一种具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位及其制备方法与应用的制作方法
专利名称：一种具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药复方有效部位，具体涉及一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位及其制备方法和其在制备治疗妇科疾病药物中的应用。
背景技术：
妇科疾病是妇女的常见病、多发病，其中多与炎症及内分泌紊乱密切相关。妇科炎症中慢性盆腔炎、慢性宫颈炎、阴道炎等发病率较高；妇科内分泌紊乱所通常以月经的紊乱为主要表现，月经正常与否决定于性甾体激素水平的高低，在性激素有序的波动变化下形成了规律月经。
流行病学研究表明痛经是目前妇科月经病中最常见疾病，分为原发性痛经和继发性痛经。主要表现为经期或行经前后出现下腹部、腰部疼痛，有时伴有头晕或恶心呕吐，严重者可出现面色苍白、出冷汗、手足厥冷、剧痛昏倒现象。目前，痛经的治疗仍采用甾体激素及前列腺素拮抗剂，前者多不易被患者接受，后者因只能暂时缓解疼痛而不能彻底治愈，且有一定副作用，故不宜长期服用，不能视为理想的药物及治疗方法。而中药市场上治疗痛经的药物如月月舒、痛经灵、益母草冲剂等，具有良好疗效，且毒副作用甚小，受到广大患者的欢迎。
子宫内膜异位症的发生率近年呈现出上升趋势，其并发症表现多样性，临床上主要表现为进行性加重的痛经、不孕、盆腔结节与包块，临床药物治疗中常用孕激素、丹那唑、内美通、促性腺激素释放激动剂和米非司酮等药物，但这些药物临床效果并不理想，特别是现用的药物是强力的生育抑制剂，具有明显的副作用。手术治疗有保守性手术和根治性手术。可见对于子宫内膜异位症患者根治性手术是不合适的，而保守性手术长常配合药物治疗。
慢性盆腔炎常为急性盆腔炎未能彻底治愈或疾病迁延、患者体质较弱所致。该病是妇女的常见病、多发病，在发展中国家，育龄期妇女盆腔炎的发病率高达40％，具有病程长、病情顽固、复发率高等特点。针对盆腔炎患者的治疗主要是抗生素治疗。在我国还有传统的中医疗法和中西医结合疗法等辅助治疗，疗效肯定。治疗盆腔炎的常用抗生素有青霉素类、头孢菌素类、林可霉素类、喹诺酮类、大环内酯类等；中医治疗盆腔炎的主要原则是活血祛瘀、清热解毒。
西药治疗该类疾病的措施有效迅速，但停药后易复发，且药物多有副作用。如黄体酮、醋酸甲羟基孕酮、对乙酰氨基酚等，这些药物均为针对妇科疾病的症状进行治疗，且黄体酮和醋酸甲羟基孕酮可有头晕、头痛、恶心、乳房胀痛等副作用，长期应用可引起子宫内膜萎缩，月经量减少，易发生阴道霉菌感染。
而中药在治疗妇科疾病中发挥着一定的特色和优势，具有调节机体整体功能、调节内分泌系统紊乱、作用缓和、副作用小等一系列优点。现有针对妇科疾病专利仅对复方药物组方配伍进行保护(如CN 136871A一种中药复方；CN1895458A一种治疗妇科疾病的重要复方提取物及其制备方法)；而有关中药复方的专利未对其有效成分进行研究(如CN1651033A一种治疗妇科疾病的中药复方及其制备方法；CN1470273A治疗妇科疾病的药物及其应用制剂；CN1530126A一种药物组合物、其制备方法及其在制备治疗妇科疾病药物中的应用)；中医药治疗妇科疾病有悠久的历史，其治则为发时攻邪治标，未发之时扶正治本，从目前临床妇科疾病治疗来看，以辨证辨病结合，中医药愈加显现其独特的治疗优势，但目前治疗妇科疾病的复方药物多存在使用不便、用药量大、成分复杂、有效部位不明确，复方中起疗效的物质基础不清楚，并存在一定的不良反应等问题，因此很有必要在中医药理论的指导下开发出一种有效物质明确、疗效确切，副作用小、服用方便的治疗妇科疾病的药物。
发明内容
发明目的本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种组方配比科学合理、有效成分明确、疗效好、副作用小、服用方便的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位，本发明另一个目的是提供该具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法和其在制备治疗妇科疾病药物中的应用。
技术方案为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位，它由下列重量份数的原料制成 当归10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黄10-50份、五灵脂8-35份、没药3-20份、延胡索3-20份。
作为优选方案，本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位由下列重量份数的原料制成 当归30-50份、川芎5-15份、赤芍15-30份、蒲黄30-50份、五灵脂15-30份、没药5-15份、延胡索5-15份。
作为更优选方案，本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位由下列重量份数的原料制成 当归35-45份、川芎10-15份、赤芍15-25份、蒲黄30-45份、五灵脂15-25份、没药10-15份、延胡索10-15份。
本发明在对古今治疗妇科疾病方剂进行筛选，在中医药理论的指导下，辨证施治，结合妇科疾病的发病机理和发病症状进行配比组方，确定以当归、川芎、赤芍，配伍活血祛瘀止痛药蒲黄、没药、延胡索和五灵脂组成七味中药进行组方，整方具有活血化瘀止痛、养血补血，调节内分泌的双重功效，主用于妇科血虚血瘀、内分泌混乱导致的痛经、子宫内膜异位症或慢性盆腔炎等病症；方中当归补血活血，调经止痛；赤芍凉血活血，具有行血，破瘀，散血块，缓急止痛功效；川芎活血祛瘀，行气止痛，三药相配，动静结合，滋而不腻，温而不燥，补而不滞，刚柔相济，阴阳调和，营血得生，共奏补血活血之功，再配伍蒲黄、没药、延胡索和五灵脂，使组方补血而不留瘀，行血而不伤血，增加补气行气止痛、活血化瘀之功，主治经脉气血凝滞，内分泌紊乱导致的妇科疾病。本发明在中医药辨证施治的指导下组方，并根据组方药味的理化性质特点，对整方的提取物通过现代分离纯化手段进行去粗存精，根据现代分析仪器和药理筛选结果表明，所得的有效部位活性成分更明确，活血化瘀、止痛抗炎作用强，不良反应更低。
本发明提供的制备具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，具体包括以下步骤 (1)取由当归10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黄10-50份、五灵脂8-35份、没药3-20份、延胡索3-20份组成的中药复方，加入总药材5～10倍量的水或醇水煎煮，合并煎煮液在20～70℃减压浓缩得浓缩液； (2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到70～90％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上大孔吸附树脂柱，用浓度20％至70％的乙醇梯度洗脱，洗脱液回收溶剂，得中药复方有效部位。
作为优选方案，以上所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，步骤(1)中煎煮溶剂醇水中乙醇浓度为0-80％，煎煮次数为1～3次。
作为优选方案，以上所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，步骤(2)中加入乙醇，使乙醇的浓度达到75～85％，放置沉淀，此操作的目的是加入乙醇使溶液中乙醇的浓度达到75～85％，放置，进行沉淀，可以沉淀去除提取液中大量极性大的大分子化合物，如多糖、鞣质、蛋白质和果胶等，有利于后续的分离纯化工艺，提高纯化效率。
作为优选方案，以上所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，步骤(3)中所述的大孔吸附树脂为D101、D102或AB-8型大孔吸附树脂。本发明通过对不同极性和不同型号树脂进行吸附和纯化能力的筛选，确定型号为D101、D102或AB-8型的大孔吸附树脂吸附和纯化效果做好，同时本发明对5％～95％不同浓度乙醇的洗脱能力进行了优选，以总洗脱物得率和机酸类、黄酮类、内酯类和萜苷类的含量作为指标，确定浓度为20％至70％的乙醇的洗脱物总含量高，机酸类、黄酮类、内酯类和萜苷类有效成分含量高，且杂质少，因此确定浓度20％至70％的乙醇为梯度洗脱溶剂，作为进一步的优选方案，浓度30％至40％的乙醇为最佳梯度洗脱溶剂。
