梭状芽孢杆菌神经毒素在组织愈合中的用途的制作方法
专利名称：梭状芽孢杆菌神经毒素在组织愈合中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过施用天然产生的和/或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素，和/或不含有络合蛋白的神经毒素促进受伤组织的愈合。该神经毒素可用于促进伤口愈合(包括预防疤痕形成)并且可应用于眼科领域，例如，通过例如闭合发炎的眼睛用于治疗受伤的角膜组织。还涉及它们的诊断用途和在本文中用作药物。
背景技术：
本发明涉及使用天然产生的和/或修饰的神经毒素促进受伤表面或浅表组织愈合。来源于血清型A、B、C1、D、E、F和G肉毒杆菌(Clostridium botulinum)神经毒素，以及梭状芽孢杆菌神经毒素中天然产生的不含络合蛋白的梭状芽孢杆菌神经毒素可用于增强或促进上述愈合。作用持续时间短的梭状芽孢杆菌神经毒素，例如E或F型已经用于某些希望肌肉麻痹时间相对短暂的情况中，例如快速愈合的伤口的治疗中。具有更短的生物学持久性的梭状芽孢杆菌神经毒素可降低抗体产生，由此保持梭状芽孢杆菌神经毒素在伤口愈合中的治疗效果。
损伤或外科介入后的伤口边缘的张力可对伤口愈合产生不利影响。反射性肌收缩，尤其可伴随发生止痛效果的降低，可能会使任何未愈合的伤口边缘移位。该移位可促使病原体进入其中并且，最坏的是，需要二次愈合治疗。在二次愈合中，必须再次打开手术伤口，每天清洁数次。必须经常地清除坏死的组织(清创术)。二次愈合与初次愈合相比需要相当长的时间不仅费力和需要额外的支出，而且导致外观令人不满意的大疤痕。它还可能导致未缝合在一起的肌肉粘连，愈合后结缔组织有瘢痕的肌肉收缩时偶然会发生疼痛。为避免该情况通常固定受伤区域。这可通过例如使用夹板，专门的绷带或其他固定和定位器械来完成。然而，这些目前使用的方法在很多情况中是不充分的和/或不方便的，并且通常不能使用，尤其是对手术后或腹部的伤口。
厌氧菌、革兰氏阳性菌肉毒杆菌产生一种有效的多肽神经毒素，肉毒素，它能导致人类和动物的神经性麻痹疾病，即肉毒杆菌中毒。在泥土中发现了肉毒杆菌的芽孢，可在不正确消毒的和密封的家庭式罐头工厂的食品容器中生长，这是许多肉毒杆菌中毒的起因。肉毒杆菌中毒的影响典型地发生在食用被肉毒杆菌污染的食物后的18至36小时。肉毒杆菌毒素可不减弱地通过肠壁，因为其通过络合蛋白，例如红血球凝聚素和无毒的，非红血球凝聚蛋白，而免受胰蛋白酶的攻击。纯的神经毒素经过肠的再吸收影响末梢运动神经元。肉毒杆菌毒素的中毒症状可从走路困难、吞咽困难和说话困难发展到呼吸肌麻痹和死亡。
肉毒杆菌毒素是人类已知的最致命的天然生物试剂。在小鼠中胃肠外施用肉毒杆菌毒素(纯化的神经毒素)血清型A(BoNT/A)约5-6微微克是一个MLD(最小致死量)。一单位(U)肉毒杆菌毒素定义为每只重量为18-20g的雌性Swiss Webster小鼠腹膜内注射的MLD。已表征了7种免疫特异性肉毒杆菌毒素类型，分别为肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，它们每一种之间通过与血清特异性抗体的中和作用互相区别。肉毒杆菌毒素的不同血清型根据其感染的动物种类，和其导致麻痹的严重程度和持续时间的不同而变化。例如，当在大鼠中测量产生麻痹几率时，确定BoNT/A是肉毒杆菌毒素血清型B(BoNT/B)效力的500倍。此外，BoNT/B在灵长类动物中以480U/kg的剂量施用时是无毒的，而该剂量大约是BoNT/A在灵长类动物中的MLD的12倍。相反，给小鼠注射时，血清型A的麻痹持续时间是E型的10倍。BoNT/C1则优先作用于鸟类。
肉毒杆菌毒素已在临床上用于治疗神经肌肉的失调，所述疾病的特征为由病理性末梢神经的活动过度导致的骨骼肌机能亢进。BoNT/A已被U.S.食品和药物管理局批准用于治疗眼睑痉挛、斜视和半侧颜面痉挛。非血清型A的肉毒杆菌毒素血清型与BoNT/A相比显然具有较低的活性和/或较短的作用时间。外周肌内注射BoNT/A后往往能在一周内看到临床效果。单次肌内注射BoNT/A后症状缓解的典型持续时间平均能保持三个月。
所有肉毒杆菌毒素血清型明显抑制神经递质乙酰胆碱在神经肌肉接合处的释放；然而，它们通过影响不同的神经分泌蛋白并且在不同的部位裂解这些蛋白来完成上述功能。例如，肉毒杆菌血清型A和E都能裂解25千道尔顿(kD)突触体联合蛋白(SNAP-25)；然而，每个毒素在该蛋白中特异的位置裂解蛋白。已发现肉毒杆菌毒素血清型C1(BoNTC1)能裂解突触融合蛋白和SNAP-25。BoNT/B、D、F和G作用于突触小泡相关膜蛋白(VAMP也称为突触小泡蛋白)，并且每个血清型在不同的部位裂解蛋白。这些机理上的差别可能影响各种肉毒杆菌毒素血清型的相对效力和/或作用持续时间。
无论何种血清型，毒素中毒的分子学机制都显示了相同并且包含数个步骤或阶段。梭状芽孢杆菌毒素的神经元内目标通常参与神经递质的释放过程。该过程的第一步，毒素通过H链与细胞表面受体间的特异性相互作用，结合靶神经元的突触前膜；据认为该受体对肉毒杆菌毒素各个血清型是不同的。H链的羧基端片断，Hc，显示在毒素靶向细胞表面中起重要作用。
在第二步中，毒素通过受体介导的细胞内吞作用被吞噬入细胞；形成包含毒素的内涵体。下一步，毒素从内涵体中脱离进入细胞的细胞质。这一步被认为是由H链的氨基端片断HN介导的，其引发毒素在pH约5.5或更低时发生结构改变。已知内涵体具有质子泵，能够降低内涵体内的pH值。毒素的构型改变使其暴露出疏水部分，使毒素将其本身嵌入内涵体膜。然后毒素从内涵体膜转移至细胞质。
肉毒杆菌毒素活性的机制的下一步骤包括连接H和L链的二硫键的还原。肉毒杆菌毒素的全部毒性包含于全毒素的L链内，其必须从重链中分离出来达到其完全活性；L链是锌(Zn++)内肽酶，其在最后的步骤中，选择性地裂解蛋白，该蛋白对包含神经递质的囊泡识别并对接至原生质膜的细胞质表面，以及与原生质膜融合是必需的。
肉毒杆菌神经毒素蛋白质分子的分子量，对于七种已知肉毒杆菌毒素血清型，为约150kD。然而，肉毒杆菌毒素是由梭状芽孢杆菌有机体作为包含150kD肉毒杆菌毒素蛋白质分子和伴随的凝血素以及非毒素蛋白质的络合物释放。因此，梭状芽孢杆菌产生的BoNT/A络合物为900kD、500kD和300kD形式。而产生的BoNT/B和C1则仅为500kD络合物。产生的BoNT/D为300kD和500kD络合物。最后，产生的BoNT/E和F仅为近300kD络合物。据信络合物(即，分子量大于约150kD)包含非毒素红血球凝集素和非毒素，非毒性非红血球凝集素蛋白。
在大量患者重复注射络合物后，产生特异的中和抗体，其能对抗神经毒素的作用。直接的后果是抗体阳性的患者不再对络合物应答。然而，他们可以再用其他毒素类型治疗，尽管不是他们所有的人都已被准予治疗。当对患者进行所有毒素类型的测试，并已形成对抗它们的抗体时，再施用肉毒杆菌毒素络合物(不论类型)都不再具有药效。在此情况中必须引起重视的是络合物的每一剂量都有助于增加抗体值直到络合物施用不再有意义，因为不再有效。
络合物中的非毒素成分可能促进特异性抗体的形成。固定在络合物中的神经毒素，在组织中长时间停留并可能激活免疫细胞迁移到组织中形成抗体。停留时间较长并不会导致靶细胞对毒素的吸收量增加，因为中毒的靶细胞已不再能吸收毒素。因此缓慢游离出络合物的神经毒素现在只具有免疫活性。此外，络合物中存在的非毒素蛋白可能增强免疫应答。红血球凝集素是一种凝集素，即根据对特定糖类的高亲和力而区分的蛋白。因为其能结合至糖类的结构，凝集素具有免疫刺激的作用。因此，有可能显示凝集素刀豆球蛋白A，植物凝集素和美洲商陆有丝分裂原激活T和B淋巴细胞。肉毒杆菌毒素络合物中的红血球凝集素，也结合膜相关糖，因此能够以相同的方式作为免疫佐剂发挥作用并参与抗体的形成，并因此导致治疗失败。
本发明的一个目的是发展一种伤口愈合并且预防疤痕形成的可选择的方法。特别地，发明人提出一种合适的活性成分，可用于有效治疗患者而不产生中和性抗体，也可用于治疗已经产生中和性抗体的患者。
体外研究已表明肉毒杆菌毒素能抑制钾离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的初级细胞培养基中释放。此外，已有报告说明肉毒杆菌毒素能抑制脊髓神经元的初级培养基中甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，以及在脑突触体标本中肉毒杆菌毒素能抑制各个神经递质乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸盐的释放。
