人核糖核酸酶u和人溶菌酶的两种进化酶的制作方法
专利名称：人核糖核酸酶u和人溶菌酶的两种进化酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类定向进化制备的进化酶，特别是涉及由人核糖核酸酶U和人溶菌酶通过定向进化制备的人核糖核酸酶U进化酶和人溶菌酶的进化酶。
近年来，随着现代生物工程技术的日新月异，以酶为主要研究对象的蛋白质工程技术发展非常迅速。在蛋白质工程研究方面，有关分子工程制备的进化酶、模块酶和杂合酶的研究日益受到重视。尤其是表达克隆(expression cloning)、分子筛选(molecular screening)、人工进化(artificial evolution)、DNA改组(DNA Shuffling)和体外突变技术开发的成功，为定向进化制备进化酶的开发与生产铺平了道路。
天然蛋白质功能的进化有一部分是通过结构域或亚结构域的重组来实现的，例如底物结合结构域，调节结构域，催化结构域这些相互独立的结构域之间的重组。这不但可以进化某种功能，还可以创造出新的功能，因为酶的活性位点位于不同的折叠单位相互作用的界面上。
基因工程与蛋白质工程应用于酶学的主要目的是通过改变天然酶的特性，创造具有新特性或性能有所改善的酶。获得新酶的原因有许多方面(1)天然酶在现存的工业条件下(例如在有机相、极端温度和pH)的稳定性较差或其催化效率很低；(2)天然酶在工程菌中的折叠效率较差或对蛋白酶敏感；(3)酶的催化活性需要提高或降低；(4)需要创造具有新反应活性的酶。定向进化制备的进化酶主要应用于改变酶的非催化特性；创造具有新活性的酶；研究酶的结构与功能之间的关系等。在新酶的开发和现有酶的改造利用方面，定向进化技术显示了它巨大的应用前景。
对酶的分子改造，几十年来的工作都着眼于两个方面，一是基于序列的合理化设计方案(Sequential rational design)，如化学修饰，定点突变(site-directed mutagenesis)等。一是利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程的非合理化设计方案(irrational design)，如定向进化(directedevolution)，杂合进化(hybrid evolution)等。对酶分子的研究可以分为认识和改造两个方面。前者是利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间关系以及氨基酸残基功能等方面的信息。以此为依据对酶分子进行改造，称为酶分子的合理性设计。与此相对应，不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变，基因重组，定向筛选等方法对其进行改造，则称为酶分子的非合理性设计。非合理性设计的实用性较强，往往可以通过随机产生的突变，改进酶的特性。对酶分子的设计与改造方法，是基于基因工程、蛋白质工程和计算机技术互补发展和渗透的结果。它标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至设计出自然界中原来并不存在的全新的酶分子。在目前，酶的分子工程改造还不成熟的情况下，通过定点突变技术改造成功了大量的酶分子，获得了比天然酶活力更高，稳定性更好的工业用酶。但总体说来，我们的能力并未达到对复杂的生物体系进行有效的人为改造的水平。近年来，易错PCR，DNA shuffling和高突变菌株等技术的应用，在对目的基因表型有高效检测筛选系统的条件下，建立了酶分子的定向进化策略，尽管不清楚酶分子的结构，仍能获得具有预期特性的新酶，基本上实现了酶的分子改造。
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业化要求，天然的酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其它性质。因此对天然酶分子水平上的改造，显得十分重要和必要。天然酶在自然条件下已经进化了千百万年，但是酶分子仍然蕴藏着巨大的进化潜力，这是酶的分子改造的基本先决条件。酶分子存在着分子改造的潜力主要原因在于1、天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境不同。一个比较好的例子是把枯草杆菌蛋白酶E应用于非水相(二甲基甲酰铵，DMF)，催化肽合成反应，自然生理条件下进化得比较完善的枯草杆菌蛋白酶E，由于没有接触过非水环境，因此其活性和稳定性不适合在有机相中完成催化反应，这就为该酶在新的筛选条件下(有机相中)提供了适合该条件的改造空间。2、实际应用中，总是期待酶的活性和稳定性越高越好，这样可以加快反应速度、提高酶的利用率、降低反应成本，但在生物体内更重要的是各种生物分子之间协同作用，作为一个整体去适应环境。生物对环境适应的进化主要不是表现为某个酶分子的活性和稳定性的不断提高，而是在于整体的适应能力，调控能力的增强。在自然选择的筛选压力下，更主要是这个系统中的瓶颈部分的进化。对于某个酶分子来说，其活性可以受到调节部位的调节，含量可以受到基因表达的调控，而当其酶活性和稳定性已经超过了满足整个体系在环境中生存的需求时，它们的提高就显得没有必要了，即失去了进化的筛选压力，因而进化的机会很有限，这也为体外定向进化留下了很大的进化空间。正如同SOD，SOD在体内的活力已经足以完成歧化生命体系自然产生的超氧离子，因此，在自然氧压下，体外进化基本不会取得进展。3、某些酶或蛋白质待进化的性质不是其在体内所涉及的，例如对蛋白药物改造消除其副作用，这部分性质的改善有着很大的进化潜力。
酶的定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为获得的)出发经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。我们以对单一酶分子基因进行定向进化为例，来说明酶分子改造的基本实验路线。在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA多聚酶不具有3’→5’校对功能，并控制突变库的大小使其与特定的筛选容量相适合，选择适当条件以较低的比率向目的基因中随机引入突变，进行正向突变间的随机组合以构建突变库，凭借定向的选择(或筛选)方法，选出所需性质的优化酶，从而排除其它突变体。也就是说，定向进化的基本规则是，“获取你所筛选的突变体”。简言之，定向进化＝随机突变+正向重组+选择(或筛选)。与自然进化不同，前者是人为引发的，后者相当于环境，作用于突变后的分子群，相当于通过选择某一方向的进化而排除其它方向突变的作用。酶的定向进化过程完全是在人为控制下进行的，是酶分子朝向人们期望的特定目标进化。
尽管用上述定向进化方法可向人类提供新的有价值酶，但酶的功能突变常常被埋没在众多的中性突变和不利突变群中。采用回交(back-crossing)法，将已进化的子代突变酶基因与野生酶基因重组，可排除这种干扰。这样，出现中性突变的频率只是50％，可全部去除不利突变。在定向进化中，尽管突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量。这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。
通常，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关。Venekei等人报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变体的方法和最佳筛选条件，主要是利用蛋白酶选择平板初选，再配合活性染色(activity staining)和X-光片消化分析(X-ray filmdigestion assay)加以验证，并检测其活力，快速筛选了44000个突变株。
