广西铁皮石斛hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法
专利名称：广西铁皮石斛hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药鉴定方法，尤其是涉及广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法 及其标准指纹图谱。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall, ex Lindl.)是兰科石斛属多年生附生草 本植物，是一种名贵的中药材，广西是石斛主要的分布区域之一。具有增强免疫力、抗氧化、 降血糖和抑制癌症等药理功效。由于人为长期无节制采挖及不合理利用石斛，其野生资源 日趋减少，行业内出现了一些以假乱真、以次充好的混乱局面。目前，一些研究者进行人工 栽培铁皮石斛，或者尝试用组织培养物替代原药材。因此，有必要对利用色谱指纹图谱对栽 培的铁皮石斛、组织培养物和原药材的药材质量进行评价。色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，可以判断药材的真伪、评价优 劣，可以在整体和局部区分不同品种的药材、同一品种野生和种植或者组织培养材料、同一 品种不同产地的药材、同一品种同一产地不同年份的药材。迄今为止，有关铁皮石斛HPLC 指纹图谱的专利有1项，已发表的论文有1篇，其中，成金乐等对石斛(包含铁皮石斛)中 酚类和黄酮类成分进行了 HPLC指纹图谱分析，(成金乐，李先霞，徐吉银，等.石斛色谱指纹 图谱测定方法，CN200810218494.5)。此方法适合于酚类和黄酮类这两类成分的质量控制。 殷放宙等建立了采自云南思茅石膏井镇的10批铁皮石斛药材的指纹图谱，获得了 15个共 有指纹峰(殷放宙，陆兔林，蔡宝昌，等.铁皮石斛药材HPLC指纹图谱研究，中草药，2008， 39(3) :433-435)。由于铁皮石斛含有多类化学成分，要控制铁皮石斛药材的质量，尽可能要检测多 个成分对其进行质量控制。另外，由于不同产地铁皮石斛药材质量差别较大，样品采集要有 足够的代表性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法及 其标准指纹图谱，为人工合理采收铁皮石斛及质量控制提供科学参考。为解决上述技术问题采用如下技术方案广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方 法包括如下步骤(1)供试品溶液的制备精密称取过60目筛的铁皮石斛粉末l.Og于磨口三角瓶 中，适量10%氨水润湿，加入甲醇50mL并密闭静置30min，于85°C下进行4h水浴回流提取， 趁热过滤，滤液于65°C下旋转蒸发至干后，用5mL甲醇溶解并定容，后用0. 45 μ m微孔滤膜 过滤，取滤液进行色谱测定；(2)HPLC 色谱分析条件色谱柱为 4. 6mmX250mm 5μπι 的 Alltima C18，以乙 腈-0. 1 %磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为310nm，流速为1. 2mL/min,柱温为 30 0C ；(3)测定精确吸取供试品溶液20 μ L注入液相色谱仪，按步骤(2)的条件操作， 记录60min的色谱图。梯度洗脱的程序设为时间梯度0、10、20、25、40、55、60min，乙腈对应的浓度梯度 15%,22%,25%,27. 5%、30%、30%、15%。广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法所得的标准指纹图谱共有色谱峰有13 个，其保留时间分别为 6. 387min、7. 595min、8. 091min、9. 104min、10. 494min、ll. 743min、 13. 133min、14. 418min、16. 777min、25. 759min、28. 555min、31. 284min、32. 533min。方法学考察结果表明，本发明的广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法重现性 好，各共有峰相对峰面积的RSD < 3%，相对保留时间的RSD < 1%;精密度考察中各共有峰 相对峰面积的RSD < 3%，相对保留时间的RSD < 1%，供试品溶液在24h内稳定性较好，符 合指纹图谱研究的要求。相对于现有方法，更具有如下的优点及效果(1)本发明是以广西不同产地的铁皮石斛(包括人工栽培的铁皮石斛)而建立起 来的HPLC指纹图谱，共有峰多，代表性强，能客观的反映铁皮石斛的内在质量；(2)通过指纹图谱中共有峰峰面积的大小，能有效地控制人工栽培铁皮石斛的合 理采收期；(3)本发明方法精确、稳定、重现性好、操作简便、易于掌握。因此，本发明建立的广西不同产地铁皮石斛的HPLC指纹图谱，对广西铁皮石斛标 准化种植和药材质量控制均具有重要的意义。
图1是广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法所得的标准指纹图谱。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。实施例广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立<1>主要仪器和试剂美国waterS2695高效液相色谱仪，美国Waters 2996 PAD 二极管阵列检测器，色 谱柱Alltima C18 (4. 6mmX 250mm，5 μ m)。乙腈(德国默克公司，色谱纯)，其他试剂为分析纯。<2> 材料共用13批材料，其中5批材料来自广西容县、广西河池、广西桂平、广西桂林等地， 8批材料为不同生育期的人工栽培铁皮石斛。<3>供试品溶液的制备精密称取铁皮石斛粉末(过60目筛)l.Og于磨口三角瓶中，适量10%氨水润湿， 加入甲醇50mL并密闭静置30min，于85°C下进行4h水浴回流提取，趁热过滤，滤液于65°C 下旋转蒸发至干后，用5mL甲醇溶解并定容，后用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取滤液进行色谱 测定。<4>指纹图谱建立与分析
