一种治疗乳腺增生的中药组合物质量检测方法
专利名称：一种治疗乳腺增生的中药组合物质量检测方法
技术领域：
本发明涉及中成药的质量检测方法，具体地说，本发明涉及一种治疗乳腺增生的 中药组合物质量检测方法。
背景技术：
乳腺增生病约占乳腺疾病的70 80%，是育龄妇女最常见的乳腺疾病，其发病率 约为40%，伴有明显的乳房疼痛，常形成乳房结节或肿块，部分患者有发展为乳腺癌的危 险。因此，对乳腺增生进行有效治疗对于维护广大妇女的健康，提高生活质量，预防乳腺癌 具有极其重要的意义。长期以来国外多用激素类、维生素类药物或手术治疗乳腺增生。80年 代以来，采用三苯氧胺治疗乳腺增生，有报道对雌激素受体阳性的患者，有效率可达86%， 但长期服用可发生阴道出血、血小板减少、恶心、呕吐、水肿及血钙增加等副作用。鉴于乳腺增生的发病与神经内分泌失衡有关，治疗上需长期用药的特点，传统中 医药较之于化学药品更具优势。国内采用中医药治疗乳腺增生取得了一定的进展，中国药 典2005年版收载了三个治疗乳腺增生的方剂乳块消片、乳疾灵颗粒和乳癖消片。然而，由于此类方剂的组方复杂，药味大多在10味左右，甚至更多。这为探讨治疗 乳腺增生病的中药药理作用机制、以及药品的质量检测增添了一定的难度。由本申请人申 请的“一种治疗乳腺增生的中药组合物、制剂及其制备方法”，公开号CN101219192A，其由山 楂、炒麦芽、鸡血藤和通草四味中药原料组成，该中药组合物具有明确的疗效，长期有效率 达99.6%。但目前尚无相关产品的质量检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗乳腺增生的中药组合物质量检测方法。为了实现本发明目的，本发明提供一种由山楂、炒麦芽、鸡血藤和通草制成的治疗 乳腺增生的中药颗粒质量检测方法，该方法包括鉴别和含量测定两部分，其中鉴别包括采 用薄层色谱法，分别用芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品进行的鉴别；含量测 定以含表儿茶素确定，以表儿茶素计，不得少于0. 70mg/g。本发明所述治疗乳腺增生的中药颗粒，其采用如下方法制备取山楂6份、炒麦芽10份、鸡血藤10份、通草3. 3份，然后加8 10倍量的水煎 煮三次，每次0. 5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1. 10 1. 12 (700C )的稠 膏，加入3份糊精，流化床制粒，干燥，整粒，制成颗粒，即得。本发明的质量检测方法，其中所述鉴别包括如下鉴别中的一种或多种1)鸡血藤的鉴别取所述中药颗粒8-15g，加水50ml使溶解，加乙醚IOOml超声 处理(功率320W，频率40kHz) 20-40min,分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试 品溶液；另取芒柄花素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液；取对照 品溶液1-3 μ 1，供试品溶液15-25 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙 酯-氯仿(20 12 3)为展开剂，展开，展距约12cm，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有鸡 血藤；本发明曾参考文献(中国现代药物应用，2008，2 (7) :16_17 ；时珍国医国药，2005， 16(11) :1125-26 ；广东药学，2004，14(5) :7_8 ；中国药业，2000，9 (12) 12)进行检测，结果 表明，上述文献中的薄层色谱展开条件对鸡血藤提取效率过低，且无法排除阴性干扰，不能 作为本发明所述颗粒剂的质量检测方法。经反复实验摸索，意外发现仅按本发明的上述方 法操作，可实现对鸡血藤的鉴别，且没有阴性干扰。由此可见，本发明的方法专属性强且操 作方便。2)山楂的鉴别取所述中药颗粒8-15g，加甲醇20ml，超声处理10-20min，滤过， 滤液作为供试品溶液；另取山楂对照药材0. Ig,加甲醇10ml，超声处理(功率320W，频 率40kHz) 15-20min,滤过，滤液作为对照药材溶液；另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每Iml 含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；取对照药材溶液及对照品溶液1-3 μ 1，供试品溶液 4-10μ1，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10 4 1)为展开 剂，展开，展距约6cm，取出，吹干，喷以0. 溴甲酚绿乙醇液；供试品色谱中在与对照药材 及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有山楂；本发明曾参考文献(时珍国医国药，2007，18(3) :641_42 ；国际医药卫生导报， 2007,13(14) 91-93 ；时珍国医国药，2006，17 (7) 1261-62 ；中国中医药信息杂志，2005， 12(8) :38-39;华西药学杂志，2003，18(6) 480-81)进行检测，结果表明，上述文献中薄层 色谱的展开条件均不能有效地将枸橼酸与其它物质有效分离，且枸橼酸提取效率过低，不 能作为本发明所述颗粒剂的质量检测方法。经反复实验摸索，意外发现样品处理仅以甲醇 直接超声提取，过滤，即可，样品处理步骤少，操作简单。并且实验表明在以乙酸乙酯-甲 醇-甲酸(10 4 1)为展开剂的条件下，枸橼酸可与其它物质有效分离，且枸橼酸斑点 明显，无阴性干扰，适合本发明颗粒剂的质量鉴别。所述含量测定方法包括如下步骤1)对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img的溶液，即得；2)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 5ml、Iml至50ml量瓶中，另精密量取对照品溶液0. 5ml、 Iml、2ml、3ml至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别精密吸取5 μ 1注入液相色谱仪 测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其中色谱条件与系统适用 性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-O.Olmol/L柠檬酸(28-35 65-72)为 流动相；检测波长为280nm ；柱温25_35°C ；理论板数按表儿茶素峰计算应不低于2000 ；3)测定法取所述中药颗粒，研细，取约0. 5-lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50 %甲醇 40-100ml，摇勻，超声处理(功率320W，频率40kHz) 30-40min,滤过，滤液浓缩至约2ml，拌 入2-3g的聚酰胺(过100 200目筛)，拌勻，加到聚酰胺干柱(100 200目，4_6g，内径 2cm)上，依次用水100ml、20%甲醇100ml、70%甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用 IOOml量瓶收集至刻度，摇勻，滤过，取续滤液5μ 1注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲 线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。
