兽用狂犬病病毒与疫苗及二者的生产方法
专利名称：兽用狂犬病病毒与疫苗及二者的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种兽用狂犬病病毒与疫苗及二者的生产方法，属于生物制品技术领 域。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)感染引起的一种病症严重、病死率极 高的自然疫源性人兽共患传染病，死亡率几乎100%，目前尚无有效的治疗措施。野生动物 是RV的主要储存宿主，人一旦被携带狂犬病毒的此类动物咬伤，就会感染发病，其病死率 为100%。根据卫生部最新公布的传染病疫情统计数据，显示近年来狂犬病继续呈现凶险的 迹象。但是狂犬病没有特殊有效的治疗手段，注射狂犬病抗原是唯一有效手段。目前市场上的狂犬病疫苗基本都是采用转瓶工艺传代细胞培养的，大规模生产需 要大量的物力人力资源，成本较高，并且批间差异大，质量不稳定。高效的疫苗生产需要大量的以高产量从宿主系统中生产出病毒。病毒株生长的培 养条件对于获得该株系的可接受的高产量来说具有重大意义。因此，为了最大化所想要的 病毒的产量，系统和培养条件都必须特定地适合于提供对于产生所想要的病毒来说有利的 环境。
发明内容
本发明主要目的是提供一种狂犬病病毒及疫苗的生产方法，其特征在于，包括如 下步骤1)微载体生物反应器中，微载体密度为40 80g/L，加入2. OX 107 5. 0X 107cellS/g微载体的传代细胞及细胞生长液，启动细胞吸附程序，使微载体与传代细 胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞；2)上述传代细胞培养至4. 0X109cells/L 8X10lclcells/L时换用细胞维持液， 按照感染复数为M. 0. I. = 0. 001 1接种狂犬病病毒，启动病毒吸附程序，使病毒与微载 体上的细胞吸附完全后，换用病毒培养程序，扩增狂犬病病毒；3)采用半量换液连续收毒工艺，病毒培养2 5天后，第一次收获病毒液，收获比 例为总培养体积的50%，继续培养9 11天后，每24h收获换液一次，收获比例为总培养体 积的50%，收获狂犬病病毒；4)收获的病毒液，冻融，灭活纯化制得狂犬病毒抗原；5)加入佐剂混合后制得狂犬病灭活疫苗。优选地，本发明所述生物反应器为微载体悬浮培养生物反应器。更优选地，本发明所述生物反应器为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器。优选地，本发明所述微载体为网状、球形或片状。优选地，本发明所述微载体的成分为聚酯、明胶或多糖。更优选地，本发明所述微载体为网状的聚酯纤维。
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优选地，本发明所述细胞生长液为含5% 10%牛血清的DMEM培养基。更优选地，本发明所述细胞维持液为含 5%牛血清的DMEM培养基。优选地，本发明所述微载体悬浮培养生物反应器的培养条件为温度36°C 37°C， C02浓度为2. 5 % 5 %，培养液pH值为7. 0 7. 4。优选地，本发明所述步骤3)中所述狂犬病病毒液的体积为2. 5L 1000L。优选地，本发明所述步骤3)中所述的收获的次数为10 12次。本发明的另一方面为使用本发明方法制备的狂犬病病毒。本发明的另一方面为提供一种兽用狂犬病抗原的生产方法，即由本发明方法制备 狂犬病病毒后，收获病毒液，冻融，灭活纯化制得狂犬病毒抗原。本发明的又一方面为使用上述方法制备的狂犬病病毒抗原。本发明的另一方面为提供一种兽用狂犬病疫苗的生产方法，即由本发明方法制备 狂犬病病毒后，收获病毒液，冻融，灭活纯化制得狂犬病毒抗原，加入佐剂即可制得兽用狂 犬病灭活疫苗。本发明的又一方面为使用本发明方法制备的狂犬病灭活疫苗。技术效果与现有技术相比，本发明的狂犬病病毒的生产方法，具有以下有益效果1.采用本发明方法，解决了传统转瓶大规模生产时单批产量不高、批间差异大、产 品质量不稳定、劳动强度大、生产成本高等问题。本发明之方法生产规模大、单批次产量高。 目前国内采用搅拌式悬浮培养工艺培养动物细胞，单台生物反应器最大规模不超过100L ； 而本发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术培养动物细胞，单台生物反 应器规模达500L，最大可达1000L，单台规模提高5 10倍。本发明之方法为连续式封闭式 生产、半连续式收获病毒本发明的方法可以全封闭生产，自动换液，半连续收获方式收集 病毒液，减少了污染的机率，产品质量均一稳定，批间差异小。本发明方法制备的细胞接种 量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。 本发明方法解决了传统工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异大、批间差异大的问 题。本发明方法，可直接线性放大用于生产。2.本发明方法中采用的载体为网状的聚酯纤维，具有亲水性和生物无害性，lg微 载体可提供2400cm2的贴壁面积，在同样的空间内极大的增大了细胞的贴壁面积，增加了细 胞生长的密度，细胞数可达到1.0X109cellS/g微载体以上，其效能为传统转瓶培养系统的 数十倍，可以节省许多成本及人力。3.本发明方法制备的细胞接种量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度 的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。