聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺衍生物及其制备方法
专利名称：聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新型聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的衍生物，及其制备方
法。
背景技术：
聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(以下称为PEG-DSPE)是一类新型脂质体载体 辅料，使用该辅料制备的脂质体具有长循环的性质。以该物质为辅料的制剂已经于1995年 在美国上市，商品名为D0XIL。聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在医药领域的应用在许 多文献都有 艮道，如[1] Inf luence of preparation path on the formation of discs and threadlike micelles inDSPE_PEG2000/lipid systems. Biophysical Chemistry, 2008,132,97 ； [2]Effects of phospholipidhydrolysis on the aggregate structure in DPPC/DSPE-PEG2000 liposome preparations after gel toIiquid crystalline phase transition，Biochimica et Biophysica Acta，2006，1758，171。由于连有聚乙二醇(以下称为PEG)的载体只具有长循环的性质，因此发展载体的 靶向性就显得很重要。由此，PEG上面联有多肽或单抗等具有靶向性的配体的发展逐渐成 为这一领域的方向。在这一领域中，整合素配体RGD的应用比较广泛，其常常用于抗肿瘤脂 质体的制备中。在肿瘤的生长和转移中血管新生起到关键作用，破坏肿瘤血管新生对肿瘤 治疗来说是一个有希望的治疗策略。整合素过量表达于增殖旺盛的内皮细胞和肿瘤组织周 围，其可作为药物传递的靶点。含RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的环肽与这些 整合素的亲和力增加。将药物载体表面用这些环肽修饰，可以提高这些载体与靶细胞的结 和能力。用RGD修饰长循环脂质体形成肿瘤新生血管靶向的药物载体能够将药物靶向传递 到肿瘤新生血管，通过破坏肿瘤的新生血管来达到抗肿瘤的目的。尽管含有RGD配体的脂质体具有靶向治疗肿瘤的作用，但其大多数为单价配体， 与肿瘤细胞的亲和性有限。例如，以黑色素瘤细胞对固定在盖玻片上的DSPE-PEG-RGD的粘 附为例，当黑色素瘤细胞的浓度为0.5 μ mol的时候，其粘附百分数仅为20%。因此增加粘 附性和亲和性是改善这类配体适用性的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增加肿瘤亲和性的RGD修饰的DSPE-PEG衍生物以适 应治疗的需要。本发明人进行了悉心的研究，结果发现DSPE-PEG连有多价RGD配体的衍生物，由 于增加了结合的位点，达到了增加肿瘤亲和性的目的。本发明是下式(I)表示的DSPE-PEG衍生物，以葡萄糖为骨架，三碳单位为连接臂。 式中η为0-9的整数。本发明的优选化合物是式(I)中η为4_7的整数。η的取 值可以调节各个RGD肽之间的距离，以满足和不同整合素的结合。本发明的另一目的是提供一种合成上述衍生物的方法。式(I)的化合物可以按照 以下反应式概括的方法进行 以下，按照反应式说明本发明的制备方法。(1)按照有机合成中常用的方法保护。例如PEG与叔丁基二甲基氯硅烷，在咪唑存 在下发生反应，得到化合物(II)。(2)按照有机合成中常用的方法保护。例如RGD肽与溴化苄，碳酸钾存在下与发生 反应，得到化合物(III)，温度范围为0-60°C。(3)五乙酰基保护的葡萄糖与式(II)的化合物，在二氯甲烷中在Lewis酸(三氟 化硼-乙醚)催化下发生成苷反应，得到式(V)的化合物，反应温度O 30°C。(4)式(V)的化合物在甲醇钠的甲醇溶液(必要时可加入适量二氯甲烷)中，于室 温下反应，然后经过强酸性阳离子交换树脂酸化，可得式(VI)的化合物。