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本发明的中药颗粒以表儿茶素计，不得少于0. 70mg/g。本发明的上述色谱条件对表儿茶素的分离度好，色谱峰形对称，没有阴性干扰。综上所述，本发明的质量检测方法的鉴别法选择以芒柄花素对照品、山楂对照药 材、枸橼酸对照品来进行对照，直接比较斑点的大小和位置，操作简便、直观；含量测定以含 表儿茶素确定，专属性强，且均未出现阴性干扰，可使所述中药颗粒的质量更加有保障，药 效更为确切，为探讨治疗乳腺增生病的中药药理作用机制、以及药品的质量检测提供可靠 的依据。
图1为本发明鸡血藤薄层色谱图；其中，1.鸡血藤阴性对照液；2.供试品溶液；3.芒柄花素对照液；图2为本发明山楂薄层色谱图；其中，1.山楂阴性对照液；2.供试品溶液；3.山楂对照药材；4.枸橼酸对照液；图3-A、图3-B、图3-C为本发明表儿茶素高效液相色谱图；其中，A 阴性对照B 表儿茶素对照品C 样品。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1一、处方山楂1200g，炒麦芽2000g，鸡血藤2000g，通草660g。二、制备方法以上四味药材，加水煎煮三次，每次0. 5小时，合并煎液，滤过，滤液 浓缩至相对密度为1. 10 1. 12(70°C )的稠膏，加入适量糊精，流化床制粒，干燥，整粒，制 成颗粒，即得本发明的中药颗粒。三、鉴别与含量测定方法如下1.鉴别方法包括如下步骤(1)鸡血藤鉴别专属性试验供试品溶液的制备取中药颗粒样品10g，加水50ml使溶解，加乙醚IOOml超声处 理30min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液。阴性溶液的制备按处方比例称取除鸡血藤以外的药材，同法制备缺鸡血藤的中 药颗粒，照上述供试品溶液制备方法处理，即得阴性对照液。对照品溶液的制备取芒柄花素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对 照品溶液。照《中国药典》2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，取对照品溶液2 μ 1，供 试品溶液与阴性对照溶液各20 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙 酯-氯仿(20 12 3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色 谱中，在与芒柄花素对照品相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。结果见图1。(2)山楂鉴别专属性试验供试品溶液的制备取中药颗粒样品10g，加甲醇20ml，超声处理15min，滤过，滤 液作为供试品溶液。
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阴性对照溶液的制备按处方比例称取除山楂以外的药材，同法制备缺山楂的中 药颗粒，照上述供试品溶液制备方法处理，即得阴性对照液。对照药材溶液制备取山楂对照药材0. Ig,加甲醇10ml，超声处理15min，滤过，滤 液作为对照药材溶液。对照品溶液制备取枸橼酸对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照 品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照药材溶液及对 照品溶液2 μ 1，供试品溶液和阴性对照液各8 μ 1，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸 乙酯-甲醇-甲酸(10 4 1)为展开剂，展开，展距约6cm，取出，吹干，喷以0. 溴甲 酚绿乙醇液。供试品色谱中，在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑 点，阴性对照无此斑点，无干扰，结果见图2。2.含量测定方法专属性试验照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲 醇-O.Olmol/L柠檬酸(33 67)为流动相；检测波长为280nm ；柱温30°C。理论板数按表 儿茶素峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img的 溶液，即得。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 5ml、lml至50ml量瓶中，另精密量取对 照品溶液0. 5ml、1ml、2ml、3ml至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别精密吸取5 μ 1 注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定法取重量差异项下的中药颗粒样品，研细，取约0. 75g，精密称定，置具塞锥 形瓶中，加入50%甲醇50ml，摇勻，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至约2ml，拌入2g的聚 酰胺(过100 200目筛)，拌勻，加到聚酰胺干柱(100 200目，5g，内径2cm)上，依次用 水IOOml、20%甲醇100ml、70%甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用IOOml量瓶收集 至刻度，摇勻，滤过，取续滤液5μ 1注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲线上读出供试品 溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。本品每g含表儿茶素(C15H14O6)计为0. 9Imgo阴性对照溶液的制备按处方比例称取麦芽及通草按制备方法制备后按测定法项 下处理，得阴性对照溶液。