玉足海参多糖的制备方法
专利名称：玉足海参多糖的制备方法
技术领域：
本发明属于中药制备技术领域，具体涉及玉足海参多糖的制备方法。
背景技术：
癌症目前已成为人类面临的一大杀手，死亡率仅次于心血管疾病，而且呈逐年上 升的趋势。目前的化学合成药物虽然抗肿瘤作用确切，疗效显著，但有不良反应大、长期应 用易产生耐药性等缺点，所以，人们迫切希望找到疗效好且不良反应低的药物，我国的传统 中药在这方面显示出了优势。近年来，广大学者对中药进行了广泛的研究。
侵袭和转移是肿瘤最基本的生物学特征，也是恶性肿瘤的致死主因。据统计，临床 诊断出原发肿瘤时，约50%的患者已产生远处的转移，而目前的手术、放化疗等方法对已多 灶性分布的恶性瘤的治疗效果也不显著，因此，寻找有效的抗肿瘤转移药物对于防治肿瘤， 降低癌症病死率具有重要意义。王光凤等采用多种肿瘤模型，研究橘皮中提取的黄酮化合 物川陈皮素的抗肿瘤作用。结果显示，川陈皮素8 32mg/kg小鼠黑色素瘤B16的抑瘤率 为42. 24% 65. 95%，对小鼠Lewis肺癌的抑瘤率为38. 84% 59. 09% ；对小鼠S180肉 瘤的抑瘤率为36. 02% 45. 98%。川陈皮素与小剂量的紫杉醇、丝裂霉素、52氟尿嘧啶、 顺钼和阿霉素联用时，表现明显的协同效应。川陈皮素对小鼠Lewis肺癌腋皮下接种肺转 移的抑制率为33. 63% 38. 94% ；对小鼠Colon26结肠癌腹腔接种腹膜转移的抑制率为 37. 74% 43. 40%。(王光凤，王小晨，肖磷，等.柑橘黄酮川陈皮素的抗肿瘤作用研究，中 草药，2007,38(11) 1694-1697)蛇床子水提物、总香豆素及蛇床子素等单体成分抗肿瘤及 相关研究表明，蛇床子不仅本身抗肿瘤效价明显，对肿瘤引起的免疫功能低下、炎症反应及 癌性疼痛具有一定的治疗价值，在肿瘤的预防及治疗中配合放化疗，对于克服肿瘤的多药 耐药以及减毒增效作用都有积极的意义。蛇床子不仅有明显的抗诱变活性，其本身也没有 致突变性和致瘤性，并且可以诱导肿瘤细胞向正常细胞转化。(周则卫，刘培勋.蛇床子化 学成分及抗肿瘤活性的研究进展，中国中药杂志，2005,30(17) 1309-1312)但以上研究都 只能对某种肿瘤细胞发挥作用，研究还不够深入。
发明内容
发明目的本发明的目的在于提供玉足海参多糖的制备方法。技术方案一、玉足海参多糖的制备将海参洗净，放入研钵，加入液氮(15mL/g)，迅速冷冻，将冻块压碎，转移至研钵研 磨，边研磨边加液氮，直至成细末(150目)；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶中，应 用冷冻干燥机冷冻干燥，冷冻干燥分为预冻、升华和二次升华三个阶段，预冻阶段将箱内 温度降至_38°C至_42°C，维持6小时；升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整 个系统抽真空，压强设置在15-20帕之间，温度在20-30分钟升至1_3°C，维持16-18小时； 二次升华阶段将温度升至22-28°C，维持8-12小时，制成玉足海参多糖冻干粉，制成玉足海参多糖冻干粉。优选方法为上述玉足海参多糖的制备方法，预冻阶段先将冷冻干燥箱内温度降 至-40°C，维持7小时；升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整个系统抽真空，压 强设置在18帕，温度在25分钟时升至2V，维持17小时；二次升华阶段将温度升至25°C， 维持10小时，制成玉足海参多糖冻干粉。
二、玉足海参粘多糖(HS)对自发性B16F10黑色素瘤转移模型的影响1.实验材料1.1实验动物与细胞清洁级C57BL/6小鼠(雌性，6_8周龄，16_20g)，上海斯莱克实验动物有限责任公 司，许可证号SCXK (沪)2007-0005 ；B16F10黑色素瘤细胞株，南京大学徐强教授惠赠。1.2实验药物HS，常州海洋生物工程有限公司，批号060201。1.3实验试剂DMEM(美国GIBCO公司批号1340114)，PBS (实验室自制)，小牛血清(天津 市洋生物制品科技有限公司批号:QWTC0701), Trypsin(AMRESC0公司批号=2009/08) EDTA(AMRESC0公司批号0105)，甲醛(上海久亿化学试剂有限公司批号20070610)，生理 盐水(上海华源长富药业有限公司批号070405045)，NaHC03(南京化学试剂有限公司批 号050480039)，液体石蜡(上海久亿化学试剂有限公司批号20040701)。1.4实验器材莱卡倒置荧光显微镜(德国莱卡公司型号DM1L)，精密移液器(法国吉尔森公 司型号P2)，全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号MLS-3020)，超净工作台(苏净集 团安泰公司制造型号SW-CJ-ZFD)，超低温冰箱(美国纽艾尔公司型号Nu-6511)，C02培 养箱(FORMA型号3111)，纯水仪(美国Spring公司型号S/N 020579)，电子天平(德 国赛多利斯有限公司型号BT323S)，台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号 DHG9123A)，冰箱(西门子公司型号KG18V21TI)，液氮罐(CBS型号:2001)，离心机(上海安 亭科学仪器厂型号KA-1000)，PH计(HANNA公司型号HI_221)，注射器。2.实验方法2. 1体内剂量的选择实验室前期实验已经阐明HS具有抗凝活性，前期实验观察HS对健康小鼠凝血时 间的影响，选取健康的ICR小鼠58只，随机分成6组，HS组尾静脉注射(41. 6mg/kg、10. 4mg/ kg、5. 2mg/kg、2. 6mg/kg和1. 3mg/kg)，对照组尾静脉注射等体积的生理盐水，采用玻片法 和毛细血管法两种方法测定凝血时间，进行比较发现HS以41. 6mg/kg剂量尾静脉注射，5只 受试小鼠测得凝血时间均大于lOmin，除了 1.3mg/kg剂量组以外，其余各组与对照组相比 均有显著性差异(P <0.01),结果如下表1-1 =HS对健康ICR小鼠凝血时间的影响(χ ± SD )Table 1-1 :The effect of HS on clotting time of health ICR mice ( 士 SD) 注与对照组相比，*P< 0.01。从结果可以看出，HS在剂量为2. 6mg/kg时已经影响了凝血时间，改变了小鼠血 液流变学的某些过程，而HS的抗凝活性是我们选择其作为研究其对肿瘤转移影响的基础， 所以基于体内抗凝剂量我们来确定本研究课题的体内给药剂量。由于荷瘤鼠状态较差，而 且对于肿瘤模型的研究一般使用的是C57BL/6小鼠，此小鼠通体全黑，尾巴很细，尾静脉不 容易找到且要持续给药很长时间，所以我们采用腹腔注射给药方式，将体内最小剂量定为 5. 2mg/kg，最大剂量定为最小剂量的五倍，为26mg/kg，中剂量取两者中间值定为11. 6mg/
