地胆头提取物及其制法和用途的制作方法
专利名称：地胆头提取物及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及地胆头提取物及抗肿瘤和保肝的药物。
背景技术：
地胆头属菊科地胆草，属多年生草本植物，别名苦地胆、土公英等，产于广东、海南、广西、福建和台湾等地，属常用的民间草药。地胆头味苦微辛、性凉，药用全草，有清热、凉血、利湿之功效。
地胆草主要含内酯、黄酮、甾醇等化合物。近年研究表明，地胆头具有明显的抗肿瘤作用及对白细胞有明显的抑制作用。另外，有关研究还表明，地胆头还具有抗菌作用、解热作用、促进胃肠道蠕动作用、保肝作用等，为地胆头的进一步开发和利用提供理论依据。我们就地胆头提取物的制备方法进行了研究，其提取方法是可行的，所得的提取物有效成分含量非常高，地胆头提取物中主要含有内酯、黄酮、甾醇等化合物，地胆头提取物具有非常明显的抗肿瘤及护肝作用。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种地胆头提取物。
本发明的第二个目的还在于提供一种地胆头提取物的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供本发明涉及的地胆头提取物的医药用途。
本发明提供一种地胆头提取物，是从菊科地胆草属多年生草本植物地胆头中提取出来，含有内酯、黄酮和甾醇化合物。
本发明的地胆头提取物由下述方法制备 (1).地胆头粉碎后，用乙醇热提或冷浸得提取液； (2).提取液离心，弃去沉淀，取上清液备用； (3).上清液加入活性碳进行吸附，离心，过滤，得滤液； (4).滤液浓缩，回收乙醇后，浓缩液加水稀释，上树脂层析柱进行层析分离，依次用水及有机溶媒洗脱，收集有机溶媒洗脱液，回收有机溶媒，余液离心，取沉淀； (5).沉淀用乙醇搅拌溶解，离心，弃去沉淀，取上清液备用； (6).将步骤(5)中的上清液进行醇沉，离心，弃去沉淀，得上清液； (7)将步骤(6)中醇沉后的上清液浓缩至干，即得地胆头提取物；或将醇沉后的上清液浓缩后，喷雾干燥或冷冻干燥，得地胆头提取物。
在上述的制备方法中，步骤(1)的醇提过程是用乙醇两次，合并提取液，每次提取时间为1小时以上，提取温度为20℃～100℃的. 在所述的步骤(1)、(5)中使用的乙醇的体积浓度均为10％～95％，乙醇加入量为地胆头或对应的沉淀物重量的3～20倍。
在所述的步骤(3)中的活性碳吸附，活性碳的用量(按溶液重量计)为2％～10％，活性碳吸附时间为2小时以上。
在所述的步骤(4)中的加水稀释过程中的加水量为原有溶液重量的4～20倍，树脂为聚酰胺树脂、硅胶树脂、离子交换树脂或大孔吸附树脂。
在所述的步骤(4)中所使用的有机溶媒为乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯或石油醚。
在所述的步骤(5)中的醇沉，是采用体积浓度为95％的乙醇进行醇沉，并经过静置、离心后分离出沉淀物，醇沉后醇的最终体积浓度为30％～95％。
还提供了本发明的地胆头提取物在制备抗肿瘤药物或保肝药物中的应用。
本发明采用现代科学方法，对所述的地胆头提取物进行提取纯化，所制得的地胆头提取物产品安全无毒，制备工艺可靠，原料易得，反应条件温和，收率高，纯度好，环保，稳定性好，对制备设备及场所要求也很低，适合于大规模工业化生产。
根据药理、药效学研究的结果表明，本发明所制得的地胆头提取物产品可开发成抗肿瘤、护肝类药物。
具体实施例方式 下面通过具体实施例对本发明作进一步详细描述，以助于理解本发明的内容。
实施例1树脂预处理 本发明所用树脂为聚酰胺树脂、硅胶树脂、离子交换树脂或大孔吸附树脂。我们以大孔树脂为例来简单介绍 树脂的预处理以水或乙醇溶胀过夜，湿法装柱，以乙醇或丙酮洗脱，至回收后无白色沉淀或浑浊即可，然后用水洗至无醇味，交替洗脱2～3次。也可用酸、碱浸，然后再水洗至中性。
树脂的再生非吸附性杂质一般用水洗除去；吸附性杂质可用一定浓度的酸或碱液除去(NaOH或HCl)。保存时加入一定量的乙醇。
实施例2地胆头提取物制备 取地胆头粉5kg，用25.0L 95％乙醇(v％，以下乙醇浓度均指体积浓度)于60℃回流提取6小时，过滤，得滤液，残渣用15.0L 95％乙醇60℃回流提取4小时，过滤，得滤液，合并两次提取液，得38.0L提取液，离心，弃去沉淀，得37.0L上清液。
