甲磺酸伊马替尼的新用途的制作方法
专利名称：甲磺酸伊马替尼的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种甲磺酸伊马替尼的新用途。
背景技术：
STI571又名Glivec，商品名为“甲磺酸伊马替尼”。目前国外主要用于慢性骨髓性 白血病的治疗，STI571能明显抑制白血病细胞增殖，细胞阻滞于G0/G1期，且具有明显的诱 导凋亡作用。甲磺酸伊马替尼的化学名称为4-(4_甲基-1-哌嗪)甲基4-4-甲基-3-4-(3-吡 啶)-2_嘧啶氨基苯基-苯胺甲磺酸盐。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种甲磺酸伊马替尼的新用途。本发明提供了甲磺酸伊马替尼在制备抑制神经元凋亡的产品中的应用。本发明的另一个目的是提供一种甲磺酸伊马替尼在制备治疗神经退行性疾病和/ 或脑缺血疾病的产品中的应用。所述抑制神经元凋亡是通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶_1(MST1，serine/ threonine-protein kinase)的憐酸化实现的。所述抑制MSTl的磷酸化是通过抑制非受体酪氨酸激酶(C-Abl)的激酶活性实现 的。所述神经元凋亡为过氧化氢和/或鱼藤酮引起的神经元凋亡。所述神经元为海马神经元，优选为鼠海马神经元，尤其优选为大鼠海马神经元。所述产品为药物。所述MSTl的磷酸化为MST1433位点酪氨酸磷酸化。甲磺酸伊马替尼(STI571)的化学名称为4-(4_甲基哌嗪)甲基_N_4_甲 基-3-4-(3-吡啶)-2_嘧啶氨基苯基-苯胺甲磺酸盐，分子式为C29H31N7O · CH4S03。本发明的实验证明，STI571作为c-Abl (非受体酪氨酸激酶)特异性抑制剂，还可 有效对抗神经细胞的氧化应激反应，抑制c-Abl的激酶活性，从而抑制神经细胞凋亡反应， 因而，可能作为抗脑缺血及抗神经退行性疾病的候选新药，具有良好的应用前景，将极大程 度拓展STI571的临床适应症。
图1为STI571抑制H2O2诱导的原代海马神经元的凋亡反应图2为STI571抑制c_Abl的激酶活性图3为c-Abl介导了 H2O2激活MSTl引起的细胞凋亡图4为c-Abl的RNAi质粒都能很好的敲除内源的c_Abl图5为c-Abl在体外磷酸化MSTl
图6为C-Ab在细胞内磷酸化MSTl图7为c-Abl在酪氨酸433位点磷酸化MSTl图8为抗体能特异性识别MSTl酪氨酸433位点磷酸化图9为c-Abl正向调节MSTl的蛋白水平图10为c-Abl激活MSTl的激酶活性图11为STI571可抑制H2O2诱导的MSTl表达图12为STI571可抑制H2O2诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化图13为STI571可抑制鱼藤酮和H2O2诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化图14为H2O2可在胞浆中激活MSTl酪氨酸433位点磷酸化
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例的细胞转染的方法均为(1)细胞培养取6孔培养板，向每孔中加入 2mL含1-2\105个细胞培养液，371 CO2培养至40% -60%汇合时(汇合过分，转染后不利 筛选细胞)。(2)转染液制备在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用 的量)A液用不含血清培养基DMEM稀释2 μ g DNA,终量100 μ L，B液用不含血清培养基 稀释2 μ L lipofection2000,终量100 μ L，轻轻混合A、B液，室温中置15-20分钟。(3)转 染把A/B复合物均勻加入培养液中，摇勻，37°C温箱置6-8小时，吸除培养基，换入新鲜培 养液继续培养。以下GFP荧光鉴定的均以GFP细胞为绿色作为阳性。细胞培养基组成DMEM(Gibco，C11995)+10%胎牛血清FBS (Biochrom，SOl 15)。MSTl (丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶-1) (mRNA :NM_021420 ；protein :ΝΡ_067395· 1。)。甲磺酸伊马替尼(STI571) (STI571由诺华公司惠赠，Novartis (Basel, Switzerland). Gonzalo I.Cancinol, Enrique Μ.Toledo2, Nancy R. Leal1, Diego E. Hernandez 1, L.Fernanda Yevenesl, Nibaldo C. Inestrosa2 and Alejandra R.Alvarezl (2008)STI571 prevents apoptosis, tau phosphorylation and behavioural impairments induced by Alzheimer's β -amyloid deposits Brainl31 (9) -.2425-2442, 公众可从中国科学院生物物理研究所获得。)实施例1、甲磺酸伊马替尼(STI571)抑制神经元凋亡1、STI571可抑制H2O2诱导的原代海马神经元的凋亡反应1) STI571可抑制H2O2诱导的原代海马神经元的凋亡反应以下培养大鼠海马神经元所用培养基的组成为DMEM(Gibco，Cl 1995)+10%胎牛血 清 FBS(Biochrom， SOl15)。实验分为两大组MSTl-原代培养大鼠海马神经元(孕鼠购自维通利华，海马神经元从孕鼠胚胎 上分离得到)，3 天后用 EGFP(pCMS-EGFP，Clontech, #6101-1)和 FLAG-VECTOR 表达质粒 (Sigma, E4401)转染。MSTl+ 原代培养大鼠海马神经元，3天后用EGFP和FLAG-MST1表达质粒(MariaK.Lehtinen. et. al,A conserved MST-FOXO signaling pathway mediates oxdative—stress responses and extends life span，cell，125，987-1001，2006 ；公众可从中国科学院生物 物理研究所获得。该质粒为将MSTl克隆到FLAG-VECTOR上。)转染；以上两大组在转染24小时后，分别获得转染后的MSTl-组细胞和转染后的MSTl+ 组细胞，进行如下处理将转染后的MSTl-组细胞分为三个小组Control (MST1-)将转染后的MSTl-组细胞继续培养；H2O2 (MST1-)将转染后的MSTl-组细胞的培养基中添加H2O2，使H2O2在培养基中的 浓度为80 μ M ；H202/STI571 (MST1-)将转染后的MSTl-组细胞的培养基中添加H2O2和STI571，使 H2O2在培养基中的浓度为80 μ Μ, STI571在培养基中的浓度为5 μ M ；将转染后的MSTl+组细胞分为三个小组Control (MST1+)将转染后的MSTl+组细胞继续培养，H2O2 (MST1+)将转染后的MSTl+组细胞的培养基中，添加H2O2.使H2O2在培养基中 的浓度为80 μ M ；H202/STI571 (MST1+)将转染后的MSTl+组细胞的培养基中，添加H2O2和STI571， 使H2O2在培养基中的浓度为80 μ Μ, STI571在培养基中的浓度为5 μ M ；以上六个小组各培养20小时后，分别用4%的多聚甲醛固定上述各组的细胞，根 据GFP荧光，分别统计细胞的凋亡比率，实验重复三次，结果取平均值Control (MST1-)为 18. 9 %, H2O2 (MST1-) % 45. 3 %, H202/STI571 (MST1-)为 29. 2% ；Control (MST1+) % 32.8 %, H2O2 (MST 1+) % 61. 1 %, H202/STI571 (MST1+)为 40. 2%。将上述结果作图分析，为图l(AN0VA，p < 0. 02,η = 3)，图中左边的一组柱状图为 MSTl-大组㈠，图中右边的一组柱状图为MSTl+大组⑴。从上述实验结果可以看出，两组柱形图中，无论是否MSTl过量表达，加入STI571 的组细胞凋亡率均降低，说明H2O2诱导的神经细胞凋亡可被STI571阻断。2) STI571可抑制c_Abl (非受体酪氨酸激酶)的激酶活性以下培养293T细胞所用培养基的组成为DMEM (Gibco，Cl 1995)+10 % FBS(Biochrom,SOl15)。实验分为两组STI571+ 将 Myc-c-Abl 表达质粒(Xuan Liu、Wei Huang、Chufang Li, Ping Li, Jing Yuan,Xiaorong Li,Xiao—Bo Qiu,Qingjun Ma and Cheng Cao,!interaction between c-Abl and arg tyrosine kinases and proteasome subunit PSMA7regulates proteasome degradation, Molecular Cell22, 317-327，2006，公众可从中国科学院生物物理研究所获 得。含有 c-Abl 的编码基因。)转染 293T 细胞(Bi, W. Xiao, L. Jia, Y. ffu, J. Xie, Q. Ren, J. Ji, G. Yuan, Ζ. (2010)c-Jun N-terminal kinase enhances MSTl-mediated pro-apoptotic signal ing through phosphorylation at serine 82. 285(9)6259-64 ；^ΑηΤ/ΛΦ