kg ο2.2制备B16F10细胞悬液常规培养B16F10肿瘤细胞，实验前4-5天，按1 10细胞传代于细胞培养瓶中， 以免细胞生长过度而出现不完全融合。每个培养瓶大约含6-8 X 106细胞，取对数生长期的 细胞，弃去培养液，用PBS洗净，加入ImL 0. 25%胰酶+0. 02% EDTA消化液，放入细胞培养 箱中，l-3min后，轻敲培养瓶使细胞脱落。加IOmL DMEM，用移液管吹打细胞，获得单细胞悬 液，转入50mL聚丙烯离心管。离心细胞(1200rpmX10min)，然后用PBS洗两遍。用苔盼蓝 计数细胞，调整细胞浓度为lX107/mL。2. 3复制B16F10自发性肿瘤转移模型每只C57BL/6小鼠左后肢足垫皮下注射含5 X 105个B16F10细胞的悬液0. 05mL, 这些小鼠每五天称一次体重。于接种后第八天按照左足垫上原发瘤的大小将小鼠随机分 为四组模型组对照组(生理盐水组)、HS低剂量组(5. 2mg/kg小鼠体重)、HS中剂量组 (11.6mg/kg小鼠体重)、HS高剂量组(26mg/kg小鼠体重)，每组动物数为10只。从接种的 第九天开始各组腹腔注射给予相应剂量的药物，模型组给予相应的生理盐水，每日一次，直 至处死动物，采集标本。在接种后第23天，麻醉小鼠，截除荷瘤下肢，10% PBS-福尔马林固 定原发瘤组织，称取原发肿瘤重量以及用直尺测量原发瘤的长轴(Li)和纵轴(L2)，按照以 下公式计算原发瘤的体积0. 5236XL1X (L2)2，最后用石蜡包埋用于免疫组化实验观察原 发位的血管生成以及各因子表达的情况。切除原发灶后22天处死小鼠，取出肺，避免镊子 触及脏器表面损伤组织，用PBS洗净组织。10% PBS-福尔马林固定肺组织，称取肺重，拍照 并且在解剖显微镜下计算肺肿瘤结节数。3.实验结果3. IHS对B16F10黑色素瘤自发性转移模型肺转移的影响实验结果采用Excel统计软件学生t检验进行检验，由实验数据可以看出，HS各 剂量组与对照组相比对黑色素瘤自发性转移模型的肺转移结节数均有抑制作用，且呈现剂 量相关性=HS 5. 2mg/kg 剂量组(P < 0. 05)、HS 11. 6mg/kg 剂量组(P < 0. 01)、HS 26mg/ kg剂量组(P < 0. 01)。对于肺重的影响，HS 26mg/kg剂量组的肺重明显低于对照组的肺重(P <0.01)，其他两组无明显作用。3. 2HS对B16F10黑色素瘤原发位肿瘤体积和重量的影响从表1-2可以看出，与生理盐水组相比，HS对于接种B16F10黑色素瘤细胞后的小 鼠足垫部的原发位肿瘤无论是体积以及重量都没有明显的影响作用。从表1-2的小鼠给药 前后的体重记录可以得出，与对照组相比，HS给药组的小鼠体重并未明显低。表1-2 =HS对B16F10原发位肿瘤生长以及小鼠体重的影响(又士S. D.) 4.结论HS能够抑制B16F10黑色素瘤肺转移，而且也抑制转移灶的生长，但是对原发肿瘤 细胞增殖没有影响，从小鼠体重变化可以看出，HS的毒副作用很小，为今后体内安全用药提 供基础。三、HS对细胞增殖作用的影响1.实验材料1. 1实验用细胞株B16F10黑色素瘤细胞株由南京大学徐强教授惠赠，常规培养在含有10%小牛血 清和2mg/mL NaHC03的DMEM培养液中；原代的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由本实验室从人 的脐静脉中分离得到，方法是通过在37°C下用0. 25%胰酶对人脐静脉消化8-10分钟，将含 有内皮细胞的胰蛋白酶液1200rpm离心10分钟后，弃上清，加入培养液，吹打混勻制成细胞 悬液后种于培养瓶中。本课题使用的HUVEC均为2-7代，所用的培养液是含有LSGS的M199 培养液。1. 2实验药物HS，常州海洋生物工程有限公司，批号060201。1. 3实验试剂DMEM(美国GIBCO公司批号1340114)，DPBS(实验室自制)，小牛血清(天津 市灏洋生物制品科技有限公司批号QWTC0701)，Trypsin(AMRESCC)公司批号2009/08)， EDTA (AMRESC0 公司批号0105)，LSGS (Cascade biologies 公司批号#070418_901)， M199(美国Sigma公司批号:083K83581)，胎牛血清(美国GIBCO公司)，MTS (Promega公司 批号G111A 22258402)，PMS (AMRESC0公司批号0361)，NaHC03 (南京化学试剂有限公司批号050480039)。1. 4实验器材可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号SPECTRA MAX 190)，莱卡倒置 荧光显微镜(德国莱卡公司型号DM1L)，精密移液器(法国吉尔森公司型号P2)，全自动 高压灭菌锅(日本SANYO公司型号MLS-3020)，超净工作台(苏净集团安泰公司制造型 号SW-CJ-ZFD)，超低温冰箱(美国纽艾尔公司型号Nu-6511)，CO2培养箱(FORMA型号 3111)，纯水仪(美国Spring公司型号S/N 020579)，电子天平(德国赛多利斯有限公司 型号BT323S)，台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号DHG9123A)，冰箱(西 门子公司型号KG18V21TI)，液氮 罐(CBS型号2001)，离心机(上海安亭科学仪器厂型号 KA-1000)，pH 计(HANNA 公司型号HI_221)，96 孔细胞培养板(Corningcostar 公司)，Tip 头若干。