一种白术多糖及其制备方法与应用的制作方法
专利名称：一种白术多糖及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种白术多糖的制备方法与其在调节肠道菌群平衡中的应用。
背景技术：
人体消化道内经常有一层微生物或微生物层存在，它们对宿主不但无害，而且 是有益和必需的，这一微生物层即称为正常微生物群(normal microbiota)或正常菌群 (normal bacteria flora)。这些微生物群(数百亿，占人体重量的1/50-1/60)在人体肠道 内进行活跃的生长代谢活动，有着极为重要的生理作用。与人体消化、吸收、免疫、抗肿瘤、 抗衰老、抵抗外来菌群侵袭等方面密切相关。众多研究结果表明，年龄、人种、膳食结构、生 活习惯、环境、疾病、抗生素治疗等会影响人肠道微生态系统及其群落结构。双歧杆菌和乳 杆菌是两种最重要的肠道益生菌，其数量和组成对维持健康肠道环境和提高免疫系统功能 起着关键作用。双歧杆菌能维持宿主肠道的微生态平衡，提高人体对乳糖的耐受性；具有抑制肠 道病原菌生长，改善蛋白质代谢并能合成多种维生素，促进机体免疫机能等。双歧杆菌在时 空、种类和数量上产生相应的动态变化，随着年龄增长而减少，从而直接影响人体的健康。 近年来，国内外出现了研究开发双歧杆菌产品的热潮，目前主要的产品有酸乳制品、胶囊 等，但该类活菌制剂保存有效性较差及活菌摄入机体后受到胃酸影响的条件限制，使向机 体补充双歧杆菌的效果降低。因而，向体内补充双歧生长因子，采用促进双歧杆菌增殖的物 质来补充体内有益菌群将是一条更易被接受的途径。在双歧生长因子中，低聚糖类研究最 多，如果糖低聚糖、大豆低聚糖、异麦芽寡糖等都具有促进双歧杆菌的增殖作用。经查证，目前消费市场上的益生元产品主要有英吉利益生元铁锌钙葡萄糖、多美 滋婴幼儿奶粉、贝因美牛初乳益生元奶粉、多维益生元豆浆粉、亨氏清儿润、雀巢力多精等 等，这些产品在治疗肠道菌群失调引起的腹泻、慢性腹泻、抗生素治疗无效的腹泻及便秘的 等方面发挥了很大的作用，同时也是某些临床疾病的良好的辅助药物。它们大多为添加低 聚果糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、褐藻胶低聚糖、菊糖等各类功能性低聚糖的产品，以乳制品 居多。通过对国内外专利文献、期刊杂志及其它公开发表的文献(如互联网)进行检索， 多糖研究主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等，并未有多糖类化合物作为益生 元开发利用。白 $ (Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)力胃禾斗(Compositae)才直·白 * Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根茎。白术为多年生草本，栽培历史悠久，主产 中国浙江省东阳、磐安一带，是著名的道地中药材“浙八味”之一，分布于浙江、江西、湖南、 湖北、陕西，亦多栽培。白术多糖，也仅限于在免疫调节及抗肿瘤、降血脂上有良好作用，没 有对益生菌和肠道菌群作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种白术多糖的制备方法与其在调节肠道菌群平衡中的应用。本发明提供的白术多糖的制备方法，包括下述步骤1)将白术用水浸泡，然后煎煮，收集滤液，浓缩得到白术浸提液；2)在步骤1)获得的白术浸提液中加入乙醇或乙醇溶液，调节乙醇最终体积百分 浓度为70% -75% (如71. 25% )，置于4°C静置24小时，离心收集沉淀，将沉淀用水溶解， 然后在水中透析去除去乙醇、小分子糖、蛋白质和盐；浓缩透析液，真空冷冻干燥，得到白术 粗多糖；3)将步骤2)获得的白术粗多糖用水溶解，添加2倍体积的Saveg液，混合摇勻， 离心收集上清液，重复此步骤，直到上清液经紫外测定在260、280nm波长处无蛋白质和核 酸的吸收峰，此上清液为脱蛋白后的糖液；然后在水中透析除去氯仿和正丁醇，浓缩透析 液，真空冷冻干燥，得到不含蛋白质的白术多糖；所述Saveg液为氯仿和正丁醇按体积比为 41混合后的混合液；所述方法中还包括将步骤3)获得的不含蛋白质的白术多糖用水溶解，进行 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱层析纯化，用50mM Tris-HCl收集含多糖的洗脱液； 将洗脱液置于水中透析去除Tris-HCl组分浓缩后冷冻干燥，得到白术多糖。