由本发明提供的制备方法提取分离得到的中药复方有效部位，经HPLC/HPLC-MS分析，提取物中的有效成分由黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类等四类化合物所组成，且四类有效成分在提取物中的重量百分比为20～90％。
作为优选方案，提取物中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为1.5％～9.5％的机酸类；1％～30％的黄酮类；1％～40％的内酯类；13％～40％的萜苷类化合物，具体包括下列重量百分比的成分芍药苷3.0％～26％、芍药内酯苷1.2％～4.8％、阿魏酸0.35％～1.56％、咖啡酸0.12％～0.48％、香草酸0.64％～2.56％、原儿茶酸1％-2％、香蒲新苷1％～4％、异鼠李素-3-O-新橙皮苷1.49％～5.96％、槲皮素0.5％-2.1％、洋川芎内酯I 3％-15％和洋川芎内酯H 1％-5％等成分。
本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位在制备治疗妇科疾病药物中的应用。
作为优选方案，所述的妇科疾病为妇女痛经、子宫内膜异位症或慢性盆腔炎疾病； 作为进一步的优选方案，把具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位和药学上可接受的载体制成胶囊剂、颗粒剂、片剂、喷雾剂、注射剂、微囊、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。
本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位在制成片剂时把具有治疗妇科疾病作用的中药复方和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位制成胶囊剂时把具有治疗妇科疾病作用的中药复方和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位制成颗粒剂时，把具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
有益效果本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位和现有技术相比具有以下优点 (1)本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方，根据中医药理论和妇科疾病的发病机制选取原料配伍组方，各组份配比科学合理，并根据组方各药味化学成分的性质特点，对整方进行提取，并对提取物通过现代分离纯化手段进行去粗存精，根据现代分析方法和药理筛选结果表明，所得的有效部位活性成分更明确，具有很好的活血化瘀、止痛、缓和妇科炎症、调节内分泌紊乱的作用，且起效快、标本兼治、不易复发，长期使用无不良反应，且本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方可以方便的和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物，方便临床服用。
(2)本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，经过实验筛选确定最佳提取和分离工艺，可操作性强，提取、分离纯化效率高，且制备方法成本低、环保、可实现工业化大生产。
具体实施例方式 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为 (1)按比例称取处方药材当归10份、川芎3份、赤芍8份、蒲黄10份、五灵脂8份、没药5份、延胡索5份，经粉碎至粒径为40目，混合，用水煎煮提取2次，第一次加总药材10倍量水煎煮1.5h，第二次加总药材8倍量水煎煮1h，合并两次煎出液，浓缩至1g生药/ml，得浓缩液； (2)用浓度为95％乙醇调步骤(1)得到的浓缩液至乙醇浓度为80％，放置12h，过滤沉淀，取上清液，浓缩至5kg，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上D101大孔吸附树脂柱，静置12h后，分别用纯水、浓度为10％～95％的乙醇进行梯度洗脱，收集浓度40％～50％乙醇洗脱部位，浓缩，即得具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位。(批号001) 经过HPLC/HPLC-MS分析，中药复方有效部位中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为9％的机酸类；28％的黄酮类；32％的内酯类；20％的萜苷类化合物。
实施例2 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为 (1)取由当归30份、川芎10份、赤芍15份、蒲黄50份、五灵脂15份、没药10份、延胡索10份组成的中药复方，混合，经粉碎至粒径为40目，用浓度为30％乙醇回流提取3次，第一次加8倍量30％乙醇回流2h，第二次加6倍量30％乙醇回流2h，第三次加6倍量30％乙醇回流1.5h，合并提取液，在50～70℃减压浓缩得浓缩液6kg； (2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到70％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上D102型大孔吸附树脂柱，用浓度10％至95％的乙醇梯度洗脱，收集30％～40％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位。(批号002) 经过HPLC/HPLC-MS分析，中药复方有效部位中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为7.6％的机酸类；26％的黄酮类；31％的内酯类；30％的萜苷类化合物。
取以上制备得到的有效部位10g，加入药用淀粉16g，混合均匀，加水制成软材，过20目筛制粒，干燥，制成颗粒，装入胶囊，每粒0.2g，或者取有效部位10g玉米淀粉20g，加入润滑剂硬脂酸镁5g，混合均匀，然后压片制成片剂。
实施例3 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为 (1)取由当归50份、川芎20份、赤芍25份、蒲黄50份、五灵脂20份、没药10份、延胡索10份组成的中药复方，混合，经粉碎至粒径为40目，用浓度为70％乙醇回流提取2次，第一次加10倍量70％乙醇回流2h，第二次加8倍量70％乙醇回流1.5h，合并提取液，在50～70℃减压浓缩得浓缩液7kg； (2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到90％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上AB-8型大孔吸附树脂柱，静置12h后，分别用纯水、10％～95％的乙醇进行梯度洗脱，收集40％～60％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位。(批号003) 经过HPLC/HPLC-MS分析，中药复方有效部位中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为8％的机酸类；23％的黄酮类；33％的内酯类；35％的萜苷类化合物。
取以上制备得到的有效部位15g，加入药用淀粉30g，混合均匀，加水制成软材，过20目筛制粒，干燥，整粒，制成颗粒剂，或者取有效部位15g玉米淀粉30g，加入润滑剂硬脂酸镁6g，混合均匀，然后压片制成片剂。
实施例4 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为 (1)取由当归30份、川芎5份、赤芍15份、蒲黄30份、五灵脂15份、没药5份、延胡索5份组成的中药复方，混合，经粉碎至粒径为40目，用水回流提取2次，第一次加10倍量水回流3h，第二次加8倍量水回流2h，合并提取液，在50～70℃减压浓缩得浓缩液6kg； (2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到80％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上D101型大孔吸附树脂柱，静置12h后，分别用纯水、10％～95％的乙醇进行梯度洗脱，收集20％～60％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位。(批号004) 经过HPLC/HPLC-MS分析，中药复方有效部位中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为6％的机酸类；20％的黄酮类；21％的内酯类；30％的萜苷类化合物。