上清液加入3.5kg活性碳进行吸附，离心，过滤，得35.0L滤液；滤液浓缩，回收乙醇后，残液中加水稀释至15.0L，上大孔树脂层析分离，先用水洗脱至无色透明，再用95％乙醇洗脱至无色透明，收集95％乙醇洗脱液20.0L，回收洗脱液中的乙醇，残液离心，取沉淀。
沉淀用重量为20.0L 60％乙醇搅拌溶解，离心，弃去沉淀，得19.0L上清液，在上清液中加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到75％，静置，离心，弃去沉淀，将醇沉后的上清液浓缩至干，即得地胆头提取物，约240g，收率为4.8％。
检测结果 1.内酯鉴别称取0.50g地胆头提取物，置100ml量瓶中，加去离子水溶解并定容。取地胆头提取物溶液2ml，加1％氢氧化钠溶液2ml，在沸水浴中加热3～5分钟，如溶液较前澄清，加酸酸化后又变浑浊则含地胆头内酯； 2.内酯含量9.61％(参考2005年版药典二部附录V D)。
3.甾醇鉴别薄层色谱法(参考2005年版药典二部附录V B)； 4.甾醇含量5.17％(参考2005年版药典二部附录V D)。
5.黄酮鉴别取样品溶液点在滤纸上，滴加1％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点； 6.黄酮1.21％，方法紫外分光光度法(中国药典2005年版药典二部附录IVA)。
实施例3地胆头提取物制备 取地胆头粉5kg，用30.0L 50％乙醇(v％，以下乙醇浓度均指体积浓度)于60℃回流提取4小时，过滤，得滤液，残渣用20.0L50％乙醇60℃回流提取2小时，过滤，得滤液，合并两次提取液，得48.0L提取液，离心，弃去沉淀，得47.0L上清液。
上清液加入0.92kg活性碳进行吸附，离心，过滤，得46.0L滤液；滤液浓缩，回收乙醇后，加水稀释至20.0L，上树脂层析分离，用水洗脱至无色透明，再用95％乙醇洗脱至无色透明，收集95％乙醇洗脱液19.5.0L，回收乙醇，离心，取沉淀。
沉淀用重量为20.0L 40％乙醇搅拌溶解，离心，弃去沉淀，得18.8L上清液，在上清液中加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到80％，静置，离心，弃去沉淀，将醇沉后的上清液浓缩，回收乙醇，冷冻干燥，即得地胆头提取物，约180g，收率为3.6％。
检测结果 1.内酯鉴别称取0.50g地胆头提取物，置100ml量瓶中，加去离子水溶解并定容。取地胆头提取物溶液2ml，加1％氢氧化钠溶液2ml，在沸水浴中加热3～5分钟，如溶液较前澄清，加酸酸化后又变浑浊则含地胆头内酯； 2.内酯含量9.78％(参考2005年版药典二部附录V D)。
3.甾醇鉴别薄层色谱法(参考2005年版药典二部附录V B)； 4.甾醇含量5.39％(参考2005年版药典二部附录V D)。
5.黄酮鉴别取样品溶液点在滤纸上，滴加1％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点； 6.黄酮1.01％，方法紫外分光光度法(中国药典2005年版药典二部附录IVA)。
实施例4地胆头提取物制备 取地胆头粉5kg，用30.0L60％乙醇(v％，以下乙醇浓度均指体积浓度)60℃回流提取8小时，过滤，得滤液，残渣用20.0L60％乙醇60℃回流提取6小时，过滤，得滤液，合并两次提取液，得47.0L提取液，离心，弃去沉淀，得46.0L上清液。
上清液加入2.0kg活性碳进行吸附，离心，过滤，得44.8L滤液；滤液浓缩，回收乙醇后，加水稀释至18.0L，上树脂层析分离，用水洗脱至无色透明，再用95％乙醇洗脱至无色透明，收集95％乙醇洗脱液19.2L，回收乙醇，离心，取沉淀。
沉淀用重量为30.0L30％乙醇搅拌溶解，离心，弃去沉淀，得19.0L上清液，在上清液中加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到70％，静置，离心，弃去沉淀，将醇沉后的上清液液浓缩后，喷雾干燥，即得地胆头提取物，约220g，收率为4.4％。