Roberts等人采用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂。从含有4900个突变体的基因库中，获得与该酶结合能力高于野生蛋白质3.6×106倍的突变体，比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍。
另有一些其它的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物，或利用绿色荧光蛋白性质等。总之，筛选或选择在酶的定向进化中至关重要，直接关系到分子改造的成败。
目前已经比较成功的开发出来的定向进化策略如下1.易错PCR(Error-prone PCR)易错PCR是利用扩增目的基因的同时向模板引入碱基错配，导致目的基因随机突变。然而，经一次突变的基因很难获得满意的结果。由此发展出连续易错PCR(sequential error-prone PCR)策略，即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。Chen和Arnold用此策略在非水相(二甲基甲酰铵，DMF)定向进化枯草杆菌蛋白酶E的活性获得成功。所得突变体PC3在60％和85％的DMF中，催化效率kcat/Km分别是野生酶的256和131倍，比活性提高了157倍。将PC3再进行两个循环的定向进化，产生的突变体13M的kcat/Km比PC3高3倍(在60％DMF中)，比野生酶高471倍。在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，故属于无性进化(asexual evolution)，一般适用于较小的基因片段。
2.DNA改组(DNA shuffling)和外显子改组(Exon shuffling)DNA改组又称有性PCR(sexual PCR)。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。故在理论和实践上，它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续易错PCR”。通过DNA改组，不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的两个或更多的已优化性质合为一体。
外显子改组类似于DNA改组。二者都是在各自含突变的片段间进行交换。前者尤其适用于真核生物。在自然界中，由于不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。外显子改组可用于获得各种大小的随机肽库。
3.体外随机重组(Random-priming in vitro recombination，RPR)该方法的原理是以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变。在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。如果需要，可反复进行上述过程，直到获得满意的进化酶性质。
4.交错延伸(Stagger extension process，StEP)交错延伸是不同于DNA改组的又一新策略。其原理的核心是，在PCR反应中，把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火，而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度，结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。
5.酶法体外随机/定位诱变(Random-site-directed mutagenesis)为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题，我们研究小组曾以类胰岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型，探索了一种酶体外诱变的新途径，即酶法体外随机/定位诱变。该方法的内涵与酶的体外定向进化类似，对目的基因既采用随机突变，增加突变位点，以快速产生优质酶，又让其突变受到一定限制，以减少筛选突变体的工作量。实际上，该法也是体外模拟自然进化。不同点在于，该法是通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例，实现碱基对的错配。
酶分子定向进化是组合化学的思想和方法在酶分子改造上的应用，同时酶分子的定向进化设计因为研究对象的特殊性而在其思想和方法上具有自身特点，对组合化学是一种很重要的发展。酶分子定向进化设计在组合化学的随机库(突变库)和筛选的基础上，增加了利用基因改组技术的有性进化思想，与自然进化更加接近，有效的解决了对于酶这样的大分子物质，其天文数字级别的突变库与有限的筛选容量之间存在的矛盾。以基因重组技术为表现形式有性进化思想对于酶(蛋白质)的改造具有革命性的意义，因此定向进化是在组合化学思想和方法基础上的又一次飞跃。
自然界中的生物进化伴随着有性繁殖的出现而大大加快，基因改组是自然界生物进化的普遍现象和主要途径之一，动植物早已利用基因改组快速进化出能执行某一特定功能的优化性质。同样酶分子的正向突变之间或者同一家族的不同酶分子之间的重组使优良形性状的突变体一最大的几率存在于突变库中，大大增加酶分子定向进化的速度。比较经典的育种技术，DNA改组技术的突出特点是，加快不同品种或不同基因型之间的重组进化速度，在所产生的突变库中，个体差异以及与亲本的差异更大。因此，可使人们更快地获得所需突变体，利于快速推向应用。
基因改组的思想和技术在实际生产中有很重要的应用，并得到了很理想的结果。重组蛋白质药物在药业占有重要地位，产值达几十亿元，但许多这样的产品含有副作用，引起严重的并发症，因此限制或不利于诊断。用DNA改组技术选择性改造这些产品的基因，可获取所需的性质，排除不利的活性。最近，对人α-干扰素基因家族的改进，产生了1026个不同的突变体，并用噬菌体表面呈现技术筛选和分析重组的INF，获得了比INF2α活性约高40倍的突变体。通过把来自不同药物蛋白的结构单元结合，可产生具有新活性的代表作，这叫杂合蛋白(酶)技术，这是自然界进化过程中产生新蛋白质的有效途径之一。例如，将两个或更多的受体蛋白结合将头孢霉素酶基因家族改组后，快速进化了moxolactamase活性，通过筛选嵌合药物蛋白库，发现了许多新的药物活性。将已进化的变种与亲本基因杂交(称回交backcrossing)，可移去中性突变，降低药物蛋白的免疫原性。微生物广泛用于工业上生产药物分子，例如抗生素、真菌素抗癌药物和免疫抑制剂。在许多情况下，编码生物合成的有关酶是已知的，它们经常处于操纵子或基因簇中。然而对对这些生物合成途径的改进是困难的，因为难以测定途径中的限速步骤。用DNA改组技术却能使这些途径获得最佳化处理。这并不需要任何与限速步骤相关的信息和详细的蛋白质结构功能分析，把完整途径作为一个进化单位便能实现这一目的，这是该策略的又一突出特征。已对atrazineh和砷酸盐解毒途径进行尝试，获得了满意的效果。苄基脂酶(Fenzylesternase)用于工业上抗生素loracarbef前体的脱保护，对它也进行了改造。最近，还利用此技术改造了tRNA合成酶的专一性。目的是改变该酶的专一性，即催化tRNA将非天然的氨基酸在专一位点带入新生蛋白链中。已进化的酶可广泛的应用于利用酶法生产药物(或它们的前体)所涉及的多步化学反应。大多数天然酶需经较大的分子改造(活性、专一性及表达水平)才适于这样的要求。