按上述色谱条件分别测定阴性对照、表儿茶素对照品、中药颗粒样品，结果见图3。 在此色谱条件下，表儿茶素能够较好的分离，且峰形良好，保留时间适中。阴性对照液在表 儿茶素保留时间处无色谱峰出现，无干扰。实施例2取实施例1的中药颗粒，鉴别方法包括如下步骤(1)鸡血藤的鉴别取样品15g，加水50ml使溶解，加乙醚IOOml超声处理(功率 320W，频率40kHz)20min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液。另取 芒柄花素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中 国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照品溶液1 μ 1，供试品溶液16μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-氯仿(20 12 3)为展开剂，展开，取出，晾 干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色谱中，在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点。(2)山楂的鉴别取本品15g，加甲醇20ml，超声处理lOmin，滤过，滤液作为供试品 溶液。另取山楂对照药材0. lg，加甲醇10ml，超声处理(功率320W，频率40kHz)20min，滤 过，滤液作为对照药材溶液。另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对 照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照药材溶液及 对照品溶液1 μ 1，供试品溶液4μ 1，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲 酸(10 4 1)为展开剂，展开，取出，吹干，喷以0.1%溴甲酚绿乙醇液。供试品色谱中， 在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。含量测定方法包括如下步骤照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲 醇-O.Olmol/L柠檬酸(28 72)为流动相；检测波长为280nm ；柱温35°C。理论板数按表 儿茶素峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img的 溶液，即得。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 5ml、lml至50ml量瓶中，另精密量取对 照品溶液0. 5ml、1ml、2ml、3ml至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别精密吸取5 μ 1 注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定法取重量差异项下的本品，研细，取约lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入 50%甲醇100ml，摇勻，超声处理(功率320W，频率40kHz)40min，滤过，滤液浓缩至约2ml， 拌入3g的聚酰胺(过100 200目筛)，拌勻，加到聚酰胺干柱(100 200目，4g，内径2cm) 上，依次用水100ml、20%甲醇100ml、70%甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用IOOml 量瓶收集至刻度，摇勻，滤过，取续滤液5μ 1注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲线上读 出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。本品每g含表儿茶素(C15H14O6)计为0. 90mg。实施例3取实施例1中的药物组合物，鉴别方法包括如下步骤(1)鸡血藤的鉴别取样品8g，加水50ml使溶解，加乙醚IOOml超声处理(功率 320W，频率40kHz)40min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液。另取 芒柄花素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中 国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照品溶液3μ 1，供试品溶液25μ 1，分别点于同 一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-氯仿(20 12 3)为展开剂，展开，取出，晾 干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色谱中，在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点。(2)山楂的鉴别取本品8g，加甲醇20ml，超声处理20min，滤过，滤液作为供试品 溶液。另取山楂对照药材0. lg，加甲醇10ml，超声处理(功率320W，频率40kHz) 15min，滤 过，滤液作为对照药材溶液。另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对 照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照药材溶液及对 照品溶液3 μ 1，供试品溶液10 μ 1，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10 4 1)为展开剂，展开，展距约6cm，取出，吹干，喷以0.1%溴甲酚绿乙醇液。供 试品色谱中，在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。含量测定方法包括如下步骤照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲 醇-O.Olmol/L柠檬酸(35 65)为流动相；检测波长为280nm ；柱温25°C。理论板数按表 儿茶素峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img的 溶液，即得。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 5ml、lml至50ml量瓶中，另精密量取对 照品溶液0. 