(5)按照有机合成中常用的方法成酯，例如式(VI)的化合物，在乙醚(或甲苯，二氯甲烷)溶液中与DCC，DMAP，丙二酸反应，可得式(VII)的化合物，温度范围为10_30°C。(6)按照有机合成中常用的方法成酯，例如式(VII)的化合物，以二氯甲烷为溶 齐U，在酸(对甲苯磺酸)，β-丙内酯的条件下反应得到式(VIII)的化合物，温度范围为 10-30 "C。(7)按照有机合成中常用的方法成酰胺，例如式(VIII)的化合物，以乙醚为溶剂 在DCC，DMAP催化下与(III)成酰胺，得到式(IX)的化合物，温度范围为10_30°C。(8)按照有机合成中常用的方法脱保护，例如式(I X)的化合物，以四氢呋喃为溶 齐U，在四丁基氟化铵的作用下，脱去硅醚保护，得到式(X)的化合物，温度范围为20-40°C。(9)按照有机合成中常用的方法成酰胺，例如式(X)的化合物，在羰基二咪唑的作 用下，与DSPE成酰胺，溶剂为甲苯或苯，得到式(XI)的化合物，温度范围为60-100°C。(10)按照有机合成常用的方法脱保护，例如式(XI)的化合物，在氢气，钯碳作用 下，以醇为溶剂脱去苄基，得到式(I)的化合物，温度范围为20-60°C。
具体实施例方式以下结合实施例更详细地说明本发明，但是本发明并不受这些记载的任何限定。实施例1PEG2000单叔丁基二甲基硅醚(化合物(II))的合成取5g(2. 5mmol)PEG2000，0. 45g(3mmol)叔丁基二 甲基氯硅烷，0. 41g(6mmol)咪 唑，加入30ml 二氯甲烷溶解。在室温下搅拌24小时后，加入少量水，分液，有机相加入饱和 碳酸氢钠溶液洗涤，加入水洗至中性，有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩。加压 柱层析(石油醚-乙酸乙酯=10 1)得到白色固体PEG2000单叔丁基二甲基硅醚搅拌 5. 27g。实施例2RGD苄基醚(化合物(III))的合成取0. 5g(l. 39mmol)RGD,溴苄(0. 52mL，4. 46mmol)，碳酸钟(0. 76g，5. 56mmol)在 悬浮在THF-H20(40 l，20mL)中室温搅拌过夜。过滤，滤液减压蒸干，硅胶柱层析(石油 醚-乙酸乙酯=8 1)，得到白色无定形固体0.73g。实施例31-0-(ω-0-叔丁基二甲基硅基)聚乙二醇基_2，3，4，6_四_0_乙酰基-β _D_葡 萄糖(化合物(V))的合成取实施例1的产物PEG2000单叔丁基二甲基硅醚Ig (0. 47mmol)，化合物 (IV)O. 37g(0. 94mmol)加入 IOml 二氯甲烷溶解。加入 BF3 · Et2O 溶液 0. 06ml (0. 47mmol), 室温下搅拌2小时，滤液浓缩至干。加压柱层析(乙酸乙酯-石油醚=5 1)得到标题化 合物1. lg。实施例41-0-(ω-0-叔丁基二甲基硅基)聚乙二醇基-β-D-葡萄糖(化合物(VI))的合 成取0.80g(0. 33mol)实施例3得到的1_0_ (ω _0_叔丁基二甲基硅基)-聚乙二 醇基-2，3，4，6-四-0-乙酰基-β-D-葡萄糖，加入Iml 二氯甲烷，6ml甲醇溶解，加入0. 33ml (0. 33mmol) IM的甲醇钠甲醇溶液，于室温下搅拌4小时，加入强酸性阳离子交换树 脂中和至中性，过滤，滤液浓缩，用乙醚洗涤残余物。残余物加压柱层析(氯仿-甲醇-水 =7:3:1)得到标题化合物0. 74g。实施例51-0-(ω-0-叔丁基二甲基硅基)聚乙二醇基_2，3，4，6_四_0_羧乙酰基-β -D-葡 萄糖(化合物(VII))取0.80g(0. 35mmol)实施例4得到的1_0_(ω-0-叔丁基二甲基硅基)-聚乙二 醇基-β-D-葡萄糖，加入0. 18g(1.68mmol)丙二酸，0. 34g(1. 68mmol) 二环己基碳二亚胺， 0. Olg (0. 08mmol)对二甲胺基吡啶加入20ml的乙醚溶液，于室温下搅拌24小时，过滤，滤液 浓缩，残余物加压柱层析(乙酸乙酯_石油醚=4 1)得到标题化合物0. 9g。实施例61-0_(ω-0-叔丁基二甲基硅基)聚乙二醇基_2，3，4，6_四-0-[3-(2_羧乙氧 基)-3-氧代丙酰基]-D-葡萄糖(化合物(VIII))取3.0g(l. lmmol)实施例5得到的1_0_ (ω-0-叔丁基二甲基硅基)-聚乙二醇 基-2，3，4，6-四-0-羧乙酰基-β -D-葡萄糖，0. 