实施例5 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为 (1)取由当归40份、川芎10份、赤芍30份、蒲黄30份、五灵脂20份、没药10份、延胡索10份组成的中药复方，混合，经粉碎至粒径为40目，用浓度30％乙醇回流提取2次，第一次加10倍量30％乙醇回流3h，第二次加8倍量30％乙醇回流2h，合并提取液，在50～70℃减压浓缩得浓缩液7.5kg； (2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到90％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上D102型大孔吸附树脂柱，静置12h后，分别用纯水、10％～95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％～70％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位。(批号005) 经过HPLC/HPLC-MS分析，中药复方有效部位中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为7％的机酸类；21％的黄酮类；28％的内酯类；26％的萜苷类化合物。
实施例6镇痛抗炎试验 1、小鼠原发性痛经试验 (1)小鼠原发性痛经模型的制备与实验 选用KM种雌性、体重18-22g的雌性小鼠，随机分组，以雌激素和缩宫素联合复制原发性痛经模型。以0.01mg·g-1·d-1给小鼠连续sc苯甲酸雌二醇8d，使小鼠子宫同步化，第8天，ip缩宫素0.01mL·g-1，制造小鼠原发性痛经动物模型。
检测指标扭体反应。
给药方法将小鼠随机分成模型对照组、阳性药物对照组(西乐葆)、实施例1制备得到的批号001有效部位的大、小剂量组；实施例2制备得到的批号002有效部位的大、小剂量组；实施例3制备得到的批号003有效部位的大、小剂量组。正常对照组、模型对照组给予等容积生理盐水，阳性药物对照组给予西乐葆0.0411mg·g-1·d-1，有效部位给药37.0g生药/kg、18.5g生药/kg为大、小剂量组，各组小鼠每组10只。按上述方法复制原发性痛经模型。从第6天起，每日上午腹腔注射苯甲酸雌二醇，下午正常对照组给予生理盐水0.4mL/只，其余各组灌胃相应药物。连续3d，于末次给药后60min，ip缩宫素0.2mL/只，记录注射后20min内小鼠扭体次数及扭体反应抑制率。
(2)实验结果与分析 由表1实验结果表明，本发明提供的中药复方有效部位在大、小剂量下，均具有显著的抑制小鼠扭体反应的作用(P＜0.05或P＜0.01)；抑制率均在50％以上，结果表明本发明提供的中药复方有效部位具有很好的镇痛作用，强于阳性对照药西乐葆。
表1中药复方有效部位对原发性痛经模型小鼠扭体的抑制作用
与模型组相比较，*P＜0.05；**P＜0.01 2、对小鼠离体子宫收缩的抑制作用 (1)小鼠离体子宫收缩实验 取未孕雌性小鼠，体重18-22g；实验前连续3天腹腔注射苯甲酸雌二醇1mg·kg-1·d-1，以同步化子宫并增加子宫对缩宫素的敏感性。于第4日取出小鼠子宫，置于Locke’s溶液中清洗，用细线分别扎住子宫颈端及两侧卵巢端，一端固定于浴槽底部，另一端连接在张力换能器上。置于20ml Locke’s液恒温浴槽中，温度为(37±0.1)℃，持续供氧，pH 7.3，通过调节螺母加1g的负荷(10mN)，平衡40min，待子宫收缩稳定，自发节律恢复后，开始进行实验。
预先记录5-10min正常收缩曲线，继加入缩宫素注射剂10μl，终浓度为5ul/L，作用15min后再加入各受试药物(实施例1至3制备得到的中药复方有效部位，批号001、002和003)，各样品受试药物加入的初始浓度均为10mg/ml，1L浴槽中受试药物的终浓度为0.01mg/ml，观察药物对缩宫素引起子宫痉挛性收缩的抑制作用，采用T检验方法统计给药前及给药后子宫的收缩频率及收缩幅度，计算抑制子宫收缩的百分率(IR％)。计算公式IR(％)＝(给药前参数-给药后参数)/给药前参数×100。
(2)数据处理与统计 各组数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，组间相关指标采用两两比较t检验，P＜0.05为差异有显著性。
(3)对小鼠离体子宫收缩实验结果，具体实验结果如表2所示 ①对小鼠离体子宫平滑肌收缩频率的影响 由表2中可看出本发明提供的中药复方有效部位对子宫平滑肌收缩频率均具有显著的抑制活性(P＜0.01或P＜0.05)。
②对小鼠离体子宫平滑肌收缩幅度的影响 由表2中可看出本发明提供的中药复方有效部位对小鼠离体子宫平滑肌收缩幅度具有显著的抑制活性(P＜0.01)。
③对小鼠离体子宫平滑肌肌张力的影响 由表2中可看出本发明提供的中药复方有效部位对小鼠离体子宫平滑肌肌张力具有显著的抑制活性(P＜0.05或P＜0.01)。
综合分析离体子宫收缩的3个评价指标表明，本发明提供的中药复方有效部位对抑制子宫收缩呈现显著活性。其ED50为128.0μg/ml，95％可信区间为104.2μg/ml～165.9μg/ml。
表2中药复方有效部位对小鼠离体子宫收缩的影响结果
3、小鼠甲醛致炎试验 (1)甲醛致炎模型的制备 取80只小鼠随机分成8组，每组10只，对照组、模型组、实施例1批号001有效部位大、小剂量组；实施例2批号002有效部位大、小剂量组；实施例3批号003有效部位大、小剂量组。对照组、模型对照组给予等容体生理盐水，复方提取物组剂量分别为37.0g·Kg-1·d-1，为生药量。给药1h后在右后足垫皮下注射2.5％甲醛生理盐水20μL，4h后，将小鼠断头处死，之后自膝关节切足，称重，比较左右足差异，以此代表炎症程度。
(2)抗小鼠足肿胀实验结果与分析，具体实验结果如表3所示 由表3可知，中药复方有效部位的大剂量均具有显著的抑制甲醛所致小鼠足肿胀作用(P＜0.05)，抑制率可达50％以上，效果强于阳性药，表明所发明的中药复方有效部位可显著抑制皮下注射甲醛引起的水肿。
表3中药复方有效部位抗足肿胀实验结果
与模型组相比较，*P＜0.05；**P＜0.01 (3)对甲醛致小鼠足肿胀组织中PGE2含量的影响 将剪下的小鼠右足，剥皮后浸泡于1mL生理盐水中1h，以2000r/min离心10min，吸取上清液0.2mL，加入0.5mol/L NaOH-CH3OH溶液1mL，在50℃水浴中异构化20分钟，加甲醇稀释到10mL，于278nm处测定其吸收值，并按下述公式计算PGE2含量 PGE2含量(μg/g)＝(E278×13.13×Vt×D)/W 计算各组间差异[注Vt＝PGE2浸泡液总体积，D＝稀释倍数，W＝右下肢重量(g)，E278＝278nm处的吸收值]。具体实验结果见表4。
表4中药复方有效部位对甲醛致小鼠足肿胀组织中PGE2含量的影响
与模型组相比较，*P＜0.05；**P＜0.01 由表4可知，所发明的中药复方有效部位对致炎组织中所含PGE2具有非常显著的抑制作用，表明可降低炎症组织中的炎症因子的合成与释放，PGE2含量越低，其抗炎作用越显著。
由以上镇痛抗炎试验结果表明，本发明提供的中药复方有效部位具有很好的镇痛和抗炎效果，且起效迅速，未见不良反应，可用于治疗妇科慢性盆腔炎疾病。
实施例7改善血液流变学及调节内分泌激素试验 1、急性血瘀SD大鼠模型的制备与实验 正常组常规饲养，模型组、治疗组大鼠置于0℃～1℃冰水中5min，每日1次，连续七天。中药复方有效部位治疗组于造模的第1天开始，按大、小剂量中药复方各样品灌胃，每日1次，连用7天，正常组、模型组给予同体积的蒸馏水。于第8天皮下注射0.1％肾上腺素0.1ml/100g，共2次，两次间隔时间4h。之后停食，于次晨采用全自动流变快测仪测定血流变学指标；采用放射免疫的方法测定血清中激素水平。
2、对大鼠急性血瘀模型全血粘度的影响 由表5可见，与模型组相比，本发明提供的中药复方有效部位在高、低剂量均明显降低全血粘度作用(P＜0.01或P＜0.05)。具体实验结果如表5所示。
表5中药复方有效部位对全血黏度的影响
