肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法
专利名称：肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法。
背景技术：
手足口病(HFMD)是由肠道病毒引起的全球性传染病，世界大部分地区均有此病 流行的报导。其中以肠道病毒71型(EV71)引起的HFMD最为严重，常发生心肌炎、肺水肿、 脑膜脑炎、脊髓灰质炎样瘫痪等并发症，严重者导致死亡。EV71属于小核糖核酸病毒科肠道 病毒属，与同属的脊髓灰质炎病毒相似，EV71对脊髓前角细胞具有一定的组织嗜性，是最常 见的引起急性弛缓性麻痹的非脊灰肠道病毒，因此，EV71被认为是继脊髓灰质炎病毒后最 值得重视的嗜神经性肠道病毒。由于EV71感染动物模型的缺乏，目前我们对EV71的致病机制还知之甚少，这也极 大地制约了对其发病转归、治疗预后及疫苗开发的研究。目前，国内外采用的乳鼠模型大都 是通过脑内注射方式感染病毒，但这种接种方式对动物损伤大，极易导致动物非正常死亡， 不利于建立稳定的动物模型。因此，建立稳定的EV71感染动物模型就显得尤为重要。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型 的建立方法，动物模型的建立可加深对肠道病毒71型病原学的了解，促进肠道病毒71型致 病机制的研究，用于高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制。本发明是通过以下技术方案实现的一种肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法，包括以下步骤取乳 鼠，肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型。所述病毒液注射量为20 y L，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以 200 u L/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37°C,5% C02培养，每天观察细胞病变 情况；接种EV71后第2天，MA104细胞有约70%出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心 取上清，即得到EV71的病毒液。所述EV71毒种，为现有技术中已有的，常规取得即可，本发明对此无限制，不再赘 述。所述乳鼠为BALB/c小鼠。所述建立方法，还包括以下小鼠模型的鉴定步骤饲养上述接种肠道病毒71型的 小鼠，两天后，后肢出现反应迟缓，四天后后肢瘫痪，七天后死亡的，即为感染成功的小鼠模 型。本发明成功地建立了稳定的肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型，其后肢瘫 痪率一般为70% 100%，死亡率为30 100%。本发明为科研人员研究肠道病毒71型病 原学、肠道病毒71型致病机制以及高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制提供了基础，具有 广阔的应用前景。
图1为临床分离毒株的肌_ 0 鉴定的电泳图，其中肩=1&11 ^(02000)力=阴性 细胞对照，B =空白试剂对照，1 =分离毒株。图2为病毒组动物后肢瘫痪示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1建立肌肉注射感染肠道病毒71型的乳鼠模型步骤如下1、EV71的分离鉴定本发明所采用的EV71毒株是从临床的重症手足口病人的大便标本中分离的，同 时采用人横纹肌肉瘤细胞株(RD)、恒河猴肾细胞株(MA104)和非洲绿猴肾细胞株(Vero)三 种细胞对标本中的病毒进行分离，结果三种细胞上菌出现了细胞病变，传代后冻存毒种。然 后提取分离到的EV71的基因组RNA，逆转录成cDNA，采用EV71国家标准引物对分离毒株进 行鉴定，结果表明分离毒株在226bp处出现了很亮的条带(如图1所示)，可证实从临床手 足口重症病人大便标本中分离的毒株为EV71。2、EV71肌肉注射感染乳鼠模型的建立2.1小鼠的准备购买清洁级的新生BALB/C乳鼠(带母鼠)两组，每组乳鼠6只，25°C、湿度50%， 分格饲养在P2实验室的净化动物饲养柜内。2. 2毒种的准备将分离的EV71毒种，以200iiL/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞， 37°C、5% C02培养，每天观察细胞病变情况。接种EV71后第2天，MA104细胞有约70%出 现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即得到EV71的病毒液。2. 3EV71感染动物模型的建立2. 3. 1动物分组将两组动物分别设为病毒组和正常对照组，病毒组肌肉接种EV71病毒，正常对照 组肌肉接种含2%胎牛血清的1640培养液。2.3.2接种￡乂71采用无菌的微量进样器，病毒组每只BALB/C乳鼠肌肉注射病毒液20 u L，正常对 照组每只BALB/C乳鼠肌肉注射含2%胎牛血清的1640培养液20 u L。然后将动物按相同 的条件饲养在净化动物饲养柜内，每天观察动物。2. 3. 3接毒后的观察前两天病毒组和正常对照组均无异常；第3天病毒组动物后肢出现反应迟缓，正 常对照组无异常；第4天病毒组全部出现明显后肢瘫痪，正常对照组无异常，取两组动物各 3只分别进行解剖固定；第7天病毒组动物均死亡，正常对照组无异常。病毒组动物瘫痪的 情况如图2所示(最右端为正常对照)，证明动物模型建立成功。