2.实验方法MTS法测定HS对常规培养的B16F10细胞和HUVEC增殖的影响，具体方法如下在 完全培养液中收集处于对数期生长的HUVEC细胞和B16F10细胞，调整细胞悬液浓度，分于 96孔板，每孔200 μ L，5000个细胞/孔，置37°C、5% CO2培养箱孵育24小时使细胞贴壁。对 于B16F10细胞，细胞贴壁后弃上清，更换新鲜的培养液，180 μ L/孔并加入20 μ 1溶于DMEM 的各浓度HS药液，HS的终浓度分别为0. 001 μ Μ，0. 01 μ Μ，0. 1 μ Μ，1 μ Μ，10 μ M禾口 100 μ Μ, 空白对照仅加入20 μ L DMEM，每组4个复孔，置摇床上低速振荡混勻，继续培养24小时； 对于HUVEC细胞，贴壁后弃上清，先用M199培养液漂洗细胞后加入含有1 %胎牛血清的 M199 (180 μ L/孔)，继续培养6小时后加入相应的剂量的HS，使其终浓度分别为0. 08 μ Μ, 0. 4 μ Μ，2 μ Μ，10 μ M和50 μ Μ，每组5个复孔，再继续培养30小时。在与相应药物共同孵育 相应时间之后，加入40 μ L/孔MTS/PMS溶液，MTS的终浓度为333 μ g/mL, PMS的终浓度为 25 μ Μ,继续培养4小时，然后置摇床上低速振荡lOmin，测量各孔在490nm处的吸光值。3.实验结果实验结果采用Excel统计软件学生t检验进行检验，实验重复三次，结果为三次独 立实验的平均值，本实验结果中将空白对照组所得出的吸光度均值归一化设定为100%，HS 各剂量组的值就表达为％空白对照。3. IHS对B16F10黑色素瘤细胞增殖的影响100倍显微镜下观察细胞形态，与对照组相比，HS各剂量组对于B16F10细胞形态 均无明显影响，但HSl μ MUO μ M和100 μ M剂量组的细胞密度明显要比对照组的稀疏一些， 490nm处吸光度实验数据显示，HS 1 μ M和10 μ M能抑制B16F10细胞增殖(P < 0. 05)，而 100 μ M HS 能明显抑制 B16F10 生长(P < 0. 01)。3. 2HS对HUVEC细胞增殖的影响从测得的吸光度以及100倍显微镜下观察发现HS在浓度高达50 μ M时会对HUVEC 细胞的正常生长有明显的抑制作用(P < 0.01)，其他各剂量组无论从形态上还是实际测得 的吸光度对HUVEC细胞的正常生长均无显著的影响。4.结论从实验的结果不难看出，共同孵育30小时之后，HS在低于50 μ M对HUVEC细胞的 正常生长并未产生任何的抑制作用，提示在本课题之后使用HUVEC细胞来研究HS抗血管生成作用时HS的剂量不应超过50 μ M且HS的作用时间应在30小时之内，而对于B16F10细胞 所使用的剂量应低于1 μ Μ,且作用时间不超过24小时，为后面体外实验剂量的确定提供依 据。从这个实验可以看出，剂量大于ΙμΜ就能够抑制B16F10生长，但对于正常细胞HUVEC 细胞的生长，HS剂量高达50 μ M才会产生抑制作用，说明HS对肿瘤细胞的杀伤力要明显强 于正常细胞。四、HS对B16F10黑色素瘤细胞实验性肺转移影响1.实验材料 1. 1实验动物与细胞清洁级C57BL/6小鼠(雌性，6_8周龄，16_20g)，上海斯莱克实验动物有限责任公 司，许可证号SCXK (沪)2007-0005 ；B16F10黑色素瘤细胞株，南京大学徐强教授惠赠。1. 2实验药物HS，常州海洋生物工程有限公司，批号060201。1. 3实验试剂DMEM(美国GiBCO公司批号1340114)，PBS(实验室自制)，小牛血清(天津市 灏洋生物制品科技有限公司批号:QWTC0701), Trypsin (AMRESC0公司批号2009/08), EDTA(AMRESC0公司批号0105)，甲醛(上海久亿化学试剂有限公司批号20070610)，生理 盐水(上海华源长富药业有限公司批号070405045)，NaHCO3(南京化学试剂有限公司批 号050480039)。1. 4实验器材莱卡倒置荧光显微镜(德国莱卡公司型号DM1L)，精密移液器(法国吉尔森公 司型号P2)，全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号MLS-3020)，超净工作台(苏净集 团安泰公司制造型号SW-CJ-ZFD)，超低温冰箱(美国纽艾尔公司型号Nu-6511)，CO2培 养箱(FORMA型号3111)，纯水仪(美国Spring公司型号S/N 020579)，电子天平(德 国赛多利斯有限公司型号BT323S)，台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号 DHG9123A)，冰箱(西门子公司型号KG18V21TI)，液氮罐(CBS型号:2001)，离心机(上海安 亭科学仪器厂型号KA-1000)，PH计(HANNA公司型号HI_221)，注射器。2.实验方法2.1制备细胞悬液常规培养B16F10肿瘤细胞，实验前4-5天，按1 10，细胞传代于细胞培养瓶中， 以免细胞生长过度而出现不完全汇合。每个培养瓶大约含6-8 X 106细胞，取对数生长期的 细胞，弃去培养液，用PBS洗净，加入ImL 0. 25%胰酶-0. 02% EDTA消化液，放入细胞培养 箱当中，l-3min后，轻敲培养瓶使细胞脱落。加IOmL DMEM，用移液管吹打细胞，获得单细胞 悬液，转入50mL聚丙烯离心管。离心细胞(1200rpmX10min)，然后用PBS洗两遍。用苔盼 蓝计数细胞，调整细胞浓度为2. 5 X 106个/mL。2. 2复制B16F10实验性肿瘤转移模型取C57BL/6小鼠置于小鼠注射固定器，尾静脉注射0. 2mL细胞悬液(含5X 105肿 瘤细胞)。接种过肿瘤细胞的小鼠随机分为4组模型组对照组(生理盐水)，HS低剂量 组(5. 2mg/kg)，HS中剂量组(11. 6mg/kg)，HS高剂量组(26mg/kg)，腹腔注射给药，每日一 次。给药23天，处死小鼠，取肺脏。避免镊子触及脏器表面，防止损伤组织，用PBS洗净组织。10% PBS-福尔马林固定肺组织，称取肺重，拍照，评价HS对B16F10肿瘤血行肺转移的影响。3.实验结果实验结果采用Excel统计软件学生t检验，从各组取出的肺组织可以看出，模型组的肺组织转移肿瘤结节数目显著多于给药组，由于肺结节太多，无法计数统计，对肺重的统 计分析表明，HS高剂量组(26mg/kg)和中剂量组(11.6mg/kg)均能抑制小鼠肺组织重量，P 值分别为P < 0. 