检测结果 1.内酯鉴别称取0.50g地胆头提取物，置100ml量瓶中，加去离子水溶解并定容。取地胆头提取物溶液2ml，加1％氢氧化钠溶液2ml，在沸水浴中加热3～5分钟，如溶液较前澄清，加酸酸化后又变浑浊则含地胆头内酯； 2.内酯含量10.11％(参考2005年版药典二部附录V D)。
3.甾醇鉴别薄层色谱法(参考2005年版药典二部附录V B)； 4.甾醇含量5.28％(参考2005年版药典二部附录V D)。
5.黄酮鉴别取样品溶液点在滤纸上，滴加1％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点； 6.黄酮1.32％，方法紫外分光光度法(中国药典2005年版药典二部附录IVA)。
实验例 药效试验结果 1、地胆头提取物的抗肿瘤作用 (1).地胆头提取物对H22荷瘤小鼠和S180荷瘤小鼠生存时间的影响 取60只昆明种雄性小鼠，体重18～22g。无菌条件下抽取接种第7天的H22荷瘤小鼠腹水，放入无菌容器内，置入冰盒内保存。显微镜下计数(癌细胞＞95％)，用HankJs液调整细胞密度至1x106/ml。按0.2ml/只无菌操作腹腔接种。随后将小鼠随机分成5组，每组12只。24h后各组开始灌胃给药(0.9％(w％)氯化钠溶液组0.2ml·d-1、环磷酰胺组30mg·kg-1·d-1、地胆头提取物低剂量组60mg·kg-1·d-1、地胆头提取物中剂量组120mg·kg-1·d-1、地胆头提取物高剂量组240mg·kg-1·d-1)，连续给药10d，停药后观察小鼠死亡时间(生存时间)，计算生命延长率。同法计算荷瘤S180小鼠的生命延长率。
试验结果 表1地胆头提取物对H22荷瘤小鼠和S180荷瘤小鼠生存时间的影响
注与氯化钠溶液组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与环磷酰胺组相 比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
表1中可以看出地胆头提取物高剂量样品组对延长H22荷瘤小鼠和S180荷瘤小鼠生存时间的效果非常明显，与对照组环磷酰胺的效果相当。
(2).地胆头提取物对S180肉瘤小鼠瘤重的影响 取60只昆明种雄性小鼠，体重18～22g。无菌条件下抽取接种第7天的S180荷瘤小鼠腹水，放入无菌容器内，置入冰盒内保存。显微镜下计数(癌细胞＞95％)，用HankJs液调整细胞密度至1x106/ml。按0.2ml/只无菌操作小鼠右前肢腋部皮下接种。将小鼠随机分成5组，每组12只，24h后各组开始灌胃给药(0.9％(w％)氯化钠溶液组0.2ml·d-1、环磷酰胺组30mg·kg-1·d-1、地胆头提取物低剂量组60mg·kg-1·d-1、地胆头提取物中剂量组120mg·kg-1·d-1、地胆头提取物高剂量组240mg·kg-1·d-1)，连续给药10d。测定小鼠体重、胸腺、脾脏、瘤重，结果见表2，并检测小鼠TNF-α、SOD、MDA及NO，结果见表3。
A胸腺指数、脾脏指数、抑瘤率的测定结果。
表2地胆头提取物对S180肉瘤瘤重、胸腺系数和脾脏系数的影响
注与氯化钠溶液组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与环磷酰胺组比较， △P＜0.05，△△P＜0.01。
表2中可以看出地胆头提取物高剂量样品组对S180肉瘤瘤重、胸腺系数和脾脏系数的抑瘤率效果非常明显，比对照组环磷酰胺的效果还好。
B SOD、MDA及NO的检测结果。
表3地胆头提取物对S180肉瘤小鼠TNF-α、SOD、MDA及NO的影响
注与氯化钠溶液组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表3中可以看出地胆头提取物高剂量样品组对S180肉瘤小鼠TNF-α、SOD、MDA及NO的影响非常明显，与对照组环磷酰胺的效果相当。
从表1-3中试验结果可以看出，地胆头提取物高剂量组抗肿瘤作用非常明显。
