一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用的制作方法
专利名称：一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种纳米核酸导向药物及其制 备方法和应用。
背景技术：
近年来，分子靶向药物在肿瘤治疗中显示出其价值。本领域中，把针对细胞受体、 基因、调控分子等信号转导为靶点的治疗，称为“靶向治疗”。靶向治疗是肿瘤治疗的趋势，其毒副作用低于细胞毒性药物，所以尽管目前靶向 药物疗效不甚明显，但也已经为肿瘤患者带来希望，为肿瘤治疗提供了新的思路与方法。许多核酸药物目前在临床应用上最大的难题就是在体内易于被降解的问题，难以 到达靶点部位，这是本领域难以克服的技术难题，大大限制了其临床应用。例如，大量的研 究已经证明microRNA可以诱导癌细胞的凋亡，抑制癌细胞的生长，分裂。并且，microRNA是 一种100%人源性的RNA，不会产生免疫反应，安全性好。然而，microRNA在进入到体内后 易于被降解，大大降低了其临床应用效果。目前，核酸药物治疗癌症大都处在研究阶段，单纯的寡核苷酸进入人体内，在很短 的时间(几分钟至十几分钟就被体内血液核酸酶完全分解，无法有效到达病灶，由于分子 量小，并且容易随经肾脏尿液排出，非特异性药物代谢，大大限制了核酸药物的效果。C32是一种体内输送基因的聚合体，其颗粒大小在纳米级，毒副作用小。其可通过 一种叫做内吞作用的过程进入细胞。然而，其在进入到体内后，受到体内环境的影响，易于 发生膨胀，从而在未到达给药靶点前就释放出其包裹的药物。因此，本领域迫切需要解决核酸药物的高效给药问题，使得药物尽可能多地到达 需要用药的部位，不被体内其它机制降解。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用。在本发明的第一方面，提供一种纳米核酸导向药物，所述药物是C32粒子、导向 物、核酸药物的复合物；所述的复合物的表面修饰有聚乙二醇。在一个优选例中，所述的聚乙二醇结合于复合物表面的氨基基团上。在另一优选例中，所述的导向物是特异性靶向药物作用位点(如哺乳动物的组 织、器官或细胞)的核酸或多肽。在另一优选例中，所述的多肽选自SEQ ID NO :11_14中的一种或几种。在另一优选例中，所述的核酸药物是干扰分子。在另一优选例中，所述的干扰分子选自SEQ ID N0:l-10的寡核苷酸中的一种或 几种。在另一优选例中，所述的干扰分子是SEQ ID NO :1_10的寡核苷酸的混合物；更佳地，是SEQ ID NO :1-10的寡核苷酸等比例的混合物。在另一优选例中，所述的纳米核酸导向药物是治疗肝癌的药物。在另一优选例中，所述的纳米核酸导向药物的粒径的平均值约170士20纳米。在本发明的另一方面，提供一种制备纳米核酸导向药物的方法，所述方法包括(1)将C32粒子、导向物、核酸药物混合，形成复合物；(2)将(1)获得的复合物进行聚乙二醇修饰，获得纳米核酸导向药物。在另一优选例中，所述的导向物是多肽，且步骤⑴包括(a)将C32与导向物进行酯化反应，形成C32-导向物复合物；以及(b)将C32-导向物复合物与核酸药物混合，形成C32-导向物-核酸药物复合物。在另一优选例中，步骤(a)中，C32与导向物的摩尔比是1 (2_3)；较佳地是 1 2.4。在另一优选例中，步骤(a)中，酯化反应的催化剂是S0427Si02。在另一优选例中，步骤(a)中，酯化反应的时间是4士2小时；较佳地是4士 1小时。在另一优选例中，聚乙二醇修饰的方法是将C32-导向物_miRNA(较佳地溶于碳 酸钠溶液)与过量的mPEG-SPA(较佳地溶于乙腈中)反应。在本发明的另一方面，提供所述的纳米核酸导向药物的用途，用于制备靶向治疗 疾病的组合物。在本发明的另一方面，提供一种组合物，含有有效量的所述的纳米核酸导向药物；以及药学上可接受的载体。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1显示了利用透射电镜(TEM)对获得的药物的结构及大小进行鉴定。右图是对 颗粒粒径的统计分析。图2显示了通过动态光散射(DLS)技术测定颗粒尺寸，采用BrookhavenZetaPALS， BI-9000AT数字自相关器，波长656nm。图3显示了流式细胞仪鉴定纳米药物的结合特异性。可见其特异性结合在肝癌细 胞上，而不结合在其他的细胞上。图4显示了采用Confocal显微镜鉴定纳米药物的结合特异性，转染特异性及效 率。左侧图为未用纳米药物处理的对照，右侧图为用纳米药物处理的细胞。图中，DAPI染 色，细胞核用蓝色荧光显示，纳米核酸药物用红色显示。