5ml、1ml、2ml、3ml至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别精密吸取5 μ 1 注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定法取重量差异项下的本品，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加 入50%甲醇40ml，摇勻，超声处理(功率320W，频率40kHz) 30min,滤过，滤液浓缩至约2ml， 拌入1.5g的聚酰胺(过100 200目筛)，拌勻，加到聚酰胺干柱(100 200目，6g，内径 2cm)上，依次用水100ml、20%甲醇100ml、70%甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用 IOOml量瓶收集至刻度，摇勻，滤过，取续滤液5μ 1注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲 线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。本品每g含表儿茶素(C15H14O6)计为0. 92mg。实施例4本发明含量测定方法的精密度试验取低中高三种浓度的对照品溶液各3份，按实施例1中色谱条件测定，记录峰面 积，结果见表1。表1精密度考察结果
权利要求
一种由山楂、炒麦芽、鸡血藤和通草制成的治疗乳腺增生的中药颗粒质量检测方法，其特征在于，该方法包括鉴别和含量测定两部分，其中鉴别包括采用薄层色谱法，分别用芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品进行的鉴别；含量测定以含表儿茶素确定，以表儿茶素计，不得少于0.70mg/g；其中，所述治疗乳腺增生的中药颗粒采用如下方法制备取山楂6份、炒麦芽10份、鸡血藤10份、通草3.3份，然后加8～10倍量的水煎煮三次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至70℃的相对密度为1.10～1.12的稠膏，加入3份糊精，流化床制粒，干燥，整粒，制成颗粒，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鉴别包括如下鉴别中的一种或多种1)鸡血藤的鉴别取所述中药颗粒8-15g，加水50ml使溶解，加乙醚IOOml超声处理 20-40min,分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液；另取芒柄花素对照 品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，取对照品溶液 1-3μ1，供试品溶液15-25μ1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以比例为20 12 3的 环已烷-乙酸乙酯_氯仿为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色 谱中在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有鸡血藤；2)山楂的鉴别取所述中药颗粒8-15g，加甲醇20ml，超声处理10-20min，滤过，滤液 作为供试品溶液；另取山楂对照药材0. lg，加甲醇10ml，超声处理15-20min，滤过，滤液作 为对照药材溶液；另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液； 照薄层色谱法试验，取对照药材溶液及对照品溶液1_3μ 1，供试品溶液4-10μ 1，分别点于 同一块聚酰胺薄膜上，以比例为10 4 1的乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取 出，吹干，喷以0. 溴甲酚绿乙醇液；供试品色谱中在与对照药材及对照品溶液色谱相应 位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有山楂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含量测定方法包括如下步骤1)对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img的溶液，即得；2)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 5ml、Iml至50ml量瓶中，另精密量取对照品溶液0. 5ml、lml、 2ml、3ml至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别精密吸取5 μ 1注入液相色谱仪 测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其中色谱条件与系统适用 性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0. 01mol/L柠檬酸为流动相，比例为 28-35 65-72;检测波长为280nm;柱温25-35°C ；理论板数按表儿茶素峰计算应不低于 2000 ；3)测定法取所述中药颗粒，研细，取约0. 5-lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50 %甲醇 40-100ml，摇勻，超声处理30-40min，滤过，滤液浓缩至约2ml，拌入2_3g的聚酰胺，拌勻，加 到聚酰胺干柱上，依次用水100ml、20%甲醇100ml、70%甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱 液后，用IOOml量瓶收集至刻度，摇勻，滤过，取续滤液5μ 1注入液相色谱仪测定峰面积，从 标准曲线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。
全文摘要
本发明提供了一种由山楂、炒麦芽、鸡血藤和通草制成的治疗乳腺增生的中药颗粒质量检测方法，该方法包括鉴别和含量测定两部分，其中鉴别包括采用薄层色谱法，分别用芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品进行的鉴别；含量测定以含表儿茶素确定，以表儿茶素计，不得少于0.70mg/g。本发明选择以芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品来进行对照，直接比较斑点的大小和位置，操作简便、直观；含量测定以含表儿茶素确定，质量更加有保障，药效更为确切。
文档编号A61K36/8998GK101954021SQ201010294950
