一种板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用的制作方法
专利名称：一种板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物医学的板层组织工程角膜支架，尤其是涉及一种用于治疗角 膜外伤、肿瘤、化学烧伤(碱烧伤)、血管化严重干眼症、角膜缘干细胞缺乏、免疫性疾病如 Stevens-Johnson综合征(SJS)、眼部类天疱疮、单纯疱疹病毒性角膜白斑、角膜移植排斥 反应等致盲性眼病的板层角膜组织工程材料及其制备方法与应用。
背景技术：
据世界卫生组织报告，角膜病是引起视力丧失的第二位主要病因，每年因角膜溃 疡、眼外伤等造成的新增角膜盲为150万至200万，儿童盲的主要病因是麻疹导致的角膜 白斑。治疗角膜盲的唯一有效方法是角膜移植术。但是由于宗教信仰、风俗习惯的影响， 身故后捐献角膜者甚少；加上人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒、狂犬病毒、克雅氏病毒 可以通过植片传播、角膜屈光手术、人口老龄化等原因使角膜供体材料严重不足，极大地限 制了角膜盲患者脱盲。随着人们对视觉质量要求的日益提高，角膜移植技术也得到不断改 进和更新，而目前供体来源不足、免疫排斥反应、角膜移植并发症等又限制了此项技术的 开展。随着角膜外伤、肿瘤、化学烧伤(碱烧伤)、血管化严重干眼症、角膜缘干细胞缺乏、 免疫性疾病、角膜移植排斥反应等患者人数的增多，角膜材料的来源也就成为目前眼科医 生存在的一个棘手的问题。如何高质量长时间维持板层角膜替代物在眼内的功能，寻找一 种能达到理想状态的角膜替代物也就成了当前眼科界研究的一个热点。然而，目前国内外 研制的各种种子细胞支架材料在角膜曲率及地形图，生物相容性，强度，降解率，透明性， 同源性，抗原性及病原性等性能方面均存在着部分缺陷。猪角膜来源广泛，价格便宜，角 膜厚度，地形图和屈光方面与人角膜极为相似([IlLiu W，McLaughlin CR, Fagerholm P， Lagali NS, Heyne B, et al. Collagen-phoshphorylcholine interpenetrating network hydrogels as corneal substitutes. Biomaterials,2009. p. 1551-9 ； [2]Biomaterials and Culture Methods. Res 2008 ;63 :535_544 ; [3]recombinant humancollagen-based corneal substitutes for I mplantation !performance of type I versus type IIIcollagen. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008 ；49 3887-3894 ； [4]Li F, Lohmann C, Suuronen Ε, VascottoS, Kobuch K, et al. Cellular and nerve regeneration within a biosynthetic extracellular matrix forcorneal transplantation. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:15346-15351 ； [5]Gilbert Tff,BadylakSF. Decellualrization of tissues and organs. Biomaterials 2006 ；27 :3675_3683)，越来越受到科学家的重视，而目前猪 的其他器官已经用于异种移植([6] Sykes M, Sandrin M. Position paper of theEthics Committee of the International Xenotransplantation Association. Transplantation 2004 ；78 1101-1107 ； [7]Kampmeier J, Birngruber R, Brinkmann R. Thermal and biomechanical parametersof porcine cornea. 2000 ;19 :355_363)。
发明内容
本发明的目的是提供一种与现有材料相比，来源丰富、透明度高、生物相容性好、 性能与新鲜角膜接近、脱细胞彻底、安全性强，能被广大患者接受并长期应用于临床的板层 组织工程角膜支架及其制作方法与应用。所述一种板层组织工程角膜支架可用于角膜移植各种供体材料的替代物。所述一种板层组织工程角膜支架为动物源性脱细胞板层角膜基质片，不含细胞成 分，胶原纤维排列整齐，间隙规则，角膜透光率为80% 95%，拉伸强度为2 5N/mm2。所述板层组织工程角膜支架可包括未干燥板层角膜支架、干燥板层角膜支架或复 水板层角膜支架等。所述未干燥板层角膜支架的含水量和膨胀率为75% 90%。所述干燥板层角膜支架是以未干燥板层角膜支架为基础，经过干燥处理的板层角 膜支架，所述干燥处理可为真空冻干，真空晾干，干燥无水CaCl2真空干燥，自然晾干，吹干， 30 60°C恒温箱内烘干等中的至少一种。所述复水板层角膜支架是以干燥板层角膜支架为基础，经过复水过程处理的板层 角膜支架，所述复水过程处理所用的复水剂选自林格氏液，平衡液，IXPBS溶液，DMEM培养 液，短、中期角膜保存液等中的至少一种，含水量和膨胀率为75% 90%。所述板层组织工程角膜支架的制作方法包括以下步骤1)将新鲜动物眼球经过碘伏浸泡，或用含抗菌素的PBS浸泡后，冲洗；2)消毒后用滤纸覆盖于角膜表面或直接浸泡，然后擦除上皮细胞层；3)在手术显微镜下作角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用 角膜剪剪下前层角膜，或直接用板层角膜分离刀分离前板层角膜；4)将分离的前板层角膜放于角膜枕上，前弹力层面朝下，然后用角膜环钻取3 IOmm直径的板层角膜基质片(10-0尼龙线标记上皮面)；将去上皮后的新鲜板层角膜基质 片直接放于密闭无菌的冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为1 5min，复温时间 为3 15min，循环次数为1 5次；5)将冻融的板层角膜基质片放置于低渗液中浸泡20 120min ；6)将经过步骤5)处理过的板层角膜基质片放于30 40°C恒温箱中，先后于 DNA酶孵育60 180min，RNA酶中孵育60 180min，同时在各自的缓冲液中加入0. 5 2. 5ug/ml的蛋白酶抑制剂，每毫克角膜基质干重含1. 10士0. 25 μ g DNA，角膜基质含水量为 50% 80% ；7)将经过酶消化的板层角膜基质片放置于电泳液TA液中(作好角膜的电泳方向 标记)，然后将整个电泳槽放于密闭消毒盒内，0 10°C恒温冰箱内进行冰浴电泳；8)将电泳完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜 支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；9)将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥处理，即得到干燥板层组织工程 角膜支架；10)将干燥板层组织工程角膜支架进行钴60消毒，进行复水处理，得复水板层角 膜支架。在步骤1)中，所述碘伏，可采用质量百分浓度为0. 5% 2%的碘伏，所述碘伏浸泡的时间可为2 5min ；所述用含抗菌素的PBS浸泡的时间可为5 lOmin，所述PBS冲 洗，可冲洗3次，每次冲洗的时间可为5min ；所述抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布 霉素或100mg/L链霉素等。在步骤2)中，所述滤纸，最好是蘸有质量百分浓度为15% 30%酒精的滤纸；所 述直接浸泡的时间可为1 5min ；所述擦除上皮细胞层，可采用棉签或角膜上皮刀擦除上 皮细胞层。在步骤3)中，所述在手术显微镜下作角膜缘切口，可采用宝石刀作深度为3 4mm,厚度为0. 8 1. 2mm,长为2. 5 3. 5mm的角膜缘切口 ；所述直接用板层角膜分离刀分 离前板层角膜的前板层角膜的深度可为3 4mm，厚度可为0. 8 1. 2mm。在步骤5)中，所述低渗液，可选自双蒸水或三蒸水等。在步骤6)中，所述酶与缓冲液的体积比可为1 50，DNA酶与RNA酶的体积比 可为10 1 ；所述蛋白酶抑制剂可采用roche公司的产品，不含EDTA，能抑制Protease， Calpain II，Cathepsin B,Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic,Papain,Plasmin, Thermolysin, Trypsin 等蛋白酶。在步骤7)中，所述冰浴电泳的时间可为1 4h，所述电泳可为单相水平电泳或双 相电泳，电泳的条件为100 180￥/011，1\14溶液配置方法将4. 84g TrisBase溶于100ml 双蒸水中，滴加1. 