权利要求
一种肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤取BALB/c乳鼠，肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法，其特征 在于所述病毒液注射量为20 iiL，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以200iiL/100mL 细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37°C、5% C02培养，每天观察细胞病变情况；接种 EV71后第2天，MA104细胞有约70%出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即 得到EV71的病毒液。
3.根据权利要求1所述的肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法，其特征 在于还包括以下小鼠模型的鉴定步骤饲养上述接种肠道病毒71型的小鼠，两天后，后肢 出现反应迟缓，四天后后肢瘫痪，七天后死亡的，即为感染成功的小鼠模型。
全文摘要
本发明公开了一种肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法取BALB/c乳鼠，肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型。所述病毒液是通过以下方法制得的将EV71毒种，以200μL/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37℃、5％CO2培养，每天观察细胞病变情况；接种EV71后第2天，MA104细胞有约70％出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即得到EV71的病毒液。本发明成功地建立了稳定的肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型，为科研人员研究肠道病毒71型病原学、肠道病毒71型致病机制以及高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制提供了基础，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K35/76GK101978971SQ20101029926
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月7日 优先权日2010年10月7日
发明者孟红, 宋楠楠, 岳盈盈, 张颖, 李志会, 李鹏, 盖中涛 申请人:山东省医学科学院基础医学研究所;济南市传染病医院
技术领域：
本发明涉及一种肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法。
背景技术：
手足口病(HFMD)是由肠道病毒引起的全球性传染病，世界大部分地区均有此病 流行的报导。其中以肠道病毒71型(EV71)引起的HFMD最为严重，常发生心肌炎、肺水肿、 脑膜脑炎、脊髓灰质炎样瘫痪等并发症，严重者导致死亡。EV71属于小核糖核酸病毒科肠道 病毒属，与同属的脊髓灰质炎病毒相似，EV71对脊髓前角细胞具有一定的组织嗜性，是最常 见的引起急性弛缓性麻痹的非脊灰肠道病毒，因此，EV71被认为是继脊髓灰质炎病毒后最 值得重视的嗜神经性肠道病毒。由于EV71感染动物模型的缺乏，目前我们对EV71的致病机制还知之甚少，这也极 大地制约了对其发病转归、治疗预后及疫苗开发的研究。目前，国内外采用的乳鼠模型大都 是通过脑内注射方式感染病毒，但这种接种方式对动物损伤大，极易导致动物非正常死亡， 不利于建立稳定的动物模型。因此，建立稳定的EV71感染动物模型就显得尤为重要。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型 的建立方法，动物模型的建立可加深对肠道病毒71型病原学的了解，促进肠道病毒71型致 病机制的研究，用于高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制。本发明是通过以下技术方案实现的一种肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法，包括以下步骤取乳 鼠，肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型。所述病毒液注射量为20 y L，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以 200 u L/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37°C,5% C02培养，每天观察细胞病变 情况；接种EV71后第2天，MA104细胞有约70%出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心 取上清，即得到EV71的病毒液。所述EV71毒种，为现有技术中已有的，常规取得即可，本发明对此无限制，不再赘 述。所述乳鼠为BALB/c小鼠。所述建立方法，还包括以下小鼠模型的鉴定步骤饲养上述接种肠道病毒71型的 小鼠，两天后，后肢出现反应迟缓，四天后后肢瘫痪，七天后死亡的，即为感染成功的小鼠模 型。本发明成功地建立了稳定的肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型，其后肢瘫 痪率一般为70% 100%，死亡率为30 100%。本发明为科研人员研究肠道病毒71型病 原学、肠道病毒71型致病机制以及高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制提供了基础，具有 广阔的应用前景。