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者刘松青, 刘耀, 夏培元, 林彩, 王章阳, 赵映兰, 陈勇川 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
技术领域：
本发明涉及中成药的质量检测方法，具体地说，本发明涉及一种治疗乳腺增生的 中药组合物质量检测方法。
背景技术：
乳腺增生病约占乳腺疾病的70 80%，是育龄妇女最常见的乳腺疾病，其发病率 约为40%，伴有明显的乳房疼痛，常形成乳房结节或肿块，部分患者有发展为乳腺癌的危 险。因此，对乳腺增生进行有效治疗对于维护广大妇女的健康，提高生活质量，预防乳腺癌 具有极其重要的意义。长期以来国外多用激素类、维生素类药物或手术治疗乳腺增生。80年 代以来，采用三苯氧胺治疗乳腺增生，有报道对雌激素受体阳性的患者，有效率可达86%， 但长期服用可发生阴道出血、血小板减少、恶心、呕吐、水肿及血钙增加等副作用。鉴于乳腺增生的发病与神经内分泌失衡有关，治疗上需长期用药的特点，传统中 医药较之于化学药品更具优势。国内采用中医药治疗乳腺增生取得了一定的进展，中国药 典2005年版收载了三个治疗乳腺增生的方剂乳块消片、乳疾灵颗粒和乳癖消片。然而，由于此类方剂的组方复杂，药味大多在10味左右，甚至更多。这为探讨治疗 乳腺增生病的中药药理作用机制、以及药品的质量检测增添了一定的难度。由本申请人申 请的“一种治疗乳腺增生的中药组合物、制剂及其制备方法”，公开号CN101219192A，其由山 楂、炒麦芽、鸡血藤和通草四味中药原料组成，该中药组合物具有明确的疗效，长期有效率 达99.6%。但目前尚无相关产品的质量检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗乳腺增生的中药组合物质量检测方法。为了实现本发明目的，本发明提供一种由山楂、炒麦芽、鸡血藤和通草制成的治疗 乳腺增生的中药颗粒质量检测方法，该方法包括鉴别和含量测定两部分，其中鉴别包括采 用薄层色谱法，分别用芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品进行的鉴别；含量测 定以含表儿茶素确定，以表儿茶素计，不得少于0. 70mg/g。本发明所述治疗乳腺增生的中药颗粒，其采用如下方法制备取山楂6份、炒麦芽10份、鸡血藤10份、通草3. 3份，然后加8 10倍量的水煎 煮三次，每次0. 5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1. 10 1. 12 (700C )的稠 膏，加入3份糊精，流化床制粒，干燥，整粒，制成颗粒，即得。本发明的质量检测方法，其中所述鉴别包括如下鉴别中的一种或多种1)鸡血藤的鉴别取所述中药颗粒8-15g，加水50ml使溶解，加乙醚IOOml超声 处理(功率320W，频率40kHz) 20-40min,分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试 品溶液；另取芒柄花素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液；取对照 品溶液1-3 μ 1，供试品溶液15-25 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙 酯-氯仿(20 12 3)为展开剂，展开，展距约12cm，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有鸡 血藤；本发明曾参考文献(中国现代药物应用，2008，2 (7) :16_17 ；时珍国医国药，2005， 16(11) :1125-26 ；广东药学，2004，14(5) :7_8 ；中国药业，2000，9 (12) 12)进行检测，结果 表明，上述文献中的薄层色谱展开条件对鸡血藤提取效率过低，且无法排除阴性干扰，不能 作为本发明所述颗粒剂的质量检测方法。经反复实验摸索，意外发现仅按本发明的上述方 法操作，可实现对鸡血藤的鉴别，且没有阴性干扰。由此可见，本发明的方法专属性强且操 作方便。2)山楂的鉴别取所述中药颗粒8-15g，加甲醇20ml，超声处理10-20min，滤过， 滤液作为供试品溶液；另取山楂对照药材0. Ig,加甲醇10ml，超声处理(功率320W，频 率40kHz) 15-20min,滤过，滤液作为对照药材溶液；另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每Iml 含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；取对照药材溶液及对照品溶液1-3 μ 1，供试品溶液 4-10μ1，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10 4 1)为展开 剂，展开，展距约6cm，取出，吹干，喷以0. 溴甲酚绿乙醇液；供试品色谱中在与对照药材 及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有山楂；本发明曾参考文献(时珍国医国药，2007，18(3) :641_42 ；国际医药卫生导报， 2007,13(14) 91-93 ；时珍国医国药，2006，17 (7) 1261-62 ；中国中医药信息杂志，2005， 12(8) :38-39;华西药学杂志，2003，18(6) 480-81)进行检测，结果表明，上述文献中薄层 色谱的展开条件均不能有效地将枸橼酸与其它物质有效分离，且枸橼酸提取效率过低，不 能作为本发明所述颗粒剂的质量检测方法。经反复实验摸索，意外发现样品处理仅以甲醇 直接超声提取，过滤，即可，样品处理步骤少，操作简单。并且实验表明在以乙酸乙酯-甲 醇-甲酸(10 4 1)为展开剂的条件下，枸橼酸可与其它物质有效分离，且枸橼酸斑点 明显，无阴性干扰，适合本发明颗粒剂的质量鉴别。所述含量测定方法包括如下步骤1)对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img的溶液，即得；2)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 5ml、Iml至50ml量瓶中，另精密量取对照品溶液0. 5ml、 Iml、2ml、3ml至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别精密吸取5 μ 1注入液相色谱仪 测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其中色谱条件与系统适用 性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-O.Olmol/L柠檬酸(28-35 65-72)为 流动相；检测波长为280nm ；柱温25_35°C ；理论板数按表儿茶素峰计算应不低于2000 ；3)测定法取所述中药颗粒，研细，取约0. 5-lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50 %甲醇 40-100ml，摇勻，超声处理(功率320W，频率40kHz) 30-40min,滤过，滤液浓缩至约2ml，拌 入2-3g的聚酰胺(过100 200目筛)，拌勻，加到聚酰胺干柱(100 200目，4_6g，内径 2cm)上，依次用水100ml、20%甲醇100ml、70%甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用 IOOml量瓶收集至刻度，摇勻，滤过，取续滤液5μ 1注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲 线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。