院生物物理研究所获得。)36小时后，向培养基中添加STI571，使STI571在培养基中的浓度为10 μ M，1小时后，收集细胞裂解液；STI571-:将Myc-c-Abl表达质粒转染293Τ细胞36小时后，继续培养，1小时后， 收集细胞裂解液；上述两组的细胞裂解液分别用Myc的抗体(Santa Cruza, Ll 108)做免疫共 沉淀，再进行 western blot,用 c_Ablp-Y412 的抗体(cell signal, 2865S)去检测 p-Y412c-Abl(磷酸化形式的c-Abl，细胞受H2O2氧化应激刺激后的磷酸化产物。)的量，用 c-Abl的抗体(Santa Cruza, Ll 108)检测c_Abl总蛋白的量。结果如图2所示，可以看出，STI571+组(+)中没有p-Y412c_Abl，说明STI571可 有效抑制c-Abl的激酶活性，c-Abl总蛋白的量在STI571+组(+)中比在STI571-(-)组高， 进一步说明了 STI571可有效抑制c-Abl的激酶活性。3) c-Abl介导了 H2O2激活MSTl引起的细胞凋亡-组原代培养海马神经元在体外培养第3天后，转染EGFP和FLAG-MST1；+组原代培养海马神经元在体外培养第3天后，转染EGFP、FLAG-MST1和 c-AblRNAil (c-Abl RNAil 为将序列为 GACCAACCTGTTCAGCGCT 的片段插入 pBase-U6_vector 的Xho I和BamH I识别位点间得到的载体；pBase-U6_vector记载在JASONR. ROSE, LILIA Μ· BABE,Defining the level of human immunodeficiency virus typel(HIV-I) protease activity required for HIV-Iparticle maturation and infectivity, JOURNAL OF VIROLOGY，p. 2751-3758，1995，公众可从中国科学院生物物理研究所获得。)；以上两组均在转染72小时后，得到转染后+组细胞和转染后_组细胞，进行如下 处理将转染后+组细胞分为两个小组control (+组)将转染后+组细胞继续培养；H2O2 (+组)将转染后+组细胞的培养基中添加H2O2，使H2O2在培养基中的浓度为 80μΜ ；将转染后-组细胞分为两个小组control (-组)将转染后-组细胞继续培养；H2O2 (-组)将转染后_组细胞的细胞培养基中添加H2O2，使H2O2在培养基中的浓 度为80μΜ;将以上四组均处理20小时后，固定细胞，统计GFP阳性细胞的凋亡比率，实验重复 三次，结果取平均值control (-组)细胞的凋亡比率为14.2%,H2O2 (-组)细胞的凋亡比率为41.6% ；control (+组)细胞的凋亡比率为19%，H2O2 (+组)细胞的凋亡比率为22. 7% ；将结果作图，结果如图3所示，图中左边的一组柱状图为_组，图中右边的一组柱 状图为+组，可以看出与-组相比，c-Abl基因敲除的细胞(+组)在H2O2处理后细胞凋亡 率显著降低，说明c-Abl介导了 H2O2激活MSTl引起的细胞凋亡(AN0VA,p < 0. 02,η = 3)。2、c-Abl在体外和体内均可磷酸化MSTl1) c-Abl的RNAi质粒能敲除内源的c_Abl
以下培养Neuro_2A细胞所用培养基的组成为DMEM (Gibco，Cl 1995) +10 % FBS(Biochrom, SOl15)实验分三组Vector :Neuro_2A (购自 ATCC，Cat. N0. CCL-B1)细胞转染 pBase-U6_vector 质粒；RNAil :Neuro-2A 细胞转染 c-Abl RNAil ；RNAi2 :Neuro-2A 细胞转染 c_Abl RNAi2 (c-Abl RNAi2 为将序列为 AAGCAGCTCGATGGACCTCCA 的片段插入 pBase-U6_vector 的 Xho I 和 BamHI 识别位点间得到 的载体)；以上三组转染72小时后，收集细胞溶液，再分别用抗体c-AbKSanta cruza, L1108)、MSTl (cell signal, #3682)、F0X03(cell signal, #2497)、Action (sigma，A5441)， 通过western blot检测c_Abl蛋白量、MSTl蛋白量、F0X03蛋白量、ACTIN蛋白量。结果如图4所示，可以看出，相比于Vector组来说，经过c_Abl沉默的RNAil组和 RNAi2组中的c-Abl的表达量减少，MSTl的表达量与c_Abl的表达量成正比，其他蛋白无明 显变化，证明2个c-Abl的RNAi质粒都能很好的敲除内源的c-Abl，使内源性MSTl表达量 降低。2) c-Abl可在体外磷酸化MSTl实验分为两组-组293T细胞转染 pCMV_myc(Clontech，#631604)；+组293T细胞转染Myc-c-Abl表达质粒；以上两组转染36小时后，收集细胞裂解液，分别用Myc的抗体(Santa Sruza, L1108)做免疫共沉淀，再用 GST-MSTl (Bi W, Xiao L，Jia Y，Wu J，Xie Q，Ren J，Ji G， Yuan Ζ.c-Jun N—terminal kinase enhances MSTl—mediated pro—apoptotic signaling through phosphorylation at serine 82. J Biol Chem. 20IOFeb 26 ；285 (9) :6259_64·公 众可从中国科学院生物物理研究所获得。)为底物做激酶实验。结果如图5所示，可以看出，在-组和+组中均有MSTl，在+组中过表达c-Abl的 情况下，+组中有p-Y-MSTl (磷酸化的MST1)，-组没有表达c-Abl，也就没有产生p_Y_MSTl， 表明c-Abl可在体外磷酸化MSTl。3) C-Ab可在细胞内磷酸化MSTl实验分为三组-组在293T 细胞单转 FLAG-MST1 ；WT 组在 293T 细胞共转 FLAG-MST1 和 Myc-c-Abl ；KD 组在 293T 细胞共转 FLAG-MST1 和 Myc-c-Abl KD ((Xuan Liu、Wei Huang、 Chufang Li, Ping Li, Jing Yuan, Xiaorong Li, Xiao-Bo Qiu, Qingjun Ma and Cheng Cao, !interaction between c~Abl and arg tyrosine kinases and proteasome subunit PSMA7regulates proteasome degradat ion,Molecular Cel 122,317-327, 2006,公众可从 中国科学院生物物理研究所获得。)；上述三组转染36小时后，收集细胞裂解液，细胞裂解液分别用FLAG的抗体(购自 Sigma，Cat. No. F3165。)做免疫共沉淀后，通过western blot，以酪氨酸磷酸化特异性抗体 (cell signal, 2865S)去检测。