为了加快溶解的速度，所述溶解用水的温度为40_80°C，如60°C。所述步骤2)和步骤3)中，所述透析的截留分子量为5000Da以下，优选为3500Da。所述步骤2)和步骤3)中，所述透析的时间为24-72小时，优选为48小时。所述步骤1)中，所述浸泡的时间为12-36小时，优选为24小时；所述浸泡用蒸馏 水为10ml/g白术；所述煎煮为将浸泡后的白术用其浸泡液直接煎煮30分钟，过滤收集滤 液，将滤渣在用于浸泡液相同体积的水煎煮30分钟，收集滤液，合并两次收集获得的滤液。所述方法中，所用的水均为蒸馏水或去离子水。比如，上述步骤1)中的浸泡白术 用水、步骤2)中溶解沉淀用水、步骤3)中的溶解白术粗多糖用水均可以为蒸馏水，上述方 法中的透析用水，DEAE-Si^pharose Fast Flow阴离子柱层析纯化前溶解白术多糖用水可以 为去离子水。上述方法制备的白术多糖即本发明所要保护的白术多糖。本发明还提供白术多糖在促进肠道有益菌的增殖或者调节肠道菌群的平衡中的 应用。所述肠道有益菌为婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌或植物乳杆菌。 所述肠道有益菌优选为婴儿双歧杆菌CICC6069、青春双歧杆菌CICC6070、两歧双歧杆菌 1. 1852、动物双歧杆菌1. 2268或植物乳杆菌1. 124。白术多糖可在体外促进肠道有益菌的 增殖，并在一定程度上可以调节肠道菌群的平衡。本发明的白术多糖的提取方法，经醇沉淀、Saveg法除蛋白、透析、阴离子柱层析， 提取的白术多糖纯度极高，纯度达色谱纯，分子量为5527Da，主要由阿拉伯糖，半乳糖，葡萄 糖和甘露糖组成。我们采用的方法提取的白术多糖的鉴定方法和仪器均属于最新的科研成果，检测 灵敏准确，可信度高。多糖分子量测定主要采用高效液相色谱及凝胶渗透色谱，本方法利用 激光检测器，灵敏度高，且不需标曲。单糖组成大都采用液相色谱或气相色谱，采用的检测
4器为脉冲安培检测，不需样品柱前或柱后衍生，分辨率高，获得的结果更可靠。本发明首次通过实验验证了白术多糖对肠道有益菌的增殖具有促进作用，实验证 明，该白术多糖可在体外促进婴儿、青春、动物双歧杆菌和植物乳杆菌等益生菌的增殖。可 以作为一种益生元生产利用，具有调节肠道菌群平衡的作用，可以作为新型功能性益生元 开发。我们将白术多糖对微生态方面进行研究，弥补了这一方面的空白，并有希望添加至产 品中，开发新型功能性益生元产品。
图1为本发明方法制得白术粗多糖的样品照片。图2为本发明方法制得白术精多糖的样品照片。图3为实施例1制得白术精多糖的S印harose CL-6B凝胶层析洗脱曲线图4为实施例1制得白术精多糖的紫外扫描5不同添加量白术精多糖对双歧杆菌生长的影响图6不同添加量白术多糖(AMP)对乳杆菌生长的影响图7白术多糖(AMP)的FT-IR谱8中A为单糖标品(1. 0 μ g/mL)HPAEC-PAD色谱图；B为实施例1制得白术精多 糖的HPAEC-PAD色谱图
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、白术多糖的提取方法1、白术多糖的提取方法取20g白术(购自北京同仁堂百旺山药店)，加入200mL蒸馏水浸泡24h，然后其 浸泡液直接煎煮30min后过滤，滤渣加同量蒸馏水(200mL)再煎煮30min，合并滤液蒸发浓 缩至IOOmL,得到白术浸提液。2)白术多糖的提取纯化水提醇沉法制备白术粗多糖将白术浸提液浓缩后加入3倍体积乙醇溶液(体积 百分浓度为95%，乙醇的终体积百分比浓度为71. 25% )，置于4°C冰箱醇沉24h，SOOOrpm 离心IOmin收集沉淀，沉淀用热蒸馏水(40-80°C，普通室温水即可，温度稍高的水可以加快 溶解速度)复溶后，置于透析袋(0SO-T8340，MD34 (3500)，美国联合碳化)中，将透析袋置 于去离子水中透析48h，除去乙醇、小分子糖、蛋白质、盐等。浓缩透析液，真空冷冻干燥，得 白术粗多糖，粗糖提取率为10% (制得粗糖质量/白术干重)，样品见图1。Saveg法除蛋白将上述透析2)后获得的白术粗多糖用热蒸馏水(40-80°C，常温 即可，温度稍高的水可以加快溶解速度)复溶后得到白术粗多糖溶液，将Saveg液(氯仿 正丁醇(体积比)=4:1)与糖液以2 1(体积比)比例混合摇勻脱蛋白，SOOOrpm离心 IOmin收集上清液，重复4次，至紫外测定在260、280nm波长处无蛋白质和核酸的吸收峰得 到脱蛋白后的糖液。将脱蛋白后的糖液置于透析袋(0SO-T8340，MD34(3500)，美国联合碳 化)中，将透析袋置于去离子水中透析48h，除去氯仿和正丁醇，浓缩，冷冻干燥得到不含蛋 白质的白术多糖。
DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱层析纯化将除蛋白后的白术多糖用去离子 水配制成10mg/mL溶液，0. 45 μ m微孔滤膜过滤后，用DEAE-S印harose Fast Flow阴离子柱 (玻璃离子交换柱2. 6 X 20em，填装DEAE-S印harose Fast Flow，购自Pharmacia)纯化，以 7mL上样后，用50mM Tris-HCl溶液洗脱，流速4. OmL/min, 2min/管，收集40管，部分收集器 收集洗脱液。以苯酚-硫酸比色法(徐斌，董英，林琳，等.改良苯酚-硫酸法测定苦瓜多 糖含量[J].食品科学，2005，26 (7) =79-82.)跟踪检测每管多糖含量。结果表明白术多糖 在洗脱液体积为120mL时洗脱完全。收集含多糖的峰的流出液，置于透析袋(0SO-T8340，MD34 (3500)，美国联合碳化) 在去离子水中透析24h，去除Tris-HCl组分，浓缩后冷冻干燥，得到白术多糖纯品并命名为 AMP (Atractylodes macrocephala polysaccharides)。该白术多糖纯品照片如图 2 所示。2、多糖纯度鉴定1)常压凝胶色谱层析(玻璃凝胶过滤柱1. 6 X 80cm,填装S印harose CL-6B，购自 Pharmacia)将步骤1获得的AMP冻干样品用去离子水溶解，配制成10mg/mL溶液，0. 45 μ m 微孔滤膜过滤后上样(IOmL)，0.05mol/L NaCl洗脱，流速30mL/h，12min/管，自动部分收集 器收集洗脱液。苯酚_硫酸比色法跟踪检测每管多糖含量，绘制曲线图。结果如图3所示，结果表明白术多糖已达色谱纯。2)紫外(UV)检测将步骤1获得的纯品AMP用去离子水溶解制备成0. 5mg/mL样 品待测液，以去离子水为空白对照，在波长220-580nm范围内利用紫外分光光度计进行紫 外全波长扫描，以确定AMP中是否含有核酸和蛋白质。结果表明步骤1获得的纯品AMP在260-280nm处无吸收，无蛋白质和核酸，如图4。3、白术多糖对肠道菌群体外促生长试验1)不同浓度白术多糖对双歧杆菌体外生长的影响将活化好的5株双歧杆菌(青 春双歧杆菌CICC6070、婴儿双歧杆菌CICC6069、长双歧杆菌CICC6068购于中国工业微生物 菌种保藏管理中心；两歧双歧杆菌1. 1852、动物双歧杆菌1. 2268购自中国普通微生物菌种 保藏管理中心(CGMCC)，；分别以接种量(106CFU/mL)接种于步骤1制备的AMP添加的 终质量百分浓度为0%、0. 1%,0. 5%U.0%U. 5%,2. 0%或2. 5%的MRS培养基中，各浓度 重复三组，37°C培养24h后，于600nm波长下测定各培养液的OD值。结果表明白术多糖可在体外促进婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌的 增殖，有良好的促生长作用，具体结果见图5。2)不同浓度白术多糖对乳杆菌的体外生长影响将活化好的2株乳杆菌(嗜酸乳 杆菌1. 2686、植物乳杆菌1. 124购自CGMCC)分别以接种量(约106CFU/mL)接种于AMP 添加终质量百分浓度为0%、0. 1%,0. 5%U. 0%U. 5%,2. 0%或2. 5%的MRS培养基中，各 浓度重复三组，37°C培养24h后，测定600nm波长下测定各培养液的OD值。结果表明白术多糖可以促进植物乳杆菌的增殖，见图6。3)白术多糖对其余主要肠道菌群体外生长的影响将活化好的5大类肠道菌群代 表菌株(青春双歧杆菌CICC6070、植物乳杆菌CGMCC1. 124、大肠杆菌ATCC83965、粪肠球菌 CGMCC1. 131、丁酸梭菌CGMCC1. 336)分别以接种量(约106CFU/mL)接种于AMP (步骤1 制备的白术多糖)添加终质量百分浓度为0. 的各自适宜培养基及对照组(不加白术多 糖)中，各组重复3组，37°C培养24h后，测定600nm波长下测定各培养液的OD值。