可按照已知方法获得梭状芽孢杆菌神经毒素，包括在发酵罐中建立并培养肉毒杆菌，然后收获并纯化发酵混合物。所有的肉毒杆菌毒素类型最初都合成为非活性的单链蛋白质，其必须经过蛋白酶裂解或切断而具有神经活性。产生肉毒杆菌毒素血清型A和G的细菌菌株具有内生的能处理毒素的蛋白酶，因此，可从细菌培养中得到大部分其活性形式。相反，肉毒杆菌毒素血清型C1，D和E是由不能蛋白水解的梭状芽孢杆菌菌株产生的，因此典型地从培养基中得到的是无活性的。后继的激活作用可由胰蛋白酶作为肽酶进行。它裂解优先暴露于酶的突出的切口部位。血清型B和F由能蛋白水解和不能蛋白水解的菌株产生，因此可能得到活性或非活性形式。然而，甚至是能蛋白水解的菌株，其产生例如BoNT/B血清型，也只裂解产生的毒素的一部分。切断和未切断分子的准确比例取决于不同的因素，包括培养的长度和培养基的温度。因此，BoNT/B的任何制品都可能包含一定百分比的非活性毒素，这是BoNT/B与BoNT/A相比效力显著较低的原因。
国际专利申请WO 00/74703公开了一种制备不含有相关络合蛋白的神经毒素制品的方法。该申请的发明主题内容引入本文作为参考。U.S.专利申请系列No.11/184,495和相应的PCT/US2005/025408公开了包含来自肉毒杆菌的肉毒杆菌神经毒素的药物组合物，其中肉毒杆菌神经毒素络合物中天然存在不含有络合蛋白的神经毒素。所述申请中，关于包含来自肉毒杆菌的肉毒杆菌神经毒素的药物组合物，肉毒杆菌神经毒素络合物中天然存在不含有络合蛋白的神经毒素，该药物组合物稳定性好并且有利地配制使其不含人类血清白蛋白，将其发明实质内容引入本文作为参考。
Frevert，J(DE103 33 317和WO 2005/007185)公开了一种稳定蛋白活性成分的组合物，例如梭状芽孢杆菌神经毒素，在药物制剂中含有，a)表面活性物质，例如非离子洗涤剂(表面活性剂)；和b)选自Glu和Gln或Asp和Asn的至少两种氨基酸的混合物。
据报道，BoNT/A已用于如下临床设置1)每次肌肉注射(多种肌肉)大约75-125单位BOTOX用于治疗颈张力失常；2)每次肌肉注射5-10单位BOTOX用于治疗眉间皱纹(眉沟)(5单位肌肉注射入降眉间肌，10单位肌肉注射入每个皱眉肌)；3)向耻骨直肠肌括约肌内注射大约30-80单位BOTOX用于治疗便秘；4)向上眼睑和下眼睑的横向睑板前的眼轮匝肌中，每条肌肉注射约1-5单位BOTOX用于治疗眼睑痉挛；5)向眼外肌肉内注射约1-5单位的BOTOX用于治疗斜视，注射量根据被注射肌肉的大小以及需要的肌肉麻痹程度(即需要的屈光度校正)进行调节；和6)向五处不同的上肢屈肌内注射BOTOX用于治疗中风后的上肢痉挛，如下(a)深指屈肌(flexor digitorum profundus)7.5U至30U(b)浅指屈肌(flexor digitorum sublimes)7.5U至30U(c)腕尺骨屈肌(flexor carpi ulnaris)10 U至40U(d)腕桡骨屈肌(flexor carpi radialis)15U至60U(e)臂二头肌50U至200U。所示的五块肌肉均在同一疗程接受注射以使该患者的上肢屈肌在每一疗程通过肌内注射接受90U至360U的BOTOX。
临床应用中选择BoNT/A而不是其他的血清型，例如血清型B、C1、D、E、F和G的原因是肉毒杆菌毒素A型具有本质上更长的治疗效果。换言之，A血清型的肉毒杆菌毒素的抑制效果更持久。
可选地，可能需要使用持续时间短的神经毒素，例如血清型E或F或修饰的血清毒素，具有合适的效果持续时间。
目前，导致各种肉毒杆菌毒素的持久性差别的原理还不清楚。然而，有两种理论可解释毒素持久性的差别。不希望束缚于任何操作理论或作用机制，下面将简要讨论这些理论。第一种理论提出毒素的持久性依赖于靶蛋白质的种类以及靶蛋白质上毒素攻击的部位-Raciborska，等人，Can.J.Physiol.Pharmcol.77679-688(1999)。例如，SNAP-25和VAMP为囊泡对接一囊泡的胞吐作用中必需的步骤-中需要的蛋白质。分别地，BoNT/A裂解靶蛋白质SNAP-25而BoNT/B裂解靶蛋白质VAMP。这两种情况的效果相同，不论裂解哪种蛋白都损害神经元通过胞吐作用释放神经递质的能力。然而，被破坏的VAMP可能比破坏的SNAP-25更容易被新的所替换，例如通过替换合成。因此，由于细胞需要更长时间合成新的SNAP-25蛋白来替换被破坏的SNAP-25，因此肉毒杆菌毒素A型具有更长的持久性。
此外，毒素的裂解部位可能影响被破坏的靶蛋白质被替换的速度。例如，肉毒杆菌毒素A和E型都裂解SNAP-25。然而，它们在不同的部位裂解，BoNT/E与BoNT/A相比，在患者中导致更短时间的麻痹(出处同上685-6)。
第二种理论提出毒素的不同的持久性取决于其在细胞内不同的半衰期或稳定性，即，毒素在细胞中有效的时间越长，效果越久-Keller，等人，FEBS Letters 456137-42(1999)。许多因素都影响毒素在细胞内的稳定性，但主要地，毒素越能抵抗细胞内蛋白酶的代谢作用而不被切断，就越稳定-Erdal，等人，Naunynschmiedeber′s Arch.Pharmacol.35167-78(1995)。
一般，分子抵抗细胞内蛋白酶代谢作用的能力取决于其结构。例如，分子的基本结构可包含一个独特的基本序列，它可导致分子容易被蛋白酶降解或不容易被降解。例如，Varshavsky描述以某些氨基酸结尾的多肽对降解蛋白酶更敏感-Proc.Natl.Acad.Sci.USA9312142-12149(1996)。
此外，已知细胞内的酶可通过例如N-糖基化，磷酸化等等修饰分子，例如多肽。这类修饰作用将在本文称为“二次修饰”。“二次修饰”通常涉及内源性分子，例如从RNA翻译后得到的多肽的修饰。然而，在这里，“二次修饰”也可涉及酶，例如细胞内的酶，修饰外源性分子的能力。例如，当给予患者外源性分子，例如药物后，这些分子将经受患者的酶，例如细胞内酶的二次修饰作用。
分子，例如多肽的某些二次修饰，可能抵抗或促进降解蛋白酶的作用。其中，这些二次修饰可以，1)影响降解蛋白酶直接作用于分子的能力和/或2)影响分子隐藏在囊泡中避开这些降解蛋白酶的能力。
梭状芽孢杆菌神经毒素是肉毒杆菌毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G中的一种，包括在天然神经毒素中存在的不含有络合蛋白的肉毒杆菌毒素，或化学修饰或基因操作修饰的神经毒素。化学修饰或基因修饰的神经毒素不含有络合蛋白，该络合蛋白自然地与肉毒杆菌神经毒素形成络合物。
对来源于肉毒杆菌神经毒素的神经毒素的修饰，由于是化学修饰或基因操作，可发生在神经毒素蛋白的各个部分，例如神经毒素分子的重链部分和/或轻链部分。可以是单处修饰或多处修饰。在一个实施方式中，来源于肉毒杆菌神经毒素的神经毒素蛋白的重链包含一处或多处修饰，与原始神经毒素相比，它可降低或增加神经毒素结合神经细胞的亲和力。该修饰后的神经毒素可包含至少一处被替代的和/或删除的和/或插入的和/或增加的和/或遗传翻译后的神经毒素氨基酸的修饰，并且优选发生在神经毒素的重链上。
需要一种修饰的神经毒素，其具有各种肉毒杆菌毒素血清型的功效，但具有改变的(更短的)生物学持久性，其可减少抗体形成。
发明简述本发明涉及使用天然存在和/或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素，以及不含有络合蛋白的神经毒素，促进患者受伤表面或浅表组织愈合的方法。该用途包括伤口愈合(包括用于防止瘢痕形成)的用法以及用于眼科学(例如用于受损角膜组织的治疗，例如闭合发炎的眼睛)。还包括它们用于诊断的用途。根据希望的作用时间，预期用于施用的血清型A、B、C1、D、E、F和G的肉毒杆菌神经毒素能促进伤口愈合以及防止疤痕形成。此外，具有短的作用时间以及不含有络合蛋白的梭状芽孢杆菌神经毒素可以在需要相对较短的肌肉麻痹的情况中使用。
本发明是基于通过麻痹作用于伤口上的肌肉来固定损伤组织例如伤口。这可以通过把末梢性肌肉松弛剂直接注射到相应肌肉中来达到。末梢性肌肉松弛剂选自天然或修饰的神经毒素，例如梭状芽孢杆菌神经毒素，具有短的作用时间并且不含有络合蛋白。本发明采用E型和F型肉毒杆菌毒素做为具体实施方式
。
本发明还提供了对在角膜炎和某些眼部手术介入中改良愈合。可以通过外围和局部注射肌肉松弛药达到药物诱导睑下垂，从而关闭眼睑。所述肌肉松弛药选自天然或修饰的短效神经毒素，例如梭状芽孢杆菌神经毒素，具有短的作用时间并且不含有络合蛋白。这种方法用于固定眼睛从而有利于愈合。E型和F型肉毒杆菌毒素做为具体实施方式