01和P < 0. 05。HS给药前后小鼠体重差异不大，且与对照组相比，小鼠体 重未发现有大幅度减少，各组的死亡率显示，HS药物对于小鼠的体内毒性较小。4.结论HS给药组小鼠的死亡率与对照组相当，而且体重与给药前也没有明显的减少，说 明HS的毒副作用很小，HS可以很好的抑制实验性B16F10黑色素瘤肺转移，HS对于B16F10 细胞直接入血之后的血行过程，黏附过程以及穿出血管过程有一定的抑制作用。有益效果玉足海参粘多糖是从广东省、海南岛一带的民间海洋生物玉足海参Hojothuria leucospilota中提取出的一种酸性粘多糖，性微寒，味甘、成。归肺、肾、大肠经。具有补肾 益精；养血润燥；止血的功效，主治精血亏损；虚弱劳怯；阳痿；梦遗；肠燥便秘；肺虚咳嗽 咯血，肠风便血，外伤出血。现代药理学研究，玉足海参粘多糖具有抑制肿瘤转移作用。将海参用普通烘箱80°C烘干后打粉，测定其中海参粘多糖的含量为2.5%，而采 用液氮冷冻，并冻干后的海参粘多糖的含量为4. 8%。
具体实施例方式结合具体实施方式
，对本发明进一步说明如下海参为海洋生物玉足海参 Ho jothurialeucospilota。实施例1取海参5g，洗净，放入研钵，加入液氮75mL，迅速冷冻，将冻块压碎，转移至研钵研 磨，边研磨边加液氮，直至成150目细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶中，应用 冷冻干燥机冷冻干燥，冷冻干燥分为预冻、升华和二次升华三个阶段，预冻阶段将箱内温 度降至_38°C，维持6小时；升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整个系统抽真 空，压强设置在15-20帕之间，温度在20-30分钟升至;TC，维持16-18小时；二次升华阶段 将温度升至22°C，维持8-12小时，制成玉足海参多糖冻干粉，制成玉足海参多糖冻干粉。实施例2取海参5g，洗净，放入研钵，加入液氮75mL，迅速冷冻，将冻块压碎，转移至研钵研 磨，边研磨边加液氮，直至成150目细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶中，应用 冷冻干燥机冷冻干燥，冷冻干燥分为预冻、升华和二次升华三个阶段，预冻阶段先将冷冻干 燥箱内温度降至-40°C，维持7小时；升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整个系 统抽真空，压强设置在18帕，温度在25分钟时升至2°C，维持17小时；二次升华阶段将温 度升至25°C，维持10小时，制成玉足海参多糖冻干粉。实施例3一种玉足海参多糖的制备方法，将海参洗净后用液氮冷冻成块状，将冻块压碎后转移至研钵研磨，边研磨边加液氮，直至磨成细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶 中，应用冷冻干燥机冷冻干燥预冻阶段先将冷冻干燥箱内温度降至_38°C，维持8小时； 升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整个系统抽真空，压强设置在15帕，温度 在20分钟升至1°C，维持18小时；二次升华阶段将温度升至22°C，维持12小时，制成玉足 海参多糖冻干粉。实施例4
一种玉足海参多糖的制备方法，将海参洗净后用液氮冷冻成块状，将冻块压碎后 转移至研钵研磨，边研磨边加液氮，直至磨成细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶 中，应用冷冻干燥机冷冻干燥预冻阶段先将冷冻干燥箱内温度降至_42°C，维持5小时； 升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整个系统抽真空，压强设置在20帕，温度 在20分钟升至3°C，维持16小时；二次升华阶段将温度升至28°C，维持8小时，制成玉足 海参多糖冻干粉。
权利要求
一种玉足海参多糖的制备方法，其特征在于将海参洗净后用液氮冷冻成块状，将冻块压碎后转移至研钵研磨，边研磨边加液氮，直至磨成细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶中，应用冷冻干燥机冷冻干燥a.预冻阶段先将冷冻干燥箱内温度降至-38℃至-42℃，维持5～8小时；b.升华阶段当冷凝器的温度达到-38℃以下时，对整个系统抽真空，压强设置在15～20帕之间，温度在20-30分钟升至1～3℃，维持16～18小时；c.二次升华阶段将温度升至22～28℃，维持8～12小时，制成玉足海参多糖冻干粉。
2.根据权利要求书1所述玉足海参多糖的制备方法，其特征在于所述预冻阶段先将冷 冻干燥箱内温度降至-40°C，维持7小时；升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整 个系统抽真空，压强设置在18帕，温度在25分钟内升至2°C，维持17小时；二次升华阶段 将温度升至25°C，维持10小时，制成玉足海参多糖冻干粉。
全文摘要
一种玉足海参多糖的制备方法，将海参洗净后用液氮冷冻成块状，将冻块压碎后转移至研钵研磨，边研磨边加液氮，直至磨成细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶中，应用冷冻干燥机冷冻干燥预冻阶段先将冷冻干燥箱内温度降至-38℃至-42℃，维持5～8小时；升华阶段当冷凝器的温度达到-38℃以下时，对整个系统抽真空，压强设置在15～20帕之间，温度在20-30分钟升至1～3℃，维持16～18小时；二次升华阶段将温度升至22～28℃，维持8～12小时，制成玉足海参多糖冻干粉。将海参用普通烘箱80℃烘干后打粉，测定其中海参粘多糖的含量为2.5％，而采用液氮冷冻，并冻干后的海参粘多糖的含量为4.8％。
文档编号A61P35/00GK101863997SQ20101018049
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者张伟伟, 徐波, 王爱云, 郑仕中, 陆茵, 陈磊, 雷娜 申请人:南京中医药大学