结果(见表1)表明，白术多糖可以促进青春双歧杆菌、植物乳杆菌的生长，对其余 3类(大肠杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌)的促进效果不明显，或有抑制作用，有调节肠道菌群 平衡的作用。表1 白术多糖对肠道菌群的调节作用
权利要求
一种白术多糖的制备方法，包括下述步骤1)将白术用水浸泡，然后煎煮，收集滤液，浓缩得到白术浸提液；2)在步骤1)获得的白术浸提液中加入乙醇或乙醇溶液，至乙醇终体积百分比浓度为70％ 75％，置于4℃静置24小时，离心收集沉淀，将沉淀用水溶解，然后在水中透析去除乙醇、小分子糖、蛋白质和盐；浓缩透析液，真空冷冻干燥，得到白术粗多糖；3)将步骤2)获得的白术粗多糖用水溶解，然后添加2倍体积的Saveg液，混合摇匀，离心收集上清液，重复此步骤，直到上清液经紫外测定在260和280nm波长处无蛋白质和核酸的吸收峰，此上清液为脱蛋白后的糖液；然后在水中透析除去氯仿和正丁醇，浓缩透析液，真空冷冻干燥，得到不含蛋白质的白术多糖；所述Saveg液为氯仿和正丁醇按体积比为4∶1混合后的混合液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将步骤3)获得的不 含蛋白质的白术多糖用水溶解，进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱层析纯化，用 50mM Tris-HCl洗脱，收集含多糖的洗脱液；将含多糖的洗脱液置于去离子水中透析去除 Tris-HCl组分浓缩后冷冻干燥，得到白术多糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤2)和步骤3)中，所述透析 的截留分子量为5000Da以下，优选为3500Da。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于所述步骤2)和步骤3)中， 所述透析的时间为24-72小时，优选为48小时。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述浸泡 的时间为12-36小时，优选为24小时；所述浸泡用水的用量为10ml/g白术；所述煎煮为将 浸泡后的白术用其浸泡液直接煎煮30分钟，过滤收集滤液，将滤渣在用于浸泡液相同体积 的水煎煮30分钟，收集滤液，合并两次收集获得的滤液。
6.权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于所述方法中，所用的水均为蒸馏 水或去离子水。
7.权利要求1-6中任意所述的方法制备的白术多糖。
8.权利要求7所述的白术多糖在促进肠道有益菌的增殖和/或调节肠道菌群平衡中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述肠道有益菌为婴儿双歧杆菌、青春双 歧杆菌、动物双歧杆菌或植物乳杆菌；所述肠道有益菌优选为婴儿双歧杆菌CICC6069、青 春双歧杆菌CICC6070、两歧双歧杆菌CGMCC1. 1852或植物乳杆菌CGMCC1. 124。
10.权利要求7所述的白术多糖在制备促进肠道有益菌的增殖和/或调节肠道菌群平 衡产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种白术多糖的制备方法与应用。该白术多糖的制备方法，包括下述步骤1)将白术用水浸泡，然后煎煮，收集滤液，浓缩得到白术浸提液；2)加入乙醇，置于4℃静置，离心收集沉淀，将沉淀溶解，然后在透析去除去乙醇、小分子糖、蛋白质和盐；干燥，得到白术粗多糖；3)将白术粗多糖溶解，然后添加2倍体积的Saveg液，混合摇匀，离心收集上清液；然后在水中透析除去除去氯仿和正丁醇，干燥，得到不含蛋白质的白术多糖。实验证明，该白术多糖可在体外促进婴儿、青春、动物双歧杆菌和植物乳杆菌等益生菌的增殖。可以作为一种益生元生产，具有调节肠道菌群平衡的作用，可以作为新型功能性益生元开发。
文档编号A61P1/00GK101955549SQ201010294879
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者刘丽莎, 尚楠, 李平兰, 王洋, 王锐 申请人:中国农业大学