具体实施例方式针对核酸药物在给药后易于被体内降解的问题，本发明人经过广泛的研究，首次 揭示了一种纳米核酸导向药物。该纳米核酸导向药物以纳米材料(C32聚合体颗粒)为载 体，其中包含导向物和核酸药物；并且，所述的复合物的表面修饰有亲水性的化合物(较佳 地为聚乙二醇，PEG)。由于进行了修饰，药物表面的电荷属性发生改变，靶向特异性更好，可减少最终获得的药物对于血浆蛋白、血管壁以及其他组织的非特异性吸附。纳米核酸导向药物本发明提供了一种纳米核酸导向药物，以纳米材料(C32聚合体颗粒)为载体，其 中包含导向物和核酸药物；并且，所述的复合物的表面修饰有亲水性的化合物(PEG)。(a)C32 聚合体所述的C32是一种体内输送基因的聚合体，其颗粒大小在纳米级，毒副作用小。其 可通过一种叫做内吞作用的过程进入细胞。制备C32聚合体的方法是本领域技术人员所熟知的，一种常规的制法是将5-氨 基-1-戊醇与1，4_ 丁二醇二丙烯酸酯在合适的条件下聚合获得。制备C32聚合体的这些 材料均可通过商业途径购买获得。本发明采用的C32聚合体，其是可降解的纳米粒子，其能够有效阻止人体内自身 的核酸酶降解核酸药物，保护核酸药物不会随尿液排出，使药物的半衰期大为增长。随着纳 米粒子缓慢分解，核酸药物也被缓慢释放，而不是瞬间释放，所以作用比较温和。本发明采用的C32聚合体可以在哺乳动物体内被降解，并且没有发现任何毒副作用。(b)导向物所述的导向物是特异性靶向药物作用位点(如哺乳动物的组织、器官或细胞)的 核酸或多肽。任何对于识别药物靶点有用的核酸或多肽都是有用的，一些具有导向作用的 核酸或多肽在现有文献中已有报导，它们也被包含在本发明中。在实际应用中，可以根据所 需靶向的药物靶点的不同(如药物靶点可以是选自肝脏、肺、脾脏、胰脏等等)，选择不同 的导向物。作为本发明的一种优选方式，所述的导向物是靶向肝脏的多肽，所述的多肽选自 SEQ ID NO 11-14中的一种或几种。导向物的应用，增强了纳米药物与作用位点的特异性结合，利于核酸药物到达病 灶。(c)核酸药物所述的核酸药物是一些对于疾病发挥治疗作用的活性物质。可根据所需治疗的疾 病的不同，选择合适的核酸药物。例如，所述的疾病是肝癌或肺癌，则所述的核酸药物是对 于治疗肝癌或肺癌有用的药物。作为本发明的优选方式，所述的核酸药物是干扰分子(如siRNA，miRNA，反义核苷 酸)或在体内能够形成干扰分子的核酸(如shRNA)。所述的干扰分子能够以同源互补序列 的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。作为本发明的优选方式，所述的干扰分子选自SEQ ID NO :1_10的寡核苷酸中的 一种或几种。应用这些寡核苷酸制备的纳米核酸导向药物是治疗肝癌的药物。较佳地，所 述的干扰分子是SEQ ID NO 1-10的寡核苷酸的混合物；更佳地，是SEQ ID NO 1-10的寡 核苷酸等比例的混合物。本发明人优化选择到了这些miRNA，它们的混合物具有良好的肝癌 治疗效果。(d) PEG 修饰本发明的纳米核酸药物的表面修饰有PEG。PEG的化学结构式为=HO(CH2CH2O)nH,由环氧乙烷聚合而成。其分子式为
权利要求
1.一种纳米核酸导向药物，其特征在于，所述药物是C32粒子、导向物、核酸药物的复 合物；所述的复合物的表面修饰有聚乙二醇。
2.如权利要求2所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的导向物是特异性靶向 药物作用位点的核酸或多肽。