。
本发明另一方面，短效的不含有络合蛋白的肉毒杆菌毒素用作一种诊断工具，以确定用于治疗多种情况的长效肉毒杆菌毒素的最佳注射位置。以E型肉毒杆菌毒素做为具体实施方式
。
因此我们认为我们的发明的组成可以在下文中得以概括天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素在制备促进患者损伤表面或浅表组织愈合的药物中的用途，其中所述药物制备用来在或接近所述损伤组织局部施用；所述用途中梭状芽孢杆菌神经毒素不含有络合蛋白，该蛋白天然与梭状芽孢杆菌神经毒素形成络合物；所述用途中天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素具有大约3至4周的短期效果；所述用途中梭状芽孢杆菌神经毒素是F型肉毒杆菌毒素；所述用途中天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素具有大约3至10天的短期效果；所述用途中梭状芽孢杆菌神经毒素是E型肉毒杆菌毒素；所述用途中梭状芽孢杆菌神经毒素是经修饰具有大约1至4周效果持续时间的神经毒素；上述用途中所述损伤组织包括伤口，上述用途中所述损伤组织包括角膜组织以及制备的所述药物用于在或接近眼睑附近局部施用；另外在上述用途中制备双组分药物，第一组分包括用于确定最佳施用位置的具有大约3至10天的短期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，而第二组分包括用于后续治疗施用的具有大约12周长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素。此外，一种治疗具有表面或浅表组织损伤的患者的方法，所述方法包括局部施用一种天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素进入或接近所述损伤组织，从而加快损伤的愈合，所述方法中梭状芽孢杆菌神经毒素不含有络合蛋白，该蛋白自然与梭状芽孢杆菌神经毒素形成络合物，所述方法中天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素具有大约3至4周的短期效果，所述方法中梭状芽孢杆菌神经毒素是F型肉毒杆菌毒素，所述方法中天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素具有大约3至10天的短期效果，所述方法中梭状芽孢杆菌神经毒素是E型肉毒杆菌毒素，所述方法中梭状芽孢杆菌神经毒素是经修饰具有大约1至4周效果持续时间的神经毒素，上述方法中所述损伤组织包括伤口，上述方法中所述损伤组织包括角膜组织以及将所述梭状芽孢肉毒杆菌神经毒素在或接近于眼睑附近局部施用，从而保持眼睑关闭并且加快损伤角膜组织的愈合。此外，一种治疗需要眼睑关闭的眼病患者以用于眼病愈合的方法，包括天然或修饰梭状芽孢杆菌神经毒素的进入或接近于眼睑局部施用，使得保持眼睑关闭并且加速眼病的愈合。另外，一种测定用于注射具有大约12周的长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素的最佳位置的方法，包括具有大约3至10天的短期效果的天然或修饰梭状芽孢杆菌神经毒素的一个或多个初期局部施用，以测定在一个或多个特殊位置的施用效果，从而因此确定用于后续的所述长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素的最佳施用位置，所述方法中天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素具有大约3至10天的短期效果，并且不含有自然与梭状芽孢杆菌神经毒素形成络合物的络合蛋白，所述方法中天然或修饰梭状芽孢杆菌神经毒素是E型肉毒杆菌毒素。同样，联合药物中包括可分别施用的第一和第二组分，其中第一组分包括具有大约3至10天的短期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，第二组分包括具有大约12周的长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，这种联合药物中还包括通过所述第一组分在一个或多个特异位置对于患者施用效果的测定，从而得以选择所述第二组分后续施用最佳位置的说明。
发明详述如文中所述，损伤或手术介入后的伤口愈合会受到伤口边缘张力的不利影响。本发明包括使用天然存在和/或修饰的神经毒素，包括梭状芽孢杆菌神经毒素，以及那些不含有络合蛋白的神经毒素，来增强伤口的愈合并预防疤痕形成。本发明此方面基于一种新方法，即通过麻痹作用于伤口的肌肉来固定伤口的周围区域。这可以通过直接注射末梢性作用肌肉松驰剂到相应肌肉来达到。但是，对此，常规的肌肉松驰剂具有两个不合适的理由。第一，由于它们的小分子量，它们从注射位置迅速扩散，从而对身体的其它部分造成不希望的效果。第二，它们的局部代谢很快并因此失去它们的效力。
肉毒杆菌毒素，一种末梢性作用肌肉松驰剂，有利于足够长时间地保持在注射位置，以通过神经吸收从而在长时间内保持其活性形式。由于毒素的高分子量，这种量不会采取扩散方式而只是从注射位置缓慢移出。由于在循环血液中的稀释，更多远处的神经未受影响。由于血清中的蛋白酶，毒素迅速失活。肉毒杆菌毒素的不同血清型具有不同的作用持续时间。A和B血清型可以阻断神经许多周，F血清型可以持续3至4周而E血清型只能持续3至10天。为了获得较短的麻痹时期，必须在手术前几天在手术区域周围一个或多个位置注射毒素，这取决于需要麻痹的肌肉大小。根据希望麻痹的时间，可选择E血清型或F血清型。由于手术时所选手术位置的肌肉组织已经通过毒素进行了麻痹，麻醉师需要更小量的突触后作用肌肉松驰剂。因此减少了呼吸肌麻痹引起术后呼吸障碍的危险。由于手术位置在术后4-5天内都保持局部麻痹，因此在这段期间内伤口缝线不会受到额外的张力。需要最长的保持局部固定的时间直到伤口完全愈合，通常最长为1-2周。如果伤口愈合情况复杂，例如通过第二次愈合，则需要较长时间的持续麻痹。另一个实施方式中，在伤口愈合中需要延长肌肉麻痹时间，因此需要进行A或B血清型的肉毒杆菌毒素的施用。在神经细胞中的毒素裂解后，神经功能缓慢地恢复，并在毒素完全蛋白水解降解后大约2天完全恢复。短暂的固定不会导致任何显著的肌肉萎缩。
另一个实施方式中，使用不含有络合蛋白，血凝素，和其它外源蛋白的A或B，C1，D，E，F，G血清型梭状芽孢杆菌肉毒杆菌神经毒素有利于伤口愈合和阻止瘢痕形成。做为两种商业的A型肉毒杆菌毒素络合产品BOTOX和DYSPORT的代替物，以及现有技术中描述的其它类型(B、C1、D、E、F、G)络合物的代替物，已经开发出一种不含有络合蛋白，血凝素，和其它外源蛋白的仅为神经毒素(A、B、C1、D、E、F、或G型)的新型药物。由于它的低分子量，其可以更快速地扩散到靶细胞并在其中得以吸收，在免疫细胞之前，被血凝素吸引并被激活。抗原学研究显示，任何不含络合蛋白类型的神经毒素，不诱导，或至多很少诱导抗体的形成，这不同于A血清型商业产品和B至G血清型的配合物。在新发明药物(不含络合蛋白的A、B、C1、D、E、F或G型神经毒素)的治疗使用中，甚至在重复施用后，都没有由于抗体而失败。由于它们直接的生物利用率，这种神经毒素可以在施用肉毒杆菌毒素络合物后，例如在BOTOX或DYSPORT治疗后出现针对相应类型的抗体效价(称作第二非响应期)后，仍然适用于患者的治疗，这就是说不再受其后BOTOX或DYSPORT治疗的影响，因为商业毒素的施用不再提供治疗效果。
这种新发明的药物对那些从未，或很多年没有进行肉毒杆菌神经毒素治疗的患者有特别的好处，因为他们的抗体效价很低或开始为零。其用途的优点在于，由于纯毒素治疗，患者效价的增长为零，或至多非常的不明显。换句话说，新发明的治疗组合物可以长时间施用而不失效。其同样适用于那些产生针对肉毒杆菌毒素的抗体效价的患者。
因此，可以通过不含有络合蛋白的神经毒素替代高分子量的毒素配合物进行施用，防止梭状芽孢杆菌肉毒杆菌神经毒素治疗过程中抗体的诱导。完全分离络合蛋白的神经毒素能够直接生物利用，并且能直接结合到运动终板的神经末梢上。