4g (5. 5mmol) β -丙内酯，0. 2g对甲苯磺酸 (1. lmmol)，加入20ml 二氯甲烷于室温下搅拌2小时，加入少量三乙胺。浓缩，加压柱层析 (乙酸乙酯_石油醚=3 1)得到标题化合物3. lg。实施例71-0-(ω-0-叔丁基二甲基硅基)聚乙二醇基_2，3，4，6_ 四 _0_[3_(2_(1，5_二-苄 氧基天冬氨酸基-甘氨酸基-精氨酸基)-2-氧代乙氧基)-3-氧代丙酰基]_ β -D-葡萄糖 (化合物(IX))取0. 70g(0. 24mmol)实施例 6 得到的化合物(VIII),0. 60g(l. 12mmol)实施例 2 得到的化合物(III)，0. Ig(0.48mmol) 二环己基碳二亚胺，0. 006g(0. 06mmol)对二甲胺基 吡啶加入IOml乙醚，于室温下搅拌24小时，过滤，滤液浓缩，残余物加压柱层析(乙酸乙 酯-石油醚=5 1)得到标题化合物1. 15g。实施例81-0-聚乙二醇基-2，3，4，6-四_0-[3-(2_(1，5_ 二-苄氧基天冬氨酸基-甘氨酸 基-精氨酸基)-2-氧代乙氧基)-3-氧代丙酰基]-β-D-葡萄糖(化合物(IX))取0. 68g(0. 14mmol)实施例 7 得到的化合物(IX),0. 04g(0. 17mmol)四丁基氟化 铵，加入20ml四氢呋喃溶解，于室温下搅拌4个小时，浓缩。残余物加压柱层析(乙酸乙 酯_石油醚=4 1)得到标题化合物0. 47g。实施例91-0-(ω-0- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺基甲酰基)聚乙二醇基_2，3，4， 6-四_0-[3-(2-(1，5- 二 -苄氧基-天冬氨酸基-甘氨酸基-精氨酸基)-2_氧代乙氧 基)-3-氧代丙酰基]_ β -D-葡萄糖单钠盐(化合物(X))取0. 45g(0 . 6mmol) 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，0. llg(0. 72mmmol)N, N，-羰基二咪 唑，加入20ml甲苯，0. 06g(0. 42mmol)三乙胺，于100°C下反应1小时，滴加2. 9g(0. 6mmol) 实施例8得到的化合物(IX)的甲苯溶液，反应0.5小时，浓缩，残余物溶于30ml丙酮，过滤 除去不溶物，滤液浓缩，残余物与阳离子交换树脂交换成钠盐，加压柱层析(乙酸乙酯-石油醚=3 1)得到标题化合物0. 88g。实施例101-0-(ω-0- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺基甲酰基)聚乙二醇基_2，3，4， 6-四-0-[3-(2-天冬氨酸基-甘氨酸基-精氨酸基-2-氧代乙氧基)-3_氧代丙酰 基]-β -D-葡萄糖单钠盐(化合物(I))取0. 28g(0. 05mmol)实施例9得到的化合物(X)，0. 03g的钯碳，加入20ml甲醇， 50°下通入氢气搅拌3小时，过滤，滤液浓缩得到固体，加压柱层析(乙酸乙酯-石油醚= 3 1)得到标题化合物用乙醇重结晶，得到标题化合物0.27g。化合物的氢谱使用氘代氯仿测定，显示出了相关的谱峰。实施例11细胞粘附实验采用pH敏感荧光探针BCECF-AM用于研究细胞与化合物单价DSPE-PEG-RGD和 4价DSPE-PEG-RGD之间的粘附。黑色素瘤细胞A375和B16 (1 X 106cells/ml)与3 μ M的 BCECF-AM(DMS0的最终浓度为0. 3% )在37°C水浴中共同孵育30分钟，PBS缓冲液洗两次 除去游离的BCECF-AM，标记过的细胞混悬在细胞培养液中备用。另将DSPE-PEG，单价DSPE-PEG-RGD和4价DSPE-PEG-RGD分别溶于氯仿中，小心 滴加在盖玻片上，铺平，待氯仿挥干后，在盖玻片上形成薄膜。将上述盖玻片分别置于8孔 细胞培养板中，用PBS缓冲液冲洗两次，加入含5% BSA的磷酸盐缓冲液于4°C孵育2小时 封板，加入上述已标记好的黑色素瘤细胞(5X 105cellS/2ml)，将培养板置于CO2培养箱中， 37°C孵育15分钟。孵育完毕后，用PBS缓冲液洗去未粘附的细胞，粘附在盖玻片上的细胞 用DMSO溶解，荧光分光光度法测定吸收度(激发波长490nm，测定波长537nm)，计算细胞的 粘附百分数。黑色素瘤细胞A375粘附结果(粘附率％ ) 黑色素瘤细胞B16粘附结果(粘附率％ )