结果如图6所示，可以看出，C-Abl可在细胞内磷酸化MSTl得到P-Y-MSTl ；而失活 的c-Abl (KD组)不能使MSTl磷酸化，无p-Y-MSTl，同时c_Abl (WT组)可以是MSTl总蛋白 含量提高，c-Abl (KD组)使MSTl总蛋白含量降低。3、c-Abl可在酪氨酸433位点磷酸化MSTl1) c-Abl在酪氨酸433位点磷酸化MSTl实验分三组FLAG-MST1-组在 293T 细胞单转 Myc-c-Abl ；FLAG-MSTlffT 组在 293T 细胞共转 FLAG-MST1 表达质粒和 Myc-c-Abl ；FLAG-MST1Y433F 组在 293T 细胞共转 FLAG-MST1Y433F (将 FLAG-MST1 上的 MSTl 的第433位的酪氨酸变成苯丙氨酸。)和Myc-c-Abl ；以上三组转染36小时后，收集细胞裂解液，细胞裂解液均用FLAG的抗体做免疫共 沉淀后，通过western blot，以p_Y433_MSTl抗体(将抗原多肽免疫兔，收集兔血清，纯化得 到多克隆抗体P-Y433-MST1，所述抗原的序列为N ‘CKIPQDOTY-pEFLKSW)去检测。结果如图7所示，c-Abl总蛋白在三组中均有表达，MSTl蛋白在FLAG-MST1WT组 和FLAG-MST1Y433F组中有表达，c-Abl和p-Y-MSTl只在FLAG-MST1WT组中有，其他两组都 没有，说明c-Abl在酪氨酸433位点磷酸化MST1，而在FLAG-MST1Y433F组，c-Abl不能使 Y433F磷酸化。2)抗体能特异性识别MSTl酪氨酸433位点磷酸化实验分为4组Myc-c-Abl-/FLAG-MST1 WT 组293T 细胞单转 FLAG-MST1 表达质粒；Myc-c-Abl KD/FLAG-MST1 WT 组293Τ 细胞共转 Myc-c-Abl KD 禾Π FLAG-MST1 表达 质粒；Myc-c-Abl WT/FLAG-MST1 WT 组在 293Τ 细胞共转 Myc-c-Abl 和 FLAG-MST1 表达 质粒；Myc-c-Abl WT/FLAG-MST1 Y433F 组在 293T 细胞共转 Myc-c-Abl 和 FLAG-MST1Y433F ；以上四组共转染36小时后，收集细胞裂解液，细胞裂解液用FlAG为抗体，进行免 疫共沉淀，再用酪氨酸433位点磷酸化特异性抗体(P-Y433-MST1)去检测激酶活性。结果如图8所示，四组均有特征蛋白ERK1/2的表达，只有Myc-c-Abl WT/ FLAG-MSTlffT组使MSTl在酪氨酸433位点磷酸化。4、c-Abl可正向调节MSTl蛋白水平，并依赖于c_Abl的激酶活性Dc-Abl正向调节MSTl的蛋白水平实验分为12组c-Abl-WT(O)/MSTl-WT 组293T 细胞共转 Oyg Myc-c-Abl 表达质粒(c-Abl-WT) 禾口 1 μ gFLAG-MSTl 表达质粒(MST1-WT)；c-Abl-WT (1) /MSTl-WT 组在 293T 细胞共转 0. 2yg Myc-c-Abl 表达质粒和 1 μ gFLAG-MSTl 表达质粒；c-Abl-WT (2) /MSTl-WT 组在 293T 细胞共转 0. 8yg Myc-c-Abl 表达质粒和 1 μ gFLAG-MSTl 表达质粒；
c-Abl-WT (3) /MSTl-WT 组在 293T 细胞共转 1.6yg Myc-c-Abl 表达质粒和 1 μ gFLAG-MSTl 表达质粒；MST 1-WT/c-AbI-KD(0)组在 293T 细胞共转 Oyg FLAG-MST1 (c-Abl-ffT)和 1 μ g
c-Abl-KD ；MST 1-WT/c-Ab I-KD(I) c-Abl-KD ；MST 1-WT/c-Ab I-KD (2) c-Abl-KD ；MST 1-WT/c-Ab I-KD (3) c-Abl-KD ；
组在293T细胞共转 组在293T细胞共转 组在293T细胞共转
0. 2μ g FLAG-MST1 禾口 1 μ g
0.8μ g FLAG-MST1 禾口 1 μ g
1.6μ g FLAG-MST1 禾口 1 μ g Myc-c-Abl(c-Abl-ffT)和 转 0. 2μ gMyc-c-Abl 和 转 0.8 μ gMyc-c-Abl 和c-Abl-WT (0) /MST1-Y433F 组在 293T 细胞共转 Oyg 1 μ g FLAG-MST1Y433F(MST1-Y433F)；c-Abl-WT (1)/MST1-Y433F 组在 293T 细胞共 1 μ gFLAG-MSTl Y433F ；c-Abl-WT (2)/MST1-Y433F 组在 293T 细胞共 1 μ gFLAG-MSTlY433F ；c-Abl-WT (3)/MST1-Y433F 组在 293T 细胞共转 1.6 μ gMyc-c-Abl 和 1 μ gFLAG-MST 1Y433F ；以上12组共转染4小时后，收集细胞裂解液，通过western blot以FLAG抗体检 测MSTl的蛋白水平。结果如图9A和9B所示，说明无论是否有激酶活性的c_Abl均可正向调节MSTl的 蛋白水平，并且无论是否为433F突变的MSTl均正向依赖于c-Abl的激酶活性。2) C-Abl激活MSTl的激酶活性实验分为两组Myc-c-Abl-/FLAG-MST1 组293T 细胞单转 FLAG-MST1 ；Myc-c-Abl+/FLAG-MST1 组293Τ 细胞共转 FLAG-MST1 和 Myc-c-Abl ；上述两组转染36小时后，收集细胞裂解液，细胞裂解液用FLAG的抗体做免疫共沉 淀后用Histon H2B(abeam, abl3212)为底物做激酶实验。结果如图10所示，MSTl和ER5V2在两组中均有表达，Myc-c-Abl+/FLAG-MST1组 有 32P-H2B (c-Abl 激活 MSTl 的活性，MSTl 使 Histon H2B 产生 32P-H2B)的表达；表明 c-Abl 可激活MSTl的激酶活性。5、STI571可抑制H2O2诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化以下培养SH-SY5Y细胞所用培养基的组成为DMEM (Gibco，Cl 1995)+10 % FBS(Biochrom,SOl15)。1) STI571可抑制H2O2诱导的MSTl表达实验分为四组H2O2-禾Π STI571-组培养 SH-SY5Y 细胞(Fernanda Martins Lopesa, b, Fabio Klamta, b (2010)Comparison between proliferative and neuron-like SH-SY5Y cells as an in vitro model for Parkinson disease studies. Brain Research 1337 85—94 公众可从中国科学院生物物理研究所获得。)；H2O2+和STI571-组培养SH-SY5Y细胞，向细胞培养基中加入H2O2，使H2O2在细胞 培养基中的浓度为200μΜ;H2O2-和STI571+组培养SH-SY5Y细胞，向细胞培养基中加入STI571，使STI571 在细胞培养基中的浓度为10 μ M ；H2O2+和STI571+组培养SH-SY5Y细胞，向细胞培养基中加入H2O2和STI571，使 H2O2和STI571分别在细胞培养基中的浓度为200 μ M和10 μ Μ，以上四组分别处理1小时后，收集细胞裂解液，再分别以P-Y433-MST1抗体做免疫 共沉淀后，通过western blot,以MSTl抗体检测。结果如图11所示，H2O2+和STI571-组有酪氨酸433位点磷酸化MST1，H2O2+和 STI571+组没有酪氨酸433位点磷酸化MST1，说明STI571可以抑制H2O2诱导的MSTl酪氨 酸433位点磷酸化。2) H2O2可诱导MSTl酪氨酸433位点磷酸化引起的细胞凋亡实验分为三组Vector组原代海马神经元体外培养3天后，共转染EGFP和FLAG-VECTOR ；MSTl-WT组原代海马神经元体外培养3天后，共转染EGFP和FLAG-MST1 ；MST1-Y433F组原代海马神经元体外培养3天后，共转染EGFP和 FLAG-MST1Y433F ；以上三组转染24小时，得到转染后的Vector组细胞、转染后的MSTl-WT组细胞和 转染后的MST1-Y433F组细胞，将上述三组细胞分为6个小组进行如下处理Vector(H2O2)组转染后的Vector组细胞的培养基中添加H2O2，使H2O2在细胞培 养基中的浓度为80μΜ;MSTl-WT(H2O2)组转染后的MST1-WT组细胞的培养基中添加H2O2，使H2O2在细胞 培养基中的浓度为80μΜ;MST1-Y433F(H2O2)组转染后的MST1-Y433F组细胞的培养基中添加H2O2，使H2O2在 细胞培养基中的浓度为80 μ M ；Vector (control)组转染后的Vector组细胞继续培养；MSTl-WT (control)组转染后的MST1-WT组细胞继续培养；MST1-Y433F(control)组转染后的 MST1-Y433F 组细胞继续培养；以上6个小组处理20小时后，分别固定细胞，分别统计GFP阳性细胞的凋亡比率。