142ml Glacial Acetic Acid，然后加双蒸水至IL ；在步骤9)中，所述干燥处理可为真空冻干，真空晾干，干燥无水Cacl2真空干燥，自 然晾干，吹干，30 60°C恒温箱内烘干等中的至少一种，所述干燥处理的时间可为6 24h。在步骤10)中，所述复水处理所采用的复水剂可选自林格氏液，平衡液，IXPBS溶 液，DMEM培养液，短期角膜保存液，中期角膜保存液等中的至少一种。本发明所述一种板层组织工程角膜支架可用于角膜移植各种供体材料的替代物， 可在治疗角膜外伤及化学烧伤系列疾病，角膜肿瘤及增生性系列疾病，角膜血管化和瘢痕 系列疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反应系列疾病等角膜病变中应用。本发明从详细分析目前常用去细胞方法出发，并根据各自的优缺点进行严格筛选 和有效组合，最后选出了对组织结构影响较小的冻融法破坏崩解细胞膜，用低渗法来胀破 核膜，采用对胶原纤维蛋白支架没有影响DNA/RNA酶破坏和消化残留的核酸，并在缓冲液 中加入了蛋白酶抑制剂，减少了角膜基质骨架细胞外基质(主要是糖胺聚糖)的破坏，利用 单相/双相电泳的方法将细胞残留碎屑和带电成分去除干净，达到彻底去除了支架材料的 抗原成分的目的，通过完全电泳出残留的核酸成分和Co60消毒的方法去除了支架材料的 病原性。为了能达到开发产品的要求，在脱细胞处理的各个环节如时间、温度、电压、如何保 证无菌及电解液的配置等方面均经过详细周密的设计和反复严格的摸索；通过一系列制作 过程的反复改良和优化，使本发明具有以下优点1)采用本发明的技术方案，制作流程简单可靠，时间短且易于实施；2)板层组织工程角膜支架来源广泛，成本低，使用方便；3)采用本发明的技术方案，脱细胞彻底，最小的减少角膜基质骨架细胞外基质的 破坏，胶原排列规则，间隙均勻，不留有任何核酸物质及可溶性蛋白成分，表面由IV型胶原 构成的前弹力层以及基底膜得以保留，提高了支架材料的生物相容性，有利于自体细胞增 殖爬行，而蛋白酶抑制剂的应用，最大限度的保护了基质的胶原蛋白；
4)采用本发明技术方案制作的板层组织工程角膜支架，生物学性质检测(透明 度、含水量、膨胀率、最大拉伸长度)，超微结构观察及视光学检测，结果发现此种材料与人 角膜基质极其相近；5)本发明不仅有利于优化动物角膜基质脱细胞条件，同时将为组织工程角膜产业 化提供重要的技术支持。
图1是经过本发明方法制作的未干燥脱细胞猪板层角膜基质片的DAPI染色结果。图2是经过本发明方法制作的未干燥脱细胞猪板层角膜基质片的DNAGel结果。图3是经过本发明方法制作的脱细胞猪板层角膜基质片的透明度情况。图4是经过本发明方法制作的未干燥脱细胞猪板层角膜基质片的透射电镜下超 微结构结果。图5是经过本发明方法制作的未干燥猪板层角膜基质片(直径为9cm)兔颈背部 植入术后8月的裂隙灯照片。图6是经过本发明方法制作未干燥猪板层角膜基质片兔眼前房内植入2月的的裂 隙灯照片。图7是经过本发明方法制作的未干燥猪板层角膜基质片在兔角膜中央囊袋平铺 术后3月后的裂隙灯照片。图8是经过本发明方法制作的未干燥猪板层角膜基质片用于兔眼角膜移植10天 的裂隙灯照片。图9为本发明制备的未干燥猪板层组织工程角膜支架和新鲜猪板层组织工程角 膜支架用于兔眼角膜移植12天内角膜上皮修复的对比曲线。在图9中，横坐标为修复时间 time (day)，纵坐标为角膜上皮已修复的比例Accumulation repair ；▲为未处理组，■为实验组。
具体实施例方式实施例1本发明所述板层组织工程角膜支架，以干燥后复水的板层角膜支架为例，包括以 下步骤将新鲜动物眼球经过碘伏消毒后经过酒精处理及刮除法去净上皮细胞，分离出板 层角膜，取下板层角膜基质片，将其放于角膜枕上用角膜环钻取下不同直径的板层角膜片， 通过反复规律密闭冻融、低渗溶胀，DNA、RNA酶消化、密闭消毒盒内冰浴电泳法、24孔板内 干燥技术及钴60消毒技术等，最后得到未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片即 得所述板层组织工程角膜基质支架。保存备用，用前可适当加入所需的生长因子等。制备方法一，包括以下步骤将新鲜动物眼球经过2%碘伏浸泡5min，消毒后用蘸 有20%酒精的滤纸覆盖于角膜表面3min，然后用棉签/角膜上皮刀轻轻的擦除上皮细胞 层；在手术显微镜下用宝石刀作深约3/4 (厚约0. 8 1. 2mm)，长约3mm的角膜缘切口，伸 入虹膜恢复器分离前层角膜，厚度约为0. 8 1. 2mm，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜； 将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，然后用角膜环钻取3 IOmm直径 的板层角膜基质片(10 0尼龙线标记上皮面)。将去上皮后的新鲜板层角膜基质片直接放于密闭无菌的2ml冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为2min，复温时间为5min， 循环次数为3次；然后将冻融的板层角膜基质片放置于三蒸水中浸泡60min。然后将经过 上述处理的基质片放于37°C温箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶中孵育120min，同时 在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制剂，其中酶与buffer的比例为1 50，DNA 酶与RNA酶的用量比例为10 1，每毫克角膜基质干重含约1. 10士0.25 μ gDNA，角膜基质 含水量在50 % 80 %，蛋白酶抑制剂是roche公司的产品，不含EDTA，能抑制Protease， Calpain II，Cathepsin B,Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic,Papain,Plasmin, Thermolysin,Trypsin等蛋白酶.然后将经过酶消化的板层角膜基质片放置于特殊的电泳 液TA液中(做好角膜的电泳方向标记)，然后将整个单相水平电泳槽放于密闭消毒盒内， 4°C恒温冰箱内进行冰浴电泳1 4h，电泳的条件为100 180V/cm ；将电泳完毕的板层角 膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保 存备用；然后将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行无水Cacl2真空干燥，时间为12h，即 得到干燥板层组织工程角膜支架；干燥后的样品进行钴60消毒，用时进行林格氏液复水处 理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片即为所述板层组织工 程角膜基质支架。保存备用，用前可适当加入所需的生长因子等。制备方法二，包括以下步骤将新鲜动物眼球经过2%碘伏浸泡5min，消毒后用蘸 有20%酒精的滤纸覆盖于角膜表面3min，然后用棉签/角膜上皮刀轻轻的擦除上皮细胞 层；在手术显微镜下直接用板层角膜分离刀分离深约3/4 (厚约0. 8 1. 2mm)的前板层角 膜；将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，然后用角膜环钻取3 IOmm直 径的板层角膜基质片(10 0尼龙线标记上皮面)。将去上皮后的新鲜板层角膜基质片直接 放于密闭无菌的2ml冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为2min，复温时间为5min， 循环次数为3次；然后将冻融的板层角膜基质片放置于三蒸水中浸泡60min。然后将经过 上述处理的基质片放于37°C温箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶中孵育120min，同时 在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制剂，其中酶与buffer的比例为1 50，DNA 酶与RNA酶的用量比例为10 1，每毫克角膜基质干重含约1.10士0.25 μ g DNA，角膜基质 含水量在50 % 80 %，蛋白酶抑制剂是roche公司的产品，不含EDTA，能抑制Protease， Calpain II，Cathepsin B, Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic,Papain,Plasmin, Thermolysin,Trypsin等蛋白酶.然后将经过酶消化的板层角膜基质片放置于特殊的电泳 液TA液中(做好角膜的电泳方向标记)，然后将整个单相水平电泳槽放于密闭消毒盒内， 4°C恒温冰箱内进行冰浴电泳1 4h，电泳的条件为100 180V/cm ；将电泳完毕的板层角 膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保 存备用；然后将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行无水CaCl2真空干燥，时间为12h，即 得到干燥板层组织工程角膜支架；干燥后的样品进行钴60消毒，用时进行林格氏液复水处 理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片即为所述板层组织工 程角膜基质支架。