色谱条件色谱柱Alltima C18(4. 6mmX 250mm, 5 μ m)；流动相乙腈-0. 1 %磷酸水溶液梯度洗脱；洗脱程序时间梯度0 — 10 — 20 — 25 — 40 — 55 — 60min,乙腈对应的浓度梯 度 15%— 22%— 25%— 27. 30%— 30%— 15% ；检测波长3IOnm；流速1· 2mL/min ；柱温30°C精确吸取供试品溶液20 μ L上机，得到记录60min的色谱图。根据13批广西铁皮 石斛材料HPLC指纹图谱分析，找出其共有色谱峰(13个峰)。由于6号峰的分离度较好，且 峰面积比较大、较稳定，因此选择6号峰为内参峰。如图1所示，这13个共有色谱峰的保留 时间分别为 6. 387min、7. 595min、8. 091min、9. 104min、10. 494min、ll. 743min、13. 133min、 14. 418min、16. 777min、25. 759min、28. 555min、31. 284min、32. 533min。<5>方法学考察<5. 1>精密度测定以同一供试品溶液，连续上机进样6次，记录色谱图。结果显示，各共有色谱峰相 对保留时间的RSD < 1. 0%，相对峰面积的RSD < 3. 0%，表明仪器系统的精密度良好。<5. 2>稳定性测定以同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h内上机进行测定，记录色谱图。结果 显示，各共有色谱峰相对保留时间的RSD < 1. 0%，相对峰面积的RSD < 3. 0%，表明供试品 溶液在24h内稳定。<5. 3>重现性测定取同一批材料6份，按照制备方法制备供试品溶液，分别上机进行测定并记录色 谱图。结果显示，各共有色谱峰相对保留时间的RSD < 1. 0%，相对峰面积的RSD <3.0%, 表明方法重现性良好。
权利要求
一种广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于该建立方法包括如下步骤(1)供试品溶液的制备精密称取过60目筛的铁皮石斛粉末1.0g于磨口三角瓶中，适量10％氨水润湿，加入甲醇50mL并密闭静置30min，于85℃下进行4h水浴回流提取，趁热过滤，滤液于65℃下旋转蒸发至干后，用5mL甲醇溶解并定容，后用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液进行色谱测定；(2)HPLC色谱分析条件色谱柱为4.6mm×250mm 5μm的Alltima C18，以乙腈 0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为310nm，流速为1.2mL/min，柱温为30℃；(3)测定精确吸取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，按步骤(2)的条件操作，记录60min的色谱图。
2.根据权利要求1所述的广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于所 述梯度洗脱的程序设为时间梯度0、10、20、25、40、55、60min，乙腈对应的浓度梯度15%、 22%,25%,27. 5%、30%、30%、15%。
3.根据权利要求1所述的广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法所得的标准指 纹图谱，其特征在于该指纹图谱共有色谱峰有13个，其保留时间分别为6. 387min、 7. 595min、8. 091min、9. 104min、10. 494min、ll. 743min、13. 133min、14. 418min、16. 777min、 25.759min、28. 555min、31. 284min、32. 533min。
全文摘要
本发明公开了一种广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法，该建立方法通过取铁皮石斛粉末，适量10％氨水润湿，85℃下在甲醇水浴回流提取4h后，过滤、蒸干，再用甲醇定容，溶液过微孔滤膜，取滤液进行色谱测定，HPLC色谱分析条件色谱柱为Alltima C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1.2mL/min；检测波长310nm；柱温30℃，得到铁皮石斛的HPLC指纹图谱。本发明还公开了上述方法所得的标准指纹图谱，该指纹图谱有13个共有色谱峰。本发明方法精确，稳定、重现性好，所得指纹图谱可为人工合理采收铁皮石斛及为其质量控制提供科学参考。
文档编号A61P37/04GK101979052SQ20101029822
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者何铁光, 卢声仙, 唐胜, 李杨瑞, 王灿琴, 王爱勤, 董文斌, 赵坤, 韦柱杨, 黄岛平, 龚明霞 申请人:广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所