2、地胆头提取物的护肝作用 取昆明雄性小鼠60只，体重25～30g，随机分成6组，空白对照组、四氯化碳模型组、阳性对照组、地胆头提取物组(低、中、高剂量组)。各样品组小鼠每日灌胃给药受试样品，空白组、四氯化碳模型组均灌生理盐水12ml/kg，药物组灌胃等体积的地胆头提取物(低剂量组为80mg/kg、中剂量组为160mg/kg、高剂量组为320mg/kg)，阳性对照组灌东宝肝泰12ml/kg(含东宝肝泰0.01g)，一天两次，连续灌胃3天，首次灌胃后除空白对照组外，其余组小鼠立即皮下注射为0.1％(w％)的CCl4 0.1mL/10g体重，实验期为60天。实验结束时，禁食12h，24h后动物眼眶取血。用全自动生化分析仪测ALT、AST，并摘取肝脏，用10％(w％)甲醛溶液固定，做病理切片检查，结果见表4至表6。
表4地胆头提取物的护肝作用
表5试验小鼠病理组织学检查结果
表6试验小鼠病理组织学检查结果
从表4-表6中可以看出地胆头提取物具有非常明显的护肝效果，与阳性对照组(东宝肝泰)的护肝效果相当。
权利要求
1.一种地胆头提取物，是从菊科地胆草属多年生草本植物地胆头中提取出来的，含有地胆头内酯、甾醇和黄酮化合物。
2.一种权利要求1中所述地胆头提取物的制备方法，包括如下过程
(1).地胆头粉碎后，用乙醇热提或冷浸，得提取液；
(2).提取液离心，弃去沉淀，取上清液备用；
(3).上清液加入活性碳进行吸附，离心，过滤，得滤液；
(4).滤液浓缩，回收乙醇后，浓缩液加水稀释，上树脂层析柱进行层析分离，再依次用水及有机溶媒洗脱，收集有机溶媒洗脱液，回收有机溶媒，余液离心，取沉淀；
(5).沉淀用乙醇搅拌溶解，离心，弃去沉淀，取上清液备用；
(6).将步骤(5)中的上清液进行醇沉，离心，弃去沉淀，得上清液；
(7)将步骤(6)中醇沉后的上清液浓缩至干，即得地胆头提取物；或将醇沉后的上清液浓缩后，喷雾干燥或冷冻干燥，得地胆头提取物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)的醇提过程是乙醇提取为两次，每次时间为1小时以上，提取温度为20℃～100℃的。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)与步骤(5)中使用的乙醇体积浓度为10％～95％，乙醇加入量为对应固体材料重量的3～20倍。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于在所述的步骤(3)中的活性碳吸附过程，活性碳的用量为上清液重量的2％～10％，活性碳吸附时间为2小时以上。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于在所述的步骤(4)中的加水稀释过程中的加水量为原有溶液重量的4～20倍，层析柱所用树脂为聚酰胺树脂、硅胶树脂、离子交换树脂或大孔吸附树脂。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于在所述的步骤(4)中所使用的有机溶媒为乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯或石油醚。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于在所述的步骤(5)中的醇沉，是采用体积浓度为95％的乙醇进行醇沉，并经过静置、离心后分离出沉淀物，醇沉后醇的最终体积浓度为30％～95％。
9.一种权利要求1所述的地胆头提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种权利要求1所述的地胆头提取物在制备保肝药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种地胆头提取物制品、其制备方法及其医药用途，是从菊科地胆草属多年生草本植物地胆头中提取出来的，含有地胆头内酯、甾醇和黄酮化合物，将地胆头药材采用20％～95％乙醇热提或冷浸得提取液，采用大孔吸附树脂分离纯化，精制地胆头提取物。地胆头提取物的主要活性成分是地胆头内酯、甾醇、黄酮等化合物。经动物试验证实，地胆头提取物有明显的抗肿瘤作用及保肝作用。
文档编号A61K36/28GK101810662SQ20101017901
公开日2010年8月25日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者韩金光 申请人:韩金光