技术领域：
本发明属于中药制备技术领域，具体涉及玉足海参多糖的制备方法。
背景技术：
癌症目前已成为人类面临的一大杀手，死亡率仅次于心血管疾病，而且呈逐年上 升的趋势。目前的化学合成药物虽然抗肿瘤作用确切，疗效显著，但有不良反应大、长期应 用易产生耐药性等缺点，所以，人们迫切希望找到疗效好且不良反应低的药物，我国的传统 中药在这方面显示出了优势。近年来，广大学者对中药进行了广泛的研究。
侵袭和转移是肿瘤最基本的生物学特征，也是恶性肿瘤的致死主因。据统计，临床 诊断出原发肿瘤时，约50%的患者已产生远处的转移，而目前的手术、放化疗等方法对已多 灶性分布的恶性瘤的治疗效果也不显著，因此，寻找有效的抗肿瘤转移药物对于防治肿瘤， 降低癌症病死率具有重要意义。王光凤等采用多种肿瘤模型，研究橘皮中提取的黄酮化合 物川陈皮素的抗肿瘤作用。结果显示，川陈皮素8 32mg/kg小鼠黑色素瘤B16的抑瘤率 为42. 24% 65. 95%，对小鼠Lewis肺癌的抑瘤率为38. 84% 59. 09% ；对小鼠S180肉 瘤的抑瘤率为36. 02% 45. 98%。川陈皮素与小剂量的紫杉醇、丝裂霉素、52氟尿嘧啶、 顺钼和阿霉素联用时，表现明显的协同效应。川陈皮素对小鼠Lewis肺癌腋皮下接种肺转 移的抑制率为33. 63% 38. 94% ；对小鼠Colon26结肠癌腹腔接种腹膜转移的抑制率为 37. 74% 43. 40%。(王光凤，王小晨，肖磷，等.柑橘黄酮川陈皮素的抗肿瘤作用研究，中 草药，2007,38(11) 1694-1697)蛇床子水提物、总香豆素及蛇床子素等单体成分抗肿瘤及 相关研究表明，蛇床子不仅本身抗肿瘤效价明显，对肿瘤引起的免疫功能低下、炎症反应及 癌性疼痛具有一定的治疗价值，在肿瘤的预防及治疗中配合放化疗，对于克服肿瘤的多药 耐药以及减毒增效作用都有积极的意义。蛇床子不仅有明显的抗诱变活性，其本身也没有 致突变性和致瘤性，并且可以诱导肿瘤细胞向正常细胞转化。(周则卫，刘培勋.蛇床子化 学成分及抗肿瘤活性的研究进展，中国中药杂志，2005,30(17) 1309-1312)但以上研究都 只能对某种肿瘤细胞发挥作用，研究还不够深入。
发明内容
发明目的本发明的目的在于提供玉足海参多糖的制备方法。技术方案一、玉足海参多糖的制备将海参洗净，放入研钵，加入液氮(15mL/g)，迅速冷冻，将冻块压碎，转移至研钵研 磨，边研磨边加液氮，直至成细末(150目)；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶中，应 用冷冻干燥机冷冻干燥，冷冻干燥分为预冻、升华和二次升华三个阶段，预冻阶段将箱内 温度降至_38°C至_42°C，维持6小时；升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整 个系统抽真空，压强设置在15-20帕之间，温度在20-30分钟升至1_3°C，维持16-18小时； 二次升华阶段将温度升至22-28°C，维持8-12小时，制成玉足海参多糖冻干粉，制成玉足海参多糖冻干粉。优选方法为上述玉足海参多糖的制备方法，预冻阶段先将冷冻干燥箱内温度降 至-40°C，维持7小时；升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整个系统抽真空，压 强设置在18帕，温度在25分钟时升至2V，维持17小时；二次升华阶段将温度升至25°C， 维持10小时，制成玉足海参多糖冻干粉。
二、玉足海参粘多糖(HS)对自发性B16F10黑色素瘤转移模型的影响1.实验材料1.1实验动物与细胞清洁级C57BL/6小鼠(雌性，6_8周龄，16_20g)，上海斯莱克实验动物有限责任公 司，许可证号SCXK (沪)2007-0005 ；B16F10黑色素瘤细胞株，南京大学徐强教授惠赠。1.2实验药物HS，常州海洋生物工程有限公司，批号060201。1.3实验试剂DMEM(美国GIBCO公司批号1340114)，PBS (实验室自制)，小牛血清(天津 市洋生物制品科技有限公司批号:QWTC0701), Trypsin(AMRESC0公司批号=2009/08) EDTA(AMRESC0公司批号0105)，甲醛(上海久亿化学试剂有限公司批号20070610)，生理 盐水(上海华源长富药业有限公司批号070405045)，NaHC03(南京化学试剂有限公司批 号050480039)，液体石蜡(上海久亿化学试剂有限公司批号20040701)。1.4实验器材莱卡倒置荧光显微镜(德国莱卡公司型号DM1L)，精密移液器(法国吉尔森公 司型号P2)，全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号MLS-3020)，超净工作台(苏净集 团安泰公司制造型号SW-CJ-ZFD)，超低温冰箱(美国纽艾尔公司型号Nu-6511)，C02培 养箱(FORMA型号3111)，纯水仪(美国Spring公司型号S/N 020579)，电子天平(德 国赛多利斯有限公司型号BT323S)，台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号 DHG9123A)，冰箱(西门子公司型号KG18V21TI)，液氮罐(CBS型号:2001)，离心机(上海安 亭科学仪器厂型号KA-1000)，PH计(HANNA公司型号HI_221)，注射器。2.实验方法2. 1体内剂量的选择实验室前期实验已经阐明HS具有抗凝活性，前期实验观察HS对健康小鼠凝血时 间的影响，选取健康的ICR小鼠58只，随机分成6组，HS组尾静脉注射(41. 6mg/kg、10. 4mg/ kg、5. 2mg/kg、2. 6mg/kg和1. 3mg/kg)，对照组尾静脉注射等体积的生理盐水，采用玻片法 和毛细血管法两种方法测定凝血时间，进行比较发现HS以41. 6mg/kg剂量尾静脉注射，5只 受试小鼠测得凝血时间均大于lOmin，除了 1.3mg/kg剂量组以外，其余各组与对照组相比 均有显著性差异(P <0.01),结果如下表1-1 =HS对健康ICR小鼠凝血时间的影响(χ ± SD )Table 1-1 :The effect of HS on clotting time of health ICR mice ( 士 SD) 注与对照组相比，*P< 0.01。从结果可以看出，HS在剂量为2. 6mg/kg时已经影响了凝血时间，改变了小鼠血 液流变学的某些过程，而HS的抗凝活性是我们选择其作为研究其对肿瘤转移影响的基础， 所以基于体内抗凝剂量我们来确定本研究课题的体内给药剂量。由于荷瘤鼠状态较差，而 且对于肿瘤模型的研究一般使用的是C57BL/6小鼠，此小鼠通体全黑，尾巴很细，尾静脉不 容易找到且要持续给药很长时间，所以我们采用腹腔注射给药方式，将体内最小剂量定为 5. 2mg/kg，最大剂量定为最小剂量的五倍，为26mg/kg，中剂量取两者中间值定为11. 6mg/