在角膜炎和眼部某些手术介入中，把绷带放在眼上或把上下眼睑缝合都是为了保持眼睛闭合。用这种方法来固定眼睛有利于愈合。可以在更换绷带时进行愈合过程的每日评估。但是，如果眼睑缝合在一起就不可能检查眼睛表面。同样可以通过外围和局部作用肌肉松驰剂的注射产生的药物诱导睑下垂来闭合眼睑。根据期望的关闭时间，把E或F型肉毒杆菌毒素注射入上睑提肌中。这种方法的优点是明显的。眼睛能够保持可接近检查，以便于监视愈合过程，并且能在对患者无压力的情况下进行任何需要的进一步测量。短暂的睑下垂是可逆的，类似于上述的麻痹过程。
如前详述，A和B血清型的肉毒杆菌毒素可以用于不同原因的肌张力障碍或痉挛。如果障碍复杂或如果症状中包括几个肌肉群，经常不清楚哪个肌肉需要通过毒素麻痹从而最大的减轻患者痛苦。如果试验把A或B血清型注射入错误的肌肉中，将对患者导致额外的压迫。为了定位长持久效应时间毒素的毒素治疗中注射的最佳位置，需要使用表现为短效应持续时间的毒素做测试。E型肉毒杆菌毒素适于这种诊断测试。患者在实际治疗前会经历预期的变化。由于其作用持续时间只有几天，患者将可预测通过长持久效应毒素治疗之后将产生什么效果。如果注射不是最佳的，干扰效应只会持续很短的时间，而可以在另外的肌肉上进行另外的注射以测试效果。
具体实施例方式
实施例1人体肉毒杆菌注射增强伤口愈合患者经过瘢痕修整切除手术。瘢痕位于腹部。瘢痕是由外伤导致的，并且当时在第三治疗中心缝合。
患者仰卧，局部注射5ml具有1∶200000肾上腺素的0.5％的利多卡因。切除瘢痕并使用单极烧灼法控制住出血。把不含有络合蛋白的肉毒杆菌毒素A注射(10单位)入伤口周围并在伤口上分散。使用6-0Vicryl用于深度缝合和6-0 Nylon用于浅表缝合来闭合伤口。
手术后大约24小时，患者显示出注射肌肉的明显麻痹，并且丧失移动切除处周围4厘米直径内的皮肤的能力。伤口在术后早期愈合良好。可以看出在伤口边缘减少了运动和张力。患者的伤口愈合且没有并发症。相比术前的瘢痕，术后12月的瘢痕的整容外形是极好的且优于最初的瘢痕。
实施例2肉毒杆菌诱导睑下垂以促进角膜愈合患者患有角膜炎或者接收了眼部外科手术介入。
注射不含有络合蛋白的E或F型肉毒杆菌毒素入提肌眼睑中，以在上眼睑上产生弛缓睑下垂，并对角膜产生安全而有效的保护。检查监视眼睛的愈合过程。重复注射直到潜在的疾病或情况治愈。
其它实施方式可以理解的是，尽管本发明已通过其详细说明进行了描述，但前述的说明是用于说明而不限制发明的范围，本发明通过所附的权利要求的范围进行限定。其它方面、优点和改进包括在下面的权利要求的范围中。
权利要求
1.天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素制备用于促进患者受伤表面或浅表组织愈合的药物中的用途，其中所述药物制备成用于在或靠近所述受伤组织局部施用。
2.如权利要求1所述的用途，其中梭状芽孢杆菌神经毒素不含有络合蛋白，该蛋白与梭状芽孢杆菌神经毒素自然地形成络合物。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素特征为具有约为3至4周的短期效果。
4.如权利要求3所述的用途，其中梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒杆菌毒素F型。
5.如权利要求1或2所述的用途，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素特征为具有约为3至10天的短期效果。
6.如权利要求5所述的用途，其中梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒杆菌毒素E型。
7.如权利要求1或2所述的用途，其中梭状芽孢杆菌神经毒素是具有约为1至4周短期效果的修饰的神经毒素。
8.如权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述受伤组织包括伤口。
9.如权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述受伤组织包括角膜组织，所述药物制备用于在或靠近眼睑附近局部施用。
10.如权利要求1-9中任一项所述的用途，其中制备两组分药物，第一组分包括具有约3至10天短期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，用于确定最佳施用部位，和第二组分包括约12周长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，用于后续的治疗施用。
11.一种治疗具有表面或浅表组织损伤的患者的方法，所述方法包括将天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素在或靠近所述损伤组织局部施用，达到促进伤口愈合的目的。
12.如权利要求11所述的方法，其中梭状芽孢杆菌神经毒素不含有络合蛋白，该蛋白与梭状芽孢杆菌神经毒素自然地形成络合物。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素特征为具有约为3至4周短期效果。
14.如权利要求13所述的方法，其中梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒杆菌毒素F型。
15.如权利要求11或12所述的方法，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素特征为具有约为3至10天短期效果。
16.如权利要求15所述的方法，其中梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒杆菌毒素E型。
17.如权利要求11或12所述的方法，其中梭状芽孢杆菌神经毒素是具有约为1至4周短期效果的修饰的神经毒素。
18.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中所述受伤组织包括伤口。
19.如权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述受伤组织包括角膜组织，所述梭状芽孢杆菌神经毒素用于在或靠近眼睑附近局部施用，达到眼睑关闭并且促进受伤的角膜组织愈合的目的。
20.确定具有约12周长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素的最佳注射部位的方法，包括首先在一处或多处局部注射天然的或修饰的具有约3至10天短期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，以确定在一个或多个特异部位施用的效果，由此选择使用具有长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素进行后续施用的最佳施用部位。
21.如权利要求20所述的方法，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素特征为具有约为3至10天的短期效果，并且不含有络合蛋白，该蛋白与梭状芽孢杆菌神经毒素自然地形成络合物。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒杆菌毒素E型。
23.一种联合药物，包括分别施用的第一和第二组分，其中第一组分包含具有约3-10天短期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，第二组分包括具有约12周长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素。
24.如权利要求23中所述的联合药物，进一步包含使用说明书，其中说明所述第一组分用于测定在患者中一个或多个特异部位的施用效果，由此选择所述第二组分进行后续施用的最佳部位。
全文摘要
天然产生的和/或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素，包括那些不含有络合蛋白的神经毒素，所述蛋白自然地与梭状芽孢杆菌神经毒素形成络合物，通过在或靠近受伤组织局部施用，用于增强患者受伤表面或浅表组织的愈合。该神经毒素可有利地用于伤口愈合并预防疤痕产生，并且可应用于眼科领域，例如，通过例如闭合发炎的眼睛用于治疗受伤的角膜组织。另一个实施方式包括评价毒素施用效果的诊断用途和使用的药物。
文档编号A61P17/02GK101027083SQ200580032613
公开日2007年8月29日 申请日期2005年9月27日 优先权日2004年9月27日
发明者H·V·泰勒 申请人:莫茨药物股份两合公司