保存备用，用前可适当加入所需的生长因子等。实施例2本发明所述板层组织工程角膜支架，以干燥后复水的板层角膜支架为例，包括以 下步骤将新鲜动物眼球经过抗菌素消毒后经过酒精处理及刮除法去净上皮细胞，分离出 板层角膜，取下板层角膜基质片，将其放于角膜枕上用角膜环钻取下不同直径的板层角膜片，通过反复规律密闭冻融、低渗溶胀，DNA、RNA酶消化、密闭消毒盒内冰浴电泳法、24孔板 内干燥技术及钴60消毒技术等，最后得到未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片 即得所述板层组织工程角膜基质支架。保存备用，用前可适当加入所需的生长因子等。制备方法一，包括以下步骤将新鲜动物眼球经过用含抗菌素的PBS浸泡IOmin 后，PBS冲洗3次X 5min。所用的抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素，100mg/L链 霉素；消毒后用蘸有20%酒精的滤纸覆盖于角膜表面3min，然后用棉签/角膜上皮刀轻轻 的擦除上皮细胞层；在手术显微镜下用宝石刀作深约3/4 (厚约0. 8 1. 2mm)，长约3mm的 角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，厚度约为0. 8 1. 2mm,分离完全后用角膜剪 剪下前层角膜；将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，然后用角膜环钻取 3 IOmm直径的板层角膜基质片(10-0尼龙线标记上皮面)。将去上皮后的新鲜板层角膜 基质片直接放于密闭无菌的2ml冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为2min，复温 时间为5min，循环次数为3次；然后将冻融的板层角膜基质片放置于三蒸水中浸泡60min。 然后将经过上述处理的基质片放于37°C温箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶中孵育 120min,同时在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制剂，其中酶与buffer的比例为 1 50，DNA酶与RNA酶的用量比例为10 1，每毫克角膜基质干重含约1. 10士0. 25 μ g DNA,角膜基质含水量在50-80%之间，蛋白酶抑制剂是roche公司的产品，不含EDTA，能抑 ffj[J Protease, Calpain II，Cathepsin B, Elastase, leukocyte, Elastase, pancreatic, Papain, Plasmin, Thermolysin, Trypsin等蛋白酶.然后将经过酶消化的板层角膜基质片 放置于特殊的电泳液TA液中(做好角膜的电泳方向标记)，然后将整个单相水平电泳槽放 于密闭消毒盒内，4°C恒温冰箱内进行冰浴电泳1 4h，电泳的条件为100 180V/cm ；将电 泳完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧 乙烷灭菌处理，保存备用；然后将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行无水CaCl2真空干 燥，时间为12h，即得到干燥板层组织工程角膜支架；干燥后的样品进行钴60消毒，用时进 行林格氏液复水处理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片即 为所述板层组织工程角膜基质支架，保存备用。制备方法二，包括以下步骤将新鲜动物眼球经过用含抗菌素的PBS浸泡IOmin 后，PBS冲洗3次X5min。所用的抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素，IOOmg/ L链霉素；消毒后用蘸有20%酒精的滤纸覆盖于角膜表面3min，然后用棉签/角膜上皮刀 轻轻的擦除上皮细胞层；在手术显微镜下直接用板层角膜分离刀分离深约3/4 (厚约0. 8 1. 2mm)的前板层角膜；将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，然后用角膜 环钻取3-10mm直径的板层角膜基质片(10-0尼龙线标记上皮面)。将去上皮后的新鲜板层 角膜基质片直接放于密闭无菌的2ml冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为2min， 复温时间为5min，循环次数为3次；然后将冻融的板层角膜基质片放置于三蒸水中浸泡 60min。然后将经过上述处理的基质片放于37°C温箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶 中孵育120min，同时在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制剂，其中酶与buffer的 比例为1 50，DNA酶与RNA酶的用量比例为10 1，每毫克角膜基质干重含约1. 10士0. 25 微克DNA，角膜基质含水量在50-80%之间，蛋白酶抑制剂是roche公司的产品，不含EDTA， f^itprtjlJ Protease,Calpain II,Cathepsin B,Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic, Papain, Plasmin, Thermolysin, Trypsin等蛋白酶.然后将经过酶消化的板层角膜基质片放置于特殊的电泳液TA液中(做好角膜的电泳方向标记)，然后将整个单相水平电泳槽放 于密闭消毒盒内，4°C恒温冰箱内进行冰浴电泳1 4h，电泳的条件为100 180V/cm ；将电 泳完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧 乙烷灭菌处理，保存备用；然后将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行无水CaCl2真空干 燥，时间为12h，即得到干燥板层组织工程角膜支架；干燥后的样品进行钴60消毒，用时进 行林格氏液复水处理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片即 为所述板层组织工程角膜基质支架。保存备用，用前可适当加入所需的生长因子等。本发明详细分析目前常用去细胞方法，并根据各自的优缺点进行严格筛选和有效 组合，最后选出了对组织结构影响较小的冻融法破坏崩解细胞膜，用低渗法来胀破核膜，采 用对胶原纤维蛋白支架没有影响DNA/RNA酶破坏和消化残留的核仁，并在缓冲液中加入了 蛋白抑制剂，减少了角膜基质骨架ECM的破坏，低温下利用单相/双相电泳的方法将细胞残 留碎屑和带电成分去除干净，达到彻底去除了支架材料的抗原成分的目的，通过完全电泳 出残留的核酸成分和Co60消毒的方法去除了支架材料的病原性。为了能达到开发产品的 要求，在脱细胞处理的各个环节如时间、温度、电压、如何保证无菌及电解液的配置等方面 均经过详细周密的设计和反复严格的摸索；通过一系列制作过程的反复改良和优化，使本 发明具有以下优点(1)采用本发明的技术方案，制作流程简单可靠，时间短且易于实施； (2)板层组织工程角膜支架来源广泛，成本低，取材和使用方便；(3)经过DAPI染色及DNA Gel结果显示(图1和2)，本发明方法制作的猪板层角膜基质，脱细胞彻底，最小的减少角 膜基质ECM的破坏，不留有任何核酸成分及可溶性蛋白，表面由IV型胶原构成的前弹力层 以及基底膜得以保留，提高了支架材料的生物相容性，有利于自体细胞增殖爬行；(4)采用 本发明技术方案制作的猪板层组织工程角膜支架，透明度高(参见图3)，生物学性质检测 包括透明度、含水量、膨胀率、最大拉伸长度等测量(参见表1)，超微结构观察(参见图4) 及视光学检测，结果发现此种材料与人角膜基质极其相近，胶原排列规则，间隙均勻；(5) 采用本发明技术方案制作的未干燥猪板层组织工程角膜支架，植入于兔皮下8个月(参见 图5)，兔眼前房内(参见图6)6月均显示其具有良好组织相容性，没有见明显的炎症反应 和排斥反应；(6)采用本发明技术方案制作的未干燥猪板层组织工程角膜支架，用于兔角 膜中央平铺术后3月(参见图7)，发现角膜较为透明，不影响其透明度，未见明显的炎症反 应和排斥反应；(7)采用本发明技术方案制作的猪板层组织工程角膜支架，用于兔角膜移 植术后10天(参见图8)，荧光素染色发现术后10天角膜上皮在其表面生长完好(参见图 9)，角膜逐渐透明，未见明显的炎症反应和排斥反应；(7)本发明不仅有利于优化动物角膜 基质脱细胞条件，同时将为组织工程角膜产业化提供重要的技术支持。表 1