kg ο2.2制备B16F10细胞悬液常规培养B16F10肿瘤细胞，实验前4-5天，按1 10细胞传代于细胞培养瓶中， 以免细胞生长过度而出现不完全融合。每个培养瓶大约含6-8 X 106细胞，取对数生长期的 细胞，弃去培养液，用PBS洗净，加入ImL 0. 25%胰酶+0. 02% EDTA消化液，放入细胞培养 箱中，l-3min后，轻敲培养瓶使细胞脱落。加IOmL DMEM，用移液管吹打细胞，获得单细胞悬 液，转入50mL聚丙烯离心管。离心细胞(1200rpmX10min)，然后用PBS洗两遍。用苔盼蓝 计数细胞，调整细胞浓度为lX107/mL。2. 3复制B16F10自发性肿瘤转移模型每只C57BL/6小鼠左后肢足垫皮下注射含5 X 105个B16F10细胞的悬液0. 05mL, 这些小鼠每五天称一次体重。于接种后第八天按照左足垫上原发瘤的大小将小鼠随机分 为四组模型组对照组(生理盐水组)、HS低剂量组(5. 2mg/kg小鼠体重)、HS中剂量组 (11.6mg/kg小鼠体重)、HS高剂量组(26mg/kg小鼠体重)，每组动物数为10只。从接种的 第九天开始各组腹腔注射给予相应剂量的药物，模型组给予相应的生理盐水，每日一次，直 至处死动物，采集标本。在接种后第23天，麻醉小鼠，截除荷瘤下肢，10% PBS-福尔马林固 定原发瘤组织，称取原发肿瘤重量以及用直尺测量原发瘤的长轴(Li)和纵轴(L2)，按照以 下公式计算原发瘤的体积0. 5236XL1X (L2)2，最后用石蜡包埋用于免疫组化实验观察原 发位的血管生成以及各因子表达的情况。切除原发灶后22天处死小鼠，取出肺，避免镊子 触及脏器表面损伤组织，用PBS洗净组织。10% PBS-福尔马林固定肺组织，称取肺重，拍照 并且在解剖显微镜下计算肺肿瘤结节数。3.实验结果3. IHS对B16F10黑色素瘤自发性转移模型肺转移的影响实验结果采用Excel统计软件学生t检验进行检验，由实验数据可以看出，HS各 剂量组与对照组相比对黑色素瘤自发性转移模型的肺转移结节数均有抑制作用，且呈现剂 量相关性=HS 5. 2mg/kg 剂量组(P < 0. 05)、HS 11. 6mg/kg 剂量组(P < 0. 01)、HS 26mg/ kg剂量组(P < 0. 01)。对于肺重的影响，HS 26mg/kg剂量组的肺重明显低于对照组的肺重(P <0.01)，其他两组无明显作用。3. 2HS对B16F10黑色素瘤原发位肿瘤体积和重量的影响从表1-2可以看出，与生理盐水组相比，HS对于接种B16F10黑色素瘤细胞后的小 鼠足垫部的原发位肿瘤无论是体积以及重量都没有明显的影响作用。从表1-2的小鼠给药 前后的体重记录可以得出，与对照组相比，HS给药组的小鼠体重并未明显低。表1-2 =HS对B16F10原发位肿瘤生长以及小鼠体重的影响(又士S. D.) 4.结论HS能够抑制B16F10黑色素瘤肺转移，而且也抑制转移灶的生长，但是对原发肿瘤 细胞增殖没有影响，从小鼠体重变化可以看出，HS的毒副作用很小，为今后体内安全用药提 供基础。三、HS对细胞增殖作用的影响1.实验材料1. 1实验用细胞株B16F10黑色素瘤细胞株由南京大学徐强教授惠赠，常规培养在含有10%小牛血 清和2mg/mL NaHC03的DMEM培养液中；原代的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由本实验室从人 的脐静脉中分离得到，方法是通过在37°C下用0. 25%胰酶对人脐静脉消化8-10分钟，将含 有内皮细胞的胰蛋白酶液1200rpm离心10分钟后，弃上清，加入培养液，吹打混勻制成细胞 悬液后种于培养瓶中。本课题使用的HUVEC均为2-7代，所用的培养液是含有LSGS的M199 培养液。1. 2实验药物HS，常州海洋生物工程有限公司，批号060201。1. 3实验试剂DMEM(美国GIBCO公司批号1340114)，DPBS(实验室自制)，小牛血清(天津 市灏洋生物制品科技有限公司批号QWTC0701)，Trypsin(AMRESCC)公司批号2009/08)， EDTA (AMRESC0 公司批号0105)，LSGS (Cascade biologies 公司批号#070418_901)， M199(美国Sigma公司批号:083K83581)，胎牛血清(美国GIBCO公司)，MTS (Promega公司 批号G111A 22258402)，PMS (AMRESC0公司批号0361)，NaHC03 (南京化学试剂有限公司批号050480039)。1. 4实验器材可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号SPECTRA MAX 190)，莱卡倒置 荧光显微镜(德国莱卡公司型号DM1L)，精密移液器(法国吉尔森公司型号P2)，全自动 高压灭菌锅(日本SANYO公司型号MLS-3020)，超净工作台(苏净集团安泰公司制造型 号SW-CJ-ZFD)，超低温冰箱(美国纽艾尔公司型号Nu-6511)，CO2培养箱(FORMA型号 3111)，纯水仪(美国Spring公司型号S/N 020579)，电子天平(德国赛多利斯有限公司 型号BT323S)，台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号DHG9123A)，冰箱(西 门子公司型号KG18V21TI)，液氮 罐(CBS型号2001)，离心机(上海安亭科学仪器厂型号 KA-1000)，pH 计(HANNA 公司型号HI_221)，96 孔细胞培养板(Corningcostar 公司)，Tip 头若干。2.