技术领域：
本发明涉及一种白术多糖的制备方法与其在调节肠道菌群平衡中的应用。
背景技术：
人体消化道内经常有一层微生物或微生物层存在，它们对宿主不但无害，而且 是有益和必需的，这一微生物层即称为正常微生物群(normal microbiota)或正常菌群 (normal bacteria flora)。这些微生物群(数百亿，占人体重量的1/50-1/60)在人体肠道 内进行活跃的生长代谢活动，有着极为重要的生理作用。与人体消化、吸收、免疫、抗肿瘤、 抗衰老、抵抗外来菌群侵袭等方面密切相关。众多研究结果表明，年龄、人种、膳食结构、生 活习惯、环境、疾病、抗生素治疗等会影响人肠道微生态系统及其群落结构。双歧杆菌和乳 杆菌是两种最重要的肠道益生菌，其数量和组成对维持健康肠道环境和提高免疫系统功能 起着关键作用。双歧杆菌能维持宿主肠道的微生态平衡，提高人体对乳糖的耐受性；具有抑制肠 道病原菌生长，改善蛋白质代谢并能合成多种维生素，促进机体免疫机能等。双歧杆菌在时 空、种类和数量上产生相应的动态变化，随着年龄增长而减少，从而直接影响人体的健康。 近年来，国内外出现了研究开发双歧杆菌产品的热潮，目前主要的产品有酸乳制品、胶囊 等，但该类活菌制剂保存有效性较差及活菌摄入机体后受到胃酸影响的条件限制，使向机 体补充双歧杆菌的效果降低。因而，向体内补充双歧生长因子，采用促进双歧杆菌增殖的物 质来补充体内有益菌群将是一条更易被接受的途径。在双歧生长因子中，低聚糖类研究最 多，如果糖低聚糖、大豆低聚糖、异麦芽寡糖等都具有促进双歧杆菌的增殖作用。经查证，目前消费市场上的益生元产品主要有英吉利益生元铁锌钙葡萄糖、多美 滋婴幼儿奶粉、贝因美牛初乳益生元奶粉、多维益生元豆浆粉、亨氏清儿润、雀巢力多精等 等，这些产品在治疗肠道菌群失调引起的腹泻、慢性腹泻、抗生素治疗无效的腹泻及便秘的 等方面发挥了很大的作用，同时也是某些临床疾病的良好的辅助药物。它们大多为添加低 聚果糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、褐藻胶低聚糖、菊糖等各类功能性低聚糖的产品，以乳制品 居多。通过对国内外专利文献、期刊杂志及其它公开发表的文献(如互联网)进行检索， 多糖研究主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等，并未有多糖类化合物作为益生 元开发利用。白 $ (Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)力胃禾斗(Compositae)才直·白 * Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根茎。白术为多年生草本，栽培历史悠久，主产 中国浙江省东阳、磐安一带，是著名的道地中药材“浙八味”之一，分布于浙江、江西、湖南、 湖北、陕西，亦多栽培。白术多糖，也仅限于在免疫调节及抗肿瘤、降血脂上有良好作用，没 有对益生菌和肠道菌群作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种白术多糖的制备方法与其在调节肠道菌群平衡中的应用。本发明提供的白术多糖的制备方法，包括下述步骤1)将白术用水浸泡，然后煎煮，收集滤液，浓缩得到白术浸提液；2)在步骤1)获得的白术浸提液中加入乙醇或乙醇溶液，调节乙醇最终体积百分 浓度为70% -75% (如71. 25% )，置于4°C静置24小时，离心收集沉淀，将沉淀用水溶解， 然后在水中透析去除去乙醇、小分子糖、蛋白质和盐；浓缩透析液，真空冷冻干燥，得到白术 粗多糖；3)将步骤2)获得的白术粗多糖用水溶解，添加2倍体积的Saveg液，混合摇勻， 离心收集上清液，重复此步骤，直到上清液经紫外测定在260、280nm波长处无蛋白质和核 酸的吸收峰，此上清液为脱蛋白后的糖液；然后在水中透析除去氯仿和正丁醇，浓缩透析 液，真空冷冻干燥，得到不含蛋白质的白术多糖；所述Saveg液为氯仿和正丁醇按体积比为 41混合后的混合液；所述方法中还包括将步骤3)获得的不含蛋白质的白术多糖用水溶解，进行 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱层析纯化，用50mM Tris-HCl收集含多糖的洗脱液； 将洗脱液置于水中透析去除Tris-HCl组分浓缩后冷冻干燥，得到白术多糖。