总之，酶分子定向进化是非常有效的更接近于自然进化的蛋白质工程研究的新策略。其突出的优点是不需事先了解酶的空间结构和催化机制并适宜于任何酶分子改造，这便大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围。特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题，使我们能较快、较多地了解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导应用(如药物设计等)奠定理论基础，该技术简便、快速、耗资低、且有实效。它不仅能使酶进化出非天然特性，还能定向进化某一代谢途径；不仅能进化出具有单一优良特性的酶，还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加，产生具有多项优化功能的酶，进而发展和丰富了酶类资源；完全在试管中进行的酶的体外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年，几个月甚至更短的时间，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃。对一些酶和砷酸盐解毒途径、抗辐射性、生物合成途径、对映体选择性、抗体库以及DNA结合位点定向进化的可喜结果令众多的相关科学家为之振奋。可见，进化能发生在自然界，也能发生在试管中。它与合理设计互补，将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶分子，将使蛋白质工程学更加显示出诱人的前景。1999年5月12日-15日在芝加哥由5000多名生物技术专家参加的会议上，对基因及其所产生的酶进行重新设计引起了广泛的关注，其中酶分子的定向进化被认为是“一场达尔文做梦也没有想到的进化革命，是再设计生命世界的开端”。Table.1列举了近年来通过定向进化方法对酶分子进行改造所取得的主要成果。
Table.1 Application of directed enzyme evolution in vitro酶 性 质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCRb-内酰胺酶 总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN’ 稳定性 盒式诱变对硝基苯酯酶 底物专一性/有机相活 易错PCR/DNA改组性胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性 盒式诱变b-半乳糖苷酶底物专一性 DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性 易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶 活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗 活性/专一性/最佳表达DNA改组1999年，美国纽约大学生物化学系的Sylvia L H等人在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)上撰文，证明了人溶菌酶(human lysozyme)和人核糖核酸酶A(human RNaseA)可以用于治疗AIDS。联合应用溶菌酶和核糖核酸酶，对HIV-1和与AIDS密切相关的Kaposi肉瘤明显的抑制作用，这项研究结果，为AIDS的治疗提供了一种新的选择。目前尚未见到有关这两种酶的杂合酶研究工作的报道。
正是因为人溶菌酶和人核糖核酸酶在应用上的潜在前景，所以我们将这两种酶通过定向进化研究，获得的进化酶具有这样两种酶相同的催化活性。同时具有这两种酶同样的应用方向。
人核糖核酸酶U属于核糖核酸酶A超家族。整个核糖核酸酶A超家族(EC3.1.27.5)分为分泌型和非分泌型两大类。又分别称为胰脏型核糖核酸酶和肝脾型核糖核酸酶。它们是经由发生在旧世界猴从新世界猴分化出来之后的一次基因复制事件而出现的，一个分支导致了非分泌型核糖核酸酶；而另一分支又分化为两个方向，它的一支产生了分泌型核糖核酸酶(在哺乳动物中)，另一支产生了龟的胰核糖核酸酶和哺乳动物的血管生长因子(ANG)。分泌型核糖核酸酶包括人胰核糖核酸酶(RNaseA，HPRNase)、血管生成素(ANG)和核糖核酸酶4(RNase4)，非分泌型核糖核酸酶(HNSR)包括嗜伊红性粒细胞起源的神经毒素(RNaseU，EDN，RNase2，RNS2)和嗜伊红性粒细胞阳离子蛋白(ECP)。人尿中的核糖核酸酶主要有两种，分别为分泌性的RNaseC(RNaseUPL)非分泌型的RNaseU(RNaseUPS)。RNaseC是一种糖蛋白，等电点为10.4，当以RNA为底物时最适pH为8.5，并且偏爱人工合成的Poly(C)。，它的氨基酸组成和N末端以及C末端序列分析，显示这个酶同哺乳动物的胰核糖核酸酶极其相似(除了糖基化特点和C末端外加残基的存在)，它共有126个氨基酸，含糖量为50.2％。核糖核酸酶U(RNaseU)也是一种糖蛋白，糖基化的位点为五个N糖基化位点(Asn)和一个C糖基化位点(Trp)，等电点为11，当以RNA为底物时最适pH为7.0。它基本上不降解Poly(C)，相对而言，它更偏爱Poly(U)。研究表明，RNaseU的N末端和C末端序列与人胰核糖核酸酶只有很小的同源性(36％)，用不同的RNA或多聚核苷酸作底物时，RNaseU的核糖核酸水解活性是RNaseA的3％～30％，这个酶的氨基酸组成显示它与人脾和人肝的极其相似(后来证明它们为同一种酶)。这两种酶都极其稳定，在溶液状态下4℃保存4个月而无活性损失。
在人嗜伊红性粒细胞颗粒中发现了许多特殊的富含Arg的阳离子蛋白，例如嗜伊红性粒细胞起源的神经毒(RNaseU)、嗜伊红性粒细胞阳离子蛋白(ECP)和主要碱性蛋白(MBP)。其中ECP和RNaseU为主要的两种，二者的编码序列85％是相同的，同源性高达67％。ECP和MBP表现出了很强的细胞毒和蠕虫毒活性，RNaseU的已知生物活性是当它注射到实验动物脑内或Intrathecally时，诱导实验动物的运动性共济失调、偏瘫和损害髓鞘神经元(神经毒，Gordon现象)，这是通过RNaseU选择性杀死小脑的浦肯野细胞获得的。近来的研究发现RNaseU也具有蠕虫毒、对呼吸道上皮细胞的细胞毒以及抗病毒的能力。RNaseU和ECP都具有核酸水解活性，但RNaseU比ECP高50-100倍，但对诱导神经毒行为而言，核糖核酸酶活性是必要的但不是充分的。RNaseU对简单的多聚核苷酸(单链poly(U)、poly(C)、或双链poly(A)、poly(U)or poly(I)、poly(C))活性很低，对小的限定的底物也不能有效地加以降解。根据文献，ECP细胞毒性的可能的结构基础为在进化过程中，ECP在从RNaseU分化出来之后，在二者之间29个氨基酸残基替换中，共有12个为Arg的替换，导致ECP的pI从8.4增加到10.6。ECP的全部表面电荷为14而RNaseU和RNaseA为7和3。并且所有的Arg都暴露在溶剂中，其中的许多Arg同晶体包装有关。
国外早期的研究集中在对RNaseU的理化性质、晶体结构、分子克隆、融合表达及RNaseU同不同组织中的RNaseA超家族成员的比较研究上，近年的研究热点在研究RNaseU的进化特点，表达调控因子，酶催化反应的分子基础、定点突变。尚未见到有关定向进化的文献。
溶菌酶(lysozyme)又称为胞壁质酶，具有强力杀菌作用，1922年由细菌学家Fleming首次发现。广泛分布于生物体内，具有生物相容性好，对组织无刺激、无毒性等优点。它的主要生理作用如下1、药理作用1.1抗菌消炎溶菌酶为一种能水解粘多糖的碱性水解酶，此类粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一，该酶能催化水解细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成分分解成可溶性糖肽，细菌内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌，在分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下，还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌等。此外，它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并能够增强抗生素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目的。