本发明提供一种新的工艺技术，能够极大的满足病 毒大量繁殖所需要的条件，并且能够制备高滴度的抗原，极大的满足疫苗制备所需，显著提 高了疫苗的产量和质量，降低生产成本。4.工艺参数控制精确本发明运用潮汐式微载体悬浮培养技术生产时可控参数 有温度、PH值、溶氧量、二氧化碳浓度、载体浓度，可实现在线监测的参数有葡萄糖、乳酸和 铵离子浓度，批次质量稳定，而传统转瓶培养工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异 大。本发明方法利用生物反应器，解决抗原浓度低、生产成本高、劳动强度大的问题，而且能 连续培养、占地小、生产规模大、无搅拌式悬浮培养时对细胞形成的剪切力、无气泡产生、对细胞伤害小。
图1为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器结构示意图。
具体实施例方式本发明实施例中使用了潮汐式微载体悬浮培养生物反应器，其他类型的微载体悬 浮培养生物反应器，如搅拌式、旋转式或灌注式微载体悬浮培养生物反应器，均可以使用 本发明之方法大规模生产狂犬病病毒或疫苗。优选地，本发明使用潮汐式微载体悬浮培养 生物反应器，可以提高培养时的培养基和溶解氧的供应，无气泡并且剪切力小，对细胞伤害本发明实施例中采用的生物反应器为潮汐式生物反应器。结构示意图如图1所 示。其中，各个标记分别为恒温搅拌系统1，培养基恒温备料槽体2，自动馈料系统3，恒温 培养箱4，载体瓶5，微载体6，DO检测器及pH控制器7，收集器8。较优地，本发明实施例中 采用了依据潮汐原理而设计的微载体悬浮培养生物反应器，培养系统分为两部份；一个是 载体瓶5，另一个是培养基恒温备料槽2。细胞固定在载体瓶，培养基流动于载体瓶与培养 基恒温备料槽之间，造成间歇性的暴露与淹没载体。本发明试验了反应器的载体瓶5体积 为0. 5L、2. 5L、5L、10L、20L、50L、100L，均能对温度、pH值、溶解氧、二氧化碳浓度自动控制。 本发明的实施例中载体瓶5体积为20L，培养基恒温备料槽2体积为500L。本发明实施例的微载体为网状纤维——聚酯纤维，本领域其他类型的微载体—— 球形、网状或片状的聚酯、明胶或多糖微载体，也可以起到固定细胞的作用，也能用于本发 明之方法大规模生产狂犬病病毒或疫苗。本发明实施例中，传代细胞使用了仓鼠肾细胞(BHK21)，其他本领域常用的传代细 胞如Vero细胞、Hamster Kidney细胞，CEF细胞，也可用于本发明之方法大规模生产狂犬病
病毒及疫苗。本发明实施例中，病毒株为Flury-LEP毒株(菌种号CVCCAV2012)，其他本领域常 用的病毒如Flury-HEP毒株(菌种号CVCCAV2013) .ERA毒株(菌种号CVCC AV61)、巴黎株 狂犬固定毒(菌种号CVCC AV2011)和CTN-1毒株(购于中国药品生物制品鉴定所)、和aG 毒株等也可用于本发明之方法大规模生产狂犬病病毒及疫苗。本发明所述方法中，在细胞吸附微载体阶段与细胞培养阶段，启动了细胞吸附程 序与细胞培养程序，本发明实施例中优化了反应器的控制参数，但本发明方法不仅限于实 施例中的参数，本领域技术人员可以根据本发明提供的技术启示，根据不同的生物反应器， 调整相应的参数，达到微载体与细胞充分结合后，大量扩增细胞的目的。本发明所述方法中，在病毒吸附细胞阶段与病毒培养阶段，启动了病毒吸附程序 与病毒培养程序，本发明实施例中优化了反应器的控制参数，但本发明方法不仅限于实施 例中的参数，本领域技术人员可以根据本发明提供的技术启示，根据不同的生物反应器，调 整相应的参数，达到病毒与细胞及微载体充分结合后，大量扩增病毒的目的。本发明试验了微载体密度为40 80g/L，加入2. 0X 107 5. 0X 107cells/g微 载体的传代细胞，更优地，本发明实施例中使用的微载体密度为60g/L，加入2. 0X107 5.0X107cells/g微载体的传代细胞，当传代细胞的密度达到4. OX 109cells/L 8X1010cells/L时，即密度达到初始密度的5 20倍时，换用细胞维持液，起始病毒吸附与
培养程序为佳。本发明试验了按照感染复数为M. 0. I. = 0. 001 1接种狂犬病病毒，收获的狂犬 病病毒毒价最高，优选地，本发明实施例中使用了 M. 0. I. = 0. 01接种病毒，启动病毒吸附 程序与病毒培养程序，扩增狂犬病病毒。本发明收获培养液，制备狂犬病病毒液，采用了从培养基恒温备料槽2通过微电 脑控制直接收取培养液，反复冻融后冷冻保存备用。优选地，本发明实施例中采用-20°C冷 冻、常温融解反复两次的方法，使病毒充分从细胞中释放出来，从而获得高含量病毒液。本发明生物反应器单批次收获的狂犬病病毒液的体积为2. 5L 1000L，本发明实 施例试验了单批次收获的狂犬病病毒液的体积为500L，本领域技术人员可以利用本发明之 方法对单批次收获的病毒液体积进行线性放大，可以放大至1000L。本发明所述收获病毒液为采用半量换液连续收毒工艺，优选地，本发明所述的收 获的次数为10 12次，更优选地，本发明实施例中试验了每隔24h收获，连续收获12次的 病毒与收获病毒制备的疫苗，经检验全部达到《中华人民共和国兽药典》之要求。本发明实施例中疫苗的制备方法为，将多次收获检验合格的病毒液混合后经过滤 净化系统除去细胞碎片等杂质后经灭活剂灭活后，加入佐剂混合制得狂犬病灭活疫苗。