为了加快溶解的速度，所述溶解用水的温度为40_80°C，如60°C。所述步骤2)和步骤3)中，所述透析的截留分子量为5000Da以下，优选为3500Da。所述步骤2)和步骤3)中，所述透析的时间为24-72小时，优选为48小时。所述步骤1)中，所述浸泡的时间为12-36小时，优选为24小时；所述浸泡用蒸馏 水为10ml/g白术；所述煎煮为将浸泡后的白术用其浸泡液直接煎煮30分钟，过滤收集滤 液，将滤渣在用于浸泡液相同体积的水煎煮30分钟，收集滤液，合并两次收集获得的滤液。所述方法中，所用的水均为蒸馏水或去离子水。比如，上述步骤1)中的浸泡白术 用水、步骤2)中溶解沉淀用水、步骤3)中的溶解白术粗多糖用水均可以为蒸馏水，上述方 法中的透析用水，DEAE-Si^pharose Fast Flow阴离子柱层析纯化前溶解白术多糖用水可以 为去离子水。上述方法制备的白术多糖即本发明所要保护的白术多糖。本发明还提供白术多糖在促进肠道有益菌的增殖或者调节肠道菌群的平衡中的 应用。所述肠道有益菌为婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌或植物乳杆菌。 所述肠道有益菌优选为婴儿双歧杆菌CICC6069、青春双歧杆菌CICC6070、两歧双歧杆菌 1. 1852、动物双歧杆菌1. 2268或植物乳杆菌1. 124。白术多糖可在体外促进肠道有益菌的 增殖，并在一定程度上可以调节肠道菌群的平衡。本发明的白术多糖的提取方法，经醇沉淀、Saveg法除蛋白、透析、阴离子柱层析， 提取的白术多糖纯度极高，纯度达色谱纯，分子量为5527Da，主要由阿拉伯糖，半乳糖，葡萄 糖和甘露糖组成。我们采用的方法提取的白术多糖的鉴定方法和仪器均属于最新的科研成果，检测 灵敏准确，可信度高。多糖分子量测定主要采用高效液相色谱及凝胶渗透色谱，本方法利用 激光检测器，灵敏度高，且不需标曲。单糖组成大都采用液相色谱或气相色谱，采用的检测
4器为脉冲安培检测，不需样品柱前或柱后衍生，分辨率高，获得的结果更可靠。本发明首次通过实验验证了白术多糖对肠道有益菌的增殖具有促进作用，实验证 明，该白术多糖可在体外促进婴儿、青春、动物双歧杆菌和植物乳杆菌等益生菌的增殖。可 以作为一种益生元生产利用，具有调节肠道菌群平衡的作用，可以作为新型功能性益生元 开发。我们将白术多糖对微生态方面进行研究，弥补了这一方面的空白，并有希望添加至产 品中，开发新型功能性益生元产品。
图1为本发明方法制得白术粗多糖的样品照片。图2为本发明方法制得白术精多糖的样品照片。图3为实施例1制得白术精多糖的S印harose CL-6B凝胶层析洗脱曲线图4为实施例1制得白术精多糖的紫外扫描5不同添加量白术精多糖对双歧杆菌生长的影响图6不同添加量白术多糖(AMP)对乳杆菌生长的影响图7白术多糖(AMP)的FT-IR谱8中A为单糖标品(1. 0 μ g/mL)HPAEC-PAD色谱图；B为实施例1制得白术精多 糖的HPAEC-PAD色谱图
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、白术多糖的提取方法1、白术多糖的提取方法取20g白术(购自北京同仁堂百旺山药店)，加入200mL蒸馏水浸泡24h，然后其 浸泡液直接煎煮30min后过滤，滤渣加同量蒸馏水(200mL)再煎煮30min，合并滤液蒸发浓 缩至IOOmL,得到白术浸提液。2)白术多糖的提取纯化水提醇沉法制备白术粗多糖将白术浸提液浓缩后加入3倍体积乙醇溶液(体积 百分浓度为95%，乙醇的终体积百分比浓度为71. 25% )，置于4°C冰箱醇沉24h，SOOOrpm 离心IOmin收集沉淀，沉淀用热蒸馏水(40-80°C，普通室温水即可，温度稍高的水可以加快 溶解速度)复溶后，置于透析袋(0SO-T8340，MD34 (3500)，美国联合碳化)中，将透析袋置 于去离子水中透析48h，除去乙醇、小分子糖、蛋白质、盐等。浓缩透析液，真空冷冻干燥，得 白术粗多糖，粗糖提取率为10% (制得粗糖质量/白术干重)，样品见图1。Saveg法除蛋白将上述透析2)后获得的白术粗多糖用热蒸馏水(40-80°C，常温 即可，温度稍高的水可以加快溶解速度)复溶后得到白术粗多糖溶液，将Saveg液(氯仿 正丁醇(体积比)=4:1)与糖液以2 1(体积比)比例混合摇勻脱蛋白，SOOOrpm离心 IOmin收集上清液，重复4次，至紫外测定在260、280nm波长处无蛋白质和核酸的吸收峰得 到脱蛋白后的糖液。将脱蛋白后的糖液置于透析袋(0SO-T8340，MD34(3500)，美国联合碳 化)中，将透析袋置于去离子水中透析48h，除去氯仿和正丁醇，浓缩，冷冻干燥得到不含蛋 白质的白术多糖。
DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱层析纯化将除蛋白后的白术多糖用去离子 水配制成10mg/mL溶液，0. 45 μ m微孔滤膜过滤后，用DEAE-S印harose Fast Flow阴离子柱 (玻璃离子交换柱2. 6 X 20em，填装DEAE-S印harose Fast Flow，购自Pharmacia)纯化，以 7mL上样后，用50mM Tris-HCl溶液洗脱，流速4. OmL/min, 2min/管，收集40管，部分收集器 收集洗脱液。以苯酚-硫酸比色法(徐斌，董英，林琳，等.改良苯酚-硫酸法测定苦瓜多 糖含量[J].食品科学，2005，26 (7) =79-82.)跟踪检测每管多糖含量。结果表明白术多糖 在洗脱液体积为120mL时洗脱完全。收集含多糖的峰的流出液，置于透析袋(0SO-T8340，MD34 (3500)，美国联合碳化) 在去离子水中透析24h，去除Tris-HCl组分，浓缩后冷冻干燥，得到白术多糖纯品并命名为 AMP (Atractylodes macrocephala polysaccharides)。该白术多糖纯品照片如图 2 所示。2、多糖纯度鉴定1)常压凝胶色谱层析(玻璃凝胶过滤柱1. 6 X 80cm,填装S印harose CL-6B，购自 Pharmacia)将步骤1获得的AMP冻干样品用去离子水溶解，配制成10mg/mL溶液，0. 45 μ m 微孔滤膜过滤后上样(IOmL)，0.05mol/L NaCl洗脱，流速30mL/h，12min/管，自动部分收集 器收集洗脱液。苯酚_硫酸比色法跟踪检测每管多糖含量，绘制曲线图。结果如图3所示，结果表明白术多糖已达色谱纯。2)紫外(UV)检测将步骤1获得的纯品AMP用去离子水溶解制备成0. 5mg/mL样 品待测液，以去离子水为空白对照，在波长220-580nm范围内利用紫外分光光度计进行紫 外全波长扫描，以确定AMP中是否含有核酸和蛋白质。结果表明步骤1获得的纯品AMP在260-280nm处无吸收，无蛋白质和核酸，如图4。3、白术多糖对肠道菌群体外促生长试验1)不同浓度白术多糖对双歧杆菌体外生长的影响将活化好的5株双歧杆菌(青 春双歧杆菌CICC6070、婴儿双歧杆菌CICC6069、长双歧杆菌CICC6068购于中国工业微生物 菌种保藏管理中心；两歧双歧杆菌1. 1852、动物双歧杆菌1. 2268购自中国普通微生物菌种 保藏管理中心(CGMCC)，；分别以接种量(106CFU/mL)接种于步骤1制备的AMP添加的 终质量百分浓度为0%、0. 1%,0. 5%U.0%U. 5%,2. 0%或2. 5%的MRS培养基中，各浓度 重复三组，37°C培养24h后，于600nm波长下测定各培养液的OD值。结果表明白术多糖可在体外促进婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌的 增殖，有良好的促生长作用，具体结果见图5。2)不同浓度白术多糖对乳杆菌的体外生长影响将活化好的2株乳杆菌(嗜酸乳 杆菌1. 2686、植物乳杆菌1. 124购自CGMCC)分别以接种量(约106CFU/mL)接种于AMP 添加终质量百分浓度为0%、0. 1%,0. 5%U. 0%U. 5%,2. 0%或2. 5%的MRS培养基中，各 浓度重复三组，37°C培养24h后，测定600nm波长下测定各培养液的OD值。结果表明白术多糖可以促进植物乳杆菌的增殖，见图6。3)白术多糖对其余主要肠道菌群体外生长的影响将活化好的5大类肠道菌群代 表菌株(青春双歧杆菌CICC6070、植物乳杆菌CGMCC1. 124、大肠杆菌ATCC83965、粪肠球菌 CGMCC1. 131、丁酸梭菌CGMCC1. 336)分别以接种量(约106CFU/mL)接种于AMP (步骤1 制备的白术多糖)添加终质量百分浓度为0. 的各自适宜培养基及对照组(不加白术多 糖)中，各组重复3组，37°C培养24h后，测定600nm波长下测定各培养液的OD值。