浓度(nmollipid/well) DSPE-PEG_单价 DSPE-PEG-RGD 4 价 DSPE-PEG-RGD
0.125 0.5 9.2 17.6 0.25 0.2 15.9 27.2 0.5 - 20.8 39.7 1.0_04_2L2_402_结果表明，单价DSPE-PEG-RGD和4价DSPE-PEG-RGD对黑色素瘤细胞的粘附率显 著高于DSPE-PEG，4价DSPE-PEG-RGD粘附率几乎两倍于单价DSPE-PEG-RGD。
权利要求
一种如下式(Ⅰ)表示的前列腺素衍生物，式中n为0-9的整数。FSA00000127048000011.tif
2.根据权利要求1所述的前列腺素衍生物，其特征在于，式(I)中式(I )中η为 4-7的整数。
3.一种制备权利要求1所述的式(I )化合物的制备方法，该方法包括以下步骤(1)保护。PEG与叔丁基二甲基氯硅烷，在咪唑存在下发生反应，得到化合物(II)。(2)保护。RGD肽与溴化苄，碳酸钾存在下与RGD肽发生反应，得到化合物(III)。(3)成苷。五乙酰基保护的葡萄糖与式(II)的化合物，在二氯甲烷中在Lewis酸(三 氟化硼_乙醚)催化下发生成苷反应，得到式(V )的化合物。(4)脱保护。式(V)的化合物在甲醇钠的甲醇溶液(必要时可加入适量二氯甲烷) 中，于室温下反应，然后经过强酸性阳离子交换树脂酸化，可得式(VI)的化合物。(5)成酯。式(VI)的化合物，在乙醚(或甲苯，二氯甲烷)溶液中与DCC，DMAP，丙二 酸反应，可得式(ΥΠ)的化合物。(6)成酯。(ΥΠ)的化合物，以二氯甲烷为溶剂，在酸(对甲苯磺酸)，β-丙内酯的条 件下反应得到式(VDI)的化合物。(7)成酰胺。式(VDI)的化合物，以乙醚为溶剂在DCC，DMAP催化下与(III)成酰胺， 得到式(IX )的化合物。(8)脱保护。式(IX)的化合物，以四氢呋喃为溶剂，在四丁基氟化铵的作用下，脱去硅 醚保护，得到式(X )的化合物。(9)成酰胺。式(X)的化合物，在羰基二咪唑的作用下，与DSPE成酰胺，溶剂为甲苯 或苯，得到式(XI)的化合物。(10)脱保护。式(XI)的化合物，在氢气，钯碳作用下，以醇为溶剂脱去苄基，得到式 (I )的化合物。
4.根据权利要求3所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)化合物 (III)的制备过程中，反应温度为0-60°C。
5.根据权利要求3所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)化合物 (V )的制备过程中，反应温度为O 30°C。
6.根据权利要求5所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)化合物 (VI)的制备过程中，反应温度为10 30°C。
7.根据权利要求6所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(6)化合物 (W)的制备过程中，反应温度为10 30°C。
8.根据权利要求7所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(7)化合物 (VDI)的制备过程中，反应温度为10 30°C。
9.根据权利要求8所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(8)化合物 (IX )的制备过程中，反应温度为20 40°C。
10.根据权利要求9所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(9)化合物 (X )的制备过程中，反应温度为60 100°C。
全文摘要
本发明是式(I)表示的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺衍生物，及其制备方法(式中n为0-9的整数)。提供一种增加肿瘤亲和性的RGD修饰的DSPE-PEG衍生物以适应治疗的需要。
文档编号A61K47/34GK101864071SQ201010178949
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者宋华先, 徐庆春, 黄海 申请人:北京中海康医药科技发展有限公司