技术领域：
本发明涉及地胆头提取物及抗肿瘤和保肝的药物。
背景技术：
地胆头属菊科地胆草，属多年生草本植物，别名苦地胆、土公英等，产于广东、海南、广西、福建和台湾等地，属常用的民间草药。地胆头味苦微辛、性凉，药用全草，有清热、凉血、利湿之功效。
地胆草主要含内酯、黄酮、甾醇等化合物。近年研究表明，地胆头具有明显的抗肿瘤作用及对白细胞有明显的抑制作用。另外，有关研究还表明，地胆头还具有抗菌作用、解热作用、促进胃肠道蠕动作用、保肝作用等，为地胆头的进一步开发和利用提供理论依据。我们就地胆头提取物的制备方法进行了研究，其提取方法是可行的，所得的提取物有效成分含量非常高，地胆头提取物中主要含有内酯、黄酮、甾醇等化合物，地胆头提取物具有非常明显的抗肿瘤及护肝作用。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种地胆头提取物。
本发明的第二个目的还在于提供一种地胆头提取物的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供本发明涉及的地胆头提取物的医药用途。
本发明提供一种地胆头提取物，是从菊科地胆草属多年生草本植物地胆头中提取出来，含有内酯、黄酮和甾醇化合物。
本发明的地胆头提取物由下述方法制备 (1).地胆头粉碎后，用乙醇热提或冷浸得提取液； (2).提取液离心，弃去沉淀，取上清液备用； (3).上清液加入活性碳进行吸附，离心，过滤，得滤液； (4).滤液浓缩，回收乙醇后，浓缩液加水稀释，上树脂层析柱进行层析分离，依次用水及有机溶媒洗脱，收集有机溶媒洗脱液，回收有机溶媒，余液离心，取沉淀； (5).沉淀用乙醇搅拌溶解，离心，弃去沉淀，取上清液备用； (6).将步骤(5)中的上清液进行醇沉，离心，弃去沉淀，得上清液； (7)将步骤(6)中醇沉后的上清液浓缩至干，即得地胆头提取物；或将醇沉后的上清液浓缩后，喷雾干燥或冷冻干燥，得地胆头提取物。
在上述的制备方法中，步骤(1)的醇提过程是用乙醇两次，合并提取液，每次提取时间为1小时以上，提取温度为20℃～100℃的. 在所述的步骤(1)、(5)中使用的乙醇的体积浓度均为10％～95％，乙醇加入量为地胆头或对应的沉淀物重量的3～20倍。
在所述的步骤(3)中的活性碳吸附，活性碳的用量(按溶液重量计)为2％～10％，活性碳吸附时间为2小时以上。
在所述的步骤(4)中的加水稀释过程中的加水量为原有溶液重量的4～20倍，树脂为聚酰胺树脂、硅胶树脂、离子交换树脂或大孔吸附树脂。
在所述的步骤(4)中所使用的有机溶媒为乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯或石油醚。
在所述的步骤(5)中的醇沉，是采用体积浓度为95％的乙醇进行醇沉，并经过静置、离心后分离出沉淀物，醇沉后醇的最终体积浓度为30％～95％。
还提供了本发明的地胆头提取物在制备抗肿瘤药物或保肝药物中的应用。
本发明采用现代科学方法，对所述的地胆头提取物进行提取纯化，所制得的地胆头提取物产品安全无毒，制备工艺可靠，原料易得，反应条件温和，收率高，纯度好，环保，稳定性好，对制备设备及场所要求也很低，适合于大规模工业化生产。
根据药理、药效学研究的结果表明，本发明所制得的地胆头提取物产品可开发成抗肿瘤、护肝类药物。
具体实施例方式 下面通过具体实施例对本发明作进一步详细描述，以助于理解本发明的内容。
实施例1树脂预处理 本发明所用树脂为聚酰胺树脂、硅胶树脂、离子交换树脂或大孔吸附树脂。我们以大孔树脂为例来简单介绍 树脂的预处理以水或乙醇溶胀过夜，湿法装柱，以乙醇或丙酮洗脱，至回收后无白色沉淀或浑浊即可，然后用水洗至无醇味，交替洗脱2～3次。也可用酸、碱浸，然后再水洗至中性。
树脂的再生非吸附性杂质一般用水洗除去；吸附性杂质可用一定浓度的酸或碱液除去(NaOH或HCl)。保存时加入一定量的乙醇。
实施例2地胆头提取物制备 取地胆头粉5kg，用25.0L 95％乙醇(v％，以下乙醇浓度均指体积浓度)于60℃回流提取6小时，过滤，得滤液，残渣用15.0L 95％乙醇60℃回流提取4小时，过滤，得滤液，合并两次提取液，得38.0L提取液，离心，弃去沉淀，得37.0L上清液。