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注拉伸强度的单位为N/mm2，含水率、膨胀率和透光率的单位均为％。各种疾病造成的角膜透明度下降，角膜基质不可逆性混浊是视力丧失的主要原 因，在致盲病因中位居第二，仅次于白内障。角膜盲最有效的治疗方法是穿透性角膜移植， 但是供体来源不足、免疫排斥反应、角膜移植并发症等限制了此项技术的开展。因此寻找一 种新的角膜替代材料就显得尤为重要。角膜替代物主要分为二类人工角膜和组织工程角 膜等效物(TECE)。TECE是以细胞为基础构建的活性替代物，主要由天然角膜的三种细胞和 胶原成分构成。构建组织工程角膜等效物的关键是支持细胞三维生长的支架材料。以胶原 为基础的天然生物聚合胶表现了极好的生物学特性，支持细胞三维生长，已经被广泛应用 于组织工程技术。目前尚无以此构建的TECE临床应用的报道，主要原因是胶原韧性差，不 耐受缝合。去细胞处理的异种组织主要成分为胶原、弹力纤维等，形态与韧性变化较小。而 且去细胞处理可以降低异种组织的炎症反应和免疫排斥反应，扩充组织来源。在组织工程 技术和再生医学研究中，去细胞生物支架材料如心脏瓣膜、血管、皮肤、神经、骨骼肌、腱膜、 韧带、小肠粘膜下组织、膀胱和肝脏，已经进入临床前期动物实验或临床治疗阶段。但目前 的研究中多联合应用物理、化学及去污剂等方法去除基质细胞，虽然尽可能的去除了细胞 成分，对角膜基质骨架和ECM损伤较大，严重影响了基质片的透明度和韧性。组织工程构建角膜的关键技术是形成角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞与生物 支架三维复合体。支架材料是组织工程领域研究的主要内容，也是组织工程角膜的基本要 素之一。支架材料的特性直接影响着复合的种子细胞能否正常黏附、生长和分化。理想的TECE的支架材料应具备以下特点1)良好的生物相容性，角膜的各种细胞能在其上或其中良好的生长。2)具有三维立体结构并携带具有生物诱导性的多种化学信号可诱导种子细胞沿 支架材料生长并向角膜细胞分化。3)支架材料的降解速率与植入的种子细胞所形成组织的速率相匹配，可逐渐被降 解吸收或成为与新生组织相互融合的组成部分，可按病损角膜的缺损情况进行塑行，达到 完善的形态修复。4)具有一定的强度和韧性，能抵抗眼内压。5)能逐渐透明化。而理想的方法需要对角膜基质温和(减少步骤，操作尽可能少，时间尽可能短，温度尽可能低)，尽可能去除了细胞但不损伤基质骨架及细胞外基质，使角 膜基质保留原有的生物学及力学特性，同时还不影响组织的透明度。为满足上述大部分的 要求，我们详细分析目前常用去细胞方法，并根据各自的优缺点进行严格筛选和有效组合， 最后发明出上述制作流程。 采用本发明制作的未干燥猪板层组织工程角膜支架，植入于兔皮下8个月，兔眼 前房内6月均显示其具有良好组织相容性，没有见明显的炎症反应和排斥反应，明显优有 未处理的猪板层角膜基质片植入结果，同时将其用于兔角膜中央及周边囊袋内平铺术后3 月和角膜移植术后10天均发现角膜逐渐透明，未见明显的炎症反应和排斥反应，明显优有 未处理的猪板层角膜基质片植入结果，荧光素染色发现术后10天角膜上皮在其表面生长 完好。
权利要求
一种板层组织工程角膜支架，其特征在于为动物源性脱细胞板层角膜基质片，不含细胞成分，胶原纤维排列整齐，间隙规则，角膜透光率为80％～95％，拉伸强度为2～5N/mm2。
2.如权利要求1所述的一种板层组织工程角膜支架，其特征在于所述板层组织工程角 膜支架包括未干燥板层角膜支架、干燥板层角膜支架或复水板层角膜支架；所述未干燥板 层角膜支架的含水量和膨胀率为75% 90%;所述干燥板层角膜支架是以未干燥板层角膜 支架为基础，经过干燥处理的板层角膜支架，所述干燥处理为真空冻干，真空晾干，干燥无 水CaCl2真空干燥，自然晾干，吹干，30 60°C恒温箱内烘干中的至少一种；所述复水板层 角膜支架是以干燥板层角膜支架为基础，经过复水过程处理的板层角膜支架，所述复水过 程处理所用的复水剂选自林格氏液，平衡液，IXPBS溶液，DMEM培养液，短、中期角膜保存 液中的至少一种，含水量和膨胀率为75% 90%。
3.如权利要求1所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于包括以下 步骤1)将新鲜动物眼球经过碘伏浸泡，或用含抗菌素的PBS浸泡后，冲洗；2)消毒后用滤纸覆盖于角膜表面或直接浸泡，然后擦除上皮细胞层；3)在手术显微镜下作角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜 剪剪下前层角膜，或直接用板层角膜分离刀分离前板层角膜；4)将分离的前板层角膜放于角膜枕上，前弹力层面朝下，然后用角膜环钻取3 IOmm 直径的板层角膜基质片；将去上皮后的新鲜板层角膜基质片直接放于密闭无菌的冻存管内 给予反复冻融复温处理，冷冻时间为1 5min，复温时间为3 15min，循环次数为1 5 次；5)将冻融的板层角膜基质片放置于低渗液中浸泡20 120min；6)将经过步骤5)处理过的板层角膜基质片放于30 40°C恒温箱中，先后于DNA酶孵 育60 180min，RNA酶中孵育60 180min，同时在各自的缓冲液中加入0. 5 2. 5ug/ml 的蛋白酶抑制剂，每毫克角膜基质干重含1. 10 士 0.25yg DNA，角膜基质含水量为50% 80% ；7)将经过酶消化的板层角膜基质片放置于电泳液TA液中(作好角膜的电泳方向标 记)，然后将整个电泳槽放于密闭消毒盒内，0 10°C恒温冰箱内进行冰浴电泳；8)将电泳完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支 架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；9)将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥处理，即得到干燥板层组织工程角膜 支架；10)将干燥板层组织工程角膜支架进行钴60消毒，进行复水处理，得复水板层角膜支架。
4.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤 1)中，所述碘伏，是采用质量百分浓度为0. 5% 2%的碘伏，所述碘伏浸泡的时间为2 5min ；所述用含抗菌素的PBS浸泡的时间为5 lOmin，所述PBS冲洗，是冲洗3次，每次冲 洗的时间为5min ；所述抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素或100mg/L链霉素。
5.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤2)中，所述滤纸，是蘸有质量百分浓度为15% 30%酒精的滤纸；所述直接浸泡的时间为1 5min;所述擦除上皮细胞层，是采用棉签或角膜上皮刀擦除上皮细胞层。
6.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤 3)中，所述在手术显微镜下作角膜缘切口，是采用宝石刀作深度为3 4mm，厚度为0. 8 1. 2mm，长为2. 5 3. 5mm的角膜缘切口 ；所述直接用板层角膜分离刀分离前板层角膜的前 板层角膜的深度为3 4mm，厚度为0. 8 1. 2mm。
7.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤5) 中，所述低渗液，选自双蒸水或三蒸水。
8.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤6) 中，所述酶与缓冲液的体积比为1 50，DNA酶与RNA酶的体积比为10 1 ；所述蛋白酶抑 制剂采用roche公司的产品，不含EDTA ；在步骤7)中，所述冰浴电泳的时间为1 4h，所述电泳为单相水平电泳或双相电泳， 电泳的条件为100 180￥/011，1\14溶液配置方法将4. 84g TrisBase溶于IOOml双蒸水 中，滴加1. 142ml Glacial Acetic Acid，然后加双蒸水至IL0
9.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤9) 中，所述干燥处理为真空冻干，真空晾干，干燥无水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹干，30 60°C恒温箱内烘干中的至少一种，所述干燥处理的时间为6 24h ；在步骤10)中，所述复 水处理所采用的复水剂选自林格氏液，平衡液，IXPBS溶液，DMEM培养液，短期角膜保存 液，中期角膜保存液中的至少一种。
10.如权利要求1所述一种板层组织工程角膜支架用于角膜移植各种供体材料的替代 物，在治疗角膜外伤及化学烧伤系列疾病，角膜肿瘤及增生性系列疾病，角膜血管化和瘢痕 系列疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反应系列疾病中应用。
全文摘要
一种板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用，涉及一种生物医学的板层组织工程角膜支架。提供一种与现有材料相比，来源丰富、透明度高、生物相容性好、性能与新鲜角膜接近、脱细胞彻底、安全性强，能被广大患者接受并长期应用于临床的板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用。所述一种板层组织工程角膜支架为动物源性脱细胞板层角膜基质片，不含细胞成分，胶原纤维排列整齐，间隙规则，角膜透光率为80％～95％，拉伸强度为2～5N/mm2。可用于角膜移植各种供体材料的替代物，可在治疗角膜外伤及化学烧伤系列疾病，角膜肿瘤及增生性系列疾病，角膜血管化和瘢痕系列疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反应系列疾病等角膜病变中应用。