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01 3、对急性血瘀模型大鼠血浆粘度、血沉、红细胞压积的影响 与模型组相比，本发明提供的中药复方有效部位能明显降低血浆黏度、血沉、红细胞压积(P＜0.01或P＜0.05)，但对纤维蛋白原含量未见明显变化(P＞0.05)。高剂量组具有明显改善血沉、红细胞压积的作用(P＜0.05)，具体实验结果如表6所示。
表6中药复方有效部位对大鼠血浆粘度、血沉及红细胞压积的影响
#P＜0.05与对照组相比；*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比 4、对急性血瘀模型大鼠血清中E2和P含量的影响 与模型组相比，本发明提供的中药复方有效部位高、低剂量组均明显或显著降低血清中E2的升高(P＜0.001或P＜0.01)；而对孕酮含量均呈现升高作用(P＜0.05，P＜0.01)，具体实验结果如表7所示。
表7中药复方有效部位对寒凝血瘀型大鼠血清中内分泌激素水平的影响 ##P＜0.01与对照组相比；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与模型组相比 由以上实验结果表明本发明提供的中药复方有效部位具有很好的活血化瘀，改善血液循环，调节内分泌混乱，恢复内分泌正常的作用，从而可以用于治疗血瘀所致的痛经或子宫内膜异位症等妇科疾病。
实施例8调节免疫功能试验 1、对小鼠脾T淋巴细胞转化实验(MTT法) 各组动物连续灌胃30天，颈椎脱臼处死动物，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的平皿中，轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液，200目筛网过滤，用Hank’s液洗涤2次，每次离心10分钟计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3×106个/ml。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液(相当于715μg/ml)，另一孔作对照。置37℃、5％CO2培养箱中培养72小时。培养结束前4小时，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/ml)50μl/孔，继续培养4小时。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。将溶解液移入2ml比色杯中，在570nm波长处测定光密度值(OD)，实验结果表明本发明提供的中药复方有效部位具有很好的促进脾T淋巴细胞增殖的作用，从而可以起到提高免疫力的作用。
2、对小鼠静息脾淋巴细胞的影响实验结果 由表8实验结果可看出，与空白对照组(生理盐水)比较，本发明提供的中药复方有效部位可明显增强小鼠淋巴细胞转化功能(P＜0.01或P＜0.05或P＜0.001)，具有促进静息皮细胞的增殖反应，提高免疫力的作用。
表8中药复方有效部位对小鼠静息脾淋巴细胞的影响
与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001. 3、对ConA诱导的活化脾T淋巴细胞增殖和ConA诱导的IFN-γ试验 实验结果表明本发明提供的中药复方有效部位在200μg/ml时和DMSO对照组相比具有明显抑制ConA诱导的活化T细胞的增殖作用(P＜0.01)，和具有明显抑制ConA诱导的IFN-γ炎性因子的产生(P＜0.01)进一步表明本发明提供的中药复方有效部位具有很好的调节免疫功能的活性。
本发明根据中医药理论辨证施治，根据妇科疾病的发病机理，进行科学组方，并采用优选的提取纯化方法制备得到中药复方有效部位，经实验结果表明本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位具有很好的抗子宫平滑肌痉挛、镇痛、抗炎、调节雌激素、孕激素水平、调节免疫功能等活性，可用于治疗多种妇科疾病，包括原发性痛经、子宫内膜异位症、急慢性盆腔炎等妇科疾病，并且由于去掉了大量非活性物质，有效部位中有效成分更清楚，含量更高，临床上用药更少、更安全，不良反应更低，因此本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有望开发成为新一代防治妇科疾病的药物。
权利要求
1.一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位，其特征在于，它由下列重量份数的原料制成
当归10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黄10-50份、五灵脂8-35份、没药3-20份、延胡索3-20份。
2.根据权利要求1所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位，其特征在于，它由下列重量份数的原料制成
当归30-50份、川芎5-15份、赤芍15-30份、蒲黄30-50份、五灵脂15-30份、没药5-15份、延胡索5-15份。
3.一种制备权利要求1所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其特征在于包括以下步骤
(1)取由当归10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黄10-50份、五灵脂8-35份、没药3-20份、延胡索3-20份组成的中药复方，加入总药材5～10倍量的水或醇水提取，合并提取液在20～70℃减压浓缩得浓缩液；
(2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到70～90％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物；
(3)取步骤(2)得到的浓缩物上大孔吸附树脂柱，用浓度20％至70％的乙醇梯度洗脱，洗脱液回收溶剂，得中药复方有效部位。
4.根据权利要求3所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(1)中提取溶剂醇水中乙醇浓度为0-80％，提取次数为1～3次。
5.根据权利要求3所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的大孔吸附树脂为D101、D102或AB-8型大孔吸附树脂。
6.根据权利要求3所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(3)得到的中药复方有效部位中包含有重量百分比20～90％的有机酸类、黄酮类、内酯类和萜苷类四类化合物。
7.根据权利要求6所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(3)得到的中药复方有效部位中包含有重量百分比1.5％～9.5％的有机酸类；1％～30％的黄酮类；1％～40％的内酯类；13％～40％的萜苷类化合物。
8.权利要求1或2所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位在制备治疗妇科疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位在制备治疗妇科疾病药物中的应用，其特征在于所述的妇科疾病为妇女痛经、子宫内膜异位症或慢性盆腔炎疾病。
10.根据权利要求8所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位在制备治疗妇科疾病药物中的应用，其特征在于把中药复方有效部位和药学上可接受的载体制成胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。
全文摘要
本发明公开了一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位及其制备方法和其应用，该有效部位是由当归、川芎、赤芍、蒲黄、五灵脂、没药、延胡索组成的中药复方的水或乙醇提取液，通过乙醇沉淀去杂，然后上大孔吸附树脂柱，用优化浓度的乙醇梯度洗脱纯化，制备得到。本发明根据中医药理论和妇科疾病发病机制选取原料配伍组方，通过现代分析仪器和药理实验表明，本发明提供的中药复方有效部位具有很好的抗子宫平滑肌痉挛、镇痛、抗炎、调节雌激素、孕激素水平、调节免疫功能等活性，可用于治疗原发性痛经、子宫内膜异位症、急慢性盆腔炎等多种妇科疾病，且成分更清楚，不良反应更低，有望开发成为新一代治疗妇科疾病的药物。
文档编号A61K35/24GK101829247SQ20101017717