本 领域其他常用的狂犬病疫苗制备所用毒株，如Flury HEP、ERA、巴黎株狂犬固定毒、CTN-1毒 株和aG毒株等，多次收获的病毒液混合后经灭活也可用于制备本发明所述疫苗。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1狂犬病疫苗的生产方法1.病毒与细胞株用于制备狂犬病疫苗的病毒株为LEP-Flury毒株，经过致病性测试，该毒株病毒 不具有致病性。以对该病毒株具有良好敏感性的细胞系仓鼠肾细胞(BHK21)，作为制苗用细 胞系，藉以感染并大量繁殖狂犬病毒。2.制备方法(1)将制备疫苗用细胞系仓鼠肾细胞(BHK21)接种到加有DMEM液体培养基(包括 5%牛血清、2. 2g/L NaHC03、50IU/ml 硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100IU/ml 青霉素 G钠盐(Penicillin G Sodium)、pH值为7. 2)与聚酯纤维微载体的载体罐内；微载体密度 为60g/L，细胞初始接种量为2. 7X107cellS/g微载体。(2)于37°C、5% C02培养环境下，细胞贴附4h，使上述制备疫苗用细胞与微载体混 合均勻，并使细胞贴附在微载体上。贴附程序参数为载体瓶中培养液上升速率为2400ml/ min，培养液在载体瓶顶部停留时间为lmin ；载体瓶中培养液下降速率为2400ml/min，培 养液在载体瓶底部停留时间为30s、设定最大换液量18500ml ；4h后切换为细胞培养程序， 细胞培养程序参数为载体瓶中培养液上升速率为1800ml/min，培养液在载体瓶顶部停留 时间为lmin ；载体瓶中培养液下降速率为ISOOml/min，培养液在载体瓶底部停留时间为 lmin、设定最大换液量18，500ml。
(3)于37°C、5% C02培养环境下，使细胞在上述微载体上生长，培养5日后，细胞 密度为3. 24X101(lcellS/L微载体，换用添加2%牛血清的DMEM细胞维持培养液，按病毒感 染复数(M. 0. I.)为0.01的比例接种狂犬病毒LEP-Flury毒株，并使之感染细胞，使病毒增 殖，病毒吸附程序为载体瓶中培养液上升速率为1500ml/min，培养液在载体瓶顶部停留 时间为lmin ；载体瓶中培养液下降速率为15000ml/min，培养液在载体瓶底部停留时间为 lmin、设定最大换液量18，500ml。(4)于37°C、5% C02培养环境下继续培养；培养5日后，第一次收获，采用半连续 工艺，换液比例为50% ；连续培养11天，每24h收获一次，每次换液比例为50% ；(5)将半量换液连续收毒工艺收获的病毒液与生物反应器的病毒液于-20°C，常 温冻融两次后混合，并进行以下检验(a)纯净性检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录相关规定进行检验，结果 无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。(b)病毒含量测定按照常规小鼠脑内接种法进行。即将收获的狂犬病毒液用灭 菌生理盐水进行10倍系列稀释，每个病毒液取10_3 10_6各4个稀释度，每个稀释度通过 脑内接种注射4只11 13g的昆明系小鼠，0. 03ml/只，连续观察14天，记录14天后小鼠 死亡情况，并根据Reed-Muench法计算病毒含量，每1. 0ml含病毒为107 8LD5(1 ；(c)特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释成为每1ml含有100个小鼠的最小感染 量的病毒悬液，与等量的抗狂犬病毒特异性血清充分混合，置15°C中和lh，其间振摇3次。 同时设立阳性对照组(病毒对照)和阴性对照组(生理盐水)。中和结束后分别接种小鼠 2只，每只脑内注射0. 03ml。除阳性对照组全部死亡外，其余两组在接种后2周内精神状态 良好，无不良反应。(6)经检验合格的狂犬病毒原液经0. 5 ii m滤芯过滤，除去细胞碎片。过滤后加入 1 40000-丙内酯，置4°C灭活24h时间，然后置于37°C水浴中水解2h即为狂犬病毒抗 原。灭活后取样脑内接种体重为11 13g小白鼠20只，每只0. 03ml，观察14d，应全部健 存(3d死亡不计)。(7)取灭活检验合格的抗原与等体积含量为20%的灭菌氢氧化铝胶盐水稀释液 均勻混合，在室温下沉淀24小时，吸出2/5上清液，即按全量浓缩至3/5，加入终含量为 1/1. 5万 1/3万硫柳汞溶液，充分混合，即为制成的狂犬病毒灭活疫苗。(8)成品检验，按照以上方法制备的狂犬病毒灭活疫苗应符合以下标准(a)物理性状本疫苗为粉红色均勻混悬液，静置后上层为红色澄清液体，下层为 淡灰色沉淀，经振摇即恢复原状。(b)纯净性检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录相关规定进行检验，结果 无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。(c)小白鼠安全试验取11 13g小白鼠8只，各脑内接种0. 03ml疫苗，另取同 样重量的8只各腹腔注射0. 5ml，观察14d无疫苗本身所致的不良反应。(d)犬安全试验取3只易感犬，各肌肉注射10个使用剂量的疫苗，逐日观察至21 日，无疫苗本身所致的不良反应。(e)效力检验用NIH法按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行测定，成品效力 为2. 8IU/剂，高于现行标准2. 5IU/剂。