实验重复三次，结果取平均值。Vector(H2O2)组GFP阳性细胞的凋亡比率为45. 3%，MSTl-WT (H2O2)组GFP阳性细胞的凋亡比率为61. ；MST1-Y433F(H2O2)组GFP阳性细胞的凋亡比率为35. 9% ；Vector (control)组GFP阳性细胞的凋亡比率为18. 9%，MSTl-WT(control)组GFP阳性细胞的凋亡比率为32. 8% ；MST1-Y433F(control)组 GFP 阳性细胞的凋亡比率为 31. 9% ；将结果作图分析，结果如图12所示(AN0VA, ρ < 0. 02, η = 3)，可以看出，H2O2可 激活MSTl野生型磷酸化进而诱导细胞凋亡，而不能激活MSTl Y433F突变型诱导神经细胞凋亡。6、STI571可抑制鱼藤酮和H2O2诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化，从而抑制细 胞凋亡鱼藤酮(Rotenone)化学名称为:[2R_(2aa,6a α，12a a )-1，2，12a_ 四氢-8， 9-二甲氧基-2-(l-甲基乙烯基)[1]苯并吡喃[3，4-b]糠酰[2，3-h][l]苯并吡 喃-6 (6aH)-酮，分子式为C23H22O6,购自sigma，产品目录号R8875。以下培养C0S7细胞所用培养基的组成为DMEM (Gibco，Cl 1995)+10 % FBS(Biochrom,SOl15)。1) STI571可抑制鱼藤酮和H2O2诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化实验分为5个组Rotenone-/STI571-组(不加入鱼藤酮和 STI571 组)培养 C0S7 细胞(Bi， W.Xiao, L. Jia, Y. Wu, J. Xie, Q. Ren, J. Ji, G. Yuan, Z. (2010)c-Jun N-terminal kinase enhances MSTl-mediated pro-apoptotic signal ing through phosphorylation at serine 82. 285(9)6259-64 ；公众可从中国科学院生物物理研究所获得)。Rotenone+/STI571-/3h组(单独加入鱼藤酮组处理3小时)培养C0S7细胞，向 培养基中加入鱼藤酮，使鱼藤酮在培养基中的浓度为25 μ M ；处理3小时；Rotenone+/STI571-/16h组(单独加入鱼藤酮组处理16小时)培养C0S7细胞， 向培养基加入鱼藤酮，使鱼藤酮在培养基中的浓度为25 μ M ；处理16小时；Rotenone+/STI571+/3h组(加入鱼藤酮和STI571组1)培养C0S7细胞，向培养 基中加入鱼藤酮和STI571，使鱼藤酮合STI571在培养基中的浓度分别为25 μ M和10 μ M ； 处理3小时；Rotenone+/STI571+/16h组(加入鱼藤酮和STI571组2)培养C0S7细胞，向培养 基中加入鱼藤酮和STI571，使鱼藤酮合STI571在培养基中的浓度分别为25 μ M和10 μ M ； 处理16小时；分别收集上述经过处理的5组细胞裂解液，通过western blot分别以P-Y433MST1 抗体，MSTl 抗体，c-Abl 抗体、cleavage caspase3 抗体(cell signal, #9664)、ERK1/2 抗 体(cell signal, #9102)进行检测。结果如图13所示，p-Y433MSTl、MSTl、c-Abl, ERK1/2在5组中均有表达，而 cleavage caspase3 (MST1酪氨酸433位点磷酸化水平提高，可以引起cleavagecaspase3 的增加。)仅在 Rotenone+/STI571+/16h 组、Rotenone+/STI571_/16h 组和 Rotenone+/ STI571-/3h 组中有表达。而加入 Rotenone+/STI571+/16h 组比 Rotenone+/STI571_/16h 组 中的MSTl酪氨酸433位点磷酸化产物(P-Y433MST1)的量少，说明STI571可抑制Rotenone 诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化，进而抑制Rotenone诱导的细胞凋亡。2) H2O2可在胞浆中激活MSTl酪氨酸433位点磷酸化实验分为4组空白对照组(control)培养原代培养海马神经元；单独加入STI571组(STI571)培养原代培养海马神经元，向培养基中加入 STI571, STI571在细胞培养基中的浓度为10 μ M ；单独加入H2O2组(H2O2):培养原代培养海马神经元，向培养基中加入H2O2，H2O2在细胞培养基中的浓度为400 μ M ；加入STI571和H2O2组(H202STI571)培养原代培养海马神经元细胞，向培养基中 分别加入STI571和H2O2，使STI571和H2O2在细胞培养基中的浓度分别为10 μ M和400 μ M ；以上4组均处理1小时后，采用免疫荧光检测方法，将各组细胞用4%多聚甲醛固 定十分钟，PBS漂洗3minX3，0. 2% Triton打孔10min，PBS漂洗3minX 3，羊血清室温封闭 1小时，加入一抗(P-Y433-MST1抗体)，4度过夜，PBS漂洗3minX3，加入荧光二抗(ALexa Fluor 488，购自 Invitrogen A11008。)37 度一小时，PBS 漂洗 3minX 3，Hoechest 染核 3min, PBS漂洗3minX 3，凉干封片，拍照。用p-Y433MSTl抗体检测神经元内源性MSTl酪氨酸433位点磷酸化。结果见图14 所示表明，H2O2可在胞浆中激活MSTl酪氨酸433位点磷酸化，而STI571可抑制该磷酸化。因此，STI571通过抑制鱼藤酮和H2O2诱导的c_Abl激酶活性，抑制c_Abl对MSTl 的体内外磷酸化，抑制c-Abl对MSTl酪氨酸433位点磷酸化等途径而抑制鱼藤酮和H2O2诱 导的神经细胞凋亡反应。该发现首次阐明STI571抗神经细胞氧化应激反应及其分子机制， 为STI571未来作为抗脑缺血及神经退行性疾病的候选新药奠定了理论和实验基础，具有 良好的发展前景。
权利要求
甲磺酸伊马替尼在制备抑制神经元凋亡的产品中的应用。
2.甲磺酸伊马替尼在制备治疗神经退行性疾病和/或脑缺血疾病的产品中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述抑制神经元凋亡是通过抑制丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶-1的磷酸化实现的。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1的 磷酸化是通过抑制非受体酪氨酸激酶的激酶活性实现的。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述神经元凋亡为过氧化氢和/或鱼藤酮引起的神经元凋亡。
6.根据权利要求3-5中任一所述的应用，其特征在于所述神经元为海马神经元。
7.根据权利要求2-5中任一所述的应用，其特征在于所述产品为药物。
8.根据权利要求3-6中任一所述的应用，其特征在于所述抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白 激酶-1的磷酸化为抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1的第433位点的酪氨酸磷酸化。
全文摘要
本发明公开了一种甲磺酸伊马替尼的新用途。本发明提供了甲磺酸伊马替尼在制备抑制神经元凋亡的产品中的应用，还提供了甲磺酸伊马替尼在制备治疗神经退行性疾病的产品中的应用。所述神经元为海马神经元。本发明的实验证明，STI571作为c-Abl特异性抑制剂，可以作为抗脑缺血及抗神经退行性疾病的候选新药，具有良好的应用前景，将极大程度拓展STI571的临床适应症。
文档编号A61K31/506GK101947221SQ20101029451
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者肖磊, 胡鹏, 袁增强, 陈冬梅 申请人:中国科学院生物物理研究所