3.如权利要求2所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的多肽选自SEQID NO 11-14中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的核酸药物是干扰分子。
5.如权利要求4所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的干扰分子选自SEQID NO 1-10的寡核苷酸中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的纳米核酸导向药物是 治疗肝癌的药物。
7.一种制备纳米核酸导向药物的方法，其特征在于，所述方法包括(1)将C32粒子、导向物、核酸药物混合，形成复合物；(2)将(1)获得的复合物进行聚乙二醇修饰，获得纳米核酸导向药物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的导向物是多肽，且步骤(1)包括(a)将C32与导向物进行酯化反应，形成C32-导向物复合物；以及(b)将C32-导向物复合物与核酸药物混合，形成C32-导向物-核酸药物复合物。
9.权利要求1所述的纳米核酸导向药物的用途，用于制备靶向治疗疾病的组合物。
10.一种组合物，其特征在于，含有有效量的权利要求1所述的纳米核酸导向药物；以及 药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用。该纳米核酸导向药物以纳米材料为载体，其中包含导向物和核酸药物；并且，所述的复合物的表面修饰有亲水性的化合物。本发明的纳米核酸导向药物靶向特异性好，对于血浆蛋白、血管壁以及其他组织的非特异性吸附低。
文档编号A61K47/48GK102000346SQ20101029859
公开日2011年4月6日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者张严冬, 李相鲁, 赵念玺, 邹水洋 申请人:东莞市麦亘生物科技有限公司
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种纳米核酸导向药物及其制 备方法和应用。
背景技术：
近年来，分子靶向药物在肿瘤治疗中显示出其价值。本领域中，把针对细胞受体、 基因、调控分子等信号转导为靶点的治疗，称为“靶向治疗”。靶向治疗是肿瘤治疗的趋势，其毒副作用低于细胞毒性药物，所以尽管目前靶向 药物疗效不甚明显，但也已经为肿瘤患者带来希望，为肿瘤治疗提供了新的思路与方法。许多核酸药物目前在临床应用上最大的难题就是在体内易于被降解的问题，难以 到达靶点部位，这是本领域难以克服的技术难题，大大限制了其临床应用。例如，大量的研 究已经证明microRNA可以诱导癌细胞的凋亡，抑制癌细胞的生长，分裂。并且，microRNA是 一种100%人源性的RNA，不会产生免疫反应，安全性好。然而，microRNA在进入到体内后 易于被降解，大大降低了其临床应用效果。目前，核酸药物治疗癌症大都处在研究阶段，单纯的寡核苷酸进入人体内，在很短 的时间(几分钟至十几分钟就被体内血液核酸酶完全分解，无法有效到达病灶，由于分子 量小，并且容易随经肾脏尿液排出，非特异性药物代谢，大大限制了核酸药物的效果。C32是一种体内输送基因的聚合体，其颗粒大小在纳米级，毒副作用小。其可通过 一种叫做内吞作用的过程进入细胞。然而，其在进入到体内后，受到体内环境的影响，易于 发生膨胀，从而在未到达给药靶点前就释放出其包裹的药物。因此，本领域迫切需要解决核酸药物的高效给药问题，使得药物尽可能多地到达 需要用药的部位，不被体内其它机制降解。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用。在本发明的第一方面，提供一种纳米核酸导向药物，所述药物是C32粒子、导向 物、核酸药物的复合物；所述的复合物的表面修饰有聚乙二醇。在一个优选例中，所述的聚乙二醇结合于复合物表面的氨基基团上。在另一优选例中，所述的导向物是特异性靶向药物作用位点(如哺乳动物的组 织、器官或细胞)的核酸或多肽。