硫酸化半乳聚糖及其制备方法
专利名称：硫酸化半乳聚糖及其制备方法
技术领域：
本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种具有确切分子量分布范围(分子量 为100-200kDa)的硫酸化半乳聚糖及其制备方法。
背景技术：
正如中国专利申请200610026830. 7公开的技术内容，从蜈蚣藻(Grateloupia filicina)中分离提取的硫酸化半乳聚糖具有抗凝血、抗血栓、抗病毒和抗肿瘤活性。由于 多糖是高分子化合物，其分子量高低不仅与其活性相关，还与其吸收密切相关。口服用药相 对于注射用药，具有优越的安全性和方便性。因此要将蜈蚣藻来源的硫酸化半乳聚糖应用 到临床，制造出一种口服有效的药物，还需要对其分子量与口服吸收的药效之间的关系加 以研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种硫酸化半乳聚糖及其制备方法，即对从 蜈蚣藻来源的硫酸化多糖进行新的制备方法的研究，筛选不同分子量分布与抗凝血活性之 间的关系，从而获得一种新的口服有效的硫酸化多糖。本发明所提供的硫酸化半乳聚糖，分子量为100_200kDa，硫酸基团含量为 26wt% 32wt%，其重复单元结构为 R = H，CH3, Xyl (木糖)或 Glc (葡萄糖)[-(1 — 3)-β -D-Galactose-2-S04-(1 — 4)-β -D-Galactose-Jn所述硫酸化半乳聚糖中半乳聚糖的含量为60wt % 69wt %。所述硫酸化半乳聚糖不含蛋白质。所述硫酸化半乳聚糖采用以下方法制备而成，具体包括以下步骤1)水提取取蜈蚣藻药材，除去盐及泥沙，拣去杂质，放入提取罐中，加药材质量15-20倍水，加热至90-100°C提取1-2小时(从温度达到90°C计时)，过300目滤布或 3000-4000rpm转速的离心分离除去药渣，收集提取液。2)酸降解将上述提取液升温至60-70°C并保持，用lmol/L盐酸或硫酸调pH值至 2 3，保温2h，取样检测溶液中多糖的分子量，至分子量为180-200kDa，停止加热，用lmol/ L氢氧化钠溶液中和至pH6 7，离心(3000-4000rpm)，弃去残渣，收集上清液。
3)膜过滤离心上述上清液，然后过0. 22-0. 45 μ m孔径的醋酸纤维素或偏氟滤 膜，收集滤液；滤液用截留分子量为IOOkDa的聚偏氟乙烯或聚砜材质的超滤膜，待滤液体 积减至初始体积8 10%时，边超滤边加入初始体积8 10%的纯净水(加入纯净水速度 与滤过液留出速度一致)，继续超滤至截留滤液体积为初始体积的8 10%。4)醇沉将上述超滤截留滤液转至醇沉灌中，搅拌下加入3倍重量的95%乙醇，静置12小时，离心(3000-4000rpm)收集沉淀。5)干燥将上述沉淀置真空干燥箱，保持80_90°C真空干燥24小时，至含水量小于 5%，即得硫酸化半乳聚糖。其中，本发明所述的分子量，是指采用凝胶色谱法，以标准多糖(葡聚糖)为对照 品，通过GPC软件计算获得。具体方法如下1 2mg标准多糖(葡聚糖)和硫酸化半乳聚 糖样品，用流动相配成2mg/ml溶液，IOOOOrpm离心lOmin，吸取上清液转入液相样品瓶，备 用。Aglient 1100高效液相色谱仪，配备示差检测器，KS-804、KS-805串联柱(Shodex公 司)，流动相为0. 2mol/L氯化钠溶液，柱温40°C，流速0. 8ml/min,进样体积25 μ 1，将标准 多糖和硫酸化半乳聚糖样品溶液依次进样，测定保留时间，用GPC软件计算硫酸化半乳聚 糖的分子量。本发明所述的硫酸化半乳聚糖的分子量分布范围为100-200kDa。通过下述方法检测表明本发明的硫酸化半乳聚糖不含蛋白质多糖样品用水溶解 配成0. lmg/ml溶液，以蒸馏水为空白，扫描200 400nm下的紫外吸收图谱。结果多糖样 品仅在256nm有一吸收峰，各多糖样品在280nm以上波长均无明显吸收峰，可判断其中不含 蛋白质。蛋白质通常在280nm以上波长有明显吸收峰。采用硫酸-苯酚法测定得本发明的硫酸化半乳聚糖中半乳聚糖的含量为 60wt%~ 69wt%0 具体如下1)对照品溶液制备精密称取105°C干燥至恒重的半乳糖标准品4mg，用蒸馏水溶 解后转入IOOml容量瓶，加蒸馏水稀释至刻度，摇勻，即得(每Iml含半乳糖40 μ g)。2)标准曲线制备精确移取对照品溶液0. 4ml, 0. 7ml, 1. Oml, 1. 3ml, 1. 6ml， 2. Oml，分别置20ml试管中，各管补加水至2. Oml，加入Iml 6%苯酚，再慢慢加入5ml浓硫 酸，立即摇勻，室温放置30min，另取2. Oml蒸馏水同上操作，作为空白，在490nm波长处测吸 光度，以吸光度为纵坐标，半乳糖含量为横坐标，绘制标准曲线。3)测定精密称取105°C干燥至恒重的蜈蚣藻多糖样品2mg，置25ml容量瓶中，力口 蒸馏水溶解后，稀释至刻度，摇勻，精确移取1ml，按标准曲线项下方法，自“各管补加水至 2. Oml ”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中半乳糖的含量，计算，即得。