对比例悬浮培养工艺与传统转瓶培养技术比较。通过对潮汐式细胞微载体悬浮培养系统与常用转瓶培养系统在相同细胞贴壁面 积时相关生产性能指标进行对比，结果如表1所示。表1不同培养系统增殖狂犬病毒的相关比较
培养方式潮汐式微栽体悬浮培养 系统3000ml转瓶培养系统细胞贴壁面 积2880000cm22880000cm2产量比值1个微载体培养系统2304个转瓶占地面积20 m2150m2人工投入2个人x4 h30个人x8 h风险暴露点<20个2304 个耗材成本低高清洗成本低高收获抗原3250 L2304x300ml=691.2L抗原效价1075LD50/ml1065LD50/ml操作工艺全自动微电脑控制程序繁瑣备注聚酯纤维载体贴壁面积lg = 2400cm2,1个潮汐式微载体悬浮培养系统加入 载体1200g。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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权利要求
一种兽用狂犬病病毒的生产方法，其特征在于，包括如下步骤1)微载体生物反应器中，微载体密度为40～80g/L，加入2.0×107～5.0×107cells/g微载体的传代细胞及细胞生长液，启动细胞吸附程序，使微载体与传代细胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞；2)上述传代细胞培养至4.0×109cells/L～8×1010cells/L时换用细胞维持液，按照感染复数为M.O.I.＝0.001～1接种狂犬病病毒，启动病毒吸附程序，使病毒与微载体上的细胞吸附完全后，换用病毒培养程序，扩增狂犬病病毒；3)采用半量换液连续收毒工艺，病毒培养2～5天后，第一次收获病毒液，收获比例为总培养体积的50％，继续培养9～11天后，每24h收获换液一次，收获比例为总培养体积的50％，收获狂犬病病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为微载体悬浮培养生物 反应器。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为潮汐式微载体悬浮培 养生物反应器。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体为网状、球形或片状。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体的成分为聚酯、明胶或多糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述细胞生长液为含5% 10%牛血清的培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述细胞维持液为含 5% 牛血清的培养基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体悬浮培养生物反应器的培养 条件为温度36°C 37°C，C02浓度为2. 5% 5%，培养液pH值为7. 0 7. 4。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述狂犬病病毒液的体积为 2. 5L 1000L。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的收获的次数为10 12次。
11.根据权利要求1 10任意一项方法制备的狂犬病病毒。
12.—种兽用狂犬病抗原的生产方法，其特征在于，由权利要求1 9任意一项方法制 备狂犬病病毒后，收获病毒液，冻融，灭活纯化制得狂犬病毒抗原。
13.根据权利要求12所述的方法制备的狂犬病抗原。
14.一种兽用狂犬病疫苗的生产方法，其特征在于，由权利要求1 10任意一项方法制 备狂犬病病毒后，收获病毒液，冻融，灭活纯化制得狂犬病毒抗原，加入佐剂即可制得兽用 狂犬病灭活疫苗。
15.根据权利要求14所述的方法制备的狂犬病灭活疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种大规模生产动物用狂犬病病毒及疫苗的方法，利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统大规模生产狂犬病病毒及疫苗将制备疫苗用细胞接种到含有培养液与微载体的载体罐中，使细胞贴附在微载体上；在适当培养环境下，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～20倍；将狂犬病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；换用细胞维持培养液，在适当培养环境下培养病毒；连续培养3～5日后，第一次收获病毒液，采用半连续工艺，换液比例为50％；继续培养9～11日，每24h收获换液一次；将收获的病毒液与生物反应器的病毒液混合，于-20℃常温反复冻融两次，灭活纯化后加入佐剂制备狂犬病疫苗。该方法生产规模大、单批次产量高、生产成本相对较低。
文档编号A61K39/205GK101979515SQ20101029495
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年3月30日
发明者乔荣岑, 孙进忠, 张许科 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司