技术领域：
本发明涉及通过施用天然产生的和/或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素，和/或不含有络合蛋白的神经毒素促进受伤组织的愈合。该神经毒素可用于促进伤口愈合(包括预防疤痕形成)并且可应用于眼科领域，例如，通过例如闭合发炎的眼睛用于治疗受伤的角膜组织。还涉及它们的诊断用途和在本文中用作药物。
背景技术：
本发明涉及使用天然产生的和/或修饰的神经毒素促进受伤表面或浅表组织愈合。来源于血清型A、B、C1、D、E、F和G肉毒杆菌(Clostridium botulinum)神经毒素，以及梭状芽孢杆菌神经毒素中天然产生的不含络合蛋白的梭状芽孢杆菌神经毒素可用于增强或促进上述愈合。作用持续时间短的梭状芽孢杆菌神经毒素，例如E或F型已经用于某些希望肌肉麻痹时间相对短暂的情况中，例如快速愈合的伤口的治疗中。具有更短的生物学持久性的梭状芽孢杆菌神经毒素可降低抗体产生，由此保持梭状芽孢杆菌神经毒素在伤口愈合中的治疗效果。
损伤或外科介入后的伤口边缘的张力可对伤口愈合产生不利影响。反射性肌收缩，尤其可伴随发生止痛效果的降低，可能会使任何未愈合的伤口边缘移位。该移位可促使病原体进入其中并且，最坏的是，需要二次愈合治疗。在二次愈合中，必须再次打开手术伤口，每天清洁数次。必须经常地清除坏死的组织(清创术)。二次愈合与初次愈合相比需要相当长的时间不仅费力和需要额外的支出，而且导致外观令人不满意的大疤痕。它还可能导致未缝合在一起的肌肉粘连，愈合后结缔组织有瘢痕的肌肉收缩时偶然会发生疼痛。为避免该情况通常固定受伤区域。这可通过例如使用夹板，专门的绷带或其他固定和定位器械来完成。然而，这些目前使用的方法在很多情况中是不充分的和/或不方便的，并且通常不能使用，尤其是对手术后或腹部的伤口。
厌氧菌、革兰氏阳性菌肉毒杆菌产生一种有效的多肽神经毒素，肉毒素，它能导致人类和动物的神经性麻痹疾病，即肉毒杆菌中毒。在泥土中发现了肉毒杆菌的芽孢，可在不正确消毒的和密封的家庭式罐头工厂的食品容器中生长，这是许多肉毒杆菌中毒的起因。肉毒杆菌中毒的影响典型地发生在食用被肉毒杆菌污染的食物后的18至36小时。肉毒杆菌毒素可不减弱地通过肠壁，因为其通过络合蛋白，例如红血球凝聚素和无毒的，非红血球凝聚蛋白，而免受胰蛋白酶的攻击。纯的神经毒素经过肠的再吸收影响末梢运动神经元。肉毒杆菌毒素的中毒症状可从走路困难、吞咽困难和说话困难发展到呼吸肌麻痹和死亡。
肉毒杆菌毒素是人类已知的最致命的天然生物试剂。在小鼠中胃肠外施用肉毒杆菌毒素(纯化的神经毒素)血清型A(BoNT/A)约5-6微微克是一个MLD(最小致死量)。一单位(U)肉毒杆菌毒素定义为每只重量为18-20g的雌性Swiss Webster小鼠腹膜内注射的MLD。已表征了7种免疫特异性肉毒杆菌毒素类型，分别为肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，它们每一种之间通过与血清特异性抗体的中和作用互相区别。肉毒杆菌毒素的不同血清型根据其感染的动物种类，和其导致麻痹的严重程度和持续时间的不同而变化。例如，当在大鼠中测量产生麻痹几率时，确定BoNT/A是肉毒杆菌毒素血清型B(BoNT/B)效力的500倍。此外，BoNT/B在灵长类动物中以480U/kg的剂量施用时是无毒的，而该剂量大约是BoNT/A在灵长类动物中的MLD的12倍。相反，给小鼠注射时，血清型A的麻痹持续时间是E型的10倍。BoNT/C1则优先作用于鸟类。
肉毒杆菌毒素已在临床上用于治疗神经肌肉的失调，所述疾病的特征为由病理性末梢神经的活动过度导致的骨骼肌机能亢进。BoNT/A已被U.S.食品和药物管理局批准用于治疗眼睑痉挛、斜视和半侧颜面痉挛。非血清型A的肉毒杆菌毒素血清型与BoNT/A相比显然具有较低的活性和/或较短的作用时间。外周肌内注射BoNT/A后往往能在一周内看到临床效果。单次肌内注射BoNT/A后症状缓解的典型持续时间平均能保持三个月。
所有肉毒杆菌毒素血清型明显抑制神经递质乙酰胆碱在神经肌肉接合处的释放；然而，它们通过影响不同的神经分泌蛋白并且在不同的部位裂解这些蛋白来完成上述功能。例如，肉毒杆菌血清型A和E都能裂解25千道尔顿(kD)突触体联合蛋白(SNAP-25)；然而，每个毒素在该蛋白中特异的位置裂解蛋白。已发现肉毒杆菌毒素血清型C1(BoNTC1)能裂解突触融合蛋白和SNAP-25。BoNT/B、D、F和G作用于突触小泡相关膜蛋白(VAMP也称为突触小泡蛋白)，并且每个血清型在不同的部位裂解蛋白。这些机理上的差别可能影响各种肉毒杆菌毒素血清型的相对效力和/或作用持续时间。
无论何种血清型，毒素中毒的分子学机制都显示了相同并且包含数个步骤或阶段。梭状芽孢杆菌毒素的神经元内目标通常参与神经递质的释放过程。该过程的第一步，毒素通过H链与细胞表面受体间的特异性相互作用，结合靶神经元的突触前膜；据认为该受体对肉毒杆菌毒素各个血清型是不同的。H链的羧基端片断，Hc，显示在毒素靶向细胞表面中起重要作用。
在第二步中，毒素通过受体介导的细胞内吞作用被吞噬入细胞；形成包含毒素的内涵体。下一步，毒素从内涵体中脱离进入细胞的细胞质。这一步被认为是由H链的氨基端片断HN介导的，其引发毒素在pH约5.5或更低时发生结构改变。已知内涵体具有质子泵，能够降低内涵体内的pH值。毒素的构型改变使其暴露出疏水部分，使毒素将其本身嵌入内涵体膜。然后毒素从内涵体膜转移至细胞质。
肉毒杆菌毒素活性的机制的下一步骤包括连接H和L链的二硫键的还原。肉毒杆菌毒素的全部毒性包含于全毒素的L链内，其必须从重链中分离出来达到其完全活性；L链是锌(Zn++)内肽酶，其在最后的步骤中，选择性地裂解蛋白，该蛋白对包含神经递质的囊泡识别并对接至原生质膜的细胞质表面，以及与原生质膜融合是必需的。
肉毒杆菌神经毒素蛋白质分子的分子量，对于七种已知肉毒杆菌毒素血清型，为约150kD。然而，肉毒杆菌毒素是由梭状芽孢杆菌有机体作为包含150kD肉毒杆菌毒素蛋白质分子和伴随的凝血素以及非毒素蛋白质的络合物释放。因此，梭状芽孢杆菌产生的BoNT/A络合物为900kD、500kD和300kD形式。而产生的BoNT/B和C1则仅为500kD络合物。产生的BoNT/D为300kD和500kD络合物。最后，产生的BoNT/E和F仅为近300kD络合物。据信络合物(即，分子量大于约150kD)包含非毒素红血球凝集素和非毒素，非毒性非红血球凝集素蛋白。
在大量患者重复注射络合物后，产生特异的中和抗体，其能对抗神经毒素的作用。直接的后果是抗体阳性的患者不再对络合物应答。然而，他们可以再用其他毒素类型治疗，尽管不是他们所有的人都已被准予治疗。当对患者进行所有毒素类型的测试，并已形成对抗它们的抗体时，再施用肉毒杆菌毒素络合物(不论类型)都不再具有药效。在此情况中必须引起重视的是络合物的每一剂量都有助于增加抗体值直到络合物施用不再有意义，因为不再有效。
络合物中的非毒素成分可能促进特异性抗体的形成。固定在络合物中的神经毒素，在组织中长时间停留并可能激活免疫细胞迁移到组织中形成抗体。停留时间较长并不会导致靶细胞对毒素的吸收量增加，因为中毒的靶细胞已不再能吸收毒素。因此缓慢游离出络合物的神经毒素现在只具有免疫活性。此外，络合物中存在的非毒素蛋白可能增强免疫应答。红血球凝集素是一种凝集素，即根据对特定糖类的高亲和力而区分的蛋白。因为其能结合至糖类的结构，凝集素具有免疫刺激的作用。因此，有可能显示凝集素刀豆球蛋白A，植物凝集素和美洲商陆有丝分裂原激活T和B淋巴细胞。肉毒杆菌毒素络合物中的红血球凝集素，也结合膜相关糖，因此能够以相同的方式作为免疫佐剂发挥作用并参与抗体的形成，并因此导致治疗失败。
本发明的一个目的是发展一种伤口愈合并且预防疤痕形成的可选择的方法。特别地，发明人提出一种合适的活性成分，可用于有效治疗患者而不产生中和性抗体，也可用于治疗已经产生中和性抗体的患者。
体外研究已表明肉毒杆菌毒素能抑制钾离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的初级细胞培养基中释放。此外，已有报告说明肉毒杆菌毒素能抑制脊髓神经元的初级培养基中甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，以及在脑突触体标本中肉毒杆菌毒素能抑制各个神经递质乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸盐的释放。