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本发明的中药颗粒以表儿茶素计，不得少于0. 70mg/g。本发明的上述色谱条件对表儿茶素的分离度好，色谱峰形对称，没有阴性干扰。综上所述，本发明的质量检测方法的鉴别法选择以芒柄花素对照品、山楂对照药 材、枸橼酸对照品来进行对照，直接比较斑点的大小和位置，操作简便、直观；含量测定以含 表儿茶素确定，专属性强，且均未出现阴性干扰，可使所述中药颗粒的质量更加有保障，药 效更为确切，为探讨治疗乳腺增生病的中药药理作用机制、以及药品的质量检测提供可靠 的依据。
图1为本发明鸡血藤薄层色谱图；其中，1.鸡血藤阴性对照液；2.供试品溶液；3.芒柄花素对照液；图2为本发明山楂薄层色谱图；其中，1.山楂阴性对照液；2.供试品溶液；3.山楂对照药材；4.枸橼酸对照液；图3-A、图3-B、图3-C为本发明表儿茶素高效液相色谱图；其中，A 阴性对照B 表儿茶素对照品C 样品。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1一、处方山楂1200g，炒麦芽2000g，鸡血藤2000g，通草660g。二、制备方法以上四味药材，加水煎煮三次，每次0. 5小时，合并煎液，滤过，滤液 浓缩至相对密度为1. 10 1. 12(70°C )的稠膏，加入适量糊精，流化床制粒，干燥，整粒，制 成颗粒，即得本发明的中药颗粒。三、鉴别与含量测定方法如下1.鉴别方法包括如下步骤(1)鸡血藤鉴别专属性试验供试品溶液的制备取中药颗粒样品10g，加水50ml使溶解，加乙醚IOOml超声处 理30min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液。阴性溶液的制备按处方比例称取除鸡血藤以外的药材，同法制备缺鸡血藤的中 药颗粒，照上述供试品溶液制备方法处理，即得阴性对照液。对照品溶液的制备取芒柄花素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对 照品溶液。照《中国药典》2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，取对照品溶液2 μ 1，供 试品溶液与阴性对照溶液各20 μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙 酯-氯仿(20 12 3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色 谱中，在与芒柄花素对照品相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。结果见图1。(2)山楂鉴别专属性试验供试品溶液的制备取中药颗粒样品10g，加甲醇20ml，超声处理15min，滤过，滤 液作为供试品溶液。
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阴性对照溶液的制备按处方比例称取除山楂以外的药材，同法制备缺山楂的中 药颗粒，照上述供试品溶液制备方法处理，即得阴性对照液。对照药材溶液制备取山楂对照药材0. Ig,加甲醇10ml，超声处理15min，滤过，滤 液作为对照药材溶液。对照品溶液制备取枸橼酸对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照 品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照药材溶液及对 照品溶液2 μ 1，供试品溶液和阴性对照液各8 μ 1，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸 乙酯-甲醇-甲酸(10 4 1)为展开剂，展开，展距约6cm，取出，吹干，喷以0. 溴甲 酚绿乙醇液。供试品色谱中，在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑 点，阴性对照无此斑点，无干扰，结果见图2。2.含量测定方法专属性试验照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲 醇-O.Olmol/L柠檬酸(33 67)为流动相；检测波长为280nm ；柱温30°C。理论板数按表 儿茶素峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img的 溶液，即得。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 5ml、lml至50ml量瓶中，另精密量取对 照品溶液0. 5ml、1ml、2ml、3ml至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别精密吸取5 μ 1 注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定法取重量差异项下的中药颗粒样品，研细，取约0. 75g，精密称定，置具塞锥 形瓶中，加入50%甲醇50ml，摇勻，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至约2ml，拌入2g的聚 酰胺(过100 200目筛)，拌勻，加到聚酰胺干柱(100 200目，5g，内径2cm)上，依次用 水IOOml、20%甲醇100ml、70%甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用IOOml量瓶收集 至刻度，摇勻，滤过，取续滤液5μ 1注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲线上读出供试品 溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。本品每g含表儿茶素(C15H14O6)计为0. 