采用氯化钡_明胶法测定得本发明的硫酸化半乳聚糖中硫酸基的质量分数为 26wt% -32wt%0 具体如下1)对照品溶液制备精密称取105°C干燥至恒重的硫酸钾标准品27. 2mg,用lmol/ L盐酸溶解后转入25ml容量瓶，加lmol/L盐酸稀释至刻度，摇勻，即得(每Iml含硫酸基 600 μ g)。2)标准曲线制备精确移取对照品溶液0μ 1，20μ 1，40μ 1，70μ 1，100μ 1， 130 μ 1，160 μ 1，200 μ 1，分别置20ml试管中，各管补加lmol/L盐酸至200 μ 1，加入3. 8ml 3%三氯乙酸，再加入Iml 氯化钡明胶溶液，摇勻，静置15!^11，另取一试管，加20(^1 水，加入3.8ml 3%三氯乙酸溶液，再加入Iml 0. 5%明胶溶液，摇勻，作为空白，在360nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标，硫酸基含量为横坐标，绘制标准曲线。3)测定精密称取105°C干燥至恒重的蜈蚣藻多糖样品7mg，置IOml安瓿中，精 确加入5ml lmol/L盐酸，封口，100°C烘箱中加热水解6h，取出，放冷，吸取1.5ml置于2ml 离心管中，IOOOOrpm离心lOmin，吸取200 μ 1上清液两份，分别置20ml试管中，各管加入 3.8ml 3%三氯乙酸溶液，一份加Iml 1 % BaCl2明胶溶液，另一份加Iml 0.5%明胶溶液， 摇勻，15min后于360nm处测吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中硫酸基的含量，计算， 即得。分子量与抗凝活性的关系。体外方法测试显示分子量越大，按摩尔浓度计的抗凝 活性越强。比如采用试管法家兔体外凝血时间测定法，比较蜈蚣藻水提取，经酸水解的不同 时长，制得分子量从31kDa到1500kDa的18个硫酸化半乳聚糖(GFP)样品的抗凝血活性， 并与10U/ml浓度的低分子肝素进行比较。结果表明分子量为31、33、36、42、49、73、76、81、 110、130、166、190、227、395、466、512、565、1500kDa 的 GFP 在浓度 0. 01mmol/L 时，均能明显 延长试管法家兔体外凝血时间，与生理盐水对照组比较P < 0. 05或P < 0. 01 ；而且呈明显 的分子量越大抗凝血作用越明显的趋势；分子量为22. 7万(O.Olmmol/L)以上的体外抗凝 血作用优于低分子肝素(10U/ml)。具体数据参见表1。表1不同分子量的GFP对兔体外凝血时间的影响(7士S，η = 6) 注与对照组比较，*为 P < O. 05，"为 P < O. 01，“为 P < 0. 01。但是，口服给药途径的动物药效试验表明硫酸化半乳聚糖的抗凝作用与体外试 验结果不同，并不与分子量呈正相关，实际上存在一个最佳的分子量分布范围。经比较三批 硫酸化半乳聚糖分子量分别为193kDa、136kDa和112kDa样品小鼠口服给药的抗血栓作用， 通过小鼠凝血时间、大鼠凝血因子测定以及角叉菜胶致小鼠尾静脉血栓形成三个实验，比 较观察三批硫酸化半乳聚糖(GFP)样品的抗血栓作用。结果表明三批GFP均能延长小鼠 凝血时间、延长凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)，抑制角叉 菜胶致小鼠尾静脉血栓的形成，GFP-B (分子量136kDa)和GFP-C(分子量112kDa)的效果 优于GFP-A (分子量193kDa)。具体参见实施例2。这是因为对于胃肠道的吸收来说，需要 一个合适的分子量范围。因此，通过分子量分布来控制适合口服途径给药的硫酸化半乳聚糖是必需的。本 发明硫酸化半乳聚糖的制备方法适合工业化规模生产，实现从蜈蚣藻中制备分子量范围在 100-200kDa内的硫酸化半乳聚糖，用于制造口服给药的各种制剂，临床用于抗凝血和抗血 栓的治疗。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。实施例1工业化生产硫酸半乳聚糖仪器设备用于控制分子量范围的关键设备是无锡赛普膜科技发展有限公司的 UF402M膜分离一体机，安装两支美国GE公司的4040型聚砜膜。1)水提取取蜈蚣藻药材(产地为山东青岛和福建宁德)10kg，用水漂洗，除去盐 及泥沙，拣去杂质，放入提取罐中，加200L水，90°C提取1. 5h (从温度达到90°C计时)，过 滤，药渣再提取两次，每次加150L水，合并三次提取液。2)酸降解将上述制得的提取液升温至60°C，待溶液温度平衡后用lmol/L盐酸调 pH值2 3 (约需lmol/L盐酸5L)，继续60°C (60 65°C )保温2h，然后用lmol/L氢氧化 钠溶液中和至pH6 7，离心(4000rpm，IOmin)，弃去残渣，收集上清液。3)膜过滤离心上述上清液，过0. 45 μ m孔径的滤膜，滤液经UF402超滤机浓缩至 约50L，然后边超滤边加入IOOkg纯净水(加入纯净水速度与滤过液留出速度一致)，直至加完，继续浓缩到50L。4)醇沉超滤浓缩液搅拌下加入150kg 95%工业乙醇沉淀多糖，静置12小时，离