可按照已知方法获得梭状芽孢杆菌神经毒素，包括在发酵罐中建立并培养肉毒杆菌，然后收获并纯化发酵混合物。所有的肉毒杆菌毒素类型最初都合成为非活性的单链蛋白质，其必须经过蛋白酶裂解或切断而具有神经活性。产生肉毒杆菌毒素血清型A和G的细菌菌株具有内生的能处理毒素的蛋白酶，因此，可从细菌培养中得到大部分其活性形式。相反，肉毒杆菌毒素血清型C1，D和E是由不能蛋白水解的梭状芽孢杆菌菌株产生的，因此典型地从培养基中得到的是无活性的。后继的激活作用可由胰蛋白酶作为肽酶进行。它裂解优先暴露于酶的突出的切口部位。血清型B和F由能蛋白水解和不能蛋白水解的菌株产生，因此可能得到活性或非活性形式。然而，甚至是能蛋白水解的菌株，其产生例如BoNT/B血清型，也只裂解产生的毒素的一部分。切断和未切断分子的准确比例取决于不同的因素，包括培养的长度和培养基的温度。因此，BoNT/B的任何制品都可能包含一定百分比的非活性毒素，这是BoNT/B与BoNT/A相比效力显著较低的原因。
国际专利申请WO 00/74703公开了一种制备不含有相关络合蛋白的神经毒素制品的方法。该申请的发明主题内容引入本文作为参考。U.S.专利申请系列No.11/184,495和相应的PCT/US2005/025408公开了包含来自肉毒杆菌的肉毒杆菌神经毒素的药物组合物，其中肉毒杆菌神经毒素络合物中天然存在不含有络合蛋白的神经毒素。所述申请中，关于包含来自肉毒杆菌的肉毒杆菌神经毒素的药物组合物，肉毒杆菌神经毒素络合物中天然存在不含有络合蛋白的神经毒素，该药物组合物稳定性好并且有利地配制使其不含人类血清白蛋白，将其发明实质内容引入本文作为参考。
Frevert，J(DE103 33 317和WO 2005/007185)公开了一种稳定蛋白活性成分的组合物，例如梭状芽孢杆菌神经毒素，在药物制剂中含有，a)表面活性物质，例如非离子洗涤剂(表面活性剂)；和b)选自Glu和Gln或Asp和Asn的至少两种氨基酸的混合物。
据报道，BoNT/A已用于如下临床设置1)每次肌肉注射(多种肌肉)大约75-125单位BOTOX用于治疗颈张力失常；2)每次肌肉注射5-10单位BOTOX用于治疗眉间皱纹(眉沟)(5单位肌肉注射入降眉间肌，10单位肌肉注射入每个皱眉肌)；3)向耻骨直肠肌括约肌内注射大约30-80单位BOTOX用于治疗便秘；4)向上眼睑和下眼睑的横向睑板前的眼轮匝肌中，每条肌肉注射约1-5单位BOTOX用于治疗眼睑痉挛；5)向眼外肌肉内注射约1-5单位的BOTOX用于治疗斜视，注射量根据被注射肌肉的大小以及需要的肌肉麻痹程度(即需要的屈光度校正)进行调节；和6)向五处不同的上肢屈肌内注射BOTOX用于治疗中风后的上肢痉挛，如下(a)深指屈肌(flexor digitorum profundus)7.5U至30U(b)浅指屈肌(flexor digitorum sublimes)7.5U至30U(c)腕尺骨屈肌(flexor carpi ulnaris)10 U至40U(d)腕桡骨屈肌(flexor carpi radialis)15U至60U(e)臂二头肌50U至200U。所示的五块肌肉均在同一疗程接受注射以使该患者的上肢屈肌在每一疗程通过肌内注射接受90U至360U的BOTOX。
临床应用中选择BoNT/A而不是其他的血清型，例如血清型B、C1、D、E、F和G的原因是肉毒杆菌毒素A型具有本质上更长的治疗效果。换言之，A血清型的肉毒杆菌毒素的抑制效果更持久。
可选地，可能需要使用持续时间短的神经毒素，例如血清型E或F或修饰的血清毒素，具有合适的效果持续时间。
目前，导致各种肉毒杆菌毒素的持久性差别的原理还不清楚。然而，有两种理论可解释毒素持久性的差别。不希望束缚于任何操作理论或作用机制，下面将简要讨论这些理论。第一种理论提出毒素的持久性依赖于靶蛋白质的种类以及靶蛋白质上毒素攻击的部位-Raciborska，等人，Can.J.Physiol.Pharmcol.77679-688(1999)。例如，SNAP-25和VAMP为囊泡对接一囊泡的胞吐作用中必需的步骤-中需要的蛋白质。分别地，BoNT/A裂解靶蛋白质SNAP-25而BoNT/B裂解靶蛋白质VAMP。这两种情况的效果相同，不论裂解哪种蛋白都损害神经元通过胞吐作用释放神经递质的能力。然而，被破坏的VAMP可能比破坏的SNAP-25更容易被新的所替换，例如通过替换合成。因此，由于细胞需要更长时间合成新的SNAP-25蛋白来替换被破坏的SNAP-25，因此肉毒杆菌毒素A型具有更长的持久性。
此外，毒素的裂解部位可能影响被破坏的靶蛋白质被替换的速度。例如，肉毒杆菌毒素A和E型都裂解SNAP-25。然而，它们在不同的部位裂解，BoNT/E与BoNT/A相比，在患者中导致更短时间的麻痹(出处同上685-6)。
第二种理论提出毒素的不同的持久性取决于其在细胞内不同的半衰期或稳定性，即，毒素在细胞中有效的时间越长，效果越久-Keller，等人，FEBS Letters 456137-42(1999)。许多因素都影响毒素在细胞内的稳定性，但主要地，毒素越能抵抗细胞内蛋白酶的代谢作用而不被切断，就越稳定-Erdal，等人，Naunynschmiedeber′s Arch.Pharmacol.35167-78(1995)。
一般，分子抵抗细胞内蛋白酶代谢作用的能力取决于其结构。例如，分子的基本结构可包含一个独特的基本序列，它可导致分子容易被蛋白酶降解或不容易被降解。例如，Varshavsky描述以某些氨基酸结尾的多肽对降解蛋白酶更敏感-Proc.Natl.Acad.Sci.USA9312142-12149(1996)。
此外，已知细胞内的酶可通过例如N-糖基化，磷酸化等等修饰分子，例如多肽。这类修饰作用将在本文称为“二次修饰”。“二次修饰”通常涉及内源性分子，例如从RNA翻译后得到的多肽的修饰。然而，在这里，“二次修饰”也可涉及酶，例如细胞内的酶，修饰外源性分子的能力。例如，当给予患者外源性分子，例如药物后，这些分子将经受患者的酶，例如细胞内酶的二次修饰作用。
分子，例如多肽的某些二次修饰，可能抵抗或促进降解蛋白酶的作用。其中，这些二次修饰可以，1)影响降解蛋白酶直接作用于分子的能力和/或2)影响分子隐藏在囊泡中避开这些降解蛋白酶的能力。
梭状芽孢杆菌神经毒素是肉毒杆菌毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G中的一种，包括在天然神经毒素中存在的不含有络合蛋白的肉毒杆菌毒素，或化学修饰或基因操作修饰的神经毒素。化学修饰或基因修饰的神经毒素不含有络合蛋白，该络合蛋白自然地与肉毒杆菌神经毒素形成络合物。
对来源于肉毒杆菌神经毒素的神经毒素的修饰，由于是化学修饰或基因操作，可发生在神经毒素蛋白的各个部分，例如神经毒素分子的重链部分和/或轻链部分。可以是单处修饰或多处修饰。在一个实施方式中，来源于肉毒杆菌神经毒素的神经毒素蛋白的重链包含一处或多处修饰，与原始神经毒素相比，它可降低或增加神经毒素结合神经细胞的亲和力。该修饰后的神经毒素可包含至少一处被替代的和/或删除的和/或插入的和/或增加的和/或遗传翻译后的神经毒素氨基酸的修饰，并且优选发生在神经毒素的重链上。
需要一种修饰的神经毒素，其具有各种肉毒杆菌毒素血清型的功效，但具有改变的(更短的)生物学持久性，其可减少抗体形成。
发明简述本发明涉及使用天然存在和/或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素，以及不含有络合蛋白的神经毒素，促进患者受伤表面或浅表组织愈合的方法。该用途包括伤口愈合(包括用于防止瘢痕形成)的用法以及用于眼科学(例如用于受损角膜组织的治疗，例如闭合发炎的眼睛)。还包括它们用于诊断的用途。根据希望的作用时间，预期用于施用的血清型A、B、C1、D、E、F和G的肉毒杆菌神经毒素能促进伤口愈合以及防止疤痕形成。此外，具有短的作用时间以及不含有络合蛋白的梭状芽孢杆菌神经毒素可以在需要相对较短的肌肉麻痹的情况中使用。
本发明是基于通过麻痹作用于伤口上的肌肉来固定损伤组织例如伤口。这可以通过把末梢性肌肉松弛剂直接注射到相应肌肉中来达到。末梢性肌肉松弛剂选自天然或修饰的神经毒素，例如梭状芽孢杆菌神经毒素，具有短的作用时间并且不含有络合蛋白。本发明采用E型和F型肉毒杆菌毒素做为具体实施方式
。
本发明还提供了对在角膜炎和某些眼部手术介入中改良愈合。可以通过外围和局部注射肌肉松弛药达到药物诱导睑下垂，从而关闭眼睑。所述肌肉松弛药选自天然或修饰的短效神经毒素，例如梭状芽孢杆菌神经毒素，具有短的作用时间并且不含有络合蛋白。这种方法用于固定眼睛从而有利于愈合。E型和F型肉毒杆菌毒素做为具体实施方式
。