技术领域：
本发明涉及一种新型聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的衍生物，及其制备方
法。
背景技术：
聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(以下称为PEG-DSPE)是一类新型脂质体载体 辅料，使用该辅料制备的脂质体具有长循环的性质。以该物质为辅料的制剂已经于1995年 在美国上市，商品名为D0XIL。聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在医药领域的应用在许 多文献都有 艮道，如[1] Inf luence of preparation path on the formation of discs and threadlike micelles inDSPE_PEG2000/lipid systems. Biophysical Chemistry, 2008,132,97 ； [2]Effects of phospholipidhydrolysis on the aggregate structure in DPPC/DSPE-PEG2000 liposome preparations after gel toIiquid crystalline phase transition，Biochimica et Biophysica Acta，2006，1758，171。由于连有聚乙二醇(以下称为PEG)的载体只具有长循环的性质，因此发展载体的 靶向性就显得很重要。由此，PEG上面联有多肽或单抗等具有靶向性的配体的发展逐渐成 为这一领域的方向。在这一领域中，整合素配体RGD的应用比较广泛，其常常用于抗肿瘤脂 质体的制备中。在肿瘤的生长和转移中血管新生起到关键作用，破坏肿瘤血管新生对肿瘤 治疗来说是一个有希望的治疗策略。整合素过量表达于增殖旺盛的内皮细胞和肿瘤组织周 围，其可作为药物传递的靶点。含RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的环肽与这些 整合素的亲和力增加。将药物载体表面用这些环肽修饰，可以提高这些载体与靶细胞的结 和能力。用RGD修饰长循环脂质体形成肿瘤新生血管靶向的药物载体能够将药物靶向传递 到肿瘤新生血管，通过破坏肿瘤的新生血管来达到抗肿瘤的目的。尽管含有RGD配体的脂质体具有靶向治疗肿瘤的作用，但其大多数为单价配体， 与肿瘤细胞的亲和性有限。例如，以黑色素瘤细胞对固定在盖玻片上的DSPE-PEG-RGD的粘 附为例，当黑色素瘤细胞的浓度为0.5 μ mol的时候，其粘附百分数仅为20%。因此增加粘 附性和亲和性是改善这类配体适用性的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增加肿瘤亲和性的RGD修饰的DSPE-PEG衍生物以适 应治疗的需要。本发明人进行了悉心的研究，结果发现DSPE-PEG连有多价RGD配体的衍生物，由 于增加了结合的位点，达到了增加肿瘤亲和性的目的。本发明是下式(I)表示的DSPE-PEG衍生物，以葡萄糖为骨架，三碳单位为连接臂。 式中η为0-9的整数。本发明的优选化合物是式(I)中η为4_7的整数。η的取 值可以调节各个RGD肽之间的距离，以满足和不同整合素的结合。本发明的另一目的是提供一种合成上述衍生物的方法。式(I)的化合物可以按照 以下反应式概括的方法进行 以下，按照反应式说明本发明的制备方法。(1)按照有机合成中常用的方法保护。例如PEG与叔丁基二甲基氯硅烷，在咪唑存 在下发生反应，得到化合物(II)。(2)按照有机合成中常用的方法保护。例如RGD肽与溴化苄，碳酸钾存在下与发生 反应，得到化合物(III)，温度范围为0-60°C。(3)五乙酰基保护的葡萄糖与式(II)的化合物，在二氯甲烷中在Lewis酸(三氟 化硼-乙醚)催化下发生成苷反应，得到式(V)的化合物，反应温度O 30°C。(4)式(V)的化合物在甲醇钠的甲醇溶液(必要时可加入适量二氯甲烷)中，于室 温下反应，然后经过强酸性阳离子交换树脂酸化，可得式(VI)的化合物。(5)按照有机合成中常用的方法成酯，例如式(VI)的化合物，在乙醚(或甲苯，二氯甲烷)溶液中与DCC，DMAP，丙二酸反应，可得式(VII)的化合物，温度范围为10_30°C。