技术领域：
本发明涉及中药鉴定方法，尤其是涉及广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法 及其标准指纹图谱。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall, ex Lindl.)是兰科石斛属多年生附生草 本植物，是一种名贵的中药材，广西是石斛主要的分布区域之一。具有增强免疫力、抗氧化、 降血糖和抑制癌症等药理功效。由于人为长期无节制采挖及不合理利用石斛，其野生资源 日趋减少，行业内出现了一些以假乱真、以次充好的混乱局面。目前，一些研究者进行人工 栽培铁皮石斛，或者尝试用组织培养物替代原药材。因此，有必要对利用色谱指纹图谱对栽 培的铁皮石斛、组织培养物和原药材的药材质量进行评价。色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，可以判断药材的真伪、评价优 劣，可以在整体和局部区分不同品种的药材、同一品种野生和种植或者组织培养材料、同一 品种不同产地的药材、同一品种同一产地不同年份的药材。迄今为止，有关铁皮石斛HPLC 指纹图谱的专利有1项，已发表的论文有1篇，其中，成金乐等对石斛(包含铁皮石斛)中 酚类和黄酮类成分进行了 HPLC指纹图谱分析，(成金乐，李先霞，徐吉银，等.石斛色谱指纹 图谱测定方法，CN200810218494.5)。此方法适合于酚类和黄酮类这两类成分的质量控制。 殷放宙等建立了采自云南思茅石膏井镇的10批铁皮石斛药材的指纹图谱，获得了 15个共 有指纹峰(殷放宙，陆兔林，蔡宝昌，等.铁皮石斛药材HPLC指纹图谱研究，中草药，2008， 39(3) :433-435)。由于铁皮石斛含有多类化学成分，要控制铁皮石斛药材的质量，尽可能要检测多 个成分对其进行质量控制。另外，由于不同产地铁皮石斛药材质量差别较大，样品采集要有 足够的代表性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法及 其标准指纹图谱，为人工合理采收铁皮石斛及质量控制提供科学参考。为解决上述技术问题采用如下技术方案广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方 法包括如下步骤(1)供试品溶液的制备精密称取过60目筛的铁皮石斛粉末l.Og于磨口三角瓶 中，适量10%氨水润湿，加入甲醇50mL并密闭静置30min，于85°C下进行4h水浴回流提取， 趁热过滤，滤液于65°C下旋转蒸发至干后，用5mL甲醇溶解并定容，后用0. 45 μ m微孔滤膜 过滤，取滤液进行色谱测定；(2)HPLC 色谱分析条件色谱柱为 4. 6mmX250mm 5μπι 的 Alltima C18，以乙 腈-0. 1 %磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为310nm，流速为1. 2mL/min,柱温为 30 0C ；(3)测定精确吸取供试品溶液20 μ L注入液相色谱仪，按步骤(2)的条件操作， 记录60min的色谱图。梯度洗脱的程序设为时间梯度0、10、20、25、40、55、60min，乙腈对应的浓度梯度 15%,22%,25%,27. 5%、30%、30%、15%。广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法所得的标准指纹图谱共有色谱峰有13 个，其保留时间分别为 6. 387min、7. 595min、8. 091min、9. 104min、10. 494min、ll. 743min、 13. 133min、14. 418min、16. 777min、25. 759min、28. 555min、31. 284min、32. 533min。方法学考察结果表明，本发明的广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法重现性 好，各共有峰相对峰面积的RSD < 3%，相对保留时间的RSD < 1%;精密度考察中各共有峰 相对峰面积的RSD < 3%，相对保留时间的RSD < 1%，供试品溶液在24h内稳定性较好，符 合指纹图谱研究的要求。相对于现有方法，更具有如下的优点及效果(1)本发明是以广西不同产地的铁皮石斛(包括人工栽培的铁皮石斛)而建立起 来的HPLC指纹图谱，共有峰多，代表性强，能客观的反映铁皮石斛的内在质量；(2)通过指纹图谱中共有峰峰面积的大小，能有效地控制人工栽培铁皮石斛的合 理采收期；(3)本发明方法精确、稳定、重现性好、操作简便、易于掌握。因此，本发明建立的广西不同产地铁皮石斛的HPLC指纹图谱，对广西铁皮石斛标 准化种植和药材质量控制均具有重要的意义。
图1是广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法所得的标准指纹图谱。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。实施例广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立<1>主要仪器和试剂美国waterS2695高效液相色谱仪，美国Waters 2996 PAD 二极管阵列检测器，色 谱柱Alltima C18 (4. 6mmX 250mm，5 μ m)。乙腈(德国默克公司，色谱纯)，其他试剂为分析纯。<2> 材料共用13批材料，其中5批材料来自广西容县、广西河池、广西桂平、广西桂林等地， 8批材料为不同生育期的人工栽培铁皮石斛。<3>供试品溶液的制备精密称取铁皮石斛粉末(过60目筛)l.Og于磨口三角瓶中，适量10%氨水润湿， 加入甲醇50mL并密闭静置30min，于85°C下进行4h水浴回流提取，趁热过滤，滤液于65°C 下旋转蒸发至干后，用5mL甲醇溶解并定容，后用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取滤液进行色谱 测定。<4>指纹图谱建立与分析