实验方法MTS法测定HS对常规培养的B16F10细胞和HUVEC增殖的影响，具体方法如下在 完全培养液中收集处于对数期生长的HUVEC细胞和B16F10细胞，调整细胞悬液浓度，分于 96孔板，每孔200 μ L，5000个细胞/孔，置37°C、5% CO2培养箱孵育24小时使细胞贴壁。对 于B16F10细胞，细胞贴壁后弃上清，更换新鲜的培养液，180 μ L/孔并加入20 μ 1溶于DMEM 的各浓度HS药液，HS的终浓度分别为0. 001 μ Μ，0. 01 μ Μ，0. 1 μ Μ，1 μ Μ，10 μ M禾口 100 μ Μ, 空白对照仅加入20 μ L DMEM，每组4个复孔，置摇床上低速振荡混勻，继续培养24小时； 对于HUVEC细胞，贴壁后弃上清，先用M199培养液漂洗细胞后加入含有1 %胎牛血清的 M199 (180 μ L/孔)，继续培养6小时后加入相应的剂量的HS，使其终浓度分别为0. 08 μ Μ, 0. 4 μ Μ，2 μ Μ，10 μ M和50 μ Μ，每组5个复孔，再继续培养30小时。在与相应药物共同孵育 相应时间之后，加入40 μ L/孔MTS/PMS溶液，MTS的终浓度为333 μ g/mL, PMS的终浓度为 25 μ Μ,继续培养4小时，然后置摇床上低速振荡lOmin，测量各孔在490nm处的吸光值。3.实验结果实验结果采用Excel统计软件学生t检验进行检验，实验重复三次，结果为三次独 立实验的平均值，本实验结果中将空白对照组所得出的吸光度均值归一化设定为100%，HS 各剂量组的值就表达为％空白对照。3. IHS对B16F10黑色素瘤细胞增殖的影响100倍显微镜下观察细胞形态，与对照组相比，HS各剂量组对于B16F10细胞形态 均无明显影响，但HSl μ MUO μ M和100 μ M剂量组的细胞密度明显要比对照组的稀疏一些， 490nm处吸光度实验数据显示，HS 1 μ M和10 μ M能抑制B16F10细胞增殖(P < 0. 05)，而 100 μ M HS 能明显抑制 B16F10 生长(P < 0. 01)。3. 2HS对HUVEC细胞增殖的影响从测得的吸光度以及100倍显微镜下观察发现HS在浓度高达50 μ M时会对HUVEC 细胞的正常生长有明显的抑制作用(P < 0.01)，其他各剂量组无论从形态上还是实际测得 的吸光度对HUVEC细胞的正常生长均无显著的影响。4.结论从实验的结果不难看出，共同孵育30小时之后，HS在低于50 μ M对HUVEC细胞的 正常生长并未产生任何的抑制作用，提示在本课题之后使用HUVEC细胞来研究HS抗血管生成作用时HS的剂量不应超过50 μ M且HS的作用时间应在30小时之内，而对于B16F10细胞 所使用的剂量应低于1 μ Μ,且作用时间不超过24小时，为后面体外实验剂量的确定提供依 据。从这个实验可以看出，剂量大于ΙμΜ就能够抑制B16F10生长，但对于正常细胞HUVEC 细胞的生长，HS剂量高达50 μ M才会产生抑制作用，说明HS对肿瘤细胞的杀伤力要明显强 于正常细胞。四、HS对B16F10黑色素瘤细胞实验性肺转移影响1.实验材料 1. 1实验动物与细胞清洁级C57BL/6小鼠(雌性，6_8周龄，16_20g)，上海斯莱克实验动物有限责任公 司，许可证号SCXK (沪)2007-0005 ；B16F10黑色素瘤细胞株，南京大学徐强教授惠赠。1. 2实验药物HS，常州海洋生物工程有限公司，批号060201。1. 3实验试剂DMEM(美国GiBCO公司批号1340114)，PBS(实验室自制)，小牛血清(天津市 灏洋生物制品科技有限公司批号:QWTC0701), Trypsin (AMRESC0公司批号2009/08), EDTA(AMRESC0公司批号0105)，甲醛(上海久亿化学试剂有限公司批号20070610)，生理 盐水(上海华源长富药业有限公司批号070405045)，NaHCO3(南京化学试剂有限公司批 号050480039)。1. 4实验器材莱卡倒置荧光显微镜(德国莱卡公司型号DM1L)，精密移液器(法国吉尔森公 司型号P2)，全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号MLS-3020)，超净工作台(苏净集 团安泰公司制造型号SW-CJ-ZFD)，超低温冰箱(美国纽艾尔公司型号Nu-6511)，CO2培 养箱(FORMA型号3111)，纯水仪(美国Spring公司型号S/N 020579)，电子天平(德 国赛多利斯有限公司型号BT323S)，台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号 DHG9123A)，冰箱(西门子公司型号KG18V21TI)，液氮罐(CBS型号:2001)，离心机(上海安 亭科学仪器厂型号KA-1000)，PH计(HANNA公司型号HI_221)，注射器。2.实验方法2.1制备细胞悬液常规培养B16F10肿瘤细胞，实验前4-5天，按1 10，细胞传代于细胞培养瓶中， 以免细胞生长过度而出现不完全汇合。每个培养瓶大约含6-8 X 106细胞，取对数生长期的 细胞，弃去培养液，用PBS洗净，加入ImL 0. 25%胰酶-0. 02% EDTA消化液，放入细胞培养 箱当中，l-3min后，轻敲培养瓶使细胞脱落。加IOmL DMEM，用移液管吹打细胞，获得单细胞 悬液，转入50mL聚丙烯离心管。离心细胞(1200rpmX10min)，然后用PBS洗两遍。用苔盼 蓝计数细胞，调整细胞浓度为2. 5 X 106个/mL。2. 2复制B16F10实验性肿瘤转移模型取C57BL/6小鼠置于小鼠注射固定器，尾静脉注射0. 2mL细胞悬液(含5X 105肿 瘤细胞)。接种过肿瘤细胞的小鼠随机分为4组模型组对照组(生理盐水)，HS低剂量 组(5. 2mg/kg)，HS中剂量组(11. 6mg/kg)，HS高剂量组(26mg/kg)，腹腔注射给药，每日一 次。给药23天，处死小鼠，取肺脏。避免镊子触及脏器表面，防止损伤组织，用PBS洗净组织。10% PBS-福尔马林固定肺组织，称取肺重，拍照，评价HS对B16F10肿瘤血行肺转移的影响。3.实验结果实验结果采用Excel统计软件学生t检验，从各组取出的肺组织可以看出，模型组的肺组织转移肿瘤结节数目显著多于给药组，由于肺结节太多，无法计数统计，对肺重的统 计分析表明，HS高剂量组(26mg/kg)和中剂量组(11.6mg/kg)均能抑制小鼠肺组织重量，P 值分别为P < 0. 