技术领域：
本发明涉及一种甲磺酸伊马替尼的新用途。
背景技术：
STI571又名Glivec，商品名为“甲磺酸伊马替尼”。目前国外主要用于慢性骨髓性 白血病的治疗，STI571能明显抑制白血病细胞增殖，细胞阻滞于G0/G1期，且具有明显的诱 导凋亡作用。甲磺酸伊马替尼的化学名称为4-(4_甲基-1-哌嗪)甲基4-4-甲基-3-4-(3-吡 啶)-2_嘧啶氨基苯基-苯胺甲磺酸盐。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种甲磺酸伊马替尼的新用途。本发明提供了甲磺酸伊马替尼在制备抑制神经元凋亡的产品中的应用。本发明的另一个目的是提供一种甲磺酸伊马替尼在制备治疗神经退行性疾病和/ 或脑缺血疾病的产品中的应用。所述抑制神经元凋亡是通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶_1(MST1，serine/ threonine-protein kinase)的憐酸化实现的。所述抑制MSTl的磷酸化是通过抑制非受体酪氨酸激酶(C-Abl)的激酶活性实现 的。所述神经元凋亡为过氧化氢和/或鱼藤酮引起的神经元凋亡。所述神经元为海马神经元，优选为鼠海马神经元，尤其优选为大鼠海马神经元。所述产品为药物。所述MSTl的磷酸化为MST1433位点酪氨酸磷酸化。甲磺酸伊马替尼(STI571)的化学名称为4-(4_甲基哌嗪)甲基_N_4_甲 基-3-4-(3-吡啶)-2_嘧啶氨基苯基-苯胺甲磺酸盐，分子式为C29H31N7O · CH4S03。本发明的实验证明，STI571作为c-Abl (非受体酪氨酸激酶)特异性抑制剂，还可 有效对抗神经细胞的氧化应激反应，抑制c-Abl的激酶活性，从而抑制神经细胞凋亡反应， 因而，可能作为抗脑缺血及抗神经退行性疾病的候选新药，具有良好的应用前景，将极大程 度拓展STI571的临床适应症。
图1为STI571抑制H2O2诱导的原代海马神经元的凋亡反应图2为STI571抑制c_Abl的激酶活性图3为c-Abl介导了 H2O2激活MSTl引起的细胞凋亡图4为c-Abl的RNAi质粒都能很好的敲除内源的c_Abl图5为c-Abl在体外磷酸化MSTl
图6为C-Ab在细胞内磷酸化MSTl图7为c-Abl在酪氨酸433位点磷酸化MSTl图8为抗体能特异性识别MSTl酪氨酸433位点磷酸化图9为c-Abl正向调节MSTl的蛋白水平图10为c-Abl激活MSTl的激酶活性图11为STI571可抑制H2O2诱导的MSTl表达图12为STI571可抑制H2O2诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化图13为STI571可抑制鱼藤酮和H2O2诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化图14为H2O2可在胞浆中激活MSTl酪氨酸433位点磷酸化
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例的细胞转染的方法均为(1)细胞培养取6孔培养板，向每孔中加入 2mL含1-2\105个细胞培养液，371 CO2培养至40% -60%汇合时(汇合过分，转染后不利 筛选细胞)。(2)转染液制备在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用 的量)A液用不含血清培养基DMEM稀释2 μ g DNA,终量100 μ L，B液用不含血清培养基 稀释2 μ L lipofection2000,终量100 μ L，轻轻混合A、B液，室温中置15-20分钟。(3)转 染把A/B复合物均勻加入培养液中，摇勻，37°C温箱置6-8小时，吸除培养基，换入新鲜培 养液继续培养。以下GFP荧光鉴定的均以GFP细胞为绿色作为阳性。细胞培养基组成DMEM(Gibco，C11995)+10%胎牛血清FBS (Biochrom，SOl 15)。MSTl (丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶-1) (mRNA :NM_021420 ；protein :ΝΡ_067395· 1。)。甲磺酸伊马替尼(STI571) (STI571由诺华公司惠赠，Novartis (Basel, Switzerland). Gonzalo I.Cancinol, Enrique Μ.Toledo2, Nancy R. Leal1, Diego E. Hernandez 1, L.Fernanda Yevenesl, Nibaldo C. Inestrosa2 and Alejandra R.Alvarezl (2008)STI571 prevents apoptosis, tau phosphorylation and behavioural impairments induced by Alzheimer's β -amyloid deposits Brainl31 (9) -.2425-2442, 公众可从中国科学院生物物理研究所获得。)实施例1、甲磺酸伊马替尼(STI571)抑制神经元凋亡1、STI571可抑制H2O2诱导的原代海马神经元的凋亡反应1) STI571可抑制H2O2诱导的原代海马神经元的凋亡反应以下培养大鼠海马神经元所用培养基的组成为DMEM(Gibco，Cl 1995)+10%胎牛血 清 FBS(Biochrom， SOl15)。实验分为两大组MSTl-原代培养大鼠海马神经元(孕鼠购自维通利华，海马神经元从孕鼠胚胎 上分离得到)，3 天后用 EGFP(pCMS-EGFP，Clontech, #6101-1)和 FLAG-VECTOR 表达质粒 (Sigma, E4401)转染。MSTl+ 原代培养大鼠海马神经元，3天后用EGFP和FLAG-MST1表达质粒(MariaK.Lehtinen. et. al,A conserved MST-FOXO signaling pathway mediates oxdative—stress responses and extends life span，cell，125，987-1001，2006 ；公众可从中国科学院生物 物理研究所获得。该质粒为将MSTl克隆到FLAG-VECTOR上。)转染；以上两大组在转染24小时后，分别获得转染后的MSTl-组细胞和转染后的MSTl+ 组细胞，进行如下处理将转染后的MSTl-组细胞分为三个小组Control (MST1-)将转染后的MSTl-组细胞继续培养；H2O2 (MST1-)将转染后的MSTl-组细胞的培养基中添加H2O2，使H2O2在培养基中的 浓度为80 μ M ；H202/STI571 (MST1-)将转染后的MSTl-组细胞的培养基中添加H2O2和STI571，使 H2O2在培养基中的浓度为80 μ Μ, STI571在培养基中的浓度为5 μ M ；将转染后的MSTl+组细胞分为三个小组Control (MST1+)将转染后的MSTl+组细胞继续培养，H2O2 (MST1+)将转染后的MSTl+组细胞的培养基中，添加H2O2.使H2O2在培养基中 的浓度为80 μ M ；H202/STI571 (MST1+)将转染后的MSTl+组细胞的培养基中，添加H2O2和STI571， 使H2O2在培养基中的浓度为80 μ Μ, STI571在培养基中的浓度为5 μ M ；以上六个小组各培养20小时后，分别用4%的多聚甲醛固定上述各组的细胞，根 据GFP荧光，分别统计细胞的凋亡比率，实验重复三次，结果取平均值Control (MST1-)为 18. 9 %, H2O2 (MST1-) % 45. 3 %, H202/STI571 (MST1-)为 29. 2% ；Control (MST1+) % 32.8 %, H2O2 (MST 1+) % 61. 1 %, H202/STI571 (MST1+)为 40. 2%。将上述结果作图分析，为图l(AN0VA，p < 0. 02,η = 3)，图中左边的一组柱状图为 MSTl-大组㈠，图中右边的一组柱状图为MSTl+大组⑴。从上述实验结果可以看出，两组柱形图中，无论是否MSTl过量表达，加入STI571 的组细胞凋亡率均降低，说明H2O2诱导的神经细胞凋亡可被STI571阻断。2) STI571可抑制c_Abl (非受体酪氨酸激酶)的激酶活性以下培养293T细胞所用培养基的组成为DMEM (Gibco，Cl 1995)+10 % FBS(Biochrom,SOl15)。实验分为两组STI571+ 将 Myc-c-Abl 表达质粒(Xuan Liu、Wei Huang、Chufang Li, Ping Li, Jing Yuan,Xiaorong Li,Xiao—Bo Qiu,Qingjun Ma and Cheng Cao,!interaction between c-Abl and arg tyrosine kinases and proteasome subunit PSMA7regulates proteasome degradation, Molecular Cell22, 317-327，2006，公众可从中国科学院生物物理研究所获 得。含有 c-Abl 的编码基因。)转染 293T 细胞(Bi, W. Xiao, L. Jia, Y. ffu, J. Xie, Q. Ren, J. Ji, G. Yuan, Ζ. (2010)c-Jun N-terminal kinase enhances MSTl-mediated pro-apoptotic signal ing through phosphorylation at serine 82. 285(9)6259-64 ；^ΑηΤ/ΛΦ