技术领域：
本发明涉及一种兽用狂犬病病毒与疫苗及二者的生产方法，属于生物制品技术领 域。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)感染引起的一种病症严重、病死率极 高的自然疫源性人兽共患传染病，死亡率几乎100%，目前尚无有效的治疗措施。野生动物 是RV的主要储存宿主，人一旦被携带狂犬病毒的此类动物咬伤，就会感染发病，其病死率 为100%。根据卫生部最新公布的传染病疫情统计数据，显示近年来狂犬病继续呈现凶险的 迹象。但是狂犬病没有特殊有效的治疗手段，注射狂犬病抗原是唯一有效手段。目前市场上的狂犬病疫苗基本都是采用转瓶工艺传代细胞培养的，大规模生产需 要大量的物力人力资源，成本较高，并且批间差异大，质量不稳定。高效的疫苗生产需要大量的以高产量从宿主系统中生产出病毒。病毒株生长的培 养条件对于获得该株系的可接受的高产量来说具有重大意义。因此，为了最大化所想要的 病毒的产量，系统和培养条件都必须特定地适合于提供对于产生所想要的病毒来说有利的 环境。
发明内容
本发明主要目的是提供一种狂犬病病毒及疫苗的生产方法，其特征在于，包括如 下步骤1)微载体生物反应器中，微载体密度为40 80g/L，加入2. OX 107 5. 0X 107cellS/g微载体的传代细胞及细胞生长液，启动细胞吸附程序，使微载体与传代细 胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞；2)上述传代细胞培养至4. 0X109cells/L 8X10lclcells/L时换用细胞维持液， 按照感染复数为M. 0. I. = 0. 001 1接种狂犬病病毒，启动病毒吸附程序，使病毒与微载 体上的细胞吸附完全后，换用病毒培养程序，扩增狂犬病病毒；3)采用半量换液连续收毒工艺，病毒培养2 5天后，第一次收获病毒液，收获比 例为总培养体积的50%，继续培养9 11天后，每24h收获换液一次，收获比例为总培养体 积的50%，收获狂犬病病毒；4)收获的病毒液，冻融，灭活纯化制得狂犬病毒抗原；5)加入佐剂混合后制得狂犬病灭活疫苗。优选地，本发明所述生物反应器为微载体悬浮培养生物反应器。更优选地，本发明所述生物反应器为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器。优选地，本发明所述微载体为网状、球形或片状。优选地，本发明所述微载体的成分为聚酯、明胶或多糖。更优选地，本发明所述微载体为网状的聚酯纤维。
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优选地，本发明所述细胞生长液为含5% 10%牛血清的DMEM培养基。更优选地，本发明所述细胞维持液为含 5%牛血清的DMEM培养基。优选地，本发明所述微载体悬浮培养生物反应器的培养条件为温度36°C 37°C， C02浓度为2. 5 % 5 %，培养液pH值为7. 0 7. 4。优选地，本发明所述步骤3)中所述狂犬病病毒液的体积为2. 5L 1000L。优选地，本发明所述步骤3)中所述的收获的次数为10 12次。本发明的另一方面为使用本发明方法制备的狂犬病病毒。本发明的另一方面为提供一种兽用狂犬病抗原的生产方法，即由本发明方法制备 狂犬病病毒后，收获病毒液，冻融，灭活纯化制得狂犬病毒抗原。本发明的又一方面为使用上述方法制备的狂犬病病毒抗原。本发明的另一方面为提供一种兽用狂犬病疫苗的生产方法，即由本发明方法制备 狂犬病病毒后，收获病毒液，冻融，灭活纯化制得狂犬病毒抗原，加入佐剂即可制得兽用狂 犬病灭活疫苗。本发明的又一方面为使用本发明方法制备的狂犬病灭活疫苗。技术效果与现有技术相比，本发明的狂犬病病毒的生产方法，具有以下有益效果1.采用本发明方法，解决了传统转瓶大规模生产时单批产量不高、批间差异大、产 品质量不稳定、劳动强度大、生产成本高等问题。本发明之方法生产规模大、单批次产量高。 目前国内采用搅拌式悬浮培养工艺培养动物细胞，单台生物反应器最大规模不超过100L ； 而本发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术培养动物细胞，单台生物反 应器规模达500L，最大可达1000L，单台规模提高5 10倍。本发明之方法为连续式封闭式 生产、半连续式收获病毒本发明的方法可以全封闭生产，自动换液，半连续收获方式收集 病毒液，减少了污染的机率，产品质量均一稳定，批间差异小。本发明方法制备的细胞接种 量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。 本发明方法解决了传统工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异大、批间差异大的问 题。本发明方法，可直接线性放大用于生产。2.本发明方法中采用的载体为网状的聚酯纤维，具有亲水性和生物无害性，lg微 载体可提供2400cm2的贴壁面积，在同样的空间内极大的增大了细胞的贴壁面积，增加了细 胞生长的密度，细胞数可达到1.0X109cellS/g微载体以上，其效能为传统转瓶培养系统的 数十倍，可以节省许多成本及人力。3.本发明方法制备的细胞接种量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度 的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。本发明提供一种新的工艺技术，能够极大的满足病 毒大量繁殖所需要的条件，并且能够制备高滴度的抗原，极大的满足疫苗制备所需，显著提 高了疫苗的产量和质量，降低生产成本。4.工艺参数控制精确本发明运用潮汐式微载体悬浮培养技术生产时可控参数 有温度、PH值、溶氧量、二氧化碳浓度、载体浓度，可实现在线监测的参数有葡萄糖、乳酸和 铵离子浓度，批次质量稳定，而传统转瓶培养工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异 大。本发明方法利用生物反应器，解决抗原浓度低、生产成本高、劳动强度大的问题，而且能 连续培养、占地小、生产规模大、无搅拌式悬浮培养时对细胞形成的剪切力、无气泡产生、对细胞伤害小。