心收集沉淀。5)干燥沉淀置具冷凝器的真空干燥箱，80°C真空干燥24小时，至含水量小于 5%o 得率 15-25% ο按以上工艺生产六批，测定了六批中试样品中半乳聚糖、硫酸基、分子量的结果如 表2所示。表2
20071019 62.3±1.5 29.8±0.7 1.12 士 0.07 20090618 68.3±1.5 29.1 士 0.8 1.87±0.05 20100112 65.9土 1.2 27.0土 0.6 1.42 士 0.08 20100118_64.4 土 1.3_ 27.2 士 0.6_1.93 士 0.04实施例2比较三批硫酸化半乳聚糖样品抗血栓作用实验1 材料1. 1试验药物硫酸化半乳聚糖样品一(GFP-A)，批号20070701，分子量193kDa。硫酸化半乳聚糖样品二(GFP-B)，批号20070727，分子量136kDa。硫酸化半乳聚糖样品二(GFP-C)，批号20071019，分子量112kDa。上述三批样品临用前用生理盐水配成所需浓度溶液。阿司匹林片湖南新汇制药有限公司，生产批号060802。1. 2器材试剂毛细玻管(内径1mm，长100mm)，华西医科大学仪器修造厂。电子天平，mettler Toledo, made by mettler-toledo group ；System CA-530 血凝仪(日本)。1. 3 动物昆明种小鼠，雄性，体重18 22g，合格证号2006A063 ；SD大鼠，雄性，体重170 200g，合格证号2006A064，均由中山大学实验动物中心提供，以上动物均在本实验室适应 3d后使用。饲养条件动物进入实验室后，分笼饲养，大小鼠均为每笼5只，由专人饲养管理。 动物室光照充足，通风和空调设备良好，室温控制在20-25°C，相对湿度为50-70%，实验室 按常规定期消毒。1. 4剂量设置按等摩尔质量剂量进行设计，大小鼠口服给药均为GFP-A高、低剂量为19mg/kg 和 9. 5mg/kg ；GFP-B 高、低剂量为 13mg/kg 和 6. 5mg/kg ；GFP-C 高、低剂量为 llmg/kg 和5.5mg/kg。阳性对照药阿司匹林片大小鼠口服给药剂量均为10mg/kg。2.方法与结果2. 1对小鼠凝血时间的影响雄性昆明小鼠80只，体重18 22g，随机分8组，每组10只，分别为1.对照 组；2. GFP-A(19mg/kg) ；3. GFP-A (9. 5mg/kg) ；4. GFP-B (13mg/kg) ；5. GFP-B (6. 5mg/kg)； 6. GFP-C(llmg/kg) ；7. GFP-C (5. 5mg/kg) ；8.阿司匹林片(10mg/kg)。均按 0. 2mL/10g 每天 灌胃给予药液一次，连续7天。末次给药后60min，用毛细管法进行凝血时间测定，结果见表 3。
_13.0314.0±153.3** GFP-B 组
6.5255.9士 96.3*
11.0285.7±121.0**
GFP-C 组
_5J_265.8 士 81.6**
阿司匹林组_10￡_302.3±83.5**注与对照组比较，*为P < 0. 05广为P < 0. 01.由表3可以看出三个批号(三种分子量)的硫酸化半乳聚糖样品连续口服给 药7d，均能明显延长小鼠的凝血时间(与对照组比较P<0.05或P<0.01)。其中样品 GFP-B (136kDa)和 GFP_C(112kDa)效果优于样品 GFP-A(193kDa)。2. 2对大鼠凝血因子的影响雄性SD大鼠，体重170 200g，随机分8组，每组6只，分别为1.对照组； 2. GFP-A (19mg/kg) ；3. GFP-A (9. 5mg/kg) ；4. GFP-B (13mg/kg) ；5. GFP-B (6. 5mg/kg)； 6. GFP-C(llmg/kg) ；7. GFP-C (5. 5mg/kg) ；8.阿司匹林片(10mg/kg)。均按 1. 0mL/100g 每天 灌胃给予药液一次，连续7天。末次给药后60min，以3%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射 麻醉，从腹腔静脉抽血1.8ml，迅速加入有1 9柠檬酸钠溶液0.2ml的测定管中，送中山大 学附属一院生化检验科用System CA-530血凝仪(日本)测定凝血酶时间(TT)、凝血酶原 时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)以及纤维蛋白原(Fbg.)的含量，结果见表4。表4对大鼠凝血因子的影响(7±S，n = 6) 注与对照组比较，*为P < 0. 05广为P < 0. 01.