文档编号A61L27/38GK101947144SQ20101029643
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者刘祖国, 李炜, 梁凌毅, 许传超, 邵毅 申请人:厦门大学
技术领域：
本发明涉及一种生物医学的板层组织工程角膜支架，尤其是涉及一种用于治疗角 膜外伤、肿瘤、化学烧伤(碱烧伤)、血管化严重干眼症、角膜缘干细胞缺乏、免疫性疾病如 Stevens-Johnson综合征(SJS)、眼部类天疱疮、单纯疱疹病毒性角膜白斑、角膜移植排斥 反应等致盲性眼病的板层角膜组织工程材料及其制备方法与应用。
背景技术：
据世界卫生组织报告，角膜病是引起视力丧失的第二位主要病因，每年因角膜溃 疡、眼外伤等造成的新增角膜盲为150万至200万，儿童盲的主要病因是麻疹导致的角膜 白斑。治疗角膜盲的唯一有效方法是角膜移植术。但是由于宗教信仰、风俗习惯的影响， 身故后捐献角膜者甚少；加上人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒、狂犬病毒、克雅氏病毒 可以通过植片传播、角膜屈光手术、人口老龄化等原因使角膜供体材料严重不足，极大地限 制了角膜盲患者脱盲。随着人们对视觉质量要求的日益提高，角膜移植技术也得到不断改 进和更新，而目前供体来源不足、免疫排斥反应、角膜移植并发症等又限制了此项技术的 开展。随着角膜外伤、肿瘤、化学烧伤(碱烧伤)、血管化严重干眼症、角膜缘干细胞缺乏、 免疫性疾病、角膜移植排斥反应等患者人数的增多，角膜材料的来源也就成为目前眼科医 生存在的一个棘手的问题。如何高质量长时间维持板层角膜替代物在眼内的功能，寻找一 种能达到理想状态的角膜替代物也就成了当前眼科界研究的一个热点。然而，目前国内外 研制的各种种子细胞支架材料在角膜曲率及地形图，生物相容性，强度，降解率，透明性， 同源性，抗原性及病原性等性能方面均存在着部分缺陷。猪角膜来源广泛，价格便宜，角 膜厚度，地形图和屈光方面与人角膜极为相似([IlLiu W，McLaughlin CR, Fagerholm P， Lagali NS, Heyne B, et al. Collagen-phoshphorylcholine interpenetrating network hydrogels as corneal substitutes. Biomaterials,2009. p. 1551-9 ； [2]Biomaterials and Culture Methods. Res 2008 ;63 :535_544 ; [3]recombinant humancollagen-based corneal substitutes for I mplantation !performance of type I versus type IIIcollagen. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008 ；49 3887-3894 ； [4]Li F, Lohmann C, Suuronen Ε, VascottoS, Kobuch K, et al. Cellular and nerve regeneration within a biosynthetic extracellular matrix forcorneal transplantation. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:15346-15351 ； [5]Gilbert Tff,BadylakSF. Decellualrization of tissues and organs. Biomaterials 2006 ；27 :3675_3683)，越来越受到科学家的重视，而目前猪 的其他器官已经用于异种移植([6] Sykes M, Sandrin M. Position paper of theEthics Committee of the International Xenotransplantation Association. Transplantation 2004 ；78 1101-1107 ； [7]Kampmeier J, Birngruber R, Brinkmann R. Thermal and biomechanical parametersof porcine cornea. 2000 ;19 :355_363)。
发明内容
本发明的目的是提供一种与现有材料相比，来源丰富、透明度高、生物相容性好、 性能与新鲜角膜接近、脱细胞彻底、安全性强，能被广大患者接受并长期应用于临床的板层 组织工程角膜支架及其制作方法与应用。所述一种板层组织工程角膜支架可用于角膜移植各种供体材料的替代物。所述一种板层组织工程角膜支架为动物源性脱细胞板层角膜基质片，不含细胞成 分，胶原纤维排列整齐，间隙规则，角膜透光率为80% 95%，拉伸强度为2 5N/mm2。所述板层组织工程角膜支架可包括未干燥板层角膜支架、干燥板层角膜支架或复 水板层角膜支架等。所述未干燥板层角膜支架的含水量和膨胀率为75% 90%。所述干燥板层角膜支架是以未干燥板层角膜支架为基础，经过干燥处理的板层角 膜支架，所述干燥处理可为真空冻干，真空晾干，干燥无水CaCl2真空干燥，自然晾干，吹干， 30 60°C恒温箱内烘干等中的至少一种。所述复水板层角膜支架是以干燥板层角膜支架为基础，经过复水过程处理的板层 角膜支架，所述复水过程处理所用的复水剂选自林格氏液，平衡液，IXPBS溶液，DMEM培养 液，短、中期角膜保存液等中的至少一种，含水量和膨胀率为75% 90%。所述板层组织工程角膜支架的制作方法包括以下步骤1)将新鲜动物眼球经过碘伏浸泡，或用含抗菌素的PBS浸泡后，冲洗；2)消毒后用滤纸覆盖于角膜表面或直接浸泡，然后擦除上皮细胞层；3)在手术显微镜下作角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用 角膜剪剪下前层角膜，或直接用板层角膜分离刀分离前板层角膜；4)将分离的前板层角膜放于角膜枕上，前弹力层面朝下，然后用角膜环钻取3 IOmm直径的板层角膜基质片(10-0尼龙线标记上皮面)；将去上皮后的新鲜板层角膜基质 片直接放于密闭无菌的冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为1 5min，复温时间 为3 15min，循环次数为1 5次；5)将冻融的板层角膜基质片放置于低渗液中浸泡20 120min ；6)将经过步骤5)处理过的板层角膜基质片放于30 40°C恒温箱中，先后于 DNA酶孵育60 180min，RNA酶中孵育60 180min，同时在各自的缓冲液中加入0. 5 2. 5ug/ml的蛋白酶抑制剂，每毫克角膜基质干重含1. 10士0. 25 μ g DNA，角膜基质含水量为 50% 80% ；7)将经过酶消化的板层角膜基质片放置于电泳液TA液中(作好角膜的电泳方向 标记)，然后将整个电泳槽放于密闭消毒盒内，0 10°C恒温冰箱内进行冰浴电泳；8)将电泳完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜 支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；9)将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥处理，即得到干燥板层组织工程 角膜支架；10)将干燥板层组织工程角膜支架进行钴60消毒，进行复水处理，得复水板层角 膜支架。在步骤1)中，所述碘伏，可采用质量百分浓度为0. 5% 2%的碘伏，所述碘伏浸泡的时间可为2 5min ；所述用含抗菌素的PBS浸泡的时间可为5 lOmin，所述PBS冲 洗，可冲洗3次，每次冲洗的时间可为5min ；所述抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布 霉素或100mg/L链霉素等。在步骤2)中，所述滤纸，最好是蘸有质量百分浓度为15% 30%酒精的滤纸；所 述直接浸泡的时间可为1 5min ；所述擦除上皮细胞层，可采用棉签或角膜上皮刀擦除上 皮细胞层。在步骤3)中，所述在手术显微镜下作角膜缘切口，可采用宝石刀作深度为3 4mm,厚度为0. 8 1. 2mm,长为2. 5 3. 5mm的角膜缘切口 ；所述直接用板层角膜分离刀分 离前板层角膜的前板层角膜的深度可为3 4mm，厚度可为0. 8 1. 2mm。在步骤5)中，所述低渗液，可选自双蒸水或三蒸水等。在步骤6)中，所述酶与缓冲液的体积比可为1 50，DNA酶与RNA酶的体积比 可为10 1 ；所述蛋白酶抑制剂可采用roche公司的产品，不含EDTA，能抑制Protease， Calpain II，Cathepsin B,Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic,Papain,Plasmin, Thermolysin, Trypsin 等蛋白酶。在步骤7)中，所述冰浴电泳的时间可为1 4h，所述电泳可为单相水平电泳或双 相电泳，电泳的条件为100 180￥/011，1\14溶液配置方法将4. 84g TrisBase溶于100ml 双蒸水中，滴加1. 