9Imgo阴性对照溶液的制备按处方比例称取麦芽及通草按制备方法制备后按测定法项 下处理，得阴性对照溶液。按上述色谱条件分别测定阴性对照、表儿茶素对照品、中药颗粒样品，结果见图3。 在此色谱条件下，表儿茶素能够较好的分离，且峰形良好，保留时间适中。阴性对照液在表 儿茶素保留时间处无色谱峰出现，无干扰。实施例2取实施例1的中药颗粒，鉴别方法包括如下步骤(1)鸡血藤的鉴别取样品15g，加水50ml使溶解，加乙醚IOOml超声处理(功率 320W，频率40kHz)20min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液。另取 芒柄花素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中 国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照品溶液1 μ 1，供试品溶液16μ 1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-氯仿(20 12 3)为展开剂，展开，取出，晾 干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色谱中，在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点。(2)山楂的鉴别取本品15g，加甲醇20ml，超声处理lOmin，滤过，滤液作为供试品 溶液。另取山楂对照药材0. lg，加甲醇10ml，超声处理(功率320W，频率40kHz)20min，滤 过，滤液作为对照药材溶液。另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对 照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照药材溶液及 对照品溶液1 μ 1，供试品溶液4μ 1，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲 酸(10 4 1)为展开剂，展开，取出，吹干，喷以0.1%溴甲酚绿乙醇液。供试品色谱中， 在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。含量测定方法包括如下步骤照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲 醇-O.Olmol/L柠檬酸(28 72)为流动相；检测波长为280nm ；柱温35°C。理论板数按表 儿茶素峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img的 溶液，即得。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 5ml、lml至50ml量瓶中，另精密量取对 照品溶液0. 5ml、1ml、2ml、3ml至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别精密吸取5 μ 1 注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定法取重量差异项下的本品，研细，取约lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入 50%甲醇100ml，摇勻，超声处理(功率320W，频率40kHz)40min，滤过，滤液浓缩至约2ml， 拌入3g的聚酰胺(过100 200目筛)，拌勻，加到聚酰胺干柱(100 200目，4g，内径2cm) 上，依次用水100ml、20%甲醇100ml、70%甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用IOOml 量瓶收集至刻度，摇勻，滤过，取续滤液5μ 1注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲线上读 出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。本品每g含表儿茶素(C15H14O6)计为0. 90mg。实施例3取实施例1中的药物组合物，鉴别方法包括如下步骤(1)鸡血藤的鉴别取样品8g，加水50ml使溶解，加乙醚IOOml超声处理(功率 320W，频率40kHz)40min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液。另取 芒柄花素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中 国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照品溶液3μ 1，供试品溶液25μ 1，分别点于同 一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-氯仿(20 12 3)为展开剂，展开，取出，晾 干，置紫外光灯254nm下检视。供试品色谱中，在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点。(2)山楂的鉴别取本品8g，加甲醇20ml，超声处理20min，滤过，滤液作为供试品 溶液。另取山楂对照药材0. lg，加甲醇10ml，超声处理(功率320W，频率40kHz) 15min，滤 过，滤液作为对照药材溶液。另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对 照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，取对照药材溶液及对 照品溶液3 μ 1，供试品溶液10 μ 1，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10 4 1)为展开剂，展开，展距约6cm，取出，吹干，喷以0.1%溴甲酚绿乙醇液。供 试品色谱中，在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。含量测定方法包括如下步骤照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲 醇-O.Olmol/L柠檬酸(35 65)为流动相；检测波长为280nm ；柱温25°C。理论板数按表 儿茶素峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img的 溶液，即得。标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 5ml、lml至50ml量瓶中，另精密量取对 照品溶液0. 