图1为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器结构示意图。
具体实施例方式本发明实施例中使用了潮汐式微载体悬浮培养生物反应器，其他类型的微载体悬 浮培养生物反应器，如搅拌式、旋转式或灌注式微载体悬浮培养生物反应器，均可以使用 本发明之方法大规模生产狂犬病病毒或疫苗。优选地，本发明使用潮汐式微载体悬浮培养 生物反应器，可以提高培养时的培养基和溶解氧的供应，无气泡并且剪切力小，对细胞伤害本发明实施例中采用的生物反应器为潮汐式生物反应器。结构示意图如图1所 示。其中，各个标记分别为恒温搅拌系统1，培养基恒温备料槽体2，自动馈料系统3，恒温 培养箱4，载体瓶5，微载体6，DO检测器及pH控制器7，收集器8。较优地，本发明实施例中 采用了依据潮汐原理而设计的微载体悬浮培养生物反应器，培养系统分为两部份；一个是 载体瓶5，另一个是培养基恒温备料槽2。细胞固定在载体瓶，培养基流动于载体瓶与培养 基恒温备料槽之间，造成间歇性的暴露与淹没载体。本发明试验了反应器的载体瓶5体积 为0. 5L、2. 5L、5L、10L、20L、50L、100L，均能对温度、pH值、溶解氧、二氧化碳浓度自动控制。 本发明的实施例中载体瓶5体积为20L，培养基恒温备料槽2体积为500L。本发明实施例的微载体为网状纤维——聚酯纤维，本领域其他类型的微载体—— 球形、网状或片状的聚酯、明胶或多糖微载体，也可以起到固定细胞的作用，也能用于本发 明之方法大规模生产狂犬病病毒或疫苗。本发明实施例中，传代细胞使用了仓鼠肾细胞(BHK21)，其他本领域常用的传代细 胞如Vero细胞、Hamster Kidney细胞，CEF细胞，也可用于本发明之方法大规模生产狂犬病
病毒及疫苗。本发明实施例中，病毒株为Flury-LEP毒株(菌种号CVCCAV2012)，其他本领域常 用的病毒如Flury-HEP毒株(菌种号CVCCAV2013) .ERA毒株(菌种号CVCC AV61)、巴黎株 狂犬固定毒(菌种号CVCC AV2011)和CTN-1毒株(购于中国药品生物制品鉴定所)、和aG 毒株等也可用于本发明之方法大规模生产狂犬病病毒及疫苗。本发明所述方法中，在细胞吸附微载体阶段与细胞培养阶段，启动了细胞吸附程 序与细胞培养程序，本发明实施例中优化了反应器的控制参数，但本发明方法不仅限于实 施例中的参数，本领域技术人员可以根据本发明提供的技术启示，根据不同的生物反应器， 调整相应的参数，达到微载体与细胞充分结合后，大量扩增细胞的目的。本发明所述方法中，在病毒吸附细胞阶段与病毒培养阶段，启动了病毒吸附程序 与病毒培养程序，本发明实施例中优化了反应器的控制参数，但本发明方法不仅限于实施 例中的参数，本领域技术人员可以根据本发明提供的技术启示，根据不同的生物反应器，调 整相应的参数，达到病毒与细胞及微载体充分结合后，大量扩增病毒的目的。本发明试验了微载体密度为40 80g/L，加入2. 0X 107 5. 0X 107cells/g微 载体的传代细胞，更优地，本发明实施例中使用的微载体密度为60g/L，加入2. 0X107 5.0X107cells/g微载体的传代细胞，当传代细胞的密度达到4. OX 109cells/L 8X1010cells/L时，即密度达到初始密度的5 20倍时，换用细胞维持液，起始病毒吸附与
培养程序为佳。本发明试验了按照感染复数为M. 0. I. = 0. 001 1接种狂犬病病毒，收获的狂犬 病病毒毒价最高，优选地，本发明实施例中使用了 M. 0. I. = 0. 01接种病毒，启动病毒吸附 程序与病毒培养程序，扩增狂犬病病毒。本发明收获培养液，制备狂犬病病毒液，采用了从培养基恒温备料槽2通过微电 脑控制直接收取培养液，反复冻融后冷冻保存备用。优选地，本发明实施例中采用-20°C冷 冻、常温融解反复两次的方法，使病毒充分从细胞中释放出来，从而获得高含量病毒液。本发明生物反应器单批次收获的狂犬病病毒液的体积为2. 5L 1000L，本发明实 施例试验了单批次收获的狂犬病病毒液的体积为500L，本领域技术人员可以利用本发明之 方法对单批次收获的病毒液体积进行线性放大，可以放大至1000L。本发明所述收获病毒液为采用半量换液连续收毒工艺，优选地，本发明所述的收 获的次数为10 12次，更优选地，本发明实施例中试验了每隔24h收获，连续收获12次的 病毒与收获病毒制备的疫苗，经检验全部达到《中华人民共和国兽药典》之要求。本发明实施例中疫苗的制备方法为，将多次收获检验合格的病毒液混合后经过滤 净化系统除去细胞碎片等杂质后经灭活剂灭活后，加入佐剂混合制得狂犬病灭活疫苗。本 领域其他常用的狂犬病疫苗制备所用毒株，如Flury HEP、ERA、巴黎株狂犬固定毒、CTN-1毒 株和aG毒株等，多次收获的病毒液混合后经灭活也可用于制备本发明所述疫苗。