兽药典》附录)94份，加硬脂酸铝2份， 边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 6份，混合后，高压灭菌备用。2)水相制备将灭活的AIV病毒液96份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分摇动，直到 吐温-80完全溶解。3)乳化将3份油相注入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入1份水相，加完后，中速 混合，然后高速乳化。在乳化终止前加入硫柳汞液，使其终浓度为0.01%。乳化后，取 疫苗5ml加入离心管中，以3500r/min离心15min，应不出现分层，若有分层现象，应重复搅 拌一次。制成禽流感灭活疫苗。4成品检验(1)性状外观白色均勻乳剂。剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。黏度用lml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗 1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0. 4ml所需时间，应在8s以内。稳定性用长度为100mm、直径为10mm的小圆底试管，加入5ml疫苗，以3500r/min 离心15min，应不出现明显分层。(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。(3)安全检验用3 5周龄SPF鸡10只，每只颈背部皮下或胸部肌肉注射疫苗2 羽份(1.0ml)，观察14日，应不出现由疫苗引起的局部和全身反应。(4)效力检验下列方法任择其一。1)血清学方法取3 6周龄SPF鸡10只，各颈部皮下注射待检成品1羽份 (0. 5ml)。接种21日后，连同5只SPF对照鸡，采血，测定HI抗体效价。免疫鸡HI抗体几 何平均效价应彡6. 51og2 ；对照鸡HI抗体效价应< 21og2。2)免疫攻毒法取3 6周龄SPF鸡10只，各颈部皮下注射待检成品0. 5ml。接种 21日后，连同5只SPF对照鸡，各静脉注射AIV HN307病毒液0. 2ml (含2X 106EID5(1)。攻 毒后第5日，采集每只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，置于含青、链霉素的生理盐水中，分别尿囊 腔接种9 11日龄SPF鸡胚5个，每胚0. 2ml，37°C孵育96小时，检测所有鸡胚尿囊液HA 效价。每个棉拭子样品接种的鸡胚中只要有1个鸡胚的尿囊液HA效价> 41og2,即可判为 病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。免疫鸡中应至少9只 鸡病毒分离阴性，对照鸡应至少4只病毒分离为阳性。
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5作用与用途用于预防H9亚型禽流感。免疫接种后14 21日产生免疫力。免疫 期为6个月。6用法与用量开产前(16 20周龄)产蛋鸡，颈部皮下或肌肉注射，每只0. 5ml。本发明的积极意义本发明涉及一种禽流感灭活疫苗及其制造方法。本发明所涉及的疫苗含有经灭活 的H9亚型禽流感病毒液和常规油佐剂；本发明是用H9亚型HN307株禽流感病毒分别接种 鸡胚培养，收获感染胚液，经甲醛溶液灭活，加常规油佐剂乳化制成。用本发明方法制备的 疫苗接种鸡能安全有效的预防H9亚型禽流感。
实施例本发明的实施例为进一步说明本发明，但这些实施例不构成对本发明的限制。实施例1疫苗安全性研究用本发明人制备的四批鸡禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HN307株)产品(批号分 别为01、02、03和04)进行安全检验。SPF鸡由山东某SPF鸡场提供；普通产蛋鸡，由山东 某种鸡场提供。(1)最小日龄鸡安全试验将不同批次鸡禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HN307株) 分别接种1日龄、5日龄SPF鸡，每组10只，颈部皮下注射0. 5ml/只(1羽份)，设相同条件 SPF鸡对照5只。观察2周，检查注射部位和全身反应情况。试验结果表明1日龄和5日 龄SPF鸡通过颈部皮下途径注射0. 5ml疫苗后，全身无任何不良反应，注射部位无红肿、溃 烂等现象，吸收良好，见表3。表31最小日龄SPF鸡疫苗安全性检验结果
注分子表示安全检验有异常反应的试验鸡数量，分母为试验鸡数量。
(2)不同接种途径的安全试验将不同批次鸡禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HN307
8株)分别以颈部皮下和胸部肌肉两种接种途径，接种5周龄SPF鸡，每组10只，每只1ml，设 相同条件SPF鸡对照5只。观察2周，检查注射部位和全身反应情况。试验表明，两种免疫 途径均具有较好的安全性，见表4。表4疫苗不同接种途径安全性检验结果