结果(见表1)表明，白术多糖可以促进青春双歧杆菌、植物乳杆菌的生长，对其余 3类(大肠杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌)的促进效果不明显，或有抑制作用，有调节肠道菌群 平衡的作用。表1 白术多糖对肠道菌群的调节作用
权利要求
一种白术多糖的制备方法，包括下述步骤1)将白术用水浸泡，然后煎煮，收集滤液，浓缩得到白术浸提液；2)在步骤1)获得的白术浸提液中加入乙醇或乙醇溶液，至乙醇终体积百分比浓度为70％ 75％，置于4℃静置24小时，离心收集沉淀，将沉淀用水溶解，然后在水中透析去除乙醇、小分子糖、蛋白质和盐；浓缩透析液，真空冷冻干燥，得到白术粗多糖；3)将步骤2)获得的白术粗多糖用水溶解，然后添加2倍体积的Saveg液，混合摇匀，离心收集上清液，重复此步骤，直到上清液经紫外测定在260和280nm波长处无蛋白质和核酸的吸收峰，此上清液为脱蛋白后的糖液；然后在水中透析除去氯仿和正丁醇，浓缩透析液，真空冷冻干燥，得到不含蛋白质的白术多糖；所述Saveg液为氯仿和正丁醇按体积比为4∶1混合后的混合液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将步骤3)获得的不 含蛋白质的白术多糖用水溶解，进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱层析纯化，用 50mM Tris-HCl洗脱，收集含多糖的洗脱液；将含多糖的洗脱液置于去离子水中透析去除 Tris-HCl组分浓缩后冷冻干燥，得到白术多糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤2)和步骤3)中，所述透析 的截留分子量为5000Da以下，优选为3500Da。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于所述步骤2)和步骤3)中， 所述透析的时间为24-72小时，优选为48小时。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述浸泡 的时间为12-36小时，优选为24小时；所述浸泡用水的用量为10ml/g白术；所述煎煮为将 浸泡后的白术用其浸泡液直接煎煮30分钟，过滤收集滤液，将滤渣在用于浸泡液相同体积 的水煎煮30分钟，收集滤液，合并两次收集获得的滤液。
6.权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于所述方法中，所用的水均为蒸馏 水或去离子水。
7.权利要求1-6中任意所述的方法制备的白术多糖。
8.权利要求7所述的白术多糖在促进肠道有益菌的增殖和/或调节肠道菌群平衡中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述肠道有益菌为婴儿双歧杆菌、青春双 歧杆菌、动物双歧杆菌或植物乳杆菌；所述肠道有益菌优选为婴儿双歧杆菌CICC6069、青 春双歧杆菌CICC6070、两歧双歧杆菌CGMCC1. 1852或植物乳杆菌CGMCC1. 124。
10.权利要求7所述的白术多糖在制备促进肠道有益菌的增殖和/或调节肠道菌群平 衡产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种白术多糖的制备方法与应用。该白术多糖的制备方法，包括下述步骤1)将白术用水浸泡，然后煎煮，收集滤液，浓缩得到白术浸提液；2)加入乙醇，置于4℃静置，离心收集沉淀，将沉淀溶解，然后在透析去除去乙醇、小分子糖、蛋白质和盐；干燥，得到白术粗多糖；3)将白术粗多糖溶解，然后添加2倍体积的Saveg液，混合摇匀，离心收集上清液；然后在水中透析除去除去氯仿和正丁醇，干燥，得到不含蛋白质的白术多糖。实验证明，该白术多糖可在体外促进婴儿、青春、动物双歧杆菌和植物乳杆菌等益生菌的增殖。可以作为一种益生元生产，具有调节肠道菌群平衡的作用，可以作为新型功能性益生元开发。
文档编号A61P1/00GK101955549SQ201010294879
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者刘丽莎, 尚楠, 李平兰, 王洋, 王锐 申请人:中国农业大学
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