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1狂犬病疫苗的生产方法1.病毒与细胞株用于制备狂犬病疫苗的病毒株为LEP-Flury毒株，经过致病性测试，该毒株病毒 不具有致病性。以对该病毒株具有良好敏感性的细胞系仓鼠肾细胞(BHK21)，作为制苗用细 胞系，藉以感染并大量繁殖狂犬病毒。2.制备方法(1)将制备疫苗用细胞系仓鼠肾细胞(BHK21)接种到加有DMEM液体培养基(包括 5%牛血清、2. 2g/L NaHC03、50IU/ml 硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100IU/ml 青霉素 G钠盐(Penicillin G Sodium)、pH值为7. 2)与聚酯纤维微载体的载体罐内；微载体密度 为60g/L，细胞初始接种量为2. 7X107cellS/g微载体。(2)于37°C、5% C02培养环境下，细胞贴附4h，使上述制备疫苗用细胞与微载体混 合均勻，并使细胞贴附在微载体上。贴附程序参数为载体瓶中培养液上升速率为2400ml/ min，培养液在载体瓶顶部停留时间为lmin ；载体瓶中培养液下降速率为2400ml/min，培 养液在载体瓶底部停留时间为30s、设定最大换液量18500ml ；4h后切换为细胞培养程序， 细胞培养程序参数为载体瓶中培养液上升速率为1800ml/min，培养液在载体瓶顶部停留 时间为lmin ；载体瓶中培养液下降速率为ISOOml/min，培养液在载体瓶底部停留时间为 lmin、设定最大换液量18，500ml。
(3)于37°C、5% C02培养环境下，使细胞在上述微载体上生长，培养5日后，细胞 密度为3. 24X101(lcellS/L微载体，换用添加2%牛血清的DMEM细胞维持培养液，按病毒感 染复数(M. 0. I.)为0.01的比例接种狂犬病毒LEP-Flury毒株，并使之感染细胞，使病毒增 殖，病毒吸附程序为载体瓶中培养液上升速率为1500ml/min，培养液在载体瓶顶部停留 时间为lmin ；载体瓶中培养液下降速率为15000ml/min，培养液在载体瓶底部停留时间为 lmin、设定最大换液量18，500ml。(4)于37°C、5% C02培养环境下继续培养；培养5日后，第一次收获，采用半连续 工艺，换液比例为50% ；连续培养11天，每24h收获一次，每次换液比例为50% ；(5)将半量换液连续收毒工艺收获的病毒液与生物反应器的病毒液于-20°C，常 温冻融两次后混合，并进行以下检验(a)纯净性检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录相关规定进行检验，结果 无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。(b)病毒含量测定按照常规小鼠脑内接种法进行。即将收获的狂犬病毒液用灭 菌生理盐水进行10倍系列稀释，每个病毒液取10_3 10_6各4个稀释度，每个稀释度通过 脑内接种注射4只11 13g的昆明系小鼠，0. 03ml/只，连续观察14天，记录14天后小鼠 死亡情况，并根据Reed-Muench法计算病毒含量，每1. 0ml含病毒为107 8LD5(1 ；(c)特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释成为每1ml含有100个小鼠的最小感染 量的病毒悬液，与等量的抗狂犬病毒特异性血清充分混合，置15°C中和lh，其间振摇3次。 同时设立阳性对照组(病毒对照)和阴性对照组(生理盐水)。中和结束后分别接种小鼠 2只，每只脑内注射0. 03ml。除阳性对照组全部死亡外，其余两组在接种后2周内精神状态 良好，无不良反应。(6)经检验合格的狂犬病毒原液经0. 5 ii m滤芯过滤，除去细胞碎片。过滤后加入 1 40000-丙内酯，置4°C灭活24h时间，然后置于37°C水浴中水解2h即为狂犬病毒抗 原。灭活后取样脑内接种体重为11 13g小白鼠20只，每只0. 03ml，观察14d，应全部健 存(3d死亡不计)。(7)取灭活检验合格的抗原与等体积含量为20%的灭菌氢氧化铝胶盐水稀释液 均勻混合，在室温下沉淀24小时，吸出2/5上清液，即按全量浓缩至3/5，加入终含量为 1/1. 5万 1/3万硫柳汞溶液，充分混合，即为制成的狂犬病毒灭活疫苗。(8)成品检验，按照以上方法制备的狂犬病毒灭活疫苗应符合以下标准(a)物理性状本疫苗为粉红色均勻混悬液，静置后上层为红色澄清液体，下层为 淡灰色沉淀，经振摇即恢复原状。(b)纯净性检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录相关规定进行检验，结果 无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。(c)小白鼠安全试验取11 13g小白鼠8只，各脑内接种0. 03ml疫苗，另取同 样重量的8只各腹腔注射0. 5ml，观察14d无疫苗本身所致的不良反应。(d)犬安全试验取3只易感犬，各肌肉注射10个使用剂量的疫苗，逐日观察至21 日，无疫苗本身所致的不良反应。(e)效力检验用NIH法按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行测定，成品效力 为2. 8IU/剂，高于现行标准2. 5IU/剂。
对比例悬浮培养工艺与传统转瓶培养技术比较。通过对潮汐式细胞微载体悬浮培养系统与常用转瓶培养系统在相同细胞贴壁面 积时相关生产性能指标进行对比，结果如表1所示。表1不同培养系统增殖狂犬病毒的相关比较