院生物物理研究所获得。)36小时后，向培养基中添加STI571，使STI571在培养基中的浓度为10 μ M，1小时后，收集细胞裂解液；STI571-:将Myc-c-Abl表达质粒转染293Τ细胞36小时后，继续培养，1小时后， 收集细胞裂解液；上述两组的细胞裂解液分别用Myc的抗体(Santa Cruza, Ll 108)做免疫共 沉淀，再进行 western blot,用 c_Ablp-Y412 的抗体(cell signal, 2865S)去检测 p-Y412c-Abl(磷酸化形式的c-Abl，细胞受H2O2氧化应激刺激后的磷酸化产物。)的量，用 c-Abl的抗体(Santa Cruza, Ll 108)检测c_Abl总蛋白的量。结果如图2所示，可以看出，STI571+组(+)中没有p-Y412c_Abl，说明STI571可 有效抑制c-Abl的激酶活性，c-Abl总蛋白的量在STI571+组(+)中比在STI571-(-)组高， 进一步说明了 STI571可有效抑制c-Abl的激酶活性。3) c-Abl介导了 H2O2激活MSTl引起的细胞凋亡-组原代培养海马神经元在体外培养第3天后，转染EGFP和FLAG-MST1；+组原代培养海马神经元在体外培养第3天后，转染EGFP、FLAG-MST1和 c-AblRNAil (c-Abl RNAil 为将序列为 GACCAACCTGTTCAGCGCT 的片段插入 pBase-U6_vector 的Xho I和BamH I识别位点间得到的载体；pBase-U6_vector记载在JASONR. ROSE, LILIA Μ· BABE,Defining the level of human immunodeficiency virus typel(HIV-I) protease activity required for HIV-Iparticle maturation and infectivity, JOURNAL OF VIROLOGY，p. 2751-3758，1995，公众可从中国科学院生物物理研究所获得。)；以上两组均在转染72小时后，得到转染后+组细胞和转染后_组细胞，进行如下 处理将转染后+组细胞分为两个小组control (+组)将转染后+组细胞继续培养；H2O2 (+组)将转染后+组细胞的培养基中添加H2O2，使H2O2在培养基中的浓度为 80μΜ ；将转染后-组细胞分为两个小组control (-组)将转染后-组细胞继续培养；H2O2 (-组)将转染后_组细胞的细胞培养基中添加H2O2，使H2O2在培养基中的浓 度为80μΜ;将以上四组均处理20小时后，固定细胞，统计GFP阳性细胞的凋亡比率，实验重复 三次，结果取平均值control (-组)细胞的凋亡比率为14.2%,H2O2 (-组)细胞的凋亡比率为41.6% ；control (+组)细胞的凋亡比率为19%，H2O2 (+组)细胞的凋亡比率为22. 7% ；将结果作图，结果如图3所示，图中左边的一组柱状图为_组，图中右边的一组柱 状图为+组，可以看出与-组相比，c-Abl基因敲除的细胞(+组)在H2O2处理后细胞凋亡 率显著降低，说明c-Abl介导了 H2O2激活MSTl引起的细胞凋亡(AN0VA,p < 0. 02,η = 3)。2、c-Abl在体外和体内均可磷酸化MSTl1) c-Abl的RNAi质粒能敲除内源的c_Abl
以下培养Neuro_2A细胞所用培养基的组成为DMEM (Gibco，Cl 1995) +10 % FBS(Biochrom, SOl15)实验分三组Vector :Neuro_2A (购自 ATCC，Cat. N0. CCL-B1)细胞转染 pBase-U6_vector 质粒；RNAil :Neuro-2A 细胞转染 c-Abl RNAil ；RNAi2 :Neuro-2A 细胞转染 c_Abl RNAi2 (c-Abl RNAi2 为将序列为 AAGCAGCTCGATGGACCTCCA 的片段插入 pBase-U6_vector 的 Xho I 和 BamHI 识别位点间得到 的载体)；以上三组转染72小时后，收集细胞溶液，再分别用抗体c-AbKSanta cruza, L1108)、MSTl (cell signal, #3682)、F0X03(cell signal, #2497)、Action (sigma，A5441)， 通过western blot检测c_Abl蛋白量、MSTl蛋白量、F0X03蛋白量、ACTIN蛋白量。结果如图4所示，可以看出，相比于Vector组来说，经过c_Abl沉默的RNAil组和 RNAi2组中的c-Abl的表达量减少，MSTl的表达量与c_Abl的表达量成正比，其他蛋白无明 显变化，证明2个c-Abl的RNAi质粒都能很好的敲除内源的c-Abl，使内源性MSTl表达量 降低。2) c-Abl可在体外磷酸化MSTl实验分为两组-组293T细胞转染 pCMV_myc(Clontech，#631604)；+组293T细胞转染Myc-c-Abl表达质粒；以上两组转染36小时后，收集细胞裂解液，分别用Myc的抗体(Santa Sruza, L1108)做免疫共沉淀，再用 GST-MSTl (Bi W, Xiao L，Jia Y，Wu J，Xie Q，Ren J，Ji G， Yuan Ζ.c-Jun N—terminal kinase enhances MSTl—mediated pro—apoptotic signaling through phosphorylation at serine 82. J Biol Chem. 20IOFeb 26 ；285 (9) :6259_64·公 众可从中国科学院生物物理研究所获得。)为底物做激酶实验。结果如图5所示，可以看出，在-组和+组中均有MSTl，在+组中过表达c-Abl的 情况下，+组中有p-Y-MSTl (磷酸化的MST1)，-组没有表达c-Abl，也就没有产生p_Y_MSTl， 表明c-Abl可在体外磷酸化MSTl。3) C-Ab可在细胞内磷酸化MSTl实验分为三组-组在293T 细胞单转 FLAG-MST1 ；WT 组在 293T 细胞共转 FLAG-MST1 和 Myc-c-Abl ；KD 组在 293T 细胞共转 FLAG-MST1 和 Myc-c-Abl KD ((Xuan Liu、Wei Huang、 Chufang Li, Ping Li, Jing Yuan, Xiaorong Li, Xiao-Bo Qiu, Qingjun Ma and Cheng Cao, !interaction between c~Abl and arg tyrosine kinases and proteasome subunit PSMA7regulates proteasome degradat ion,Molecular Cel 122,317-327, 2006,公众可从 中国科学院生物物理研究所获得。)；上述三组转染36小时后，收集细胞裂解液，细胞裂解液分别用FLAG的抗体(购自 Sigma，Cat. No. F3165。)做免疫共沉淀后，通过western blot，以酪氨酸磷酸化特异性抗体 (cell signal, 2865S)去检测。