由表4可以看出连续口服给药7d，三个批号(三种分子量)的硫酸化半乳聚糖 样品均有延长PT、TT、APTT的作用，其中GFP-B (136kDa)高剂量能明显延长PT和TT (与对 照组比较P < 0.05或P < 0.01) ；GFP-C(112kDa)高剂量能明显延长PT。三个批号(三种 分子量)的硫酸化半乳聚糖样品对纤维蛋白原(Fbg.)的影响不显著，但均有降低其含量的 趋势。2. 3对小鼠尾静脉血栓形成的影响雄性昆明小鼠80只，体重18 22g，随机分8组，每组10只，分别为1.对照 组；2. GFP-A(19mg/kg) ；3. GFP-A (9. 5mg/kg) ；4. GFP-B (13mg/kg) ；5. GFP-B (6. 5mg/kg)； 6. GFP-C(llmg/kg) ；7. GFP-C (5. 5mg/kg) ；8.阿司匹林片(10mg/kg)。均按 0. 2mL/10g 每天 灌胃给予药液一次，连续7天。于第5天给药后lh，在小鼠的腰背皮下按0. 2ml/10g注射 0.5%的角叉菜胶，于注射后24h、48h以及72h量取小鼠出现黑尾长度(即为血栓长度)和 全尾长度，计算黑尾长度与全尾长度比值和尾静脉血栓形成率。结果见表5和表6。表5对小鼠尾静脉血栓长度以及形成率的影响(7±S，n= 10) 注与对照组比较，*为 P < 0. 05，# 为 P < 0. 01，_加< 0. 001表6对小鼠尾静脉血栓形成长占尾长百分率的影响(X±S，n= 10) 注与对照组比较，*为 P < 0. 05，# 为 P < 0. 01，_ 为 P < 0. 001由表5和表6可以看出连续给药7d，三个批号(三种分子量)的硫酸化半乳聚糖 样品均能明显抑制小鼠尾静脉血栓的形成，其中样品GFP-B(136kDa)和GFP-C(112kDa)效
果较佳。3.小结三批硫酸化半乳聚糖(GFP)样品均能延长小鼠凝血时间，延长凝血酶时间(TT)、 凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)，抑制角叉菜胶致小鼠尾静脉血栓的形成， GFP-B (136kDa)和 GFP_C(112kDa)的效果优于 GFP-A (193kDa)。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。
权利要求
一种硫酸化半乳聚糖，分子量为100-200kDa，其特征在于，所述硫酸化半乳聚糖中硫酸基团的含量为26wt％～32wt％，其重复单元结构如下其中R＝H，CH3，Xyl或Glc。FSA00000124794400011.tif
2.根据权利要求1所述的硫酸化半乳聚糖，其特征在于，所述硫酸化半乳聚糖中半乳 聚糖的含量为60wt% 69wt%。
3.根据权利要求1所述的硫酸化半乳聚糖，其特征在于，所述硫酸化半乳聚糖不含蛋 白质。
4.权利要求1所述的硫酸化半乳聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)水提取取蜈蚣藻药材，除去盐及泥沙，拣去杂质，放入提取罐中，加药材质量15-20 倍水，加热至90-100°C提取1-2小时，从温度达到90°C计时，过300目滤布或3000-4000rpm 转速的离心分离除去药渣，收集提取液；2)酸降解将上述提取液升温至60-70°C并保持，用稀盐酸或硫酸调pH值至2 3，保 温，取样检测溶液中多糖的分子量，至分子量为180-200kDa，停止加热，用氢氧化钠溶液中 和至pH6 7，离心，弃去残渣，收集上清液；3)膜过滤离心上述上清液，然后过0.22-0. 45 μ m孔径的醋酸纤维素或偏氟滤膜，收 集滤液；滤液用聚偏氟乙烯或聚砜材质的超滤膜过滤，待滤液体积减至初始体积8 10% 时，边超滤边加入初始体积8 10%的纯净水，加入纯净水速度与滤过液留出速度一致，继 续超滤至截留滤液体积为初始体积的8 10% ；4)醇沉将上述超滤截留滤液转至醇沉灌中，搅拌下加入乙醇，静置，离心收集沉淀；5)干燥将上述沉淀置真空干燥箱，保持80-90°C真空干燥24小时，至含水量<5%， 即得硫酸化半乳聚糖。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸化半乳聚糖为口服制剂。
全文摘要
本发明公开了一种硫酸化半乳聚糖及其制备方法。其中，所述硫酸化半乳聚糖的分子量为100-200kDa，硫酸基团含量为26wt％～32wt％，半乳聚糖含量为60wt％～69wt％，且所述硫酸化半乳聚糖不含蛋白质。所述硫酸化半乳聚糖经水提取、酸降解、膜过滤、醇沉、干燥等工艺制备而成。本发明的制备工艺适合工业化规模生产，实现了从蜈蚣藻中制备分子量范围在100-200kDa内的硫酸化半乳聚糖，可用于制造口服给药的各种制剂，临床上应用于抗凝血和抗血栓的治疗。
文档编号A61P7/02GK101851298SQ20101017729
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者单圆圆, 方通, 施松善, 朱勤, 潘俊芳, 王顺春 申请人:上海和臣医药工程有限公司;上海中医药大学