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者宿树兰, 段金廒, 钱大玮, 华永庆, 洪敏 , 周卫 申请人:南京中医药大学
技术领域：
本发明涉及一种中药复方有效部位，具体涉及一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位及其制备方法和其在制备治疗妇科疾病药物中的应用。
背景技术：
妇科疾病是妇女的常见病、多发病，其中多与炎症及内分泌紊乱密切相关。妇科炎症中慢性盆腔炎、慢性宫颈炎、阴道炎等发病率较高；妇科内分泌紊乱所通常以月经的紊乱为主要表现，月经正常与否决定于性甾体激素水平的高低，在性激素有序的波动变化下形成了规律月经。
流行病学研究表明痛经是目前妇科月经病中最常见疾病，分为原发性痛经和继发性痛经。主要表现为经期或行经前后出现下腹部、腰部疼痛，有时伴有头晕或恶心呕吐，严重者可出现面色苍白、出冷汗、手足厥冷、剧痛昏倒现象。目前，痛经的治疗仍采用甾体激素及前列腺素拮抗剂，前者多不易被患者接受，后者因只能暂时缓解疼痛而不能彻底治愈，且有一定副作用，故不宜长期服用，不能视为理想的药物及治疗方法。而中药市场上治疗痛经的药物如月月舒、痛经灵、益母草冲剂等，具有良好疗效，且毒副作用甚小，受到广大患者的欢迎。
子宫内膜异位症的发生率近年呈现出上升趋势，其并发症表现多样性，临床上主要表现为进行性加重的痛经、不孕、盆腔结节与包块，临床药物治疗中常用孕激素、丹那唑、内美通、促性腺激素释放激动剂和米非司酮等药物，但这些药物临床效果并不理想，特别是现用的药物是强力的生育抑制剂，具有明显的副作用。手术治疗有保守性手术和根治性手术。可见对于子宫内膜异位症患者根治性手术是不合适的，而保守性手术长常配合药物治疗。
慢性盆腔炎常为急性盆腔炎未能彻底治愈或疾病迁延、患者体质较弱所致。该病是妇女的常见病、多发病，在发展中国家，育龄期妇女盆腔炎的发病率高达40％，具有病程长、病情顽固、复发率高等特点。针对盆腔炎患者的治疗主要是抗生素治疗。在我国还有传统的中医疗法和中西医结合疗法等辅助治疗，疗效肯定。治疗盆腔炎的常用抗生素有青霉素类、头孢菌素类、林可霉素类、喹诺酮类、大环内酯类等；中医治疗盆腔炎的主要原则是活血祛瘀、清热解毒。
西药治疗该类疾病的措施有效迅速，但停药后易复发，且药物多有副作用。如黄体酮、醋酸甲羟基孕酮、对乙酰氨基酚等，这些药物均为针对妇科疾病的症状进行治疗，且黄体酮和醋酸甲羟基孕酮可有头晕、头痛、恶心、乳房胀痛等副作用，长期应用可引起子宫内膜萎缩，月经量减少，易发生阴道霉菌感染。
而中药在治疗妇科疾病中发挥着一定的特色和优势，具有调节机体整体功能、调节内分泌系统紊乱、作用缓和、副作用小等一系列优点。现有针对妇科疾病专利仅对复方药物组方配伍进行保护(如CN 136871A一种中药复方；CN1895458A一种治疗妇科疾病的重要复方提取物及其制备方法)；而有关中药复方的专利未对其有效成分进行研究(如CN1651033A一种治疗妇科疾病的中药复方及其制备方法；CN1470273A治疗妇科疾病的药物及其应用制剂；CN1530126A一种药物组合物、其制备方法及其在制备治疗妇科疾病药物中的应用)；中医药治疗妇科疾病有悠久的历史，其治则为发时攻邪治标，未发之时扶正治本，从目前临床妇科疾病治疗来看，以辨证辨病结合，中医药愈加显现其独特的治疗优势，但目前治疗妇科疾病的复方药物多存在使用不便、用药量大、成分复杂、有效部位不明确，复方中起疗效的物质基础不清楚，并存在一定的不良反应等问题，因此很有必要在中医药理论的指导下开发出一种有效物质明确、疗效确切，副作用小、服用方便的治疗妇科疾病的药物。
发明内容
发明目的本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种组方配比科学合理、有效成分明确、疗效好、副作用小、服用方便的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位，本发明另一个目的是提供该具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法和其在制备治疗妇科疾病药物中的应用。
技术方案为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位，它由下列重量份数的原料制成 当归10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黄10-50份、五灵脂8-35份、没药3-20份、延胡索3-20份。
作为优选方案，本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位由下列重量份数的原料制成 当归30-50份、川芎5-15份、赤芍15-30份、蒲黄30-50份、五灵脂15-30份、没药5-15份、延胡索5-15份。
作为更优选方案，本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位由下列重量份数的原料制成 当归35-45份、川芎10-15份、赤芍15-25份、蒲黄30-45份、五灵脂15-25份、没药10-15份、延胡索10-15份。
本发明在对古今治疗妇科疾病方剂进行筛选，在中医药理论的指导下，辨证施治，结合妇科疾病的发病机理和发病症状进行配比组方，确定以当归、川芎、赤芍，配伍活血祛瘀止痛药蒲黄、没药、延胡索和五灵脂组成七味中药进行组方，整方具有活血化瘀止痛、养血补血，调节内分泌的双重功效，主用于妇科血虚血瘀、内分泌混乱导致的痛经、子宫内膜异位症或慢性盆腔炎等病症；方中当归补血活血，调经止痛；赤芍凉血活血，具有行血，破瘀，散血块，缓急止痛功效；川芎活血祛瘀，行气止痛，三药相配，动静结合，滋而不腻，温而不燥，补而不滞，刚柔相济，阴阳调和，营血得生，共奏补血活血之功，再配伍蒲黄、没药、延胡索和五灵脂，使组方补血而不留瘀，行血而不伤血，增加补气行气止痛、活血化瘀之功，主治经脉气血凝滞，内分泌紊乱导致的妇科疾病。本发明在中医药辨证施治的指导下组方，并根据组方药味的理化性质特点，对整方的提取物通过现代分离纯化手段进行去粗存精，根据现代分析仪器和药理筛选结果表明，所得的有效部位活性成分更明确，活血化瘀、止痛抗炎作用强，不良反应更低。
本发明提供的制备具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，具体包括以下步骤 (1)取由当归10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黄10-50份、五灵脂8-35份、没药3-20份、延胡索3-20份组成的中药复方，加入总药材5～10倍量的水或醇水煎煮，合并煎煮液在20～70℃减压浓缩得浓缩液； (2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到70～90％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上大孔吸附树脂柱，用浓度20％至70％的乙醇梯度洗脱，洗脱液回收溶剂，得中药复方有效部位。
作为优选方案，以上所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，步骤(1)中煎煮溶剂醇水中乙醇浓度为0-80％，煎煮次数为1～3次。
作为优选方案，以上所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，步骤(2)中加入乙醇，使乙醇的浓度达到75～85％，放置沉淀，此操作的目的是加入乙醇使溶液中乙醇的浓度达到75～85％，放置，进行沉淀，可以沉淀去除提取液中大量极性大的大分子化合物，如多糖、鞣质、蛋白质和果胶等，有利于后续的分离纯化工艺，提高纯化效率。
作为优选方案，以上所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，步骤(3)中所述的大孔吸附树脂为D101、D102或AB-8型大孔吸附树脂。本发明通过对不同极性和不同型号树脂进行吸附和纯化能力的筛选，确定型号为D101、D102或AB-8型的大孔吸附树脂吸附和纯化效果做好，同时本发明对5％～95％不同浓度乙醇的洗脱能力进行了优选，以总洗脱物得率和机酸类、黄酮类、内酯类和萜苷类的含量作为指标，确定浓度为20％至70％的乙醇的洗脱物总含量高，机酸类、黄酮类、内酯类和萜苷类有效成分含量高，且杂质少，因此确定浓度20％至70％的乙醇为梯度洗脱溶剂，作为进一步的优选方案，浓度30％至40％的乙醇为最佳梯度洗脱溶剂。