1.2抗病毒溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
1.3增强免疫力溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。它可改善和增强巨噬细胞吞噬和消化功能，激活白细胞吞噬功能，并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少，从而增强机体的抵抗力。
1.4其它方面的药理作用溶菌酶还具有激活血小板的功能，可以改善组织局部血液循环障碍，分解脓液，增强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。
2、临床应用2.1五官科的应用溶菌酶首先适用于五官科各种炎症。研究表明它对眼、耳、鼻、喉、口腔等的急、慢性炎症均有一定疗效，特别是对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显，但对于严重的急性炎症，单独应用该酶效果不明显，必须和抗生素同时使用以发挥协同作用。溶菌酶对表层性溃疡的治疗效果比对深层性的好，而且病型不同，如对于轻型的口腔溃疡，含服含片即可治愈；对于口炎型和重型溃疡患者，除服含片外，需加抗生素、维生素B族口服药或静脉输液，以达到治愈目的。
含溶菌酶和降钙素的糊剂可用于治疗破坏型慢性牙周炎，将此糊剂涂布于周端病灶效果很好，并且有助于降低并发症，防止骨性组织再生。溶菌酶还可以阻止牙龈炎和龋齿的发生，抑制菌斑和牙石的形成。
2.2皮肤科的应用溶菌酶可用于治疗扁平疣、传染性软疣、寻常性疣、尖锐湿疣、带状疱疹等多种皮肤病。对于带状疱疹，内服该酶即可；而对扁平疣、传染性软疣等的治疗，则最好采用内服该酶加5-氟脲嘧啶溶液外涂，疗效比单独使用有明显提高。
2.3其它方面的应用溶菌酶可用于小儿或乳儿哮喘性支气管炎、呼吸道内膜肿胀等，它可使黏膜肿胀很快消除，使痰液变稀、呼吸通畅。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。在机体内它还具有抗流感病毒和腺病毒的生长，并能防止疱疹性病毒感染。此外，对肉瘤引起的疼痛、久治不愈的小儿腹泻以及Sjogren’s病，均有一定的疗效。
人体溶菌酶的浓度还可作为多种疾病的诊断指标用于临床。1966年Osserman首先把血清溶菌酶水平的测定作为白血病分型的依据，有助于急性白血病的诊断。Prockeep等人又认为如血清溶菌酶水平不超过肾阈值时，对尿溶菌酶的测定可作为肾小管损伤的有益诊断指标。又有研究报道可通过脑脊液中溶菌酶的浓度来区分病毒性脑膜炎和细菌性脑膜炎，还有人把泪液中溶菌酶的浓度作为干眼综合征的诊断指标等。
本发明的目的是提供制备工艺简单、成本低廉的人核糖核酸酶U和人溶菌酶的进化酶的制备方法，得到一类具有高活力、高稳定性、适用范围广泛的进化酶产品。
本发明制备工艺如下(1)基因突变文库的构建利用基因工程和蛋白质工程原理和方法构建人核糖核酸酶U和人溶菌酶的突变文库。
(2)转化将突变文库转入受体细胞中，进行表达。
(3)进化酶筛选利用两种酶的特性，将具有较高活力、较高稳定性和较高应用价值的进化酶筛选出来。
(4)建立进化酶表达的培养条件，包括培养基、最适pH值、最适温度、通气量、搅拌条件、浊度及培养时间、产品分离纯化路线等。本进化酶具有如下性能(一)生化特性1、热稳定性人核糖核酸酶和人溶菌酶进化酶是一种罕见的稳定蛋白质，在30-100℃的温度下，保温30分钟，然后在标准活力测定条件下，测定酶活力，结果表明在中性pH值的稀盐中，它的跃迁温度为77℃，在pH5.5加热4小时后，酶变得更加活泼，但在pH1-3时，其跃迁温度下降至45℃，低浓度的Mn(10-7mol/L)在中性和碱性条件下能使酶免受热失活作用；2、pH值稳定性在pH2-12范围内活力稳定；3、分子量通过分子筛凝胶排阻层析方法测定人核糖核酸酶U进化酶分子量约为15KD，人溶菌酶进化酶分子量约为14KD；(二)生理活性分别采用人溶菌酶和人核糖核酸酶U活力测定方法测定进化酶活力。1、人核糖核酸酶U活力测定方法通过测定核糖核酸酶将RNA水解为酸性可溶核苷酸的速度来表征酶活力，反应混合物包含100μg寡聚核糖核酸，20μl纯化的核糖核酸酶溶液(溶于0.1mol/L乙酸钠，pH5.5)， 在37℃孵育60分钟，加入冰预冷的3％三氯乙酸终止反应，14,000g离心15分钟除去未降解的寡聚核糖核酸，测出在A260处光密度值。
酶活力单位定义在上述标准条件下，每分钟光密度增加0.1所需要的酶量为一个酶活力单位。2、人溶菌酶活力测定方法取1.2mL溶于磷酸钠缓冲液中(50mmol/L，pH6.4)的溶壁微球菌(150μg/mL)中，加入300μL粗酶液，立即摇匀，并在30℃下测出在A450处10分钟内光密度变化值。
酶活力单位定义在上述标准条件下，每分钟光密度降低0.001所需要的酶量为一个酶活力单位。3、测定结果人核糖核酸酶U进化酶活力大于10,000U/mg；人溶菌酶进化酶活力大于20,000U/mg。
综上所述，可见本发明所涉及的两种进化酶具有制取工艺简单，各种稳定性高，酶活力强，适应范围广等特点。
权利要求
1.一种人核糖核酸酶U的进化酶，由如下方法制取，(1)基因突变文库的构建利用基因工程和蛋白质工程原理和方法构建人核糖核酸酶U和人溶菌酶的突变文库；(2)转化将突变文库转入受体细胞中，进行表达；(3)进化酶筛选利用两种酶的特性，将具有较高活力、较高稳定性和较高应用价值的进化酶筛选出来；(4)建立进化酶表达的培养条件，包括培养基、最适pH值、最适温度、通气量、搅拌条件、浊度及培养时间、产品分离纯化路线等；其特征在于，所制得的进化酶具有人核糖核酸酶U的所有优良特性及具有高的热稳定性、pH值稳定性，分子量为15KD，酶活力大于10,000U/mg。
2.一种人溶菌酶的进化酶，由如下方法制取，(1)基因突变文库的构建利用基因工程和蛋白质工程原理和方法构建人核糖核酸酶U和人溶菌酶的突变文库；(2)转化将突变文库转入受体细胞中，进行表达；(3)进化酶筛选利用两种酶的特性，将具有较高活力、较高稳定性和较高应用价值的进化酶筛选出来；(4)建立进化酶表达的培养条件，包括培养基、最适pH值、最适温度、通气量、搅拌条件、浊度及培养时间、产品分离纯化路线等；其特征在于，所制得的进化酶具有人溶菌酶的所有优良特性及具有高的热稳定性、pH值稳定性，分子量为14KD，酶活力大于20,000U/mg。
3.如权利要求1或2所述的进化酶在制备抗菌药物中的应用。
4.如权利要求1或2所述的进化酶在制备抗病毒药物中的应用。
5.如权利要求1或2所述的进化酶在制备抗炎症药物中的应用。
6.如权利要求1或2所述的进化酶在制备治疗龋齿药物中的应用。
7.如权利要求1或2所述的进化酶在制备预防癌症药物中的应用。
8.如权利要求1或2所述的进化酶在制备治疗爱滋病及其它疾病的药物中的应用。
9.如权利要求1或2所述的进化酶的联合或分别的应用。
10.如权利要求1或2所述的进化酶在其它方面的应用。
全文摘要
本发明涉及两种人源酶的分子进化酶。本发明的进化酶分别是以人核糖核酸酶U和人溶菌酶为原料,经过基因钓取,定向进化,表达筛选等步骤,最后制得。本品具有制备工艺简单、生产成本低、酶活力较高、稳定性好、应用价值大等优点,可独自或联合广泛地应用于抗菌药物、抗病毒药物、抗炎症药物、治疗龋齿药物、治疗爱滋病药物等医药工业各领域。
文档编号A61K38/43GK1377960SQ0210912
公开日2002年11月6日 申请日期2002年1月30日 优先权日2002年1月30日
发明者张今, 王晓平, 苟小军, 孔祥铎, 李爽, 朱师珍 申请人:吉林大学