技术领域：
本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种具有确切分子量分布范围(分子量 为100-200kDa)的硫酸化半乳聚糖及其制备方法。
背景技术：
正如中国专利申请200610026830. 7公开的技术内容，从蜈蚣藻(Grateloupia filicina)中分离提取的硫酸化半乳聚糖具有抗凝血、抗血栓、抗病毒和抗肿瘤活性。由于 多糖是高分子化合物，其分子量高低不仅与其活性相关，还与其吸收密切相关。口服用药相 对于注射用药，具有优越的安全性和方便性。因此要将蜈蚣藻来源的硫酸化半乳聚糖应用 到临床，制造出一种口服有效的药物，还需要对其分子量与口服吸收的药效之间的关系加 以研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种硫酸化半乳聚糖及其制备方法，即对从 蜈蚣藻来源的硫酸化多糖进行新的制备方法的研究，筛选不同分子量分布与抗凝血活性之 间的关系，从而获得一种新的口服有效的硫酸化多糖。本发明所提供的硫酸化半乳聚糖，分子量为100_200kDa，硫酸基团含量为 26wt% 32wt%，其重复单元结构为 R = H，CH3, Xyl (木糖)或 Glc (葡萄糖)[-(1 — 3)-β -D-Galactose-2-S04-(1 — 4)-β -D-Galactose-Jn所述硫酸化半乳聚糖中半乳聚糖的含量为60wt % 69wt %。所述硫酸化半乳聚糖不含蛋白质。所述硫酸化半乳聚糖采用以下方法制备而成，具体包括以下步骤1)水提取取蜈蚣藻药材，除去盐及泥沙，拣去杂质，放入提取罐中，加药材质量15-20倍水，加热至90-100°C提取1-2小时(从温度达到90°C计时)，过300目滤布或 3000-4000rpm转速的离心分离除去药渣，收集提取液。2)酸降解将上述提取液升温至60-70°C并保持，用lmol/L盐酸或硫酸调pH值至 2 3，保温2h，取样检测溶液中多糖的分子量，至分子量为180-200kDa，停止加热，用lmol/ L氢氧化钠溶液中和至pH6 7，离心(3000-4000rpm)，弃去残渣，收集上清液。
3)膜过滤离心上述上清液，然后过0. 22-0. 45 μ m孔径的醋酸纤维素或偏氟滤 膜，收集滤液；滤液用截留分子量为IOOkDa的聚偏氟乙烯或聚砜材质的超滤膜，待滤液体 积减至初始体积8 10%时，边超滤边加入初始体积8 10%的纯净水(加入纯净水速度 与滤过液留出速度一致)，继续超滤至截留滤液体积为初始体积的8 10%。4)醇沉将上述超滤截留滤液转至醇沉灌中，搅拌下加入3倍重量的95%乙醇，静置12小时，离心(3000-4000rpm)收集沉淀。5)干燥将上述沉淀置真空干燥箱，保持80_90°C真空干燥24小时，至含水量小于 5%，即得硫酸化半乳聚糖。其中，本发明所述的分子量，是指采用凝胶色谱法，以标准多糖(葡聚糖)为对照 品，通过GPC软件计算获得。具体方法如下1 2mg标准多糖(葡聚糖)和硫酸化半乳聚 糖样品，用流动相配成2mg/ml溶液，IOOOOrpm离心lOmin，吸取上清液转入液相样品瓶，备 用。Aglient 1100高效液相色谱仪，配备示差检测器，KS-804、KS-805串联柱(Shodex公 司)，流动相为0. 2mol/L氯化钠溶液，柱温40°C，流速0. 8ml/min,进样体积25 μ 1，将标准 多糖和硫酸化半乳聚糖样品溶液依次进样，测定保留时间，用GPC软件计算硫酸化半乳聚 糖的分子量。本发明所述的硫酸化半乳聚糖的分子量分布范围为100-200kDa。通过下述方法检测表明本发明的硫酸化半乳聚糖不含蛋白质多糖样品用水溶解 配成0. lmg/ml溶液，以蒸馏水为空白，扫描200 400nm下的紫外吸收图谱。结果多糖样 品仅在256nm有一吸收峰，各多糖样品在280nm以上波长均无明显吸收峰，可判断其中不含 蛋白质。蛋白质通常在280nm以上波长有明显吸收峰。采用硫酸-苯酚法测定得本发明的硫酸化半乳聚糖中半乳聚糖的含量为 60wt%~ 69wt%0 具体如下1)对照品溶液制备精密称取105°C干燥至恒重的半乳糖标准品4mg，用蒸馏水溶 解后转入IOOml容量瓶，加蒸馏水稀释至刻度，摇勻，即得(每Iml含半乳糖40 μ g)。2)标准曲线制备精确移取对照品溶液0. 4ml, 0. 7ml, 1. Oml, 1. 3ml, 1. 6ml， 2. Oml，分别置20ml试管中，各管补加水至2. Oml，加入Iml 6%苯酚，再慢慢加入5ml浓硫 酸，立即摇勻，室温放置30min，另取2. Oml蒸馏水同上操作，作为空白，在490nm波长处测吸 光度，以吸光度为纵坐标，半乳糖含量为横坐标，绘制标准曲线。3)测定精密称取105°C干燥至恒重的蜈蚣藻多糖样品2mg，置25ml容量瓶中，力口 蒸馏水溶解后，稀释至刻度，摇勻，精确移取1ml，按标准曲线项下方法，自“各管补加水至 2. Oml ”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中半乳糖的含量，计算，即得。