由本发明提供的制备方法提取分离得到的中药复方有效部位，经HPLC/HPLC-MS分析，提取物中的有效成分由黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类等四类化合物所组成，且四类有效成分在提取物中的重量百分比为20～90％。
作为优选方案，提取物中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为1.5％～9.5％的机酸类；1％～30％的黄酮类；1％～40％的内酯类；13％～40％的萜苷类化合物，具体包括下列重量百分比的成分芍药苷3.0％～26％、芍药内酯苷1.2％～4.8％、阿魏酸0.35％～1.56％、咖啡酸0.12％～0.48％、香草酸0.64％～2.56％、原儿茶酸1％-2％、香蒲新苷1％～4％、异鼠李素-3-O-新橙皮苷1.49％～5.96％、槲皮素0.5％-2.1％、洋川芎内酯I 3％-15％和洋川芎内酯H 1％-5％等成分。
本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位在制备治疗妇科疾病药物中的应用。
作为优选方案，所述的妇科疾病为妇女痛经、子宫内膜异位症或慢性盆腔炎疾病； 作为进一步的优选方案，把具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位和药学上可接受的载体制成胶囊剂、颗粒剂、片剂、喷雾剂、注射剂、微囊、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。
本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位在制成片剂时把具有治疗妇科疾病作用的中药复方和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位制成胶囊剂时把具有治疗妇科疾病作用的中药复方和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位制成颗粒剂时，把具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
有益效果本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位和现有技术相比具有以下优点 (1)本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方，根据中医药理论和妇科疾病的发病机制选取原料配伍组方，各组份配比科学合理，并根据组方各药味化学成分的性质特点，对整方进行提取，并对提取物通过现代分离纯化手段进行去粗存精，根据现代分析方法和药理筛选结果表明，所得的有效部位活性成分更明确，具有很好的活血化瘀、止痛、缓和妇科炎症、调节内分泌紊乱的作用，且起效快、标本兼治、不易复发，长期使用无不良反应，且本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方可以方便的和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物，方便临床服用。
(2)本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，经过实验筛选确定最佳提取和分离工艺，可操作性强，提取、分离纯化效率高，且制备方法成本低、环保、可实现工业化大生产。
具体实施例方式 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为 (1)按比例称取处方药材当归10份、川芎3份、赤芍8份、蒲黄10份、五灵脂8份、没药5份、延胡索5份，经粉碎至粒径为40目，混合，用水煎煮提取2次，第一次加总药材10倍量水煎煮1.5h，第二次加总药材8倍量水煎煮1h，合并两次煎出液，浓缩至1g生药/ml，得浓缩液； (2)用浓度为95％乙醇调步骤(1)得到的浓缩液至乙醇浓度为80％，放置12h，过滤沉淀，取上清液，浓缩至5kg，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上D101大孔吸附树脂柱，静置12h后，分别用纯水、浓度为10％～95％的乙醇进行梯度洗脱，收集浓度40％～50％乙醇洗脱部位，浓缩，即得具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位。(批号001) 经过HPLC/HPLC-MS分析，中药复方有效部位中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为9％的机酸类；28％的黄酮类；32％的内酯类；20％的萜苷类化合物。
实施例2 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为 (1)取由当归30份、川芎10份、赤芍15份、蒲黄50份、五灵脂15份、没药10份、延胡索10份组成的中药复方，混合，经粉碎至粒径为40目，用浓度为30％乙醇回流提取3次，第一次加8倍量30％乙醇回流2h，第二次加6倍量30％乙醇回流2h，第三次加6倍量30％乙醇回流1.5h，合并提取液，在50～70℃减压浓缩得浓缩液6kg； (2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到70％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上D102型大孔吸附树脂柱，用浓度10％至95％的乙醇梯度洗脱，收集30％～40％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位。(批号002) 经过HPLC/HPLC-MS分析，中药复方有效部位中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为7.6％的机酸类；26％的黄酮类；31％的内酯类；30％的萜苷类化合物。
取以上制备得到的有效部位10g，加入药用淀粉16g，混合均匀，加水制成软材，过20目筛制粒，干燥，制成颗粒，装入胶囊，每粒0.2g，或者取有效部位10g玉米淀粉20g，加入润滑剂硬脂酸镁5g，混合均匀，然后压片制成片剂。
实施例3 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为 (1)取由当归50份、川芎20份、赤芍25份、蒲黄50份、五灵脂20份、没药10份、延胡索10份组成的中药复方，混合，经粉碎至粒径为40目，用浓度为70％乙醇回流提取2次，第一次加10倍量70％乙醇回流2h，第二次加8倍量70％乙醇回流1.5h，合并提取液，在50～70℃减压浓缩得浓缩液7kg； (2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到90％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上AB-8型大孔吸附树脂柱，静置12h后，分别用纯水、10％～95％的乙醇进行梯度洗脱，收集40％～60％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位。(批号003) 经过HPLC/HPLC-MS分析，中药复方有效部位中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为8％的机酸类；23％的黄酮类；33％的内酯类；35％的萜苷类化合物。
取以上制备得到的有效部位15g，加入药用淀粉30g，混合均匀，加水制成软材，过20目筛制粒，干燥，整粒，制成颗粒剂，或者取有效部位15g玉米淀粉30g，加入润滑剂硬脂酸镁6g，混合均匀，然后压片制成片剂。
实施例4 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为 (1)取由当归30份、川芎5份、赤芍15份、蒲黄30份、五灵脂15份、没药5份、延胡索5份组成的中药复方，混合，经粉碎至粒径为40目，用水回流提取2次，第一次加10倍量水回流3h，第二次加8倍量水回流2h，合并提取液，在50～70℃减压浓缩得浓缩液6kg； (2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到80％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上D101型大孔吸附树脂柱，静置12h后，分别用纯水、10％～95％的乙醇进行梯度洗脱，收集20％～60％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位。(批号004) 经过HPLC/HPLC-MS分析，中药复方有效部位中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为6％的机酸类；20％的黄酮类；21％的内酯类；30％的萜苷类化合物。