(6)按照有机合成中常用的方法成酯，例如式(VII)的化合物，以二氯甲烷为溶 齐U，在酸(对甲苯磺酸)，β-丙内酯的条件下反应得到式(VIII)的化合物，温度范围为 10-30 "C。(7)按照有机合成中常用的方法成酰胺，例如式(VIII)的化合物，以乙醚为溶剂 在DCC，DMAP催化下与(III)成酰胺，得到式(IX)的化合物，温度范围为10_30°C。(8)按照有机合成中常用的方法脱保护，例如式(I X)的化合物，以四氢呋喃为溶 齐U，在四丁基氟化铵的作用下，脱去硅醚保护，得到式(X)的化合物，温度范围为20-40°C。(9)按照有机合成中常用的方法成酰胺，例如式(X)的化合物，在羰基二咪唑的作 用下，与DSPE成酰胺，溶剂为甲苯或苯，得到式(XI)的化合物，温度范围为60-100°C。(10)按照有机合成常用的方法脱保护，例如式(XI)的化合物，在氢气，钯碳作用 下，以醇为溶剂脱去苄基，得到式(I)的化合物，温度范围为20-60°C。
具体实施例方式以下结合实施例更详细地说明本发明，但是本发明并不受这些记载的任何限定。实施例1PEG2000单叔丁基二甲基硅醚(化合物(II))的合成取5g(2. 5mmol)PEG2000，0. 45g(3mmol)叔丁基二 甲基氯硅烷，0. 41g(6mmol)咪 唑，加入30ml 二氯甲烷溶解。在室温下搅拌24小时后，加入少量水，分液，有机相加入饱和 碳酸氢钠溶液洗涤，加入水洗至中性，有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩。加压 柱层析(石油醚-乙酸乙酯=10 1)得到白色固体PEG2000单叔丁基二甲基硅醚搅拌 5. 27g。实施例2RGD苄基醚(化合物(III))的合成取0. 5g(l. 39mmol)RGD,溴苄(0. 52mL，4. 46mmol)，碳酸钟(0. 76g，5. 56mmol)在 悬浮在THF-H20(40 l，20mL)中室温搅拌过夜。过滤，滤液减压蒸干，硅胶柱层析(石油 醚-乙酸乙酯=8 1)，得到白色无定形固体0.73g。实施例31-0-(ω-0-叔丁基二甲基硅基)聚乙二醇基_2，3，4，6_四_0_乙酰基-β _D_葡 萄糖(化合物(V))的合成取实施例1的产物PEG2000单叔丁基二甲基硅醚Ig (0. 47mmol)，化合物 (IV)O. 37g(0. 94mmol)加入 IOml 二氯甲烷溶解。加入 BF3 · Et2O 溶液 0. 06ml (0. 47mmol), 室温下搅拌2小时，滤液浓缩至干。加压柱层析(乙酸乙酯-石油醚=5 1)得到标题化 合物1. lg。实施例41-0-(ω-0-叔丁基二甲基硅基)聚乙二醇基-β-D-葡萄糖(化合物(VI))的合 成取0.80g(0. 33mol)实施例3得到的1_0_ (ω _0_叔丁基二甲基硅基)-聚乙二 醇基-2，3，4，6-四-0-乙酰基-β-D-葡萄糖，加入Iml 二氯甲烷，6ml甲醇溶解，加入0. 33ml (0. 33mmol) IM的甲醇钠甲醇溶液，于室温下搅拌4小时，加入强酸性阳离子交换树 脂中和至中性，过滤，滤液浓缩，用乙醚洗涤残余物。残余物加压柱层析(氯仿-甲醇-水 =7:3:1)得到标题化合物0. 74g。实施例51-0-(ω-0-叔丁基二甲基硅基)聚乙二醇基_2，3，4，6_四_0_羧乙酰基-β -D-葡 萄糖(化合物(VII))取0.80g(0. 35mmol)实施例4得到的1_0_(ω-0-叔丁基二甲基硅基)-聚乙二 醇基-β-D-葡萄糖，加入0. 18g(1.68mmol)丙二酸，0. 34g(1. 68mmol) 二环己基碳二亚胺， 0. Olg (0. 08mmol)对二甲胺基吡啶加入20ml的乙醚溶液，于室温下搅拌24小时，过滤，滤液 浓缩，残余物加压柱层析(乙酸乙酯_石油醚=4 1)得到标题化合物0. 9g。实施例61-0_(ω-0-叔丁基二甲基硅基)聚乙二醇基_2，3，4，6_四-0-[3-(2_羧乙氧 基)-3-氧代丙酰基]-D-葡萄糖(化合物(VIII))取3.0g(l. lmmol)实施例5得到的1_0_ (ω-0-叔丁基二甲基硅基)-聚乙二醇 基-2，3，4，6-四-0-羧乙酰基-β -D-葡萄糖，0. 4g (5. 5mmol) β -丙内酯，0. 2g对甲苯磺酸 (1. lmmol)，加入20ml 二氯甲烷于室温下搅拌2小时，加入少量三乙胺。