技术领域：
本发明涉及一类定向进化制备的进化酶，特别是涉及由人核糖核酸酶U和人溶菌酶通过定向进化制备的人核糖核酸酶U进化酶和人溶菌酶的进化酶。
近年来，随着现代生物工程技术的日新月异，以酶为主要研究对象的蛋白质工程技术发展非常迅速。在蛋白质工程研究方面，有关分子工程制备的进化酶、模块酶和杂合酶的研究日益受到重视。尤其是表达克隆(expression cloning)、分子筛选(molecular screening)、人工进化(artificial evolution)、DNA改组(DNA Shuffling)和体外突变技术开发的成功，为定向进化制备进化酶的开发与生产铺平了道路。
天然蛋白质功能的进化有一部分是通过结构域或亚结构域的重组来实现的，例如底物结合结构域，调节结构域，催化结构域这些相互独立的结构域之间的重组。这不但可以进化某种功能，还可以创造出新的功能，因为酶的活性位点位于不同的折叠单位相互作用的界面上。
基因工程与蛋白质工程应用于酶学的主要目的是通过改变天然酶的特性，创造具有新特性或性能有所改善的酶。获得新酶的原因有许多方面(1)天然酶在现存的工业条件下(例如在有机相、极端温度和pH)的稳定性较差或其催化效率很低；(2)天然酶在工程菌中的折叠效率较差或对蛋白酶敏感；(3)酶的催化活性需要提高或降低；(4)需要创造具有新反应活性的酶。定向进化制备的进化酶主要应用于改变酶的非催化特性；创造具有新活性的酶；研究酶的结构与功能之间的关系等。在新酶的开发和现有酶的改造利用方面，定向进化技术显示了它巨大的应用前景。
对酶的分子改造，几十年来的工作都着眼于两个方面，一是基于序列的合理化设计方案(Sequential rational design)，如化学修饰，定点突变(site-directed mutagenesis)等。一是利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程的非合理化设计方案(irrational design)，如定向进化(directedevolution)，杂合进化(hybrid evolution)等。对酶分子的研究可以分为认识和改造两个方面。前者是利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间关系以及氨基酸残基功能等方面的信息。以此为依据对酶分子进行改造，称为酶分子的合理性设计。与此相对应，不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变，基因重组，定向筛选等方法对其进行改造，则称为酶分子的非合理性设计。非合理性设计的实用性较强，往往可以通过随机产生的突变，改进酶的特性。对酶分子的设计与改造方法，是基于基因工程、蛋白质工程和计算机技术互补发展和渗透的结果。它标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至设计出自然界中原来并不存在的全新的酶分子。在目前，酶的分子工程改造还不成熟的情况下，通过定点突变技术改造成功了大量的酶分子，获得了比天然酶活力更高，稳定性更好的工业用酶。但总体说来，我们的能力并未达到对复杂的生物体系进行有效的人为改造的水平。近年来，易错PCR，DNA shuffling和高突变菌株等技术的应用，在对目的基因表型有高效检测筛选系统的条件下，建立了酶分子的定向进化策略，尽管不清楚酶分子的结构，仍能获得具有预期特性的新酶，基本上实现了酶的分子改造。
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业化要求，天然的酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其它性质。因此对天然酶分子水平上的改造，显得十分重要和必要。天然酶在自然条件下已经进化了千百万年，但是酶分子仍然蕴藏着巨大的进化潜力，这是酶的分子改造的基本先决条件。酶分子存在着分子改造的潜力主要原因在于1、天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境不同。一个比较好的例子是把枯草杆菌蛋白酶E应用于非水相(二甲基甲酰铵，DMF)，催化肽合成反应，自然生理条件下进化得比较完善的枯草杆菌蛋白酶E，由于没有接触过非水环境，因此其活性和稳定性不适合在有机相中完成催化反应，这就为该酶在新的筛选条件下(有机相中)提供了适合该条件的改造空间。2、实际应用中，总是期待酶的活性和稳定性越高越好，这样可以加快反应速度、提高酶的利用率、降低反应成本，但在生物体内更重要的是各种生物分子之间协同作用，作为一个整体去适应环境。生物对环境适应的进化主要不是表现为某个酶分子的活性和稳定性的不断提高，而是在于整体的适应能力，调控能力的增强。在自然选择的筛选压力下，更主要是这个系统中的瓶颈部分的进化。对于某个酶分子来说，其活性可以受到调节部位的调节，含量可以受到基因表达的调控，而当其酶活性和稳定性已经超过了满足整个体系在环境中生存的需求时，它们的提高就显得没有必要了，即失去了进化的筛选压力，因而进化的机会很有限，这也为体外定向进化留下了很大的进化空间。正如同SOD，SOD在体内的活力已经足以完成歧化生命体系自然产生的超氧离子，因此，在自然氧压下，体外进化基本不会取得进展。3、某些酶或蛋白质待进化的性质不是其在体内所涉及的，例如对蛋白药物改造消除其副作用，这部分性质的改善有着很大的进化潜力。
酶的定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为获得的)出发经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。我们以对单一酶分子基因进行定向进化为例，来说明酶分子改造的基本实验路线。在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA多聚酶不具有3’→5’校对功能，并控制突变库的大小使其与特定的筛选容量相适合，选择适当条件以较低的比率向目的基因中随机引入突变，进行正向突变间的随机组合以构建突变库，凭借定向的选择(或筛选)方法，选出所需性质的优化酶，从而排除其它突变体。也就是说，定向进化的基本规则是，“获取你所筛选的突变体”。简言之，定向进化＝随机突变+正向重组+选择(或筛选)。与自然进化不同，前者是人为引发的，后者相当于环境，作用于突变后的分子群，相当于通过选择某一方向的进化而排除其它方向突变的作用。酶的定向进化过程完全是在人为控制下进行的，是酶分子朝向人们期望的特定目标进化。
尽管用上述定向进化方法可向人类提供新的有价值酶，但酶的功能突变常常被埋没在众多的中性突变和不利突变群中。采用回交(back-crossing)法，将已进化的子代突变酶基因与野生酶基因重组，可排除这种干扰。这样，出现中性突变的频率只是50％，可全部去除不利突变。在定向进化中，尽管突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量。这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。
通常，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关。Venekei等人报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变体的方法和最佳筛选条件，主要是利用蛋白酶选择平板初选，再配合活性染色(activity staining)和X-光片消化分析(X-ray filmdigestion assay)加以验证，并检测其活力，快速筛选了44000个突变株。
Roberts等人采用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂。从含有4900个突变体的基因库中，获得与该酶结合能力高于野生蛋白质3.6×106倍的突变体，比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍。