采用氯化钡_明胶法测定得本发明的硫酸化半乳聚糖中硫酸基的质量分数为 26wt% -32wt%0 具体如下1)对照品溶液制备精密称取105°C干燥至恒重的硫酸钾标准品27. 2mg,用lmol/ L盐酸溶解后转入25ml容量瓶，加lmol/L盐酸稀释至刻度，摇勻，即得(每Iml含硫酸基 600 μ g)。2)标准曲线制备精确移取对照品溶液0μ 1，20μ 1，40μ 1，70μ 1，100μ 1， 130 μ 1，160 μ 1，200 μ 1，分别置20ml试管中，各管补加lmol/L盐酸至200 μ 1，加入3. 8ml 3%三氯乙酸，再加入Iml 氯化钡明胶溶液，摇勻，静置15!^11，另取一试管，加20(^1 水，加入3.8ml 3%三氯乙酸溶液，再加入Iml 0. 5%明胶溶液，摇勻，作为空白，在360nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标，硫酸基含量为横坐标，绘制标准曲线。3)测定精密称取105°C干燥至恒重的蜈蚣藻多糖样品7mg，置IOml安瓿中，精 确加入5ml lmol/L盐酸，封口，100°C烘箱中加热水解6h，取出，放冷，吸取1.5ml置于2ml 离心管中，IOOOOrpm离心lOmin，吸取200 μ 1上清液两份，分别置20ml试管中，各管加入 3.8ml 3%三氯乙酸溶液，一份加Iml 1 % BaCl2明胶溶液，另一份加Iml 0.5%明胶溶液， 摇勻，15min后于360nm处测吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中硫酸基的含量，计算， 即得。分子量与抗凝活性的关系。体外方法测试显示分子量越大，按摩尔浓度计的抗凝 活性越强。比如采用试管法家兔体外凝血时间测定法，比较蜈蚣藻水提取，经酸水解的不同 时长，制得分子量从31kDa到1500kDa的18个硫酸化半乳聚糖(GFP)样品的抗凝血活性， 并与10U/ml浓度的低分子肝素进行比较。结果表明分子量为31、33、36、42、49、73、76、81、 110、130、166、190、227、395、466、512、565、1500kDa 的 GFP 在浓度 0. 01mmol/L 时，均能明显 延长试管法家兔体外凝血时间，与生理盐水对照组比较P < 0. 05或P < 0. 01 ；而且呈明显 的分子量越大抗凝血作用越明显的趋势；分子量为22. 7万(O.Olmmol/L)以上的体外抗凝 血作用优于低分子肝素(10U/ml)。具体数据参见表1。表1不同分子量的GFP对兔体外凝血时间的影响(7士S，η = 6) 注与对照组比较，*为 P < O. 05，"为 P < O. 01，“为 P < 0. 01。但是，口服给药途径的动物药效试验表明硫酸化半乳聚糖的抗凝作用与体外试 验结果不同，并不与分子量呈正相关，实际上存在一个最佳的分子量分布范围。经比较三批 硫酸化半乳聚糖分子量分别为193kDa、136kDa和112kDa样品小鼠口服给药的抗血栓作用， 通过小鼠凝血时间、大鼠凝血因子测定以及角叉菜胶致小鼠尾静脉血栓形成三个实验，比 较观察三批硫酸化半乳聚糖(GFP)样品的抗血栓作用。结果表明三批GFP均能延长小鼠 凝血时间、延长凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)，抑制角叉 菜胶致小鼠尾静脉血栓的形成，GFP-B (分子量136kDa)和GFP-C(分子量112kDa)的效果 优于GFP-A (分子量193kDa)。具体参见实施例2。这是因为对于胃肠道的吸收来说，需要 一个合适的分子量范围。因此，通过分子量分布来控制适合口服途径给药的硫酸化半乳聚糖是必需的。本 发明硫酸化半乳聚糖的制备方法适合工业化规模生产，实现从蜈蚣藻中制备分子量范围在 100-200kDa内的硫酸化半乳聚糖，用于制造口服给药的各种制剂，临床用于抗凝血和抗血 栓的治疗。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。实施例1工业化生产硫酸半乳聚糖仪器设备用于控制分子量范围的关键设备是无锡赛普膜科技发展有限公司的 UF402M膜分离一体机，安装两支美国GE公司的4040型聚砜膜。1)水提取取蜈蚣藻药材(产地为山东青岛和福建宁德)10kg，用水漂洗，除去盐 及泥沙，拣去杂质，放入提取罐中，加200L水，90°C提取1. 5h (从温度达到90°C计时)，过 滤，药渣再提取两次，每次加150L水，合并三次提取液。2)酸降解将上述制得的提取液升温至60°C，待溶液温度平衡后用lmol/L盐酸调 pH值2 3 (约需lmol/L盐酸5L)，继续60°C (60 65°C )保温2h，然后用lmol/L氢氧化 钠溶液中和至pH6 7，离心(4000rpm，IOmin)，弃去残渣，收集上清液。3)膜过滤离心上述上清液，过0. 45 μ m孔径的滤膜，滤液经UF402超滤机浓缩至 约50L，然后边超滤边加入IOOkg纯净水(加入纯净水速度与滤过液留出速度一致)，直至加完，继续浓缩到50L。4)醇沉超滤浓缩液搅拌下加入150kg 95%工业乙醇沉淀多糖，静置12小时，离