浓缩，加压柱层析 (乙酸乙酯_石油醚=3 1)得到标题化合物3. lg。实施例71-0-(ω-0-叔丁基二甲基硅基)聚乙二醇基_2，3，4，6_ 四 _0_[3_(2_(1，5_二-苄 氧基天冬氨酸基-甘氨酸基-精氨酸基)-2-氧代乙氧基)-3-氧代丙酰基]_ β -D-葡萄糖 (化合物(IX))取0. 70g(0. 24mmol)实施例 6 得到的化合物(VIII),0. 60g(l. 12mmol)实施例 2 得到的化合物(III)，0. Ig(0.48mmol) 二环己基碳二亚胺，0. 006g(0. 06mmol)对二甲胺基 吡啶加入IOml乙醚，于室温下搅拌24小时，过滤，滤液浓缩，残余物加压柱层析(乙酸乙 酯-石油醚=5 1)得到标题化合物1. 15g。实施例81-0-聚乙二醇基-2，3，4，6-四_0-[3-(2_(1，5_ 二-苄氧基天冬氨酸基-甘氨酸 基-精氨酸基)-2-氧代乙氧基)-3-氧代丙酰基]-β-D-葡萄糖(化合物(IX))取0. 68g(0. 14mmol)实施例 7 得到的化合物(IX),0. 04g(0. 17mmol)四丁基氟化 铵，加入20ml四氢呋喃溶解，于室温下搅拌4个小时，浓缩。残余物加压柱层析(乙酸乙 酯_石油醚=4 1)得到标题化合物0. 47g。实施例91-0-(ω-0- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺基甲酰基)聚乙二醇基_2，3，4， 6-四_0-[3-(2-(1，5- 二 -苄氧基-天冬氨酸基-甘氨酸基-精氨酸基)-2_氧代乙氧 基)-3-氧代丙酰基]_ β -D-葡萄糖单钠盐(化合物(X))取0. 45g(0 . 6mmol) 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，0. llg(0. 72mmmol)N, N，-羰基二咪 唑，加入20ml甲苯，0. 06g(0. 42mmol)三乙胺，于100°C下反应1小时，滴加2. 9g(0. 6mmol) 实施例8得到的化合物(IX)的甲苯溶液，反应0.5小时，浓缩，残余物溶于30ml丙酮，过滤 除去不溶物，滤液浓缩，残余物与阳离子交换树脂交换成钠盐，加压柱层析(乙酸乙酯-石油醚=3 1)得到标题化合物0. 88g。实施例101-0-(ω-0- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺基甲酰基)聚乙二醇基_2，3，4， 6-四-0-[3-(2-天冬氨酸基-甘氨酸基-精氨酸基-2-氧代乙氧基)-3_氧代丙酰 基]-β -D-葡萄糖单钠盐(化合物(I))取0. 28g(0. 05mmol)实施例9得到的化合物(X)，0. 03g的钯碳，加入20ml甲醇， 50°下通入氢气搅拌3小时，过滤，滤液浓缩得到固体，加压柱层析(乙酸乙酯-石油醚= 3 1)得到标题化合物用乙醇重结晶，得到标题化合物0.27g。化合物的氢谱使用氘代氯仿测定，显示出了相关的谱峰。实施例11细胞粘附实验采用pH敏感荧光探针BCECF-AM用于研究细胞与化合物单价DSPE-PEG-RGD和 4价DSPE-PEG-RGD之间的粘附。黑色素瘤细胞A375和B16 (1 X 106cells/ml)与3 μ M的 BCECF-AM(DMS0的最终浓度为0. 3% )在37°C水浴中共同孵育30分钟，PBS缓冲液洗两次 除去游离的BCECF-AM，标记过的细胞混悬在细胞培养液中备用。另将DSPE-PEG，单价DSPE-PEG-RGD和4价DSPE-PEG-RGD分别溶于氯仿中，小心 滴加在盖玻片上，铺平，待氯仿挥干后，在盖玻片上形成薄膜。将上述盖玻片分别置于8孔 细胞培养板中，用PBS缓冲液冲洗两次，加入含5% BSA的磷酸盐缓冲液于4°C孵育2小时 封板，加入上述已标记好的黑色素瘤细胞(5X 105cellS/2ml)，将培养板置于CO2培养箱中， 37°C孵育15分钟。孵育完毕后，用PBS缓冲液洗去未粘附的细胞，粘附在盖玻片上的细胞 用DMSO溶解，荧光分光光度法测定吸收度(激发波长490nm，测定波长537nm)，计算细胞的 粘附百分数。黑色素瘤细胞A375粘附结果(粘附率％ ) 黑色素瘤细胞B16粘附结果(粘附率％ )
浓度(nmollipid/well) DSPE-PEG_单价 DSPE-PEG-RGD 4 价 DSPE-PEG-RGD