上清液加入3.5kg活性碳进行吸附，离心，过滤，得35.0L滤液；滤液浓缩，回收乙醇后，残液中加水稀释至15.0L，上大孔树脂层析分离，先用水洗脱至无色透明，再用95％乙醇洗脱至无色透明，收集95％乙醇洗脱液20.0L，回收洗脱液中的乙醇，残液离心，取沉淀。
沉淀用重量为20.0L 60％乙醇搅拌溶解，离心，弃去沉淀，得19.0L上清液，在上清液中加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到75％，静置，离心，弃去沉淀，将醇沉后的上清液浓缩至干，即得地胆头提取物，约240g，收率为4.8％。
检测结果 1.内酯鉴别称取0.50g地胆头提取物，置100ml量瓶中，加去离子水溶解并定容。取地胆头提取物溶液2ml，加1％氢氧化钠溶液2ml，在沸水浴中加热3～5分钟，如溶液较前澄清，加酸酸化后又变浑浊则含地胆头内酯； 2.内酯含量9.61％(参考2005年版药典二部附录V D)。
3.甾醇鉴别薄层色谱法(参考2005年版药典二部附录V B)； 4.甾醇含量5.17％(参考2005年版药典二部附录V D)。
5.黄酮鉴别取样品溶液点在滤纸上，滴加1％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点； 6.黄酮1.21％，方法紫外分光光度法(中国药典2005年版药典二部附录IVA)。
实施例3地胆头提取物制备 取地胆头粉5kg，用30.0L 50％乙醇(v％，以下乙醇浓度均指体积浓度)于60℃回流提取4小时，过滤，得滤液，残渣用20.0L50％乙醇60℃回流提取2小时，过滤，得滤液，合并两次提取液，得48.0L提取液，离心，弃去沉淀，得47.0L上清液。
上清液加入0.92kg活性碳进行吸附，离心，过滤，得46.0L滤液；滤液浓缩，回收乙醇后，加水稀释至20.0L，上树脂层析分离，用水洗脱至无色透明，再用95％乙醇洗脱至无色透明，收集95％乙醇洗脱液19.5.0L，回收乙醇，离心，取沉淀。
沉淀用重量为20.0L 40％乙醇搅拌溶解，离心，弃去沉淀，得18.8L上清液，在上清液中加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到80％，静置，离心，弃去沉淀，将醇沉后的上清液浓缩，回收乙醇，冷冻干燥，即得地胆头提取物，约180g，收率为3.6％。
检测结果 1.内酯鉴别称取0.50g地胆头提取物，置100ml量瓶中，加去离子水溶解并定容。取地胆头提取物溶液2ml，加1％氢氧化钠溶液2ml，在沸水浴中加热3～5分钟，如溶液较前澄清，加酸酸化后又变浑浊则含地胆头内酯； 2.内酯含量9.78％(参考2005年版药典二部附录V D)。
3.甾醇鉴别薄层色谱法(参考2005年版药典二部附录V B)； 4.甾醇含量5.39％(参考2005年版药典二部附录V D)。
5.黄酮鉴别取样品溶液点在滤纸上，滴加1％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点； 6.黄酮1.01％，方法紫外分光光度法(中国药典2005年版药典二部附录IVA)。
实施例4地胆头提取物制备 取地胆头粉5kg，用30.0L60％乙醇(v％，以下乙醇浓度均指体积浓度)60℃回流提取8小时，过滤，得滤液，残渣用20.0L60％乙醇60℃回流提取6小时，过滤，得滤液，合并两次提取液，得47.0L提取液，离心，弃去沉淀，得46.0L上清液。
上清液加入2.0kg活性碳进行吸附，离心，过滤，得44.8L滤液；滤液浓缩，回收乙醇后，加水稀释至18.0L，上树脂层析分离，用水洗脱至无色透明，再用95％乙醇洗脱至无色透明，收集95％乙醇洗脱液19.2L，回收乙醇，离心，取沉淀。
沉淀用重量为30.0L30％乙醇搅拌溶解，离心，弃去沉淀，得19.0L上清液，在上清液中加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到70％，静置，离心，弃去沉淀，将醇沉后的上清液液浓缩后，喷雾干燥，即得地胆头提取物，约220g，收率为4.4％。