心收集沉淀。5)干燥沉淀置具冷凝器的真空干燥箱，80°C真空干燥24小时，至含水量小于 5%o 得率 15-25% ο按以上工艺生产六批，测定了六批中试样品中半乳聚糖、硫酸基、分子量的结果如 表2所示。表2
20071019 62.3±1.5 29.8±0.7 1.12 士 0.07 20090618 68.3±1.5 29.1 士 0.8 1.87±0.05 20100112 65.9土 1.2 27.0土 0.6 1.42 士 0.08 20100118_64.4 土 1.3_ 27.2 士 0.6_1.93 士 0.04实施例2比较三批硫酸化半乳聚糖样品抗血栓作用实验1 材料1. 1试验药物硫酸化半乳聚糖样品一(GFP-A)，批号20070701，分子量193kDa。硫酸化半乳聚糖样品二(GFP-B)，批号20070727，分子量136kDa。硫酸化半乳聚糖样品二(GFP-C)，批号20071019，分子量112kDa。上述三批样品临用前用生理盐水配成所需浓度溶液。阿司匹林片湖南新汇制药有限公司，生产批号060802。1. 2器材试剂毛细玻管(内径1mm，长100mm)，华西医科大学仪器修造厂。电子天平，mettler Toledo, made by mettler-toledo group ；System CA-530 血凝仪(日本)。1. 3 动物昆明种小鼠，雄性，体重18 22g，合格证号2006A063 ；SD大鼠，雄性，体重170 200g，合格证号2006A064，均由中山大学实验动物中心提供，以上动物均在本实验室适应 3d后使用。饲养条件动物进入实验室后，分笼饲养，大小鼠均为每笼5只，由专人饲养管理。 动物室光照充足，通风和空调设备良好，室温控制在20-25°C，相对湿度为50-70%，实验室 按常规定期消毒。1. 4剂量设置按等摩尔质量剂量进行设计，大小鼠口服给药均为GFP-A高、低剂量为19mg/kg 和 9. 5mg/kg ；GFP-B 高、低剂量为 13mg/kg 和 6. 5mg/kg ；GFP-C 高、低剂量为 llmg/kg 和5.5mg/kg。阳性对照药阿司匹林片大小鼠口服给药剂量均为10mg/kg。2.方法与结果2. 1对小鼠凝血时间的影响雄性昆明小鼠80只，体重18 22g，随机分8组，每组10只，分别为1.对照 组；2. GFP-A(19mg/kg) ；3. GFP-A (9. 5mg/kg) ；4. GFP-B (13mg/kg) ；5. GFP-B (6. 5mg/kg)； 6. GFP-C(llmg/kg) ；7. GFP-C (5. 5mg/kg) ；8.阿司匹林片(10mg/kg)。均按 0. 2mL/10g 每天 灌胃给予药液一次，连续7天。末次给药后60min，用毛细管法进行凝血时间测定，结果见表 3。
_13.0314.0±153.3** GFP-B 组
6.5255.9士 96.3*
11.0285.7±121.0**
GFP-C 组
_5J_265.8 士 81.6**
阿司匹林组_10￡_302.3±83.5**注与对照组比较，*为P < 0. 05广为P < 0. 01.由表3可以看出三个批号(三种分子量)的硫酸化半乳聚糖样品连续口服给 药7d，均能明显延长小鼠的凝血时间(与对照组比较P<0.05或P<0.01)。其中样品 GFP-B (136kDa)和 GFP_C(112kDa)效果优于样品 GFP-A(193kDa)。2. 2对大鼠凝血因子的影响雄性SD大鼠，体重170 200g，随机分8组，每组6只，分别为1.对照组； 2. GFP-A (19mg/kg) ；3. GFP-A (9. 5mg/kg) ；4. GFP-B (13mg/kg) ；5. GFP-B (6. 5mg/kg)； 6. GFP-C(llmg/kg) ；7. GFP-C (5. 5mg/kg) ；8.阿司匹林片(10mg/kg)。均按 1. 0mL/100g 每天 灌胃给予药液一次，连续7天。末次给药后60min，以3%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射 麻醉，从腹腔静脉抽血1.8ml，迅速加入有1 9柠檬酸钠溶液0.2ml的测定管中，送中山大 学附属一院生化检验科用System CA-530血凝仪(日本)测定凝血酶时间(TT)、凝血酶原 时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)以及纤维蛋白原(Fbg.)的含量，结果见表4。表4对大鼠凝血因子的影响(7±S，n = 6) 注与对照组比较，*为P < 0. 05广为P < 0. 01.