在另一优选例中，所述的多肽选自SEQ ID NO :11_14中的一种或几种。在另一优选例中，所述的核酸药物是干扰分子。在另一优选例中，所述的干扰分子选自SEQ ID N0:l-10的寡核苷酸中的一种或 几种。在另一优选例中，所述的干扰分子是SEQ ID NO :1_10的寡核苷酸的混合物；更佳地，是SEQ ID NO :1-10的寡核苷酸等比例的混合物。在另一优选例中，所述的纳米核酸导向药物是治疗肝癌的药物。在另一优选例中，所述的纳米核酸导向药物的粒径的平均值约170士20纳米。在本发明的另一方面，提供一种制备纳米核酸导向药物的方法，所述方法包括(1)将C32粒子、导向物、核酸药物混合，形成复合物；(2)将(1)获得的复合物进行聚乙二醇修饰，获得纳米核酸导向药物。在另一优选例中，所述的导向物是多肽，且步骤⑴包括(a)将C32与导向物进行酯化反应，形成C32-导向物复合物；以及(b)将C32-导向物复合物与核酸药物混合，形成C32-导向物-核酸药物复合物。在另一优选例中，步骤(a)中，C32与导向物的摩尔比是1 (2_3)；较佳地是 1 2.4。在另一优选例中，步骤(a)中，酯化反应的催化剂是S0427Si02。在另一优选例中，步骤(a)中，酯化反应的时间是4士2小时；较佳地是4士 1小时。在另一优选例中，聚乙二醇修饰的方法是将C32-导向物_miRNA(较佳地溶于碳 酸钠溶液)与过量的mPEG-SPA(较佳地溶于乙腈中)反应。在本发明的另一方面，提供所述的纳米核酸导向药物的用途，用于制备靶向治疗 疾病的组合物。在本发明的另一方面，提供一种组合物，含有有效量的所述的纳米核酸导向药物；以及药学上可接受的载体。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1显示了利用透射电镜(TEM)对获得的药物的结构及大小进行鉴定。右图是对 颗粒粒径的统计分析。图2显示了通过动态光散射(DLS)技术测定颗粒尺寸，采用BrookhavenZetaPALS， BI-9000AT数字自相关器，波长656nm。图3显示了流式细胞仪鉴定纳米药物的结合特异性。可见其特异性结合在肝癌细 胞上，而不结合在其他的细胞上。图4显示了采用Confocal显微镜鉴定纳米药物的结合特异性，转染特异性及效 率。左侧图为未用纳米药物处理的对照，右侧图为用纳米药物处理的细胞。图中，DAPI染 色，细胞核用蓝色荧光显示，纳米核酸药物用红色显示。
具体实施例方式针对核酸药物在给药后易于被体内降解的问题，本发明人经过广泛的研究，首次 揭示了一种纳米核酸导向药物。该纳米核酸导向药物以纳米材料(C32聚合体颗粒)为载 体，其中包含导向物和核酸药物；并且，所述的复合物的表面修饰有亲水性的化合物(较佳 地为聚乙二醇，PEG)。由于进行了修饰，药物表面的电荷属性发生改变，靶向特异性更好，可减少最终获得的药物对于血浆蛋白、血管壁以及其他组织的非特异性吸附。纳米核酸导向药物本发明提供了一种纳米核酸导向药物，以纳米材料(C32聚合体颗粒)为载体，其 中包含导向物和核酸药物；并且，所述的复合物的表面修饰有亲水性的化合物(PEG)。(a)C32 聚合体所述的C32是一种体内输送基因的聚合体，其颗粒大小在纳米级，毒副作用小。其 可通过一种叫做内吞作用的过程进入细胞。制备C32聚合体的方法是本领域技术人员所熟知的，一种常规的制法是将5-氨 基-1-戊醇与1，4_ 丁二醇二丙烯酸酯在合适的条件下聚合获得。制备C32聚合体的这些 材料均可通过商业途径购买获得。本发明采用的C32聚合体，其是可降解的纳米粒子，其能够有效阻止人体内自身 的核酸酶降解核酸药物，保护核酸药物不会随尿液排出，使药物的半衰期大为增长。随着纳 米粒子缓慢分解，核酸药物也被缓慢释放，而不是瞬间释放，所以作用比较温和。本发明采用的C32聚合体可以在哺乳动物体内被降解，并且没有发现任何毒副作用。(b)导向物所述的导向物是特异性靶向药物作用位点(如哺乳动物的组织、器官或细胞)的 核酸或多肽。任何对于识别药物靶点有用的核酸或多肽都是有用的，一些具有导向作用的 核酸或多肽在现有文献中已有报导，它们也被包含在本发明中。在实际应用中，可以根据所 需靶向的药物靶点的不同(如药物靶点可以是选自肝脏、肺、脾脏、胰脏等等)，选择不同 的导向物。