色谱条件色谱柱Alltima C18(4. 6mmX 250mm, 5 μ m)；流动相乙腈-0. 1 %磷酸水溶液梯度洗脱；洗脱程序时间梯度0 — 10 — 20 — 25 — 40 — 55 — 60min,乙腈对应的浓度梯 度 15%— 22%— 25%— 27. 30%— 30%— 15% ；检测波长3IOnm；流速1· 2mL/min ；柱温30°C精确吸取供试品溶液20 μ L上机，得到记录60min的色谱图。根据13批广西铁皮 石斛材料HPLC指纹图谱分析，找出其共有色谱峰(13个峰)。由于6号峰的分离度较好，且 峰面积比较大、较稳定，因此选择6号峰为内参峰。如图1所示，这13个共有色谱峰的保留 时间分别为 6. 387min、7. 595min、8. 091min、9. 104min、10. 494min、ll. 743min、13. 133min、 14. 418min、16. 777min、25. 759min、28. 555min、31. 284min、32. 533min。<5>方法学考察<5. 1>精密度测定以同一供试品溶液，连续上机进样6次，记录色谱图。结果显示，各共有色谱峰相 对保留时间的RSD < 1. 0%，相对峰面积的RSD < 3. 0%，表明仪器系统的精密度良好。<5. 2>稳定性测定以同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h内上机进行测定，记录色谱图。结果 显示，各共有色谱峰相对保留时间的RSD < 1. 0%，相对峰面积的RSD < 3. 0%，表明供试品 溶液在24h内稳定。<5. 3>重现性测定取同一批材料6份，按照制备方法制备供试品溶液，分别上机进行测定并记录色 谱图。结果显示，各共有色谱峰相对保留时间的RSD < 1. 0%，相对峰面积的RSD <3.0%, 表明方法重现性良好。
权利要求
一种广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于该建立方法包括如下步骤(1)供试品溶液的制备精密称取过60目筛的铁皮石斛粉末1.0g于磨口三角瓶中，适量10％氨水润湿，加入甲醇50mL并密闭静置30min，于85℃下进行4h水浴回流提取，趁热过滤，滤液于65℃下旋转蒸发至干后，用5mL甲醇溶解并定容，后用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液进行色谱测定；(2)HPLC色谱分析条件色谱柱为4.6mm×250mm 5μm的Alltima C18，以乙腈 0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为310nm，流速为1.2mL/min，柱温为30℃；(3)测定精确吸取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，按步骤(2)的条件操作，记录60min的色谱图。
2.根据权利要求1所述的广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于所 述梯度洗脱的程序设为时间梯度0、10、20、25、40、55、60min，乙腈对应的浓度梯度15%、 22%,25%,27. 5%、30%、30%、15%。
3.根据权利要求1所述的广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法所得的标准指 纹图谱，其特征在于该指纹图谱共有色谱峰有13个，其保留时间分别为6. 387min、 7. 595min、8. 091min、9. 104min、10. 494min、ll. 743min、13. 133min、14. 418min、16. 777min、 25.759min、28. 555min、31. 284min、32. 533min。
全文摘要
本发明公开了一种广西铁皮石斛HPLC指纹图谱的建立方法，该建立方法通过取铁皮石斛粉末，适量10％氨水润湿，85℃下在甲醇水浴回流提取4h后，过滤、蒸干，再用甲醇定容，溶液过微孔滤膜，取滤液进行色谱测定，HPLC色谱分析条件色谱柱为Alltima C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1.2mL/min；检测波长310nm；柱温30℃，得到铁皮石斛的HPLC指纹图谱。本发明还公开了上述方法所得的标准指纹图谱，该指纹图谱有13个共有色谱峰。本发明方法精确，稳定、重现性好，所得指纹图谱可为人工合理采收铁皮石斛及为其质量控制提供科学参考。
文档编号A61P37/04GK101979052SQ20101029822
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者何铁光, 卢声仙, 唐胜, 李杨瑞, 王灿琴, 王爱勤, 董文斌, 赵坤, 韦柱杨, 黄岛平, 龚明霞 申请人:广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所
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