142ml Glacial Acetic Acid，然后加双蒸水至IL ；在步骤9)中，所述干燥处理可为真空冻干，真空晾干，干燥无水Cacl2真空干燥，自 然晾干，吹干，30 60°C恒温箱内烘干等中的至少一种，所述干燥处理的时间可为6 24h。在步骤10)中，所述复水处理所采用的复水剂可选自林格氏液，平衡液，IXPBS溶 液，DMEM培养液，短期角膜保存液，中期角膜保存液等中的至少一种。本发明所述一种板层组织工程角膜支架可用于角膜移植各种供体材料的替代物， 可在治疗角膜外伤及化学烧伤系列疾病，角膜肿瘤及增生性系列疾病，角膜血管化和瘢痕 系列疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反应系列疾病等角膜病变中应用。本发明从详细分析目前常用去细胞方法出发，并根据各自的优缺点进行严格筛选 和有效组合，最后选出了对组织结构影响较小的冻融法破坏崩解细胞膜，用低渗法来胀破 核膜，采用对胶原纤维蛋白支架没有影响DNA/RNA酶破坏和消化残留的核酸，并在缓冲液 中加入了蛋白酶抑制剂，减少了角膜基质骨架细胞外基质(主要是糖胺聚糖)的破坏，利用 单相/双相电泳的方法将细胞残留碎屑和带电成分去除干净，达到彻底去除了支架材料的 抗原成分的目的，通过完全电泳出残留的核酸成分和Co60消毒的方法去除了支架材料的 病原性。为了能达到开发产品的要求，在脱细胞处理的各个环节如时间、温度、电压、如何保 证无菌及电解液的配置等方面均经过详细周密的设计和反复严格的摸索；通过一系列制作 过程的反复改良和优化，使本发明具有以下优点1)采用本发明的技术方案，制作流程简单可靠，时间短且易于实施；2)板层组织工程角膜支架来源广泛，成本低，使用方便；3)采用本发明的技术方案，脱细胞彻底，最小的减少角膜基质骨架细胞外基质的 破坏，胶原排列规则，间隙均勻，不留有任何核酸物质及可溶性蛋白成分，表面由IV型胶原 构成的前弹力层以及基底膜得以保留，提高了支架材料的生物相容性，有利于自体细胞增 殖爬行，而蛋白酶抑制剂的应用，最大限度的保护了基质的胶原蛋白；
4)采用本发明技术方案制作的板层组织工程角膜支架，生物学性质检测(透明 度、含水量、膨胀率、最大拉伸长度)，超微结构观察及视光学检测，结果发现此种材料与人 角膜基质极其相近；5)本发明不仅有利于优化动物角膜基质脱细胞条件，同时将为组织工程角膜产业 化提供重要的技术支持。
图1是经过本发明方法制作的未干燥脱细胞猪板层角膜基质片的DAPI染色结果。图2是经过本发明方法制作的未干燥脱细胞猪板层角膜基质片的DNAGel结果。图3是经过本发明方法制作的脱细胞猪板层角膜基质片的透明度情况。图4是经过本发明方法制作的未干燥脱细胞猪板层角膜基质片的透射电镜下超 微结构结果。图5是经过本发明方法制作的未干燥猪板层角膜基质片(直径为9cm)兔颈背部 植入术后8月的裂隙灯照片。图6是经过本发明方法制作未干燥猪板层角膜基质片兔眼前房内植入2月的的裂 隙灯照片。图7是经过本发明方法制作的未干燥猪板层角膜基质片在兔角膜中央囊袋平铺 术后3月后的裂隙灯照片。图8是经过本发明方法制作的未干燥猪板层角膜基质片用于兔眼角膜移植10天 的裂隙灯照片。图9为本发明制备的未干燥猪板层组织工程角膜支架和新鲜猪板层组织工程角 膜支架用于兔眼角膜移植12天内角膜上皮修复的对比曲线。在图9中，横坐标为修复时间 time (day)，纵坐标为角膜上皮已修复的比例Accumulation repair ；▲为未处理组，■为实验组。
具体实施例方式实施例1本发明所述板层组织工程角膜支架，以干燥后复水的板层角膜支架为例，包括以 下步骤将新鲜动物眼球经过碘伏消毒后经过酒精处理及刮除法去净上皮细胞，分离出板 层角膜，取下板层角膜基质片，将其放于角膜枕上用角膜环钻取下不同直径的板层角膜片， 通过反复规律密闭冻融、低渗溶胀，DNA、RNA酶消化、密闭消毒盒内冰浴电泳法、24孔板内 干燥技术及钴60消毒技术等，最后得到未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片即 得所述板层组织工程角膜基质支架。保存备用，用前可适当加入所需的生长因子等。制备方法一，包括以下步骤将新鲜动物眼球经过2%碘伏浸泡5min，消毒后用蘸 有20%酒精的滤纸覆盖于角膜表面3min，然后用棉签/角膜上皮刀轻轻的擦除上皮细胞 层；在手术显微镜下用宝石刀作深约3/4 (厚约0. 8 1. 2mm)，长约3mm的角膜缘切口，伸 入虹膜恢复器分离前层角膜，厚度约为0. 8 1. 2mm，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜； 将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，然后用角膜环钻取3 IOmm直径 的板层角膜基质片(10 0尼龙线标记上皮面)。将去上皮后的新鲜板层角膜基质片直接放于密闭无菌的2ml冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为2min，复温时间为5min， 循环次数为3次；然后将冻融的板层角膜基质片放置于三蒸水中浸泡60min。然后将经过 上述处理的基质片放于37°C温箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶中孵育120min，同时 在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制剂，其中酶与buffer的比例为1 50，DNA 酶与RNA酶的用量比例为10 1，每毫克角膜基质干重含约1. 10士0.25 μ gDNA，角膜基质 含水量在50 % 80 %，蛋白酶抑制剂是roche公司的产品，不含EDTA，能抑制Protease， Calpain II，Cathepsin B,Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic,Papain,Plasmin, Thermolysin,Trypsin等蛋白酶.然后将经过酶消化的板层角膜基质片放置于特殊的电泳 液TA液中(做好角膜的电泳方向标记)，然后将整个单相水平电泳槽放于密闭消毒盒内， 4°C恒温冰箱内进行冰浴电泳1 4h，电泳的条件为100 180V/cm ；将电泳完毕的板层角 膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保 存备用；然后将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行无水Cacl2真空干燥，时间为12h，即 得到干燥板层组织工程角膜支架；干燥后的样品进行钴60消毒，用时进行林格氏液复水处 理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片即为所述板层组织工 程角膜基质支架。保存备用，用前可适当加入所需的生长因子等。制备方法二，包括以下步骤将新鲜动物眼球经过2%碘伏浸泡5min，消毒后用蘸 有20%酒精的滤纸覆盖于角膜表面3min，然后用棉签/角膜上皮刀轻轻的擦除上皮细胞 层；在手术显微镜下直接用板层角膜分离刀分离深约3/4 (厚约0. 8 1. 2mm)的前板层角 膜；将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，然后用角膜环钻取3 IOmm直 径的板层角膜基质片(10 0尼龙线标记上皮面)。将去上皮后的新鲜板层角膜基质片直接 放于密闭无菌的2ml冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为2min，复温时间为5min， 循环次数为3次；然后将冻融的板层角膜基质片放置于三蒸水中浸泡60min。然后将经过 上述处理的基质片放于37°C温箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶中孵育120min，同时 在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制剂，其中酶与buffer的比例为1 50，DNA 酶与RNA酶的用量比例为10 1，每毫克角膜基质干重含约1.10士0.25 μ g DNA，角膜基质 含水量在50 % 80 %，蛋白酶抑制剂是roche公司的产品，不含EDTA，能抑制Protease， Calpain II，Cathepsin B, Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic,Papain,Plasmin, Thermolysin,Trypsin等蛋白酶.然后将经过酶消化的板层角膜基质片放置于特殊的电泳 液TA液中(做好角膜的电泳方向标记)，然后将整个单相水平电泳槽放于密闭消毒盒内， 4°C恒温冰箱内进行冰浴电泳1 4h，电泳的条件为100 180V/cm ；将电泳完毕的板层角 膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保 存备用；然后将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行无水CaCl2真空干燥，时间为12h，即 得到干燥板层组织工程角膜支架；干燥后的样品进行钴60消毒，用时进行林格氏液复水处 理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片即为所述板层组织工 程角膜基质支架。