结果如图6所示，可以看出，C-Abl可在细胞内磷酸化MSTl得到P-Y-MSTl ；而失活 的c-Abl (KD组)不能使MSTl磷酸化，无p-Y-MSTl，同时c_Abl (WT组)可以是MSTl总蛋白 含量提高，c-Abl (KD组)使MSTl总蛋白含量降低。3、c-Abl可在酪氨酸433位点磷酸化MSTl1) c-Abl在酪氨酸433位点磷酸化MSTl实验分三组FLAG-MST1-组在 293T 细胞单转 Myc-c-Abl ；FLAG-MSTlffT 组在 293T 细胞共转 FLAG-MST1 表达质粒和 Myc-c-Abl ；FLAG-MST1Y433F 组在 293T 细胞共转 FLAG-MST1Y433F (将 FLAG-MST1 上的 MSTl 的第433位的酪氨酸变成苯丙氨酸。)和Myc-c-Abl ；以上三组转染36小时后，收集细胞裂解液，细胞裂解液均用FLAG的抗体做免疫共 沉淀后，通过western blot，以p_Y433_MSTl抗体(将抗原多肽免疫兔，收集兔血清，纯化得 到多克隆抗体P-Y433-MST1，所述抗原的序列为N ‘CKIPQDOTY-pEFLKSW)去检测。结果如图7所示，c-Abl总蛋白在三组中均有表达，MSTl蛋白在FLAG-MST1WT组 和FLAG-MST1Y433F组中有表达，c-Abl和p-Y-MSTl只在FLAG-MST1WT组中有，其他两组都 没有，说明c-Abl在酪氨酸433位点磷酸化MST1，而在FLAG-MST1Y433F组，c-Abl不能使 Y433F磷酸化。2)抗体能特异性识别MSTl酪氨酸433位点磷酸化实验分为4组Myc-c-Abl-/FLAG-MST1 WT 组293T 细胞单转 FLAG-MST1 表达质粒；Myc-c-Abl KD/FLAG-MST1 WT 组293Τ 细胞共转 Myc-c-Abl KD 禾Π FLAG-MST1 表达 质粒；Myc-c-Abl WT/FLAG-MST1 WT 组在 293Τ 细胞共转 Myc-c-Abl 和 FLAG-MST1 表达 质粒；Myc-c-Abl WT/FLAG-MST1 Y433F 组在 293T 细胞共转 Myc-c-Abl 和 FLAG-MST1Y433F ；以上四组共转染36小时后，收集细胞裂解液，细胞裂解液用FlAG为抗体，进行免 疫共沉淀，再用酪氨酸433位点磷酸化特异性抗体(P-Y433-MST1)去检测激酶活性。结果如图8所示，四组均有特征蛋白ERK1/2的表达，只有Myc-c-Abl WT/ FLAG-MSTlffT组使MSTl在酪氨酸433位点磷酸化。4、c-Abl可正向调节MSTl蛋白水平，并依赖于c_Abl的激酶活性Dc-Abl正向调节MSTl的蛋白水平实验分为12组c-Abl-WT(O)/MSTl-WT 组293T 细胞共转 Oyg Myc-c-Abl 表达质粒(c-Abl-WT) 禾口 1 μ gFLAG-MSTl 表达质粒(MST1-WT)；c-Abl-WT (1) /MSTl-WT 组在 293T 细胞共转 0. 2yg Myc-c-Abl 表达质粒和 1 μ gFLAG-MSTl 表达质粒；c-Abl-WT (2) /MSTl-WT 组在 293T 细胞共转 0. 8yg Myc-c-Abl 表达质粒和 1 μ gFLAG-MSTl 表达质粒；
c-Abl-WT (3) /MSTl-WT 组在 293T 细胞共转 1.6yg Myc-c-Abl 表达质粒和 1 μ gFLAG-MSTl 表达质粒；MST 1-WT/c-AbI-KD(0)组在 293T 细胞共转 Oyg FLAG-MST1 (c-Abl-ffT)和 1 μ g
c-Abl-KD ；MST 1-WT/c-Ab I-KD(I) c-Abl-KD ；MST 1-WT/c-Ab I-KD (2) c-Abl-KD ；MST 1-WT/c-Ab I-KD (3) c-Abl-KD ；
组在293T细胞共转 组在293T细胞共转 组在293T细胞共转
0. 2μ g FLAG-MST1 禾口 1 μ g
0.8μ g FLAG-MST1 禾口 1 μ g
1.6μ g FLAG-MST1 禾口 1 μ g Myc-c-Abl(c-Abl-ffT)和 转 0. 2μ gMyc-c-Abl 和 转 0.8 μ gMyc-c-Abl 和c-Abl-WT (0) /MST1-Y433F 组在 293T 细胞共转 Oyg 1 μ g FLAG-MST1Y433F(MST1-Y433F)；c-Abl-WT (1)/MST1-Y433F 组在 293T 细胞共 1 μ gFLAG-MSTl Y433F ；c-Abl-WT (2)/MST1-Y433F 组在 293T 细胞共 1 μ gFLAG-MSTlY433F ；c-Abl-WT (3)/MST1-Y433F 组在 293T 细胞共转 1.6 μ gMyc-c-Abl 和 1 μ gFLAG-MST 1Y433F ；以上12组共转染4小时后，收集细胞裂解液，通过western blot以FLAG抗体检 测MSTl的蛋白水平。结果如图9A和9B所示，说明无论是否有激酶活性的c_Abl均可正向调节MSTl的 蛋白水平，并且无论是否为433F突变的MSTl均正向依赖于c-Abl的激酶活性。2) C-Abl激活MSTl的激酶活性实验分为两组Myc-c-Abl-/FLAG-MST1 组293T 细胞单转 FLAG-MST1 ；Myc-c-Abl+/FLAG-MST1 组293Τ 细胞共转 FLAG-MST1 和 Myc-c-Abl ；上述两组转染36小时后，收集细胞裂解液，细胞裂解液用FLAG的抗体做免疫共沉 淀后用Histon H2B(abeam, abl3212)为底物做激酶实验。结果如图10所示，MSTl和ER5V2在两组中均有表达，Myc-c-Abl+/FLAG-MST1组 有 32P-H2B (c-Abl 激活 MSTl 的活性，MSTl 使 Histon H2B 产生 32P-H2B)的表达；表明 c-Abl 可激活MSTl的激酶活性。5、STI571可抑制H2O2诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化以下培养SH-SY5Y细胞所用培养基的组成为DMEM (Gibco，Cl 1995)+10 % FBS(Biochrom,SOl15)。1) STI571可抑制H2O2诱导的MSTl表达实验分为四组H2O2-禾Π STI571-组培养 SH-SY5Y 细胞(Fernanda Martins Lopesa, b, Fabio Klamta, b (2010)Comparison between proliferative and neuron-like SH-SY5Y cells as an in vitro model for Parkinson disease studies. Brain Research 1337 85—94 公众可从中国科学院生物物理研究所获得。)；H2O2+和STI571-组培养SH-SY5Y细胞，向细胞培养基中加入H2O2，使H2O2在细胞 培养基中的浓度为200μΜ;H2O2-和STI571+组培养SH-SY5Y细胞，向细胞培养基中加入STI571，使STI571 在细胞培养基中的浓度为10 μ M ；H2O2+和STI571+组培养SH-SY5Y细胞，向细胞培养基中加入H2O2和STI571，使 H2O2和STI571分别在细胞培养基中的浓度为200 μ M和10 μ Μ，以上四组分别处理1小时后，收集细胞裂解液，再分别以P-Y433-MST1抗体做免疫 共沉淀后，通过western blot,以MSTl抗体检测。结果如图11所示，H2O2+和STI571-组有酪氨酸433位点磷酸化MST1，H2O2+和 STI571+组没有酪氨酸433位点磷酸化MST1，说明STI571可以抑制H2O2诱导的MSTl酪氨 酸433位点磷酸化。2) H2O2可诱导MSTl酪氨酸433位点磷酸化引起的细胞凋亡实验分为三组Vector组原代海马神经元体外培养3天后，共转染EGFP和FLAG-VECTOR ；MSTl-WT组原代海马神经元体外培养3天后，共转染EGFP和FLAG-MST1 ；MST1-Y433F组原代海马神经元体外培养3天后，共转染EGFP和 FLAG-MST1Y433F ；以上三组转染24小时，得到转染后的Vector组细胞、转染后的MSTl-WT组细胞和 转染后的MST1-Y433F组细胞，将上述三组细胞分为6个小组进行如下处理Vector(H2O2)组转染后的Vector组细胞的培养基中添加H2O2，使H2O2在细胞培 养基中的浓度为80μΜ;MSTl-WT(H2O2)组转染后的MST1-WT组细胞的培养基中添加H2O2，使H2O2在细胞 培养基中的浓度为80μΜ;MST1-Y433F(H2O2)组转染后的MST1-Y433F组细胞的培养基中添加H2O2，使H2O2在 细胞培养基中的浓度为80 μ M ；Vector (control)组转染后的Vector组细胞继续培养；MSTl-WT (control)组转染后的MST1-WT组细胞继续培养；MST1-Y433F(control)组转染后的 MST1-Y433F 组细胞继续培养；以上6个小组处理20小时后，分别固定细胞，分别统计GFP阳性细胞的凋亡比率。