另有一些其它的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物，或利用绿色荧光蛋白性质等。总之，筛选或选择在酶的定向进化中至关重要，直接关系到分子改造的成败。
目前已经比较成功的开发出来的定向进化策略如下1.易错PCR(Error-prone PCR)易错PCR是利用扩增目的基因的同时向模板引入碱基错配，导致目的基因随机突变。然而，经一次突变的基因很难获得满意的结果。由此发展出连续易错PCR(sequential error-prone PCR)策略，即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。Chen和Arnold用此策略在非水相(二甲基甲酰铵，DMF)定向进化枯草杆菌蛋白酶E的活性获得成功。所得突变体PC3在60％和85％的DMF中，催化效率kcat/Km分别是野生酶的256和131倍，比活性提高了157倍。将PC3再进行两个循环的定向进化，产生的突变体13M的kcat/Km比PC3高3倍(在60％DMF中)，比野生酶高471倍。在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，故属于无性进化(asexual evolution)，一般适用于较小的基因片段。
2.DNA改组(DNA shuffling)和外显子改组(Exon shuffling)DNA改组又称有性PCR(sexual PCR)。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。故在理论和实践上，它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续易错PCR”。通过DNA改组，不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的两个或更多的已优化性质合为一体。
外显子改组类似于DNA改组。二者都是在各自含突变的片段间进行交换。前者尤其适用于真核生物。在自然界中，由于不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。外显子改组可用于获得各种大小的随机肽库。
3.体外随机重组(Random-priming in vitro recombination，RPR)该方法的原理是以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变。在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。如果需要，可反复进行上述过程，直到获得满意的进化酶性质。
4.交错延伸(Stagger extension process，StEP)交错延伸是不同于DNA改组的又一新策略。其原理的核心是，在PCR反应中，把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火，而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度，结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。
5.酶法体外随机/定位诱变(Random-site-directed mutagenesis)为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题，我们研究小组曾以类胰岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型，探索了一种酶体外诱变的新途径，即酶法体外随机/定位诱变。该方法的内涵与酶的体外定向进化类似，对目的基因既采用随机突变，增加突变位点，以快速产生优质酶，又让其突变受到一定限制，以减少筛选突变体的工作量。实际上，该法也是体外模拟自然进化。不同点在于，该法是通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例，实现碱基对的错配。
酶分子定向进化是组合化学的思想和方法在酶分子改造上的应用，同时酶分子的定向进化设计因为研究对象的特殊性而在其思想和方法上具有自身特点，对组合化学是一种很重要的发展。酶分子定向进化设计在组合化学的随机库(突变库)和筛选的基础上，增加了利用基因改组技术的有性进化思想，与自然进化更加接近，有效的解决了对于酶这样的大分子物质，其天文数字级别的突变库与有限的筛选容量之间存在的矛盾。以基因重组技术为表现形式有性进化思想对于酶(蛋白质)的改造具有革命性的意义，因此定向进化是在组合化学思想和方法基础上的又一次飞跃。
自然界中的生物进化伴随着有性繁殖的出现而大大加快，基因改组是自然界生物进化的普遍现象和主要途径之一，动植物早已利用基因改组快速进化出能执行某一特定功能的优化性质。同样酶分子的正向突变之间或者同一家族的不同酶分子之间的重组使优良形性状的突变体一最大的几率存在于突变库中，大大增加酶分子定向进化的速度。比较经典的育种技术，DNA改组技术的突出特点是，加快不同品种或不同基因型之间的重组进化速度，在所产生的突变库中，个体差异以及与亲本的差异更大。因此，可使人们更快地获得所需突变体，利于快速推向应用。
基因改组的思想和技术在实际生产中有很重要的应用，并得到了很理想的结果。重组蛋白质药物在药业占有重要地位，产值达几十亿元，但许多这样的产品含有副作用，引起严重的并发症，因此限制或不利于诊断。用DNA改组技术选择性改造这些产品的基因，可获取所需的性质，排除不利的活性。最近，对人α-干扰素基因家族的改进，产生了1026个不同的突变体，并用噬菌体表面呈现技术筛选和分析重组的INF，获得了比INF2α活性约高40倍的突变体。通过把来自不同药物蛋白的结构单元结合，可产生具有新活性的代表作，这叫杂合蛋白(酶)技术，这是自然界进化过程中产生新蛋白质的有效途径之一。例如，将两个或更多的受体蛋白结合将头孢霉素酶基因家族改组后，快速进化了moxolactamase活性，通过筛选嵌合药物蛋白库，发现了许多新的药物活性。将已进化的变种与亲本基因杂交(称回交backcrossing)，可移去中性突变，降低药物蛋白的免疫原性。微生物广泛用于工业上生产药物分子，例如抗生素、真菌素抗癌药物和免疫抑制剂。在许多情况下，编码生物合成的有关酶是已知的，它们经常处于操纵子或基因簇中。然而对对这些生物合成途径的改进是困难的，因为难以测定途径中的限速步骤。用DNA改组技术却能使这些途径获得最佳化处理。这并不需要任何与限速步骤相关的信息和详细的蛋白质结构功能分析，把完整途径作为一个进化单位便能实现这一目的，这是该策略的又一突出特征。已对atrazineh和砷酸盐解毒途径进行尝试，获得了满意的效果。苄基脂酶(Fenzylesternase)用于工业上抗生素loracarbef前体的脱保护，对它也进行了改造。最近，还利用此技术改造了tRNA合成酶的专一性。目的是改变该酶的专一性，即催化tRNA将非天然的氨基酸在专一位点带入新生蛋白链中。已进化的酶可广泛的应用于利用酶法生产药物(或它们的前体)所涉及的多步化学反应。大多数天然酶需经较大的分子改造(活性、专一性及表达水平)才适于这样的要求。