检测结果 1.内酯鉴别称取0.50g地胆头提取物，置100ml量瓶中，加去离子水溶解并定容。取地胆头提取物溶液2ml，加1％氢氧化钠溶液2ml，在沸水浴中加热3～5分钟，如溶液较前澄清，加酸酸化后又变浑浊则含地胆头内酯； 2.内酯含量10.11％(参考2005年版药典二部附录V D)。
3.甾醇鉴别薄层色谱法(参考2005年版药典二部附录V B)； 4.甾醇含量5.28％(参考2005年版药典二部附录V D)。
5.黄酮鉴别取样品溶液点在滤纸上，滴加1％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点； 6.黄酮1.32％，方法紫外分光光度法(中国药典2005年版药典二部附录IVA)。
实验例 药效试验结果 1、地胆头提取物的抗肿瘤作用 (1).地胆头提取物对H22荷瘤小鼠和S180荷瘤小鼠生存时间的影响 取60只昆明种雄性小鼠，体重18～22g。无菌条件下抽取接种第7天的H22荷瘤小鼠腹水，放入无菌容器内，置入冰盒内保存。显微镜下计数(癌细胞＞95％)，用HankJs液调整细胞密度至1x106/ml。按0.2ml/只无菌操作腹腔接种。随后将小鼠随机分成5组，每组12只。24h后各组开始灌胃给药(0.9％(w％)氯化钠溶液组0.2ml·d-1、环磷酰胺组30mg·kg-1·d-1、地胆头提取物低剂量组60mg·kg-1·d-1、地胆头提取物中剂量组120mg·kg-1·d-1、地胆头提取物高剂量组240mg·kg-1·d-1)，连续给药10d，停药后观察小鼠死亡时间(生存时间)，计算生命延长率。同法计算荷瘤S180小鼠的生命延长率。
试验结果 表1地胆头提取物对H22荷瘤小鼠和S180荷瘤小鼠生存时间的影响
注与氯化钠溶液组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与环磷酰胺组相 比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
表1中可以看出地胆头提取物高剂量样品组对延长H22荷瘤小鼠和S180荷瘤小鼠生存时间的效果非常明显，与对照组环磷酰胺的效果相当。
(2).地胆头提取物对S180肉瘤小鼠瘤重的影响 取60只昆明种雄性小鼠，体重18～22g。无菌条件下抽取接种第7天的S180荷瘤小鼠腹水，放入无菌容器内，置入冰盒内保存。显微镜下计数(癌细胞＞95％)，用HankJs液调整细胞密度至1x106/ml。按0.2ml/只无菌操作小鼠右前肢腋部皮下接种。将小鼠随机分成5组，每组12只，24h后各组开始灌胃给药(0.9％(w％)氯化钠溶液组0.2ml·d-1、环磷酰胺组30mg·kg-1·d-1、地胆头提取物低剂量组60mg·kg-1·d-1、地胆头提取物中剂量组120mg·kg-1·d-1、地胆头提取物高剂量组240mg·kg-1·d-1)，连续给药10d。测定小鼠体重、胸腺、脾脏、瘤重，结果见表2，并检测小鼠TNF-α、SOD、MDA及NO，结果见表3。
A胸腺指数、脾脏指数、抑瘤率的测定结果。
表2地胆头提取物对S180肉瘤瘤重、胸腺系数和脾脏系数的影响
注与氯化钠溶液组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与环磷酰胺组比较， △P＜0.05，△△P＜0.01。
表2中可以看出地胆头提取物高剂量样品组对S180肉瘤瘤重、胸腺系数和脾脏系数的抑瘤率效果非常明显，比对照组环磷酰胺的效果还好。
B SOD、MDA及NO的检测结果。
表3地胆头提取物对S180肉瘤小鼠TNF-α、SOD、MDA及NO的影响
注与氯化钠溶液组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表3中可以看出地胆头提取物高剂量样品组对S180肉瘤小鼠TNF-α、SOD、MDA及NO的影响非常明显，与对照组环磷酰胺的效果相当。
从表1-3中试验结果可以看出，地胆头提取物高剂量组抗肿瘤作用非常明显。