保存备用，用前可适当加入所需的生长因子等。实施例2本发明所述板层组织工程角膜支架，以干燥后复水的板层角膜支架为例，包括以 下步骤将新鲜动物眼球经过抗菌素消毒后经过酒精处理及刮除法去净上皮细胞，分离出 板层角膜，取下板层角膜基质片，将其放于角膜枕上用角膜环钻取下不同直径的板层角膜片，通过反复规律密闭冻融、低渗溶胀，DNA、RNA酶消化、密闭消毒盒内冰浴电泳法、24孔板 内干燥技术及钴60消毒技术等，最后得到未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片 即得所述板层组织工程角膜基质支架。保存备用，用前可适当加入所需的生长因子等。制备方法一，包括以下步骤将新鲜动物眼球经过用含抗菌素的PBS浸泡IOmin 后，PBS冲洗3次X 5min。所用的抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素，100mg/L链 霉素；消毒后用蘸有20%酒精的滤纸覆盖于角膜表面3min，然后用棉签/角膜上皮刀轻轻 的擦除上皮细胞层；在手术显微镜下用宝石刀作深约3/4 (厚约0. 8 1. 2mm)，长约3mm的 角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，厚度约为0. 8 1. 2mm,分离完全后用角膜剪 剪下前层角膜；将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，然后用角膜环钻取 3 IOmm直径的板层角膜基质片(10-0尼龙线标记上皮面)。将去上皮后的新鲜板层角膜 基质片直接放于密闭无菌的2ml冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为2min，复温 时间为5min，循环次数为3次；然后将冻融的板层角膜基质片放置于三蒸水中浸泡60min。 然后将经过上述处理的基质片放于37°C温箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶中孵育 120min,同时在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制剂，其中酶与buffer的比例为 1 50，DNA酶与RNA酶的用量比例为10 1，每毫克角膜基质干重含约1. 10士0. 25 μ g DNA,角膜基质含水量在50-80%之间，蛋白酶抑制剂是roche公司的产品，不含EDTA，能抑 ffj[J Protease, Calpain II，Cathepsin B, Elastase, leukocyte, Elastase, pancreatic, Papain, Plasmin, Thermolysin, Trypsin等蛋白酶.然后将经过酶消化的板层角膜基质片 放置于特殊的电泳液TA液中(做好角膜的电泳方向标记)，然后将整个单相水平电泳槽放 于密闭消毒盒内，4°C恒温冰箱内进行冰浴电泳1 4h，电泳的条件为100 180V/cm ；将电 泳完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧 乙烷灭菌处理，保存备用；然后将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行无水CaCl2真空干 燥，时间为12h，即得到干燥板层组织工程角膜支架；干燥后的样品进行钴60消毒，用时进 行林格氏液复水处理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片即 为所述板层组织工程角膜基质支架，保存备用。制备方法二，包括以下步骤将新鲜动物眼球经过用含抗菌素的PBS浸泡IOmin 后，PBS冲洗3次X5min。所用的抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素，IOOmg/ L链霉素；消毒后用蘸有20%酒精的滤纸覆盖于角膜表面3min，然后用棉签/角膜上皮刀 轻轻的擦除上皮细胞层；在手术显微镜下直接用板层角膜分离刀分离深约3/4 (厚约0. 8 1. 2mm)的前板层角膜；将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，然后用角膜 环钻取3-10mm直径的板层角膜基质片(10-0尼龙线标记上皮面)。将去上皮后的新鲜板层 角膜基质片直接放于密闭无菌的2ml冻存管内给予反复冻融复温处理，冷冻时间为2min， 复温时间为5min，循环次数为3次；然后将冻融的板层角膜基质片放置于三蒸水中浸泡 60min。然后将经过上述处理的基质片放于37°C温箱中，先后于DNA酶孵育120min，RNA酶 中孵育120min，同时在各自的buffer中加入lug/ml的蛋白酶抑制剂，其中酶与buffer的 比例为1 50，DNA酶与RNA酶的用量比例为10 1，每毫克角膜基质干重含约1. 10士0. 25 微克DNA，角膜基质含水量在50-80%之间，蛋白酶抑制剂是roche公司的产品，不含EDTA， f^itprtjlJ Protease,Calpain II,Cathepsin B,Elastase, leukocyte,Elastase,pancreatic, Papain, Plasmin, Thermolysin, Trypsin等蛋白酶.然后将经过酶消化的板层角膜基质片放置于特殊的电泳液TA液中(做好角膜的电泳方向标记)，然后将整个单相水平电泳槽放 于密闭消毒盒内，4°C恒温冰箱内进行冰浴电泳1 4h，电泳的条件为100 180V/cm ；将电 泳完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧 乙烷灭菌处理，保存备用；然后将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行无水CaCl2真空干 燥，时间为12h，即得到干燥板层组织工程角膜支架；干燥后的样品进行钴60消毒，用时进 行林格氏液复水处理。最后得到所需的未干燥、干燥以及干燥后复水的板层角膜基质片即 为所述板层组织工程角膜基质支架。保存备用，用前可适当加入所需的生长因子等。本发明详细分析目前常用去细胞方法，并根据各自的优缺点进行严格筛选和有效 组合，最后选出了对组织结构影响较小的冻融法破坏崩解细胞膜，用低渗法来胀破核膜，采 用对胶原纤维蛋白支架没有影响DNA/RNA酶破坏和消化残留的核仁，并在缓冲液中加入了 蛋白抑制剂，减少了角膜基质骨架ECM的破坏，低温下利用单相/双相电泳的方法将细胞残 留碎屑和带电成分去除干净，达到彻底去除了支架材料的抗原成分的目的，通过完全电泳 出残留的核酸成分和Co60消毒的方法去除了支架材料的病原性。为了能达到开发产品的 要求，在脱细胞处理的各个环节如时间、温度、电压、如何保证无菌及电解液的配置等方面 均经过详细周密的设计和反复严格的摸索；通过一系列制作过程的反复改良和优化，使本 发明具有以下优点(1)采用本发明的技术方案，制作流程简单可靠，时间短且易于实施； (2)板层组织工程角膜支架来源广泛，成本低，取材和使用方便；(3)经过DAPI染色及DNA Gel结果显示(图1和2)，本发明方法制作的猪板层角膜基质，脱细胞彻底，最小的减少角 膜基质ECM的破坏，不留有任何核酸成分及可溶性蛋白，表面由IV型胶原构成的前弹力层 以及基底膜得以保留，提高了支架材料的生物相容性，有利于自体细胞增殖爬行；(4)采用 本发明技术方案制作的猪板层组织工程角膜支架，透明度高(参见图3)，生物学性质检测 包括透明度、含水量、膨胀率、最大拉伸长度等测量(参见表1)，超微结构观察(参见图4) 及视光学检测，结果发现此种材料与人角膜基质极其相近，胶原排列规则，间隙均勻；(5) 采用本发明技术方案制作的未干燥猪板层组织工程角膜支架，植入于兔皮下8个月(参见 图5)，兔眼前房内(参见图6)6月均显示其具有良好组织相容性，没有见明显的炎症反应 和排斥反应；(6)采用本发明技术方案制作的未干燥猪板层组织工程角膜支架，用于兔角 膜中央平铺术后3月(参见图7)，发现角膜较为透明，不影响其透明度，未见明显的炎症反 应和排斥反应；(7)采用本发明技术方案制作的猪板层组织工程角膜支架，用于兔角膜移 植术后10天(参见图8)，荧光素染色发现术后10天角膜上皮在其表面生长完好(参见图 9)，角膜逐渐透明，未见明显的炎症反应和排斥反应；(7)本发明不仅有利于优化动物角膜 基质脱细胞条件，同时将为组织工程角膜产业化提供重要的技术支持。表 1