0.125 0.5 9.2 17.6 0.25 0.2 15.9 27.2 0.5 - 20.8 39.7 1.0_04_2L2_402_结果表明，单价DSPE-PEG-RGD和4价DSPE-PEG-RGD对黑色素瘤细胞的粘附率显 著高于DSPE-PEG，4价DSPE-PEG-RGD粘附率几乎两倍于单价DSPE-PEG-RGD。
权利要求
一种如下式(Ⅰ)表示的前列腺素衍生物，式中n为0-9的整数。FSA00000127048000011.tif
2.根据权利要求1所述的前列腺素衍生物，其特征在于，式(I)中式(I )中η为 4-7的整数。
3.一种制备权利要求1所述的式(I )化合物的制备方法，该方法包括以下步骤(1)保护。PEG与叔丁基二甲基氯硅烷，在咪唑存在下发生反应，得到化合物(II)。(2)保护。RGD肽与溴化苄，碳酸钾存在下与RGD肽发生反应，得到化合物(III)。(3)成苷。五乙酰基保护的葡萄糖与式(II)的化合物，在二氯甲烷中在Lewis酸(三 氟化硼_乙醚)催化下发生成苷反应，得到式(V )的化合物。(4)脱保护。式(V)的化合物在甲醇钠的甲醇溶液(必要时可加入适量二氯甲烷) 中，于室温下反应，然后经过强酸性阳离子交换树脂酸化，可得式(VI)的化合物。(5)成酯。式(VI)的化合物，在乙醚(或甲苯，二氯甲烷)溶液中与DCC，DMAP，丙二 酸反应，可得式(ΥΠ)的化合物。(6)成酯。(ΥΠ)的化合物，以二氯甲烷为溶剂，在酸(对甲苯磺酸)，β-丙内酯的条 件下反应得到式(VDI)的化合物。(7)成酰胺。式(VDI)的化合物，以乙醚为溶剂在DCC，DMAP催化下与(III)成酰胺， 得到式(IX )的化合物。(8)脱保护。式(IX)的化合物，以四氢呋喃为溶剂，在四丁基氟化铵的作用下，脱去硅 醚保护，得到式(X )的化合物。(9)成酰胺。式(X)的化合物，在羰基二咪唑的作用下，与DSPE成酰胺，溶剂为甲苯 或苯，得到式(XI)的化合物。(10)脱保护。式(XI)的化合物，在氢气，钯碳作用下，以醇为溶剂脱去苄基，得到式 (I )的化合物。
4.根据权利要求3所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)化合物 (III)的制备过程中，反应温度为0-60°C。
5.根据权利要求3所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)化合物 (V )的制备过程中，反应温度为O 30°C。
6.根据权利要求5所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)化合物 (VI)的制备过程中，反应温度为10 30°C。
7.根据权利要求6所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(6)化合物 (W)的制备过程中，反应温度为10 30°C。
8.根据权利要求7所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(7)化合物 (VDI)的制备过程中，反应温度为10 30°C。
9.根据权利要求8所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(8)化合物 (IX )的制备过程中，反应温度为20 40°C。
10.根据权利要求9所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于，步骤(9)化合物 (X )的制备过程中，反应温度为60 100°C。
全文摘要
本发明是式(I)表示的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺衍生物，及其制备方法(式中n为0-9的整数)。提供一种增加肿瘤亲和性的RGD修饰的DSPE-PEG衍生物以适应治疗的需要。
文档编号A61K47/34GK101864071SQ201010178949
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者宋华先, 徐庆春, 黄海 申请人:北京中海康医药科技发展有限公司
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