2、地胆头提取物的护肝作用 取昆明雄性小鼠60只，体重25～30g，随机分成6组，空白对照组、四氯化碳模型组、阳性对照组、地胆头提取物组(低、中、高剂量组)。各样品组小鼠每日灌胃给药受试样品，空白组、四氯化碳模型组均灌生理盐水12ml/kg，药物组灌胃等体积的地胆头提取物(低剂量组为80mg/kg、中剂量组为160mg/kg、高剂量组为320mg/kg)，阳性对照组灌东宝肝泰12ml/kg(含东宝肝泰0.01g)，一天两次，连续灌胃3天，首次灌胃后除空白对照组外，其余组小鼠立即皮下注射为0.1％(w％)的CCl4 0.1mL/10g体重，实验期为60天。实验结束时，禁食12h，24h后动物眼眶取血。用全自动生化分析仪测ALT、AST，并摘取肝脏，用10％(w％)甲醛溶液固定，做病理切片检查，结果见表4至表6。
表4地胆头提取物的护肝作用
表5试验小鼠病理组织学检查结果
表6试验小鼠病理组织学检查结果
从表4-表6中可以看出地胆头提取物具有非常明显的护肝效果，与阳性对照组(东宝肝泰)的护肝效果相当。
权利要求
1.一种地胆头提取物，是从菊科地胆草属多年生草本植物地胆头中提取出来的，含有地胆头内酯、甾醇和黄酮化合物。
2.一种权利要求1中所述地胆头提取物的制备方法，包括如下过程
(1).地胆头粉碎后，用乙醇热提或冷浸，得提取液；
(2).提取液离心，弃去沉淀，取上清液备用；
(3).上清液加入活性碳进行吸附，离心，过滤，得滤液；
(4).滤液浓缩，回收乙醇后，浓缩液加水稀释，上树脂层析柱进行层析分离，再依次用水及有机溶媒洗脱，收集有机溶媒洗脱液，回收有机溶媒，余液离心，取沉淀；
(5).沉淀用乙醇搅拌溶解，离心，弃去沉淀，取上清液备用；
(6).将步骤(5)中的上清液进行醇沉，离心，弃去沉淀，得上清液；
(7)将步骤(6)中醇沉后的上清液浓缩至干，即得地胆头提取物；或将醇沉后的上清液浓缩后，喷雾干燥或冷冻干燥，得地胆头提取物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)的醇提过程是乙醇提取为两次，每次时间为1小时以上，提取温度为20℃～100℃的。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)与步骤(5)中使用的乙醇体积浓度为10％～95％，乙醇加入量为对应固体材料重量的3～20倍。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于在所述的步骤(3)中的活性碳吸附过程，活性碳的用量为上清液重量的2％～10％，活性碳吸附时间为2小时以上。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于在所述的步骤(4)中的加水稀释过程中的加水量为原有溶液重量的4～20倍，层析柱所用树脂为聚酰胺树脂、硅胶树脂、离子交换树脂或大孔吸附树脂。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于在所述的步骤(4)中所使用的有机溶媒为乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯或石油醚。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于在所述的步骤(5)中的醇沉，是采用体积浓度为95％的乙醇进行醇沉，并经过静置、离心后分离出沉淀物，醇沉后醇的最终体积浓度为30％～95％。
9.一种权利要求1所述的地胆头提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种权利要求1所述的地胆头提取物在制备保肝药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种地胆头提取物制品、其制备方法及其医药用途，是从菊科地胆草属多年生草本植物地胆头中提取出来的，含有地胆头内酯、甾醇和黄酮化合物，将地胆头药材采用20％～95％乙醇热提或冷浸得提取液，采用大孔吸附树脂分离纯化，精制地胆头提取物。地胆头提取物的主要活性成分是地胆头内酯、甾醇、黄酮等化合物。经动物试验证实，地胆头提取物有明显的抗肿瘤作用及保肝作用。
文档编号A61K36/28GK101810662SQ20101017901
公开日2010年8月25日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者韩金光 申请人:韩金光
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