实施例5 一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其制备方法为 (1)取由当归40份、川芎10份、赤芍30份、蒲黄30份、五灵脂20份、没药10份、延胡索10份组成的中药复方，混合，经粉碎至粒径为40目，用浓度30％乙醇回流提取2次，第一次加10倍量30％乙醇回流3h，第二次加8倍量30％乙醇回流2h，合并提取液，在50～70℃减压浓缩得浓缩液7.5kg； (2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到90％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物； (3)取步骤(2)得到的浓缩物上D102型大孔吸附树脂柱，静置12h后，分别用纯水、10％～95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％～70％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得具有治疗妇科疾病的中药复方有效部位。(批号005) 经过HPLC/HPLC-MS分析，中药复方有效部位中黄酮类、萜苷类、内酯类、有机酸类四类化合物重量百分组成为7％的机酸类；21％的黄酮类；28％的内酯类；26％的萜苷类化合物。
实施例6镇痛抗炎试验 1、小鼠原发性痛经试验 (1)小鼠原发性痛经模型的制备与实验 选用KM种雌性、体重18-22g的雌性小鼠，随机分组，以雌激素和缩宫素联合复制原发性痛经模型。以0.01mg·g-1·d-1给小鼠连续sc苯甲酸雌二醇8d，使小鼠子宫同步化，第8天，ip缩宫素0.01mL·g-1，制造小鼠原发性痛经动物模型。
检测指标扭体反应。
给药方法将小鼠随机分成模型对照组、阳性药物对照组(西乐葆)、实施例1制备得到的批号001有效部位的大、小剂量组；实施例2制备得到的批号002有效部位的大、小剂量组；实施例3制备得到的批号003有效部位的大、小剂量组。正常对照组、模型对照组给予等容积生理盐水，阳性药物对照组给予西乐葆0.0411mg·g-1·d-1，有效部位给药37.0g生药/kg、18.5g生药/kg为大、小剂量组，各组小鼠每组10只。按上述方法复制原发性痛经模型。从第6天起，每日上午腹腔注射苯甲酸雌二醇，下午正常对照组给予生理盐水0.4mL/只，其余各组灌胃相应药物。连续3d，于末次给药后60min，ip缩宫素0.2mL/只，记录注射后20min内小鼠扭体次数及扭体反应抑制率。
(2)实验结果与分析 由表1实验结果表明，本发明提供的中药复方有效部位在大、小剂量下，均具有显著的抑制小鼠扭体反应的作用(P＜0.05或P＜0.01)；抑制率均在50％以上，结果表明本发明提供的中药复方有效部位具有很好的镇痛作用，强于阳性对照药西乐葆。
表1中药复方有效部位对原发性痛经模型小鼠扭体的抑制作用
与模型组相比较，*P＜0.05；**P＜0.01 2、对小鼠离体子宫收缩的抑制作用 (1)小鼠离体子宫收缩实验 取未孕雌性小鼠，体重18-22g；实验前连续3天腹腔注射苯甲酸雌二醇1mg·kg-1·d-1，以同步化子宫并增加子宫对缩宫素的敏感性。于第4日取出小鼠子宫，置于Locke’s溶液中清洗，用细线分别扎住子宫颈端及两侧卵巢端，一端固定于浴槽底部，另一端连接在张力换能器上。置于20ml Locke’s液恒温浴槽中，温度为(37±0.1)℃，持续供氧，pH 7.3，通过调节螺母加1g的负荷(10mN)，平衡40min，待子宫收缩稳定，自发节律恢复后，开始进行实验。
预先记录5-10min正常收缩曲线，继加入缩宫素注射剂10μl，终浓度为5ul/L，作用15min后再加入各受试药物(实施例1至3制备得到的中药复方有效部位，批号001、002和003)，各样品受试药物加入的初始浓度均为10mg/ml，1L浴槽中受试药物的终浓度为0.01mg/ml，观察药物对缩宫素引起子宫痉挛性收缩的抑制作用，采用T检验方法统计给药前及给药后子宫的收缩频率及收缩幅度，计算抑制子宫收缩的百分率(IR％)。计算公式IR(％)＝(给药前参数-给药后参数)/给药前参数×100。
(2)数据处理与统计 各组数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，组间相关指标采用两两比较t检验，P＜0.05为差异有显著性。
(3)对小鼠离体子宫收缩实验结果，具体实验结果如表2所示 ①对小鼠离体子宫平滑肌收缩频率的影响 由表2中可看出本发明提供的中药复方有效部位对子宫平滑肌收缩频率均具有显著的抑制活性(P＜0.01或P＜0.05)。
②对小鼠离体子宫平滑肌收缩幅度的影响 由表2中可看出本发明提供的中药复方有效部位对小鼠离体子宫平滑肌收缩幅度具有显著的抑制活性(P＜0.01)。
③对小鼠离体子宫平滑肌肌张力的影响 由表2中可看出本发明提供的中药复方有效部位对小鼠离体子宫平滑肌肌张力具有显著的抑制活性(P＜0.05或P＜0.01)。
综合分析离体子宫收缩的3个评价指标表明，本发明提供的中药复方有效部位对抑制子宫收缩呈现显著活性。其ED50为128.0μg/ml，95％可信区间为104.2μg/ml～165.9μg/ml。
表2中药复方有效部位对小鼠离体子宫收缩的影响结果
3、小鼠甲醛致炎试验 (1)甲醛致炎模型的制备 取80只小鼠随机分成8组，每组10只，对照组、模型组、实施例1批号001有效部位大、小剂量组；实施例2批号002有效部位大、小剂量组；实施例3批号003有效部位大、小剂量组。对照组、模型对照组给予等容体生理盐水，复方提取物组剂量分别为37.0g·Kg-1·d-1，为生药量。给药1h后在右后足垫皮下注射2.5％甲醛生理盐水20μL，4h后，将小鼠断头处死，之后自膝关节切足，称重，比较左右足差异，以此代表炎症程度。
(2)抗小鼠足肿胀实验结果与分析，具体实验结果如表3所示 由表3可知，中药复方有效部位的大剂量均具有显著的抑制甲醛所致小鼠足肿胀作用(P＜0.05)，抑制率可达50％以上，效果强于阳性药，表明所发明的中药复方有效部位可显著抑制皮下注射甲醛引起的水肿。
表3中药复方有效部位抗足肿胀实验结果
与模型组相比较，*P＜0.05；**P＜0.01 (3)对甲醛致小鼠足肿胀组织中PGE2含量的影响 将剪下的小鼠右足，剥皮后浸泡于1mL生理盐水中1h，以2000r/min离心10min，吸取上清液0.2mL，加入0.5mol/L NaOH-CH3OH溶液1mL，在50℃水浴中异构化20分钟，加甲醇稀释到10mL，于278nm处测定其吸收值，并按下述公式计算PGE2含量 PGE2含量(μg/g)＝(E278×13.13×Vt×D)/W 计算各组间差异[注Vt＝PGE2浸泡液总体积，D＝稀释倍数，W＝右下肢重量(g)，E278＝278nm处的吸收值]。具体实验结果见表4。
表4中药复方有效部位对甲醛致小鼠足肿胀组织中PGE2含量的影响
与模型组相比较，*P＜0.05；**P＜0.01 由表4可知，所发明的中药复方有效部位对致炎组织中所含PGE2具有非常显著的抑制作用，表明可降低炎症组织中的炎症因子的合成与释放，PGE2含量越低，其抗炎作用越显著。
由以上镇痛抗炎试验结果表明，本发明提供的中药复方有效部位具有很好的镇痛和抗炎效果，且起效迅速，未见不良反应，可用于治疗妇科慢性盆腔炎疾病。
实施例7改善血液流变学及调节内分泌激素试验 1、急性血瘀SD大鼠模型的制备与实验 正常组常规饲养，模型组、治疗组大鼠置于0℃～1℃冰水中5min，每日1次，连续七天。中药复方有效部位治疗组于造模的第1天开始，按大、小剂量中药复方各样品灌胃，每日1次，连用7天，正常组、模型组给予同体积的蒸馏水。于第8天皮下注射0.1％肾上腺素0.1ml/100g，共2次，两次间隔时间4h。之后停食，于次晨采用全自动流变快测仪测定血流变学指标；采用放射免疫的方法测定血清中激素水平。
2、对大鼠急性血瘀模型全血粘度的影响 由表5可见，与模型组相比，本发明提供的中药复方有效部位在高、低剂量均明显降低全血粘度作用(P＜0.01或P＜0.05)。具体实验结果如表5所示。
表5中药复方有效部位对全血黏度的影响
与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01 3、对急性血瘀模型大鼠血浆粘度、血沉、红细胞压积的影响 与模型组相比，本发明提供的中药复方有效部位能明显降低血浆黏度、血沉、红细胞压积(P＜0.01或P＜0.05)，但对纤维蛋白原含量未见明显变化(P＞0.05)。高剂量组具有明显改善血沉、红细胞压积的作用(P＜0.05)，具体实验结果如表6所示。