作为本发明的一种优选方式，所述的导向物是靶向肝脏的多肽，所述的多肽选自 SEQ ID NO 11-14中的一种或几种。导向物的应用，增强了纳米药物与作用位点的特异性结合，利于核酸药物到达病 灶。(c)核酸药物所述的核酸药物是一些对于疾病发挥治疗作用的活性物质。可根据所需治疗的疾 病的不同，选择合适的核酸药物。例如，所述的疾病是肝癌或肺癌，则所述的核酸药物是对 于治疗肝癌或肺癌有用的药物。作为本发明的优选方式，所述的核酸药物是干扰分子(如siRNA，miRNA，反义核苷 酸)或在体内能够形成干扰分子的核酸(如shRNA)。所述的干扰分子能够以同源互补序列 的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。作为本发明的优选方式，所述的干扰分子选自SEQ ID NO :1_10的寡核苷酸中的 一种或几种。应用这些寡核苷酸制备的纳米核酸导向药物是治疗肝癌的药物。较佳地，所 述的干扰分子是SEQ ID NO 1-10的寡核苷酸的混合物；更佳地，是SEQ ID NO 1-10的寡 核苷酸等比例的混合物。本发明人优化选择到了这些miRNA，它们的混合物具有良好的肝癌 治疗效果。(d) PEG 修饰本发明的纳米核酸药物的表面修饰有PEG。PEG的化学结构式为=HO(CH2CH2O)nH,由环氧乙烷聚合而成。其分子式为
权利要求
1.一种纳米核酸导向药物，其特征在于，所述药物是C32粒子、导向物、核酸药物的复 合物；所述的复合物的表面修饰有聚乙二醇。
2.如权利要求2所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的导向物是特异性靶向 药物作用位点的核酸或多肽。
3.如权利要求2所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的多肽选自SEQID NO 11-14中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的核酸药物是干扰分子。
5.如权利要求4所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的干扰分子选自SEQID NO 1-10的寡核苷酸中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的纳米核酸导向药物，其特征在于，所述的纳米核酸导向药物是 治疗肝癌的药物。
7.一种制备纳米核酸导向药物的方法，其特征在于，所述方法包括(1)将C32粒子、导向物、核酸药物混合，形成复合物；(2)将(1)获得的复合物进行聚乙二醇修饰，获得纳米核酸导向药物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的导向物是多肽，且步骤(1)包括(a)将C32与导向物进行酯化反应，形成C32-导向物复合物；以及(b)将C32-导向物复合物与核酸药物混合，形成C32-导向物-核酸药物复合物。
9.权利要求1所述的纳米核酸导向药物的用途，用于制备靶向治疗疾病的组合物。
10.一种组合物，其特征在于，含有有效量的权利要求1所述的纳米核酸导向药物；以及 药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及一种纳米核酸导向药物及其制备方法和应用。该纳米核酸导向药物以纳米材料为载体，其中包含导向物和核酸药物；并且，所述的复合物的表面修饰有亲水性的化合物。本发明的纳米核酸导向药物靶向特异性好，对于血浆蛋白、血管壁以及其他组织的非特异性吸附低。
文档编号A61K47/48GK102000346SQ20101029859
公开日2011年4月6日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者张严冬, 李相鲁, 赵念玺, 邹水洋 申请人:东莞市麦亘生物科技有限公司
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