总之，酶分子定向进化是非常有效的更接近于自然进化的蛋白质工程研究的新策略。其突出的优点是不需事先了解酶的空间结构和催化机制并适宜于任何酶分子改造，这便大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围。特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题，使我们能较快、较多地了解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导应用(如药物设计等)奠定理论基础，该技术简便、快速、耗资低、且有实效。它不仅能使酶进化出非天然特性，还能定向进化某一代谢途径；不仅能进化出具有单一优良特性的酶，还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加，产生具有多项优化功能的酶，进而发展和丰富了酶类资源；完全在试管中进行的酶的体外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年，几个月甚至更短的时间，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃。对一些酶和砷酸盐解毒途径、抗辐射性、生物合成途径、对映体选择性、抗体库以及DNA结合位点定向进化的可喜结果令众多的相关科学家为之振奋。可见，进化能发生在自然界，也能发生在试管中。它与合理设计互补，将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶分子，将使蛋白质工程学更加显示出诱人的前景。1999年5月12日-15日在芝加哥由5000多名生物技术专家参加的会议上，对基因及其所产生的酶进行重新设计引起了广泛的关注，其中酶分子的定向进化被认为是“一场达尔文做梦也没有想到的进化革命，是再设计生命世界的开端”。Table.1列举了近年来通过定向进化方法对酶分子进行改造所取得的主要成果。
Table.1 Application of directed enzyme evolution in vitro酶 性 质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCRb-内酰胺酶 总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN’ 稳定性 盒式诱变对硝基苯酯酶 底物专一性/有机相活 易错PCR/DNA改组性胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性 盒式诱变b-半乳糖苷酶底物专一性 DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性 易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶 活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗 活性/专一性/最佳表达DNA改组1999年，美国纽约大学生物化学系的Sylvia L H等人在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)上撰文，证明了人溶菌酶(human lysozyme)和人核糖核酸酶A(human RNaseA)可以用于治疗AIDS。联合应用溶菌酶和核糖核酸酶，对HIV-1和与AIDS密切相关的Kaposi肉瘤明显的抑制作用，这项研究结果，为AIDS的治疗提供了一种新的选择。目前尚未见到有关这两种酶的杂合酶研究工作的报道。
正是因为人溶菌酶和人核糖核酸酶在应用上的潜在前景，所以我们将这两种酶通过定向进化研究，获得的进化酶具有这样两种酶相同的催化活性。同时具有这两种酶同样的应用方向。
人核糖核酸酶U属于核糖核酸酶A超家族。整个核糖核酸酶A超家族(EC3.1.27.5)分为分泌型和非分泌型两大类。又分别称为胰脏型核糖核酸酶和肝脾型核糖核酸酶。它们是经由发生在旧世界猴从新世界猴分化出来之后的一次基因复制事件而出现的，一个分支导致了非分泌型核糖核酸酶；而另一分支又分化为两个方向，它的一支产生了分泌型核糖核酸酶(在哺乳动物中)，另一支产生了龟的胰核糖核酸酶和哺乳动物的血管生长因子(ANG)。分泌型核糖核酸酶包括人胰核糖核酸酶(RNaseA，HPRNase)、血管生成素(ANG)和核糖核酸酶4(RNase4)，非分泌型核糖核酸酶(HNSR)包括嗜伊红性粒细胞起源的神经毒素(RNaseU，EDN，RNase2，RNS2)和嗜伊红性粒细胞阳离子蛋白(ECP)。人尿中的核糖核酸酶主要有两种，分别为分泌性的RNaseC(RNaseUPL)非分泌型的RNaseU(RNaseUPS)。RNaseC是一种糖蛋白，等电点为10.4，当以RNA为底物时最适pH为8.5，并且偏爱人工合成的Poly(C)。，它的氨基酸组成和N末端以及C末端序列分析，显示这个酶同哺乳动物的胰核糖核酸酶极其相似(除了糖基化特点和C末端外加残基的存在)，它共有126个氨基酸，含糖量为50.2％。核糖核酸酶U(RNaseU)也是一种糖蛋白，糖基化的位点为五个N糖基化位点(Asn)和一个C糖基化位点(Trp)，等电点为11，当以RNA为底物时最适pH为7.0。它基本上不降解Poly(C)，相对而言，它更偏爱Poly(U)。研究表明，RNaseU的N末端和C末端序列与人胰核糖核酸酶只有很小的同源性(36％)，用不同的RNA或多聚核苷酸作底物时，RNaseU的核糖核酸水解活性是RNaseA的3％～30％，这个酶的氨基酸组成显示它与人脾和人肝的极其相似(后来证明它们为同一种酶)。这两种酶都极其稳定，在溶液状态下4℃保存4个月而无活性损失。
在人嗜伊红性粒细胞颗粒中发现了许多特殊的富含Arg的阳离子蛋白，例如嗜伊红性粒细胞起源的神经毒(RNaseU)、嗜伊红性粒细胞阳离子蛋白(ECP)和主要碱性蛋白(MBP)。其中ECP和RNaseU为主要的两种，二者的编码序列85％是相同的，同源性高达67％。ECP和MBP表现出了很强的细胞毒和蠕虫毒活性，RNaseU的已知生物活性是当它注射到实验动物脑内或Intrathecally时，诱导实验动物的运动性共济失调、偏瘫和损害髓鞘神经元(神经毒，Gordon现象)，这是通过RNaseU选择性杀死小脑的浦肯野细胞获得的。近来的研究发现RNaseU也具有蠕虫毒、对呼吸道上皮细胞的细胞毒以及抗病毒的能力。RNaseU和ECP都具有核酸水解活性，但RNaseU比ECP高50-100倍，但对诱导神经毒行为而言，核糖核酸酶活性是必要的但不是充分的。RNaseU对简单的多聚核苷酸(单链poly(U)、poly(C)、或双链poly(A)、poly(U)or poly(I)、poly(C))活性很低，对小的限定的底物也不能有效地加以降解。根据文献，ECP细胞毒性的可能的结构基础为在进化过程中，ECP在从RNaseU分化出来之后，在二者之间29个氨基酸残基替换中，共有12个为Arg的替换，导致ECP的pI从8.4增加到10.6。ECP的全部表面电荷为14而RNaseU和RNaseA为7和3。并且所有的Arg都暴露在溶剂中，其中的许多Arg同晶体包装有关。
国外早期的研究集中在对RNaseU的理化性质、晶体结构、分子克隆、融合表达及RNaseU同不同组织中的RNaseA超家族成员的比较研究上，近年的研究热点在研究RNaseU的进化特点，表达调控因子，酶催化反应的分子基础、定点突变。尚未见到有关定向进化的文献。
溶菌酶(lysozyme)又称为胞壁质酶，具有强力杀菌作用，1922年由细菌学家Fleming首次发现。广泛分布于生物体内，具有生物相容性好，对组织无刺激、无毒性等优点。它的主要生理作用如下1、药理作用1.1抗菌消炎溶菌酶为一种能水解粘多糖的碱性水解酶，此类粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一，该酶能催化水解细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成分分解成可溶性糖肽，细菌内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌，在分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下，还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌等。此外，它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并能够增强抗生素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目的。