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注拉伸强度的单位为N/mm2，含水率、膨胀率和透光率的单位均为％。各种疾病造成的角膜透明度下降，角膜基质不可逆性混浊是视力丧失的主要原 因，在致盲病因中位居第二，仅次于白内障。角膜盲最有效的治疗方法是穿透性角膜移植， 但是供体来源不足、免疫排斥反应、角膜移植并发症等限制了此项技术的开展。因此寻找一 种新的角膜替代材料就显得尤为重要。角膜替代物主要分为二类人工角膜和组织工程角 膜等效物(TECE)。TECE是以细胞为基础构建的活性替代物，主要由天然角膜的三种细胞和 胶原成分构成。构建组织工程角膜等效物的关键是支持细胞三维生长的支架材料。以胶原 为基础的天然生物聚合胶表现了极好的生物学特性，支持细胞三维生长，已经被广泛应用 于组织工程技术。目前尚无以此构建的TECE临床应用的报道，主要原因是胶原韧性差，不 耐受缝合。去细胞处理的异种组织主要成分为胶原、弹力纤维等，形态与韧性变化较小。而 且去细胞处理可以降低异种组织的炎症反应和免疫排斥反应，扩充组织来源。在组织工程 技术和再生医学研究中，去细胞生物支架材料如心脏瓣膜、血管、皮肤、神经、骨骼肌、腱膜、 韧带、小肠粘膜下组织、膀胱和肝脏，已经进入临床前期动物实验或临床治疗阶段。但目前 的研究中多联合应用物理、化学及去污剂等方法去除基质细胞，虽然尽可能的去除了细胞 成分，对角膜基质骨架和ECM损伤较大，严重影响了基质片的透明度和韧性。组织工程构建角膜的关键技术是形成角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞与生物 支架三维复合体。支架材料是组织工程领域研究的主要内容，也是组织工程角膜的基本要 素之一。支架材料的特性直接影响着复合的种子细胞能否正常黏附、生长和分化。理想的TECE的支架材料应具备以下特点1)良好的生物相容性，角膜的各种细胞能在其上或其中良好的生长。2)具有三维立体结构并携带具有生物诱导性的多种化学信号可诱导种子细胞沿 支架材料生长并向角膜细胞分化。3)支架材料的降解速率与植入的种子细胞所形成组织的速率相匹配，可逐渐被降 解吸收或成为与新生组织相互融合的组成部分，可按病损角膜的缺损情况进行塑行，达到 完善的形态修复。4)具有一定的强度和韧性，能抵抗眼内压。5)能逐渐透明化。而理想的方法需要对角膜基质温和(减少步骤，操作尽可能少，时间尽可能短，温度尽可能低)，尽可能去除了细胞但不损伤基质骨架及细胞外基质，使角 膜基质保留原有的生物学及力学特性，同时还不影响组织的透明度。为满足上述大部分的 要求，我们详细分析目前常用去细胞方法，并根据各自的优缺点进行严格筛选和有效组合， 最后发明出上述制作流程。 采用本发明制作的未干燥猪板层组织工程角膜支架，植入于兔皮下8个月，兔眼 前房内6月均显示其具有良好组织相容性，没有见明显的炎症反应和排斥反应，明显优有 未处理的猪板层角膜基质片植入结果，同时将其用于兔角膜中央及周边囊袋内平铺术后3 月和角膜移植术后10天均发现角膜逐渐透明，未见明显的炎症反应和排斥反应，明显优有 未处理的猪板层角膜基质片植入结果，荧光素染色发现术后10天角膜上皮在其表面生长 完好。
权利要求
一种板层组织工程角膜支架，其特征在于为动物源性脱细胞板层角膜基质片，不含细胞成分，胶原纤维排列整齐，间隙规则，角膜透光率为80％～95％，拉伸强度为2～5N/mm2。
2.如权利要求1所述的一种板层组织工程角膜支架，其特征在于所述板层组织工程角 膜支架包括未干燥板层角膜支架、干燥板层角膜支架或复水板层角膜支架；所述未干燥板 层角膜支架的含水量和膨胀率为75% 90%;所述干燥板层角膜支架是以未干燥板层角膜 支架为基础，经过干燥处理的板层角膜支架，所述干燥处理为真空冻干，真空晾干，干燥无 水CaCl2真空干燥，自然晾干，吹干，30 60°C恒温箱内烘干中的至少一种；所述复水板层 角膜支架是以干燥板层角膜支架为基础，经过复水过程处理的板层角膜支架，所述复水过 程处理所用的复水剂选自林格氏液，平衡液，IXPBS溶液，DMEM培养液，短、中期角膜保存 液中的至少一种，含水量和膨胀率为75% 90%。
3.如权利要求1所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于包括以下 步骤1)将新鲜动物眼球经过碘伏浸泡，或用含抗菌素的PBS浸泡后，冲洗；2)消毒后用滤纸覆盖于角膜表面或直接浸泡，然后擦除上皮细胞层；3)在手术显微镜下作角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜 剪剪下前层角膜，或直接用板层角膜分离刀分离前板层角膜；4)将分离的前板层角膜放于角膜枕上，前弹力层面朝下，然后用角膜环钻取3 IOmm 直径的板层角膜基质片；将去上皮后的新鲜板层角膜基质片直接放于密闭无菌的冻存管内 给予反复冻融复温处理，冷冻时间为1 5min，复温时间为3 15min，循环次数为1 5 次；5)将冻融的板层角膜基质片放置于低渗液中浸泡20 120min；6)将经过步骤5)处理过的板层角膜基质片放于30 40°C恒温箱中，先后于DNA酶孵 育60 180min，RNA酶中孵育60 180min，同时在各自的缓冲液中加入0. 5 2. 5ug/ml 的蛋白酶抑制剂，每毫克角膜基质干重含1. 10 士 0.25yg DNA，角膜基质含水量为50% 80% ；7)将经过酶消化的板层角膜基质片放置于电泳液TA液中(作好角膜的电泳方向标 记)，然后将整个电泳槽放于密闭消毒盒内，0 10°C恒温冰箱内进行冰浴电泳；8)将电泳完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支 架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；9)将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥处理，即得到干燥板层组织工程角膜 支架；10)将干燥板层组织工程角膜支架进行钴60消毒，进行复水处理，得复水板层角膜支架。
4.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤 1)中，所述碘伏，是采用质量百分浓度为0. 5% 2%的碘伏，所述碘伏浸泡的时间为2 5min ；所述用含抗菌素的PBS浸泡的时间为5 lOmin，所述PBS冲洗，是冲洗3次，每次冲 洗的时间为5min ；所述抗菌素包括5万U/L青霉素，8万U/L妥布霉素或100mg/L链霉素。
5.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤2)中，所述滤纸，是蘸有质量百分浓度为15% 30%酒精的滤纸；所述直接浸泡的时间为1 5min;所述擦除上皮细胞层，是采用棉签或角膜上皮刀擦除上皮细胞层。
6.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤 3)中，所述在手术显微镜下作角膜缘切口，是采用宝石刀作深度为3 4mm，厚度为0. 8 1. 2mm，长为2. 5 3. 5mm的角膜缘切口 ；所述直接用板层角膜分离刀分离前板层角膜的前 板层角膜的深度为3 4mm，厚度为0. 8 1. 2mm。
7.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤5) 中，所述低渗液，选自双蒸水或三蒸水。
8.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤6) 中，所述酶与缓冲液的体积比为1 50，DNA酶与RNA酶的体积比为10 1 ；所述蛋白酶抑 制剂采用roche公司的产品，不含EDTA ；在步骤7)中，所述冰浴电泳的时间为1 4h，所述电泳为单相水平电泳或双相电泳， 电泳的条件为100 180￥/011，1\14溶液配置方法将4. 84g TrisBase溶于IOOml双蒸水 中，滴加1. 142ml Glacial Acetic Acid，然后加双蒸水至IL0
9.如权利要求3所述的一种板层组织工程角膜支架的制作方法，其特征在于在步骤9) 中，所述干燥处理为真空冻干，真空晾干，干燥无水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹干，30 60°C恒温箱内烘干中的至少一种，所述干燥处理的时间为6 24h ；在步骤10)中，所述复 水处理所采用的复水剂选自林格氏液，平衡液，IXPBS溶液，DMEM培养液，短期角膜保存 液，中期角膜保存液中的至少一种。
10.如权利要求1所述一种板层组织工程角膜支架用于角膜移植各种供体材料的替代 物，在治疗角膜外伤及化学烧伤系列疾病，角膜肿瘤及增生性系列疾病，角膜血管化和瘢痕 系列疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反应系列疾病中应用。
全文摘要
一种板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用，涉及一种生物医学的板层组织工程角膜支架。提供一种与现有材料相比，来源丰富、透明度高、生物相容性好、性能与新鲜角膜接近、脱细胞彻底、安全性强，能被广大患者接受并长期应用于临床的板层组织工程角膜支架及其制作方法与应用。所述一种板层组织工程角膜支架为动物源性脱细胞板层角膜基质片，不含细胞成分，胶原纤维排列整齐，间隙规则，角膜透光率为80％～95％，拉伸强度为2～5N/mm2。可用于角膜移植各种供体材料的替代物，可在治疗角膜外伤及化学烧伤系列疾病，角膜肿瘤及增生性系列疾病，角膜血管化和瘢痕系列疾病，角膜免疫性疾病，角膜移植排斥反应系列疾病等角膜病变中应用。
文档编号A61L27/38GK101947144SQ20101029643
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者刘祖国, 李炜, 梁凌毅, 许传超, 邵毅 申请人:厦门大学
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