本发明另一方面，短效的不含有络合蛋白的肉毒杆菌毒素用作一种诊断工具，以确定用于治疗多种情况的长效肉毒杆菌毒素的最佳注射位置。以E型肉毒杆菌毒素做为具体实施方式
。
因此我们认为我们的发明的组成可以在下文中得以概括天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素在制备促进患者损伤表面或浅表组织愈合的药物中的用途，其中所述药物制备用来在或接近所述损伤组织局部施用；所述用途中梭状芽孢杆菌神经毒素不含有络合蛋白，该蛋白天然与梭状芽孢杆菌神经毒素形成络合物；所述用途中天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素具有大约3至4周的短期效果；所述用途中梭状芽孢杆菌神经毒素是F型肉毒杆菌毒素；所述用途中天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素具有大约3至10天的短期效果；所述用途中梭状芽孢杆菌神经毒素是E型肉毒杆菌毒素；所述用途中梭状芽孢杆菌神经毒素是经修饰具有大约1至4周效果持续时间的神经毒素；上述用途中所述损伤组织包括伤口，上述用途中所述损伤组织包括角膜组织以及制备的所述药物用于在或接近眼睑附近局部施用；另外在上述用途中制备双组分药物，第一组分包括用于确定最佳施用位置的具有大约3至10天的短期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，而第二组分包括用于后续治疗施用的具有大约12周长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素。此外，一种治疗具有表面或浅表组织损伤的患者的方法，所述方法包括局部施用一种天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素进入或接近所述损伤组织，从而加快损伤的愈合，所述方法中梭状芽孢杆菌神经毒素不含有络合蛋白，该蛋白自然与梭状芽孢杆菌神经毒素形成络合物，所述方法中天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素具有大约3至4周的短期效果，所述方法中梭状芽孢杆菌神经毒素是F型肉毒杆菌毒素，所述方法中天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素具有大约3至10天的短期效果，所述方法中梭状芽孢杆菌神经毒素是E型肉毒杆菌毒素，所述方法中梭状芽孢杆菌神经毒素是经修饰具有大约1至4周效果持续时间的神经毒素，上述方法中所述损伤组织包括伤口，上述方法中所述损伤组织包括角膜组织以及将所述梭状芽孢肉毒杆菌神经毒素在或接近于眼睑附近局部施用，从而保持眼睑关闭并且加快损伤角膜组织的愈合。此外，一种治疗需要眼睑关闭的眼病患者以用于眼病愈合的方法，包括天然或修饰梭状芽孢杆菌神经毒素的进入或接近于眼睑局部施用，使得保持眼睑关闭并且加速眼病的愈合。另外，一种测定用于注射具有大约12周的长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素的最佳位置的方法，包括具有大约3至10天的短期效果的天然或修饰梭状芽孢杆菌神经毒素的一个或多个初期局部施用，以测定在一个或多个特殊位置的施用效果，从而因此确定用于后续的所述长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素的最佳施用位置，所述方法中天然或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素具有大约3至10天的短期效果，并且不含有自然与梭状芽孢杆菌神经毒素形成络合物的络合蛋白，所述方法中天然或修饰梭状芽孢杆菌神经毒素是E型肉毒杆菌毒素。同样，联合药物中包括可分别施用的第一和第二组分，其中第一组分包括具有大约3至10天的短期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，第二组分包括具有大约12周的长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，这种联合药物中还包括通过所述第一组分在一个或多个特异位置对于患者施用效果的测定，从而得以选择所述第二组分后续施用最佳位置的说明。
发明详述如文中所述，损伤或手术介入后的伤口愈合会受到伤口边缘张力的不利影响。本发明包括使用天然存在和/或修饰的神经毒素，包括梭状芽孢杆菌神经毒素，以及那些不含有络合蛋白的神经毒素，来增强伤口的愈合并预防疤痕形成。本发明此方面基于一种新方法，即通过麻痹作用于伤口的肌肉来固定伤口的周围区域。这可以通过直接注射末梢性作用肌肉松驰剂到相应肌肉来达到。但是，对此，常规的肌肉松驰剂具有两个不合适的理由。第一，由于它们的小分子量，它们从注射位置迅速扩散，从而对身体的其它部分造成不希望的效果。第二，它们的局部代谢很快并因此失去它们的效力。
肉毒杆菌毒素，一种末梢性作用肌肉松驰剂，有利于足够长时间地保持在注射位置，以通过神经吸收从而在长时间内保持其活性形式。由于毒素的高分子量，这种量不会采取扩散方式而只是从注射位置缓慢移出。由于在循环血液中的稀释，更多远处的神经未受影响。由于血清中的蛋白酶，毒素迅速失活。肉毒杆菌毒素的不同血清型具有不同的作用持续时间。A和B血清型可以阻断神经许多周，F血清型可以持续3至4周而E血清型只能持续3至10天。为了获得较短的麻痹时期，必须在手术前几天在手术区域周围一个或多个位置注射毒素，这取决于需要麻痹的肌肉大小。根据希望麻痹的时间，可选择E血清型或F血清型。由于手术时所选手术位置的肌肉组织已经通过毒素进行了麻痹，麻醉师需要更小量的突触后作用肌肉松驰剂。因此减少了呼吸肌麻痹引起术后呼吸障碍的危险。由于手术位置在术后4-5天内都保持局部麻痹，因此在这段期间内伤口缝线不会受到额外的张力。需要最长的保持局部固定的时间直到伤口完全愈合，通常最长为1-2周。如果伤口愈合情况复杂，例如通过第二次愈合，则需要较长时间的持续麻痹。另一个实施方式中，在伤口愈合中需要延长肌肉麻痹时间，因此需要进行A或B血清型的肉毒杆菌毒素的施用。在神经细胞中的毒素裂解后，神经功能缓慢地恢复，并在毒素完全蛋白水解降解后大约2天完全恢复。短暂的固定不会导致任何显著的肌肉萎缩。
另一个实施方式中，使用不含有络合蛋白，血凝素，和其它外源蛋白的A或B，C1，D，E，F，G血清型梭状芽孢杆菌肉毒杆菌神经毒素有利于伤口愈合和阻止瘢痕形成。做为两种商业的A型肉毒杆菌毒素络合产品BOTOX和DYSPORT的代替物，以及现有技术中描述的其它类型(B、C1、D、E、F、G)络合物的代替物，已经开发出一种不含有络合蛋白，血凝素，和其它外源蛋白的仅为神经毒素(A、B、C1、D、E、F、或G型)的新型药物。由于它的低分子量，其可以更快速地扩散到靶细胞并在其中得以吸收，在免疫细胞之前，被血凝素吸引并被激活。抗原学研究显示，任何不含络合蛋白类型的神经毒素，不诱导，或至多很少诱导抗体的形成，这不同于A血清型商业产品和B至G血清型的配合物。在新发明药物(不含络合蛋白的A、B、C1、D、E、F或G型神经毒素)的治疗使用中，甚至在重复施用后，都没有由于抗体而失败。由于它们直接的生物利用率，这种神经毒素可以在施用肉毒杆菌毒素络合物后，例如在BOTOX或DYSPORT治疗后出现针对相应类型的抗体效价(称作第二非响应期)后，仍然适用于患者的治疗，这就是说不再受其后BOTOX或DYSPORT治疗的影响，因为商业毒素的施用不再提供治疗效果。
这种新发明的药物对那些从未，或很多年没有进行肉毒杆菌神经毒素治疗的患者有特别的好处，因为他们的抗体效价很低或开始为零。其用途的优点在于，由于纯毒素治疗，患者效价的增长为零，或至多非常的不明显。换句话说，新发明的治疗组合物可以长时间施用而不失效。其同样适用于那些产生针对肉毒杆菌毒素的抗体效价的患者。
因此，可以通过不含有络合蛋白的神经毒素替代高分子量的毒素配合物进行施用，防止梭状芽孢杆菌肉毒杆菌神经毒素治疗过程中抗体的诱导。完全分离络合蛋白的神经毒素能够直接生物利用，并且能直接结合到运动终板的神经末梢上。
在角膜炎和眼部某些手术介入中，把绷带放在眼上或把上下眼睑缝合都是为了保持眼睛闭合。用这种方法来固定眼睛有利于愈合。可以在更换绷带时进行愈合过程的每日评估。但是，如果眼睑缝合在一起就不可能检查眼睛表面。同样可以通过外围和局部作用肌肉松驰剂的注射产生的药物诱导睑下垂来闭合眼睑。根据期望的关闭时间，把E或F型肉毒杆菌毒素注射入上睑提肌中。这种方法的优点是明显的。眼睛能够保持可接近检查，以便于监视愈合过程，并且能在对患者无压力的情况下进行任何需要的进一步测量。短暂的睑下垂是可逆的，类似于上述的麻痹过程。