01和P < 0. 05。HS给药前后小鼠体重差异不大，且与对照组相比，小鼠体 重未发现有大幅度减少，各组的死亡率显示，HS药物对于小鼠的体内毒性较小。4.结论HS给药组小鼠的死亡率与对照组相当，而且体重与给药前也没有明显的减少，说 明HS的毒副作用很小，HS可以很好的抑制实验性B16F10黑色素瘤肺转移，HS对于B16F10 细胞直接入血之后的血行过程，黏附过程以及穿出血管过程有一定的抑制作用。有益效果玉足海参粘多糖是从广东省、海南岛一带的民间海洋生物玉足海参Hojothuria leucospilota中提取出的一种酸性粘多糖，性微寒，味甘、成。归肺、肾、大肠经。具有补肾 益精；养血润燥；止血的功效，主治精血亏损；虚弱劳怯；阳痿；梦遗；肠燥便秘；肺虚咳嗽 咯血，肠风便血，外伤出血。现代药理学研究，玉足海参粘多糖具有抑制肿瘤转移作用。将海参用普通烘箱80°C烘干后打粉，测定其中海参粘多糖的含量为2.5%，而采 用液氮冷冻，并冻干后的海参粘多糖的含量为4. 8%。
具体实施例方式结合具体实施方式
，对本发明进一步说明如下海参为海洋生物玉足海参 Ho jothurialeucospilota。实施例1取海参5g，洗净，放入研钵，加入液氮75mL，迅速冷冻，将冻块压碎，转移至研钵研 磨，边研磨边加液氮，直至成150目细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶中，应用 冷冻干燥机冷冻干燥，冷冻干燥分为预冻、升华和二次升华三个阶段，预冻阶段将箱内温 度降至_38°C，维持6小时；升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整个系统抽真 空，压强设置在15-20帕之间，温度在20-30分钟升至;TC，维持16-18小时；二次升华阶段 将温度升至22°C，维持8-12小时，制成玉足海参多糖冻干粉，制成玉足海参多糖冻干粉。实施例2取海参5g，洗净，放入研钵，加入液氮75mL，迅速冷冻，将冻块压碎，转移至研钵研 磨，边研磨边加液氮，直至成150目细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶中，应用 冷冻干燥机冷冻干燥，冷冻干燥分为预冻、升华和二次升华三个阶段，预冻阶段先将冷冻干 燥箱内温度降至-40°C，维持7小时；升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整个系 统抽真空，压强设置在18帕，温度在25分钟时升至2°C，维持17小时；二次升华阶段将温 度升至25°C，维持10小时，制成玉足海参多糖冻干粉。实施例3一种玉足海参多糖的制备方法，将海参洗净后用液氮冷冻成块状，将冻块压碎后转移至研钵研磨，边研磨边加液氮，直至磨成细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶 中，应用冷冻干燥机冷冻干燥预冻阶段先将冷冻干燥箱内温度降至_38°C，维持8小时； 升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整个系统抽真空，压强设置在15帕，温度 在20分钟升至1°C，维持18小时；二次升华阶段将温度升至22°C，维持12小时，制成玉足 海参多糖冻干粉。实施例4
一种玉足海参多糖的制备方法，将海参洗净后用液氮冷冻成块状，将冻块压碎后 转移至研钵研磨，边研磨边加液氮，直至磨成细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶 中，应用冷冻干燥机冷冻干燥预冻阶段先将冷冻干燥箱内温度降至_42°C，维持5小时； 升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整个系统抽真空，压强设置在20帕，温度 在20分钟升至3°C，维持16小时；二次升华阶段将温度升至28°C，维持8小时，制成玉足 海参多糖冻干粉。
权利要求
一种玉足海参多糖的制备方法，其特征在于将海参洗净后用液氮冷冻成块状，将冻块压碎后转移至研钵研磨，边研磨边加液氮，直至磨成细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶中，应用冷冻干燥机冷冻干燥a.预冻阶段先将冷冻干燥箱内温度降至-38℃至-42℃，维持5～8小时；b.升华阶段当冷凝器的温度达到-38℃以下时，对整个系统抽真空，压强设置在15～20帕之间，温度在20-30分钟升至1～3℃，维持16～18小时；c.二次升华阶段将温度升至22～28℃，维持8～12小时，制成玉足海参多糖冻干粉。
2.根据权利要求书1所述玉足海参多糖的制备方法，其特征在于所述预冻阶段先将冷 冻干燥箱内温度降至-40°C，维持7小时；升华阶段当冷凝器的温度达到_38°C以下时，对整 个系统抽真空，压强设置在18帕，温度在25分钟内升至2°C，维持17小时；二次升华阶段 将温度升至25°C，维持10小时，制成玉足海参多糖冻干粉。
全文摘要
一种玉足海参多糖的制备方法，将海参洗净后用液氮冷冻成块状，将冻块压碎后转移至研钵研磨，边研磨边加液氮，直至磨成细末；将研磨好的玉足海参细末转移至冻干瓶中，应用冷冻干燥机冷冻干燥预冻阶段先将冷冻干燥箱内温度降至-38℃至-42℃，维持5～8小时；升华阶段当冷凝器的温度达到-38℃以下时，对整个系统抽真空，压强设置在15～20帕之间，温度在20-30分钟升至1～3℃，维持16～18小时；二次升华阶段将温度升至22～28℃，维持8～12小时，制成玉足海参多糖冻干粉。将海参用普通烘箱80℃烘干后打粉，测定其中海参粘多糖的含量为2.5％，而采用液氮冷冻，并冻干后的海参粘多糖的含量为4.8％。
文档编号A61P35/00GK101863997SQ20101018049
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者张伟伟, 徐波, 王爱云, 郑仕中, 陆茵, 陈磊, 雷娜 申请人:南京中医药大学
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