实验重复三次，结果取平均值。Vector(H2O2)组GFP阳性细胞的凋亡比率为45. 3%，MSTl-WT (H2O2)组GFP阳性细胞的凋亡比率为61. ；MST1-Y433F(H2O2)组GFP阳性细胞的凋亡比率为35. 9% ；Vector (control)组GFP阳性细胞的凋亡比率为18. 9%，MSTl-WT(control)组GFP阳性细胞的凋亡比率为32. 8% ；MST1-Y433F(control)组 GFP 阳性细胞的凋亡比率为 31. 9% ；将结果作图分析，结果如图12所示(AN0VA, ρ < 0. 02, η = 3)，可以看出，H2O2可 激活MSTl野生型磷酸化进而诱导细胞凋亡，而不能激活MSTl Y433F突变型诱导神经细胞凋亡。6、STI571可抑制鱼藤酮和H2O2诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化，从而抑制细 胞凋亡鱼藤酮(Rotenone)化学名称为:[2R_(2aa,6a α，12a a )-1，2，12a_ 四氢-8， 9-二甲氧基-2-(l-甲基乙烯基)[1]苯并吡喃[3，4-b]糠酰[2，3-h][l]苯并吡 喃-6 (6aH)-酮，分子式为C23H22O6,购自sigma，产品目录号R8875。以下培养C0S7细胞所用培养基的组成为DMEM (Gibco，Cl 1995)+10 % FBS(Biochrom,SOl15)。1) STI571可抑制鱼藤酮和H2O2诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化实验分为5个组Rotenone-/STI571-组(不加入鱼藤酮和 STI571 组)培养 C0S7 细胞(Bi， W.Xiao, L. Jia, Y. Wu, J. Xie, Q. Ren, J. Ji, G. Yuan, Z. (2010)c-Jun N-terminal kinase enhances MSTl-mediated pro-apoptotic signal ing through phosphorylation at serine 82. 285(9)6259-64 ；公众可从中国科学院生物物理研究所获得)。Rotenone+/STI571-/3h组(单独加入鱼藤酮组处理3小时)培养C0S7细胞，向 培养基中加入鱼藤酮，使鱼藤酮在培养基中的浓度为25 μ M ；处理3小时；Rotenone+/STI571-/16h组(单独加入鱼藤酮组处理16小时)培养C0S7细胞， 向培养基加入鱼藤酮，使鱼藤酮在培养基中的浓度为25 μ M ；处理16小时；Rotenone+/STI571+/3h组(加入鱼藤酮和STI571组1)培养C0S7细胞，向培养 基中加入鱼藤酮和STI571，使鱼藤酮合STI571在培养基中的浓度分别为25 μ M和10 μ M ； 处理3小时；Rotenone+/STI571+/16h组(加入鱼藤酮和STI571组2)培养C0S7细胞，向培养 基中加入鱼藤酮和STI571，使鱼藤酮合STI571在培养基中的浓度分别为25 μ M和10 μ M ； 处理16小时；分别收集上述经过处理的5组细胞裂解液，通过western blot分别以P-Y433MST1 抗体，MSTl 抗体，c-Abl 抗体、cleavage caspase3 抗体(cell signal, #9664)、ERK1/2 抗 体(cell signal, #9102)进行检测。结果如图13所示，p-Y433MSTl、MSTl、c-Abl, ERK1/2在5组中均有表达，而 cleavage caspase3 (MST1酪氨酸433位点磷酸化水平提高，可以引起cleavagecaspase3 的增加。)仅在 Rotenone+/STI571+/16h 组、Rotenone+/STI571_/16h 组和 Rotenone+/ STI571-/3h 组中有表达。而加入 Rotenone+/STI571+/16h 组比 Rotenone+/STI571_/16h 组 中的MSTl酪氨酸433位点磷酸化产物(P-Y433MST1)的量少，说明STI571可抑制Rotenone 诱导的MSTl酪氨酸433位点磷酸化，进而抑制Rotenone诱导的细胞凋亡。2) H2O2可在胞浆中激活MSTl酪氨酸433位点磷酸化实验分为4组空白对照组(control)培养原代培养海马神经元；单独加入STI571组(STI571)培养原代培养海马神经元，向培养基中加入 STI571, STI571在细胞培养基中的浓度为10 μ M ；单独加入H2O2组(H2O2):培养原代培养海马神经元，向培养基中加入H2O2，H2O2在细胞培养基中的浓度为400 μ M ；加入STI571和H2O2组(H202STI571)培养原代培养海马神经元细胞，向培养基中 分别加入STI571和H2O2，使STI571和H2O2在细胞培养基中的浓度分别为10 μ M和400 μ M ；以上4组均处理1小时后，采用免疫荧光检测方法，将各组细胞用4%多聚甲醛固 定十分钟，PBS漂洗3minX3，0. 2% Triton打孔10min，PBS漂洗3minX 3，羊血清室温封闭 1小时，加入一抗(P-Y433-MST1抗体)，4度过夜，PBS漂洗3minX3，加入荧光二抗(ALexa Fluor 488，购自 Invitrogen A11008。)37 度一小时，PBS 漂洗 3minX 3，Hoechest 染核 3min, PBS漂洗3minX 3，凉干封片，拍照。用p-Y433MSTl抗体检测神经元内源性MSTl酪氨酸433位点磷酸化。结果见图14 所示表明，H2O2可在胞浆中激活MSTl酪氨酸433位点磷酸化，而STI571可抑制该磷酸化。因此，STI571通过抑制鱼藤酮和H2O2诱导的c_Abl激酶活性，抑制c_Abl对MSTl 的体内外磷酸化，抑制c-Abl对MSTl酪氨酸433位点磷酸化等途径而抑制鱼藤酮和H2O2诱 导的神经细胞凋亡反应。该发现首次阐明STI571抗神经细胞氧化应激反应及其分子机制， 为STI571未来作为抗脑缺血及神经退行性疾病的候选新药奠定了理论和实验基础，具有 良好的发展前景。
权利要求
甲磺酸伊马替尼在制备抑制神经元凋亡的产品中的应用。
2.甲磺酸伊马替尼在制备治疗神经退行性疾病和/或脑缺血疾病的产品中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述抑制神经元凋亡是通过抑制丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶-1的磷酸化实现的。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1的 磷酸化是通过抑制非受体酪氨酸激酶的激酶活性实现的。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述神经元凋亡为过氧化氢和/或鱼藤酮引起的神经元凋亡。
6.根据权利要求3-5中任一所述的应用，其特征在于所述神经元为海马神经元。
7.根据权利要求2-5中任一所述的应用，其特征在于所述产品为药物。
8.根据权利要求3-6中任一所述的应用，其特征在于所述抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白 激酶-1的磷酸化为抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1的第433位点的酪氨酸磷酸化。
全文摘要
本发明公开了一种甲磺酸伊马替尼的新用途。本发明提供了甲磺酸伊马替尼在制备抑制神经元凋亡的产品中的应用，还提供了甲磺酸伊马替尼在制备治疗神经退行性疾病的产品中的应用。所述神经元为海马神经元。本发明的实验证明，STI571作为c-Abl特异性抑制剂，可以作为抗脑缺血及抗神经退行性疾病的候选新药，具有良好的应用前景，将极大程度拓展STI571的临床适应症。
文档编号A61K31/506GK101947221SQ20101029451
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者肖磊, 胡鹏, 袁增强, 陈冬梅 申请人:中国科学院生物物理研究所
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