1.2抗病毒溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
1.3增强免疫力溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。它可改善和增强巨噬细胞吞噬和消化功能，激活白细胞吞噬功能，并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少，从而增强机体的抵抗力。
1.4其它方面的药理作用溶菌酶还具有激活血小板的功能，可以改善组织局部血液循环障碍，分解脓液，增强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。
2、临床应用2.1五官科的应用溶菌酶首先适用于五官科各种炎症。研究表明它对眼、耳、鼻、喉、口腔等的急、慢性炎症均有一定疗效，特别是对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显，但对于严重的急性炎症，单独应用该酶效果不明显，必须和抗生素同时使用以发挥协同作用。溶菌酶对表层性溃疡的治疗效果比对深层性的好，而且病型不同，如对于轻型的口腔溃疡，含服含片即可治愈；对于口炎型和重型溃疡患者，除服含片外，需加抗生素、维生素B族口服药或静脉输液，以达到治愈目的。
含溶菌酶和降钙素的糊剂可用于治疗破坏型慢性牙周炎，将此糊剂涂布于周端病灶效果很好，并且有助于降低并发症，防止骨性组织再生。溶菌酶还可以阻止牙龈炎和龋齿的发生，抑制菌斑和牙石的形成。
2.2皮肤科的应用溶菌酶可用于治疗扁平疣、传染性软疣、寻常性疣、尖锐湿疣、带状疱疹等多种皮肤病。对于带状疱疹，内服该酶即可；而对扁平疣、传染性软疣等的治疗，则最好采用内服该酶加5-氟脲嘧啶溶液外涂，疗效比单独使用有明显提高。
2.3其它方面的应用溶菌酶可用于小儿或乳儿哮喘性支气管炎、呼吸道内膜肿胀等，它可使黏膜肿胀很快消除，使痰液变稀、呼吸通畅。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。在机体内它还具有抗流感病毒和腺病毒的生长，并能防止疱疹性病毒感染。此外，对肉瘤引起的疼痛、久治不愈的小儿腹泻以及Sjogren’s病，均有一定的疗效。
人体溶菌酶的浓度还可作为多种疾病的诊断指标用于临床。1966年Osserman首先把血清溶菌酶水平的测定作为白血病分型的依据，有助于急性白血病的诊断。Prockeep等人又认为如血清溶菌酶水平不超过肾阈值时，对尿溶菌酶的测定可作为肾小管损伤的有益诊断指标。又有研究报道可通过脑脊液中溶菌酶的浓度来区分病毒性脑膜炎和细菌性脑膜炎，还有人把泪液中溶菌酶的浓度作为干眼综合征的诊断指标等。
本发明的目的是提供制备工艺简单、成本低廉的人核糖核酸酶U和人溶菌酶的进化酶的制备方法，得到一类具有高活力、高稳定性、适用范围广泛的进化酶产品。
本发明制备工艺如下(1)基因突变文库的构建利用基因工程和蛋白质工程原理和方法构建人核糖核酸酶U和人溶菌酶的突变文库。
(2)转化将突变文库转入受体细胞中，进行表达。
(3)进化酶筛选利用两种酶的特性，将具有较高活力、较高稳定性和较高应用价值的进化酶筛选出来。
(4)建立进化酶表达的培养条件，包括培养基、最适pH值、最适温度、通气量、搅拌条件、浊度及培养时间、产品分离纯化路线等。本进化酶具有如下性能(一)生化特性1、热稳定性人核糖核酸酶和人溶菌酶进化酶是一种罕见的稳定蛋白质，在30-100℃的温度下，保温30分钟，然后在标准活力测定条件下，测定酶活力，结果表明在中性pH值的稀盐中，它的跃迁温度为77℃，在pH5.5加热4小时后，酶变得更加活泼，但在pH1-3时，其跃迁温度下降至45℃，低浓度的Mn(10-7mol/L)在中性和碱性条件下能使酶免受热失活作用；2、pH值稳定性在pH2-12范围内活力稳定；3、分子量通过分子筛凝胶排阻层析方法测定人核糖核酸酶U进化酶分子量约为15KD，人溶菌酶进化酶分子量约为14KD；(二)生理活性分别采用人溶菌酶和人核糖核酸酶U活力测定方法测定进化酶活力。1、人核糖核酸酶U活力测定方法通过测定核糖核酸酶将RNA水解为酸性可溶核苷酸的速度来表征酶活力，反应混合物包含100μg寡聚核糖核酸，20μl纯化的核糖核酸酶溶液(溶于0.1mol/L乙酸钠，pH5.5)， 在37℃孵育60分钟，加入冰预冷的3％三氯乙酸终止反应，14,000g离心15分钟除去未降解的寡聚核糖核酸，测出在A260处光密度值。
酶活力单位定义在上述标准条件下，每分钟光密度增加0.1所需要的酶量为一个酶活力单位。2、人溶菌酶活力测定方法取1.2mL溶于磷酸钠缓冲液中(50mmol/L，pH6.4)的溶壁微球菌(150μg/mL)中，加入300μL粗酶液，立即摇匀，并在30℃下测出在A450处10分钟内光密度变化值。
酶活力单位定义在上述标准条件下，每分钟光密度降低0.001所需要的酶量为一个酶活力单位。3、测定结果人核糖核酸酶U进化酶活力大于10,000U/mg；人溶菌酶进化酶活力大于20,000U/mg。
综上所述，可见本发明所涉及的两种进化酶具有制取工艺简单，各种稳定性高，酶活力强，适应范围广等特点。
权利要求
1.一种人核糖核酸酶U的进化酶，由如下方法制取，(1)基因突变文库的构建利用基因工程和蛋白质工程原理和方法构建人核糖核酸酶U和人溶菌酶的突变文库；(2)转化将突变文库转入受体细胞中，进行表达；(3)进化酶筛选利用两种酶的特性，将具有较高活力、较高稳定性和较高应用价值的进化酶筛选出来；(4)建立进化酶表达的培养条件，包括培养基、最适pH值、最适温度、通气量、搅拌条件、浊度及培养时间、产品分离纯化路线等；其特征在于，所制得的进化酶具有人核糖核酸酶U的所有优良特性及具有高的热稳定性、pH值稳定性，分子量为15KD，酶活力大于10,000U/mg。
2.一种人溶菌酶的进化酶，由如下方法制取，(1)基因突变文库的构建利用基因工程和蛋白质工程原理和方法构建人核糖核酸酶U和人溶菌酶的突变文库；(2)转化将突变文库转入受体细胞中，进行表达；(3)进化酶筛选利用两种酶的特性，将具有较高活力、较高稳定性和较高应用价值的进化酶筛选出来；(4)建立进化酶表达的培养条件，包括培养基、最适pH值、最适温度、通气量、搅拌条件、浊度及培养时间、产品分离纯化路线等；其特征在于，所制得的进化酶具有人溶菌酶的所有优良特性及具有高的热稳定性、pH值稳定性，分子量为14KD，酶活力大于20,000U/mg。
3.如权利要求1或2所述的进化酶在制备抗菌药物中的应用。
4.如权利要求1或2所述的进化酶在制备抗病毒药物中的应用。
5.如权利要求1或2所述的进化酶在制备抗炎症药物中的应用。
6.如权利要求1或2所述的进化酶在制备治疗龋齿药物中的应用。
7.如权利要求1或2所述的进化酶在制备预防癌症药物中的应用。
8.如权利要求1或2所述的进化酶在制备治疗爱滋病及其它疾病的药物中的应用。
9.如权利要求1或2所述的进化酶的联合或分别的应用。
10.如权利要求1或2所述的进化酶在其它方面的应用。
全文摘要
本发明涉及两种人源酶的分子进化酶。本发明的进化酶分别是以人核糖核酸酶U和人溶菌酶为原料,经过基因钓取,定向进化,表达筛选等步骤,最后制得。本品具有制备工艺简单、生产成本低、酶活力较高、稳定性好、应用价值大等优点,可独自或联合广泛地应用于抗菌药物、抗病毒药物、抗炎症药物、治疗龋齿药物、治疗爱滋病药物等医药工业各领域。
文档编号A61K38/43GK1377960SQ0210912
公开日2002年11月6日 申请日期2002年1月30日 优先权日2002年1月30日
发明者张今, 王晓平, 苟小军, 孔祥铎, 李爽, 朱师珍 申请人:吉林大学
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