由表4可以看出连续口服给药7d，三个批号(三种分子量)的硫酸化半乳聚糖 样品均有延长PT、TT、APTT的作用，其中GFP-B (136kDa)高剂量能明显延长PT和TT (与对 照组比较P < 0.05或P < 0.01) ；GFP-C(112kDa)高剂量能明显延长PT。三个批号(三种 分子量)的硫酸化半乳聚糖样品对纤维蛋白原(Fbg.)的影响不显著，但均有降低其含量的 趋势。2. 3对小鼠尾静脉血栓形成的影响雄性昆明小鼠80只，体重18 22g，随机分8组，每组10只，分别为1.对照 组；2. GFP-A(19mg/kg) ；3. GFP-A (9. 5mg/kg) ；4. GFP-B (13mg/kg) ；5. GFP-B (6. 5mg/kg)； 6. GFP-C(llmg/kg) ；7. GFP-C (5. 5mg/kg) ；8.阿司匹林片(10mg/kg)。均按 0. 2mL/10g 每天 灌胃给予药液一次，连续7天。于第5天给药后lh，在小鼠的腰背皮下按0. 2ml/10g注射 0.5%的角叉菜胶，于注射后24h、48h以及72h量取小鼠出现黑尾长度(即为血栓长度)和 全尾长度，计算黑尾长度与全尾长度比值和尾静脉血栓形成率。结果见表5和表6。表5对小鼠尾静脉血栓长度以及形成率的影响(7±S，n= 10) 注与对照组比较，*为 P < 0. 05，# 为 P < 0. 01，_加< 0. 001表6对小鼠尾静脉血栓形成长占尾长百分率的影响(X±S，n= 10) 注与对照组比较，*为 P < 0. 05，# 为 P < 0. 01，_ 为 P < 0. 001由表5和表6可以看出连续给药7d，三个批号(三种分子量)的硫酸化半乳聚糖 样品均能明显抑制小鼠尾静脉血栓的形成，其中样品GFP-B(136kDa)和GFP-C(112kDa)效
果较佳。3.小结三批硫酸化半乳聚糖(GFP)样品均能延长小鼠凝血时间，延长凝血酶时间(TT)、 凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)，抑制角叉菜胶致小鼠尾静脉血栓的形成， GFP-B (136kDa)和 GFP_C(112kDa)的效果优于 GFP-A (193kDa)。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。
权利要求
一种硫酸化半乳聚糖，分子量为100-200kDa，其特征在于，所述硫酸化半乳聚糖中硫酸基团的含量为26wt％～32wt％，其重复单元结构如下其中R＝H，CH3，Xyl或Glc。FSA00000124794400011.tif
2.根据权利要求1所述的硫酸化半乳聚糖，其特征在于，所述硫酸化半乳聚糖中半乳 聚糖的含量为60wt% 69wt%。
3.根据权利要求1所述的硫酸化半乳聚糖，其特征在于，所述硫酸化半乳聚糖不含蛋 白质。
4.权利要求1所述的硫酸化半乳聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)水提取取蜈蚣藻药材，除去盐及泥沙，拣去杂质，放入提取罐中，加药材质量15-20 倍水，加热至90-100°C提取1-2小时，从温度达到90°C计时，过300目滤布或3000-4000rpm 转速的离心分离除去药渣，收集提取液；2)酸降解将上述提取液升温至60-70°C并保持，用稀盐酸或硫酸调pH值至2 3，保 温，取样检测溶液中多糖的分子量，至分子量为180-200kDa，停止加热，用氢氧化钠溶液中 和至pH6 7，离心，弃去残渣，收集上清液；3)膜过滤离心上述上清液，然后过0.22-0. 45 μ m孔径的醋酸纤维素或偏氟滤膜，收 集滤液；滤液用聚偏氟乙烯或聚砜材质的超滤膜过滤，待滤液体积减至初始体积8 10% 时，边超滤边加入初始体积8 10%的纯净水，加入纯净水速度与滤过液留出速度一致，继 续超滤至截留滤液体积为初始体积的8 10% ；4)醇沉将上述超滤截留滤液转至醇沉灌中，搅拌下加入乙醇，静置，离心收集沉淀；5)干燥将上述沉淀置真空干燥箱，保持80-90°C真空干燥24小时，至含水量<5%， 即得硫酸化半乳聚糖。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸化半乳聚糖为口服制剂。
全文摘要
本发明公开了一种硫酸化半乳聚糖及其制备方法。其中，所述硫酸化半乳聚糖的分子量为100-200kDa，硫酸基团含量为26wt％～32wt％，半乳聚糖含量为60wt％～69wt％，且所述硫酸化半乳聚糖不含蛋白质。所述硫酸化半乳聚糖经水提取、酸降解、膜过滤、醇沉、干燥等工艺制备而成。本发明的制备工艺适合工业化规模生产，实现了从蜈蚣藻中制备分子量范围在100-200kDa内的硫酸化半乳聚糖，可用于制造口服给药的各种制剂，临床上应用于抗凝血和抗血栓的治疗。
文档编号A61P7/02GK101851298SQ20101017729
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者单圆圆, 方通, 施松善, 朱勤, 潘俊芳, 王顺春 申请人:上海和臣医药工程有限公司;上海中医药大学
最新回复(0)