疫苗批号 接种途径 全身反应 注射部位 注分子表示安全检验有异常的试验鸡数量，分母为试验鸡数量。(3)单剂量重复接种安全试验将不同批次鸡禽流感(Η9亚型)灭活疫苗(ΗΝ307 株)分别接种4周龄SPF鸡，颈部皮下注射0. 5ml/只，每组10只，免疫2周后颈部皮下注 射0. 5ml/只，间隔2周后再颈部皮下注射0. 5ml/只，观察鸡只反应。设非免疫对照5只。 接种鸡精神、饮水和采食均无异常反应，观察2周，解剖观察注射部位，疫苗基本完全吸收， 无坏死或硬结。详细结果见表5。 表5单剂量重复接种安全性检验结果 注分子表示安全检验有异常的试验鸡数量，分母为试验鸡数量。(4)不同接种剂量安全性试验取3周龄SPF鸡，分别以不同剂量(0.5ml、lml、1. 5ml和2ml)颈部皮下注射鸡禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HN307株)，每组接种10只鸡， 观察14日，解剖观察注射部位有无异常。设非免疫对照5只。试验结果表明鸡只无全身不 良反应，注射部位吸收较好，结果见表6。表6疫苗不同接种剂量安全性检验结果 注分子表示安全检验有异常的试验鸡数量，分母为试验鸡只数。(5)疫苗对产蛋鸡生产性能的影响试验将不同批次疫苗分别接种28周龄高产蛋 鸡各500只，每只肌肉注射0. 5ml。另设空白对照组各500只，在相同条件下饲养，观察2 周，记录每组每天产蛋量和临床表现。产蛋率结果见表7，接种疫苗和对照(不注射疫苗)， 各组在注射疫苗后的各种生产性能指标无明显差异，表明疫苗接种鸡群对疫苗的应激反应很小。表7疫苗对产蛋鸡安全性试验 5 结论(1)疫苗对1日龄和5日龄SPF鸡接种是安全的。(2)通过颈部皮下和肌肉注射接种5周龄SPF鸡，每只2羽份，证实疫苗是安全的。(3)疫苗单剂量重复接种3次，接种鸡精神、采食和饮水均无异常反应，说明单剂 量重复接种本疫苗也是安全的。(4)以1 4个羽份疫苗剂量接种SPF我’结果表明是安全的。(5)通过对高产期蛋鸡接种，证实该疫苗对高产期蛋鸡是安全的。实施例2疫苗最小免疫剂量研究1. 6疫苗最小免疫剂量试验每批次的疫苗取4周龄SPF鸡50只，每组10只分别接种不同的免疫剂量(0. 05ml/ 羽，0. Iml/羽，0. 3ml/羽和0. 5ml/羽)，同时设SPF鸡对照5只。免疫21日后，每只鸡采血 0. 5ml,HI方法检测禽流感(H9亚型)抗体效价，然后分别各静脉注射10倍稀释的AIVHN307 毒液0. 2ml (含2X IO6EID5tl)。攻毒后第5日，采集每只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，置于2ml的 含有青链霉素的灭菌生理盐水中，分别接种10日龄SPF鸡胚5个，进行病毒分离，检测HA 效价，HA检测为阴性的样品需盲传一代。抗体检测结果见表8。表8不同剂量接种后HI抗体几何平均效价(log2)及攻毒试验 *注分子表示发病/病毒分离阳性鸡数量，分母表示攻毒鸡数量。血清抗体效价与免疫剂量成正相关。禽流感Η9亚型抗体效价有2批低于6. 01og2， 随着免疫剂量的增加，0. Iml 0. 5ml免疫剂量均可达到较好的免疫效果。AIV HN307株攻 毒后，10只鸡均保护9只以上，而对照组病毒分离均为阳性。结论通过对不同免疫剂量所产生的疫苗抗体水平和攻毒保护效果综合分析， 0. Iml/羽为最小免疫剂量，推荐的常规免疫剂量为0. 5ml/羽。实施例3疫苗免疫持续期研究疫苗的应用对象主要是产蛋鸡，试验选用开产前蛋鸡。每批次疫苗免疫100只，每只0. 5ml，胸部肌肉注射，同时设同条件下饲养的未免疫对照鸡30只。免疫前及免疫后1、3、6、8个月测定HI抗体效价(检测用H9亚型禽流感 血凝抗原购自哈尔滨兽医研究所)；免疫后3个月、6个月和8个月，每组各取10只免疫鸡， 同时取相近日龄的SPF鸡5只，进行H9亚型禽流感病毒强毒(HN307株)攻毒，病毒液用生 理盐水进行10倍稀释后，每只静脉注射0. 2ml (约含2 X IO6EID50)。接种疫苗后禽流感H9抗体检测结果见表9。表9HI抗体几何平均效价(log2)
…n免疫后时间(月) 不同批次疫苗产生的H9抗体水平基本一致，免疫后1个月抗体上升至高峰，为 10. 0 10. 31og2 ；免疫后3个月，为8. 0 8. 31og2 ；免疫后6个月，为6. 5 6. 91og2 ；免 疫后8个月，为5. 5 6. 01og2。而对照组抗体为逐渐下降趋势。接种后AIV HN307攻毒试验结果见表10。表10AIV HN307 攻毒结果
不同时间(月)攻毒病毒分离率
疫苗批次 .............................................................................................
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010/100/100/10020/100/101/10
030/100/102/10
040/100/100/10
SPF 鸡对照5/55/55/5注分子表示攻毒后病毒分离阳性鸡数量，分母为攻毒鸡数。对照鸡攻毒后病毒分离全部为阳性，免疫后6个月内免疫鸡保护率为100%，免疫 后8个月03批疫苗保护效果降低为8/10。通过对接种所产生的抗体水平和攻毒保护效果综合分析，使用剂量0. 5ml/羽，开 产前免疫一次，禽流感H9亚型免疫期可达6个月。
权利要求
一种禽流感灭活疫苗灭活疫苗，其特征在于本品含有经灭活的H9亚型HN307株禽流感病毒，本病毒已于2010年02月02日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号CGMCC No.3598，病毒液和常规油佐剂。
2.一种禽流感灭活疫苗的制造方法，其特征在于本品系用接种鸡胚培养，收获感染胚 液，经甲醛溶液灭活，加常规油佐剂乳化制成。
全文摘要
本发明涉及一种禽流感灭活疫苗及其制造方法，本发明所涉及的疫苗含有经灭活的H9亚型禽流感病毒液和常规油佐剂；本发明是用H9亚型HN307株禽流感病毒(CGMCCNo.3598)分别接种鸡胚培养，收获感染胚液，经甲醛溶液灭活，加常规油佐剂乳化制成。用本发明方法制备的疫苗接种鸡能安全有效的预防H9亚型禽流感。
文档编号A61P31/16GK101843900SQ20101010594
公开日2010年9月29日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者丰素兰, 何海蓉, 刘莉, 周建民, 岳建新, 彭平, 李吉轩, 杨培豫, 梅忠 申请人:乾元浩生物股份有限公司
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