表6中药复方有效部位对大鼠血浆粘度、血沉及红细胞压积的影响
#P＜0.05与对照组相比；*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比 4、对急性血瘀模型大鼠血清中E2和P含量的影响 与模型组相比，本发明提供的中药复方有效部位高、低剂量组均明显或显著降低血清中E2的升高(P＜0.001或P＜0.01)；而对孕酮含量均呈现升高作用(P＜0.05，P＜0.01)，具体实验结果如表7所示。
表7中药复方有效部位对寒凝血瘀型大鼠血清中内分泌激素水平的影响 ##P＜0.01与对照组相比；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与模型组相比 由以上实验结果表明本发明提供的中药复方有效部位具有很好的活血化瘀，改善血液循环，调节内分泌混乱，恢复内分泌正常的作用，从而可以用于治疗血瘀所致的痛经或子宫内膜异位症等妇科疾病。
实施例8调节免疫功能试验 1、对小鼠脾T淋巴细胞转化实验(MTT法) 各组动物连续灌胃30天，颈椎脱臼处死动物，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的平皿中，轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液，200目筛网过滤，用Hank’s液洗涤2次，每次离心10分钟计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3×106个/ml。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液(相当于715μg/ml)，另一孔作对照。置37℃、5％CO2培养箱中培养72小时。培养结束前4小时，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/ml)50μl/孔，继续培养4小时。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。将溶解液移入2ml比色杯中，在570nm波长处测定光密度值(OD)，实验结果表明本发明提供的中药复方有效部位具有很好的促进脾T淋巴细胞增殖的作用，从而可以起到提高免疫力的作用。
2、对小鼠静息脾淋巴细胞的影响实验结果 由表8实验结果可看出，与空白对照组(生理盐水)比较，本发明提供的中药复方有效部位可明显增强小鼠淋巴细胞转化功能(P＜0.01或P＜0.05或P＜0.001)，具有促进静息皮细胞的增殖反应，提高免疫力的作用。
表8中药复方有效部位对小鼠静息脾淋巴细胞的影响
与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001. 3、对ConA诱导的活化脾T淋巴细胞增殖和ConA诱导的IFN-γ试验 实验结果表明本发明提供的中药复方有效部位在200μg/ml时和DMSO对照组相比具有明显抑制ConA诱导的活化T细胞的增殖作用(P＜0.01)，和具有明显抑制ConA诱导的IFN-γ炎性因子的产生(P＜0.01)进一步表明本发明提供的中药复方有效部位具有很好的调节免疫功能的活性。
本发明根据中医药理论辨证施治，根据妇科疾病的发病机理，进行科学组方，并采用优选的提取纯化方法制备得到中药复方有效部位，经实验结果表明本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位具有很好的抗子宫平滑肌痉挛、镇痛、抗炎、调节雌激素、孕激素水平、调节免疫功能等活性，可用于治疗多种妇科疾病，包括原发性痛经、子宫内膜异位症、急慢性盆腔炎等妇科疾病，并且由于去掉了大量非活性物质，有效部位中有效成分更清楚，含量更高，临床上用药更少、更安全，不良反应更低，因此本发明提供的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有望开发成为新一代防治妇科疾病的药物。
权利要求
1.一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位，其特征在于，它由下列重量份数的原料制成
当归10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黄10-50份、五灵脂8-35份、没药3-20份、延胡索3-20份。
2.根据权利要求1所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位，其特征在于，它由下列重量份数的原料制成
当归30-50份、川芎5-15份、赤芍15-30份、蒲黄30-50份、五灵脂15-30份、没药5-15份、延胡索5-15份。
3.一种制备权利要求1所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的方法，其特征在于包括以下步骤
(1)取由当归10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黄10-50份、五灵脂8-35份、没药3-20份、延胡索3-20份组成的中药复方，加入总药材5～10倍量的水或醇水提取，合并提取液在20～70℃减压浓缩得浓缩液；
(2)取步骤(1)得到的浓缩液加入乙醇，使乙醇的浓度达到70～90％，放置沉淀，分离上清液，浓缩，得浓缩物；
(3)取步骤(2)得到的浓缩物上大孔吸附树脂柱，用浓度20％至70％的乙醇梯度洗脱，洗脱液回收溶剂，得中药复方有效部位。
4.根据权利要求3所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(1)中提取溶剂醇水中乙醇浓度为0-80％，提取次数为1～3次。
5.根据权利要求3所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的大孔吸附树脂为D101、D102或AB-8型大孔吸附树脂。
6.根据权利要求3所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(3)得到的中药复方有效部位中包含有重量百分比20～90％的有机酸类、黄酮类、内酯类和萜苷类四类化合物。
7.根据权利要求6所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(3)得到的中药复方有效部位中包含有重量百分比1.5％～9.5％的有机酸类；1％～30％的黄酮类；1％～40％的内酯类；13％～40％的萜苷类化合物。
8.权利要求1或2所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位在制备治疗妇科疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位在制备治疗妇科疾病药物中的应用，其特征在于所述的妇科疾病为妇女痛经、子宫内膜异位症或慢性盆腔炎疾病。
10.根据权利要求8所述的具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位在制备治疗妇科疾病药物中的应用，其特征在于把中药复方有效部位和药学上可接受的载体制成胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。
全文摘要
本发明公开了一种具有治疗妇科疾病作用的中药复方有效部位及其制备方法和其应用，该有效部位是由当归、川芎、赤芍、蒲黄、五灵脂、没药、延胡索组成的中药复方的水或乙醇提取液，通过乙醇沉淀去杂，然后上大孔吸附树脂柱，用优化浓度的乙醇梯度洗脱纯化，制备得到。本发明根据中医药理论和妇科疾病发病机制选取原料配伍组方，通过现代分析仪器和药理实验表明，本发明提供的中药复方有效部位具有很好的抗子宫平滑肌痉挛、镇痛、抗炎、调节雌激素、孕激素水平、调节免疫功能等活性，可用于治疗原发性痛经、子宫内膜异位症、急慢性盆腔炎等多种妇科疾病，且成分更清楚，不良反应更低，有望开发成为新一代治疗妇科疾病的药物。
文档编号A61K35/24GK101829247SQ20101017717
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者宿树兰, 段金廒, 钱大玮, 华永庆, 洪敏 , 周卫 申请人:南京中医药大学
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