5ml、1ml、2ml、3ml至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别精密吸取5 μ 1 注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定法取重量差异项下的本品，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加 入50%甲醇40ml，摇勻，超声处理(功率320W，频率40kHz) 30min,滤过，滤液浓缩至约2ml， 拌入1.5g的聚酰胺(过100 200目筛)，拌勻，加到聚酰胺干柱(100 200目，6g，内径 2cm)上，依次用水100ml、20%甲醇100ml、70%甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱液后，用 IOOml量瓶收集至刻度，摇勻，滤过，取续滤液5μ 1注入液相色谱仪测定峰面积，从标准曲 线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。本品每g含表儿茶素(C15H14O6)计为0. 92mg。实施例4本发明含量测定方法的精密度试验取低中高三种浓度的对照品溶液各3份，按实施例1中色谱条件测定，记录峰面 积，结果见表1。表1精密度考察结果
权利要求
一种由山楂、炒麦芽、鸡血藤和通草制成的治疗乳腺增生的中药颗粒质量检测方法，其特征在于，该方法包括鉴别和含量测定两部分，其中鉴别包括采用薄层色谱法，分别用芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品进行的鉴别；含量测定以含表儿茶素确定，以表儿茶素计，不得少于0.70mg/g；其中，所述治疗乳腺增生的中药颗粒采用如下方法制备取山楂6份、炒麦芽10份、鸡血藤10份、通草3.3份，然后加8～10倍量的水煎煮三次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至70℃的相对密度为1.10～1.12的稠膏，加入3份糊精，流化床制粒，干燥，整粒，制成颗粒，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鉴别包括如下鉴别中的一种或多种1)鸡血藤的鉴别取所述中药颗粒8-15g，加水50ml使溶解，加乙醚IOOml超声处理 20-40min,分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇Iml溶解，作为供试品溶液；另取芒柄花素对照 品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，取对照品溶液 1-3μ1，供试品溶液15-25μ1，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以比例为20 12 3的 环已烷-乙酸乙酯_氯仿为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色 谱中在与对照品相应位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有鸡血藤；2)山楂的鉴别取所述中药颗粒8-15g，加甲醇20ml，超声处理10-20min，滤过，滤液 作为供试品溶液；另取山楂对照药材0. lg，加甲醇10ml，超声处理15-20min，滤过，滤液作 为对照药材溶液；另取枸橼酸对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液； 照薄层色谱法试验，取对照药材溶液及对照品溶液1_3μ 1，供试品溶液4-10μ 1，分别点于 同一块聚酰胺薄膜上，以比例为10 4 1的乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取 出，吹干，喷以0. 溴甲酚绿乙醇液；供试品色谱中在与对照药材及对照品溶液色谱相应 位置上，显相同颜色的斑点时，说明所述中药颗粒含有山楂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含量测定方法包括如下步骤1)对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img的溶液，即得；2)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0. 5ml、Iml至50ml量瓶中，另精密量取对照品溶液0. 5ml、lml、 2ml、3ml至IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别精密吸取5 μ 1注入液相色谱仪 测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其中色谱条件与系统适用 性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0. 01mol/L柠檬酸为流动相，比例为 28-35 65-72;检测波长为280nm;柱温25-35°C ；理论板数按表儿茶素峰计算应不低于 2000 ；3)测定法取所述中药颗粒，研细，取约0. 5-lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50 %甲醇 40-100ml，摇勻，超声处理30-40min，滤过，滤液浓缩至约2ml，拌入2_3g的聚酰胺，拌勻，加 到聚酰胺干柱上，依次用水100ml、20%甲醇100ml、70%甲醇适量洗脱，弃去前200ml洗脱 液后，用IOOml量瓶收集至刻度，摇勻，滤过，取续滤液5μ 1注入液相色谱仪测定峰面积，从 标准曲线上读出供试品溶液中表儿茶素的含量，计算，即得。
全文摘要
本发明提供了一种由山楂、炒麦芽、鸡血藤和通草制成的治疗乳腺增生的中药颗粒质量检测方法，该方法包括鉴别和含量测定两部分，其中鉴别包括采用薄层色谱法，分别用芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品进行的鉴别；含量测定以含表儿茶素确定，以表儿茶素计，不得少于0.70mg/g。本发明选择以芒柄花素对照品、山楂对照药材、枸橼酸对照品来进行对照，直接比较斑点的大小和位置，操作简便、直观；含量测定以含表儿茶素确定，质量更加有保障，药效更为确切。
文档编号A61K36/8998GK101954021SQ201010294950
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者刘松青, 刘耀, 夏培元, 林彩, 王章阳, 赵映兰, 陈勇川 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
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