图1为临床分离毒株的肌_ 0 鉴定的电泳图，其中肩=1&11 ^(02000)力=阴性 细胞对照，B =空白试剂对照，1 =分离毒株。图2为病毒组动物后肢瘫痪示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1建立肌肉注射感染肠道病毒71型的乳鼠模型步骤如下1、EV71的分离鉴定本发明所采用的EV71毒株是从临床的重症手足口病人的大便标本中分离的，同 时采用人横纹肌肉瘤细胞株(RD)、恒河猴肾细胞株(MA104)和非洲绿猴肾细胞株(Vero)三 种细胞对标本中的病毒进行分离，结果三种细胞上菌出现了细胞病变，传代后冻存毒种。然 后提取分离到的EV71的基因组RNA，逆转录成cDNA，采用EV71国家标准引物对分离毒株进 行鉴定，结果表明分离毒株在226bp处出现了很亮的条带(如图1所示)，可证实从临床手 足口重症病人大便标本中分离的毒株为EV71。2、EV71肌肉注射感染乳鼠模型的建立2.1小鼠的准备购买清洁级的新生BALB/C乳鼠(带母鼠)两组，每组乳鼠6只，25°C、湿度50%， 分格饲养在P2实验室的净化动物饲养柜内。2. 2毒种的准备将分离的EV71毒种，以200iiL/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞， 37°C、5% C02培养，每天观察细胞病变情况。接种EV71后第2天，MA104细胞有约70%出 现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即得到EV71的病毒液。2. 3EV71感染动物模型的建立2. 3. 1动物分组将两组动物分别设为病毒组和正常对照组，病毒组肌肉接种EV71病毒，正常对照 组肌肉接种含2%胎牛血清的1640培养液。2.3.2接种￡乂71采用无菌的微量进样器，病毒组每只BALB/C乳鼠肌肉注射病毒液20 u L，正常对 照组每只BALB/C乳鼠肌肉注射含2%胎牛血清的1640培养液20 u L。然后将动物按相同 的条件饲养在净化动物饲养柜内，每天观察动物。2. 3. 3接毒后的观察前两天病毒组和正常对照组均无异常；第3天病毒组动物后肢出现反应迟缓，正 常对照组无异常；第4天病毒组全部出现明显后肢瘫痪，正常对照组无异常，取两组动物各 3只分别进行解剖固定；第7天病毒组动物均死亡，正常对照组无异常。病毒组动物瘫痪的 情况如图2所示(最右端为正常对照)，证明动物模型建立成功。
权利要求
一种肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤取BALB/c乳鼠，肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法，其特征 在于所述病毒液注射量为20 iiL，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以200iiL/100mL 细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37°C、5% C02培养，每天观察细胞病变情况；接种 EV71后第2天，MA104细胞有约70%出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即 得到EV71的病毒液。
3.根据权利要求1所述的肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法，其特征 在于还包括以下小鼠模型的鉴定步骤饲养上述接种肠道病毒71型的小鼠，两天后，后肢 出现反应迟缓，四天后后肢瘫痪，七天后死亡的，即为感染成功的小鼠模型。
全文摘要
本发明公开了一种肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型的建立方法取BALB/c乳鼠，肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型。所述病毒液是通过以下方法制得的将EV71毒种，以200μL/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37℃、5％CO2培养，每天观察细胞病变情况；接种EV71后第2天，MA104细胞有约70％出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即得到EV71的病毒液。本发明成功地建立了稳定的肠道病毒71型肌肉注射感染的乳鼠模型，为科研人员研究肠道病毒71型病原学、肠道病毒71型致病机制以及高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制提供了基础，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K35/76GK101978971SQ20101029926
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月7日 优先权日2010年10月7日
发明者孟红, 宋楠楠, 岳盈盈, 张颖, 李志会, 李鹏, 盖中涛 申请人:山东省医学科学院基础医学研究所;济南市传染病医院
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