培养方式潮汐式微栽体悬浮培养 系统3000ml转瓶培养系统细胞贴壁面 积2880000cm22880000cm2产量比值1个微载体培养系统2304个转瓶占地面积20 m2150m2人工投入2个人x4 h30个人x8 h风险暴露点<20个2304 个耗材成本低高清洗成本低高收获抗原3250 L2304x300ml=691.2L抗原效价1075LD50/ml1065LD50/ml操作工艺全自动微电脑控制程序繁瑣备注聚酯纤维载体贴壁面积lg = 2400cm2,1个潮汐式微载体悬浮培养系统加入 载体1200g。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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权利要求
一种兽用狂犬病病毒的生产方法，其特征在于，包括如下步骤1)微载体生物反应器中，微载体密度为40～80g/L，加入2.0×107～5.0×107cells/g微载体的传代细胞及细胞生长液，启动细胞吸附程序，使微载体与传代细胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞；2)上述传代细胞培养至4.0×109cells/L～8×1010cells/L时换用细胞维持液，按照感染复数为M.O.I.＝0.001～1接种狂犬病病毒，启动病毒吸附程序，使病毒与微载体上的细胞吸附完全后，换用病毒培养程序，扩增狂犬病病毒；3)采用半量换液连续收毒工艺，病毒培养2～5天后，第一次收获病毒液，收获比例为总培养体积的50％，继续培养9～11天后，每24h收获换液一次，收获比例为总培养体积的50％，收获狂犬病病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为微载体悬浮培养生物 反应器。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为潮汐式微载体悬浮培 养生物反应器。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体为网状、球形或片状。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体的成分为聚酯、明胶或多糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述细胞生长液为含5% 10%牛血清的培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述细胞维持液为含 5% 牛血清的培养基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体悬浮培养生物反应器的培养 条件为温度36°C 37°C，C02浓度为2. 5% 5%，培养液pH值为7. 0 7. 4。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述狂犬病病毒液的体积为 2. 5L 1000L。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的收获的次数为10 12次。
11.根据权利要求1 10任意一项方法制备的狂犬病病毒。
12.—种兽用狂犬病抗原的生产方法，其特征在于，由权利要求1 9任意一项方法制 备狂犬病病毒后，收获病毒液，冻融，灭活纯化制得狂犬病毒抗原。
13.根据权利要求12所述的方法制备的狂犬病抗原。
14.一种兽用狂犬病疫苗的生产方法，其特征在于，由权利要求1 10任意一项方法制 备狂犬病病毒后，收获病毒液，冻融，灭活纯化制得狂犬病毒抗原，加入佐剂即可制得兽用 狂犬病灭活疫苗。
15.根据权利要求14所述的方法制备的狂犬病灭活疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种大规模生产动物用狂犬病病毒及疫苗的方法，利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统大规模生产狂犬病病毒及疫苗将制备疫苗用细胞接种到含有培养液与微载体的载体罐中，使细胞贴附在微载体上；在适当培养环境下，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～20倍；将狂犬病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；换用细胞维持培养液，在适当培养环境下培养病毒；连续培养3～5日后，第一次收获病毒液，采用半连续工艺，换液比例为50％；继续培养9～11日，每24h收获换液一次；将收获的病毒液与生物反应器的病毒液混合，于-20℃常温反复冻融两次，灭活纯化后加入佐剂制备狂犬病疫苗。该方法生产规模大、单批次产量高、生产成本相对较低。
文档编号A61K39/205GK101979515SQ20101029495
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年3月30日
发明者乔荣岑, 孙进忠, 张许科 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司
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