如前详述，A和B血清型的肉毒杆菌毒素可以用于不同原因的肌张力障碍或痉挛。如果障碍复杂或如果症状中包括几个肌肉群，经常不清楚哪个肌肉需要通过毒素麻痹从而最大的减轻患者痛苦。如果试验把A或B血清型注射入错误的肌肉中，将对患者导致额外的压迫。为了定位长持久效应时间毒素的毒素治疗中注射的最佳位置，需要使用表现为短效应持续时间的毒素做测试。E型肉毒杆菌毒素适于这种诊断测试。患者在实际治疗前会经历预期的变化。由于其作用持续时间只有几天，患者将可预测通过长持久效应毒素治疗之后将产生什么效果。如果注射不是最佳的，干扰效应只会持续很短的时间，而可以在另外的肌肉上进行另外的注射以测试效果。
具体实施例方式
实施例1人体肉毒杆菌注射增强伤口愈合患者经过瘢痕修整切除手术。瘢痕位于腹部。瘢痕是由外伤导致的，并且当时在第三治疗中心缝合。
患者仰卧，局部注射5ml具有1∶200000肾上腺素的0.5％的利多卡因。切除瘢痕并使用单极烧灼法控制住出血。把不含有络合蛋白的肉毒杆菌毒素A注射(10单位)入伤口周围并在伤口上分散。使用6-0Vicryl用于深度缝合和6-0 Nylon用于浅表缝合来闭合伤口。
手术后大约24小时，患者显示出注射肌肉的明显麻痹，并且丧失移动切除处周围4厘米直径内的皮肤的能力。伤口在术后早期愈合良好。可以看出在伤口边缘减少了运动和张力。患者的伤口愈合且没有并发症。相比术前的瘢痕，术后12月的瘢痕的整容外形是极好的且优于最初的瘢痕。
实施例2肉毒杆菌诱导睑下垂以促进角膜愈合患者患有角膜炎或者接收了眼部外科手术介入。
注射不含有络合蛋白的E或F型肉毒杆菌毒素入提肌眼睑中，以在上眼睑上产生弛缓睑下垂，并对角膜产生安全而有效的保护。检查监视眼睛的愈合过程。重复注射直到潜在的疾病或情况治愈。
其它实施方式可以理解的是，尽管本发明已通过其详细说明进行了描述，但前述的说明是用于说明而不限制发明的范围，本发明通过所附的权利要求的范围进行限定。其它方面、优点和改进包括在下面的权利要求的范围中。
权利要求
1.天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素制备用于促进患者受伤表面或浅表组织愈合的药物中的用途，其中所述药物制备成用于在或靠近所述受伤组织局部施用。
2.如权利要求1所述的用途，其中梭状芽孢杆菌神经毒素不含有络合蛋白，该蛋白与梭状芽孢杆菌神经毒素自然地形成络合物。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素特征为具有约为3至4周的短期效果。
4.如权利要求3所述的用途，其中梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒杆菌毒素F型。
5.如权利要求1或2所述的用途，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素特征为具有约为3至10天的短期效果。
6.如权利要求5所述的用途，其中梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒杆菌毒素E型。
7.如权利要求1或2所述的用途，其中梭状芽孢杆菌神经毒素是具有约为1至4周短期效果的修饰的神经毒素。
8.如权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述受伤组织包括伤口。
9.如权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述受伤组织包括角膜组织，所述药物制备用于在或靠近眼睑附近局部施用。
10.如权利要求1-9中任一项所述的用途，其中制备两组分药物，第一组分包括具有约3至10天短期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，用于确定最佳施用部位，和第二组分包括约12周长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，用于后续的治疗施用。
11.一种治疗具有表面或浅表组织损伤的患者的方法，所述方法包括将天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素在或靠近所述损伤组织局部施用，达到促进伤口愈合的目的。
12.如权利要求11所述的方法，其中梭状芽孢杆菌神经毒素不含有络合蛋白，该蛋白与梭状芽孢杆菌神经毒素自然地形成络合物。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素特征为具有约为3至4周短期效果。
14.如权利要求13所述的方法，其中梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒杆菌毒素F型。
15.如权利要求11或12所述的方法，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素特征为具有约为3至10天短期效果。
16.如权利要求15所述的方法，其中梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒杆菌毒素E型。
17.如权利要求11或12所述的方法，其中梭状芽孢杆菌神经毒素是具有约为1至4周短期效果的修饰的神经毒素。
18.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中所述受伤组织包括伤口。
19.如权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述受伤组织包括角膜组织，所述梭状芽孢杆菌神经毒素用于在或靠近眼睑附近局部施用，达到眼睑关闭并且促进受伤的角膜组织愈合的目的。
20.确定具有约12周长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素的最佳注射部位的方法，包括首先在一处或多处局部注射天然的或修饰的具有约3至10天短期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，以确定在一个或多个特异部位施用的效果，由此选择使用具有长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素进行后续施用的最佳施用部位。
21.如权利要求20所述的方法，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素特征为具有约为3至10天的短期效果，并且不含有络合蛋白，该蛋白与梭状芽孢杆菌神经毒素自然地形成络合物。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中天然的或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素为肉毒杆菌毒素E型。
23.一种联合药物，包括分别施用的第一和第二组分，其中第一组分包含具有约3-10天短期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素，第二组分包括具有约12周长期效果的梭状芽孢杆菌神经毒素。
24.如权利要求23中所述的联合药物，进一步包含使用说明书，其中说明所述第一组分用于测定在患者中一个或多个特异部位的施用效果，由此选择所述第二组分进行后续施用的最佳部位。
全文摘要
天然产生的和/或修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素，包括那些不含有络合蛋白的神经毒素，所述蛋白自然地与梭状芽孢杆菌神经毒素形成络合物，通过在或靠近受伤组织局部施用，用于增强患者受伤表面或浅表组织的愈合。该神经毒素可有利地用于伤口愈合并预防疤痕产生，并且可应用于眼科领域，例如，通过例如闭合发炎的眼睛用于治疗受伤的角膜组织。另一个实施方式包括评价毒素施用效果的诊断用途和使用的药物。
文档编号A61P17/02GK101027083SQ200580032613
公开日2007年8月29日 申请日期2005年9月27日 优先权日2004年9月27日
发明者H·V·泰勒 申请人:莫茨药物股份两合公司
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