一种苯骈苯丙素用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途的制作方法

专利名称：：一种苯骈苯丙素用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，具体而言，本发明涉及式(1)所示的两个苯骈苯丙素或其可药用盐用于制备抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸HBVDNA复制、治疗乙型病毒性肝炎药物之用途，该二苯骈苯丙素具有确切抑制HBVDNA活性，其在高剂量(100微克/毫升)时对HBVDNA的复制抑制活性是α-干扰素在最高浓度10000单位/毫升浓度时的抑制活性的1.3至2.2倍，且其中一个超过阳性对照药物拉米呋啶同样浓度下对HBVDNA的抑制活性，属于极其强效的非核苷类抑制乙肝病毒天然产物，以上药效学结果表明该类苯骈苯丙素或其可药用盐可预期用于制备抑制HBVDNA复制、治疗乙型肝炎病毒感染疾病药物的用途。
背景技术：
：乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒HBV引起的传染病。HBV是嗜肝DNA病毒科hepadnaviridae的一员，其形状为直径42纳米的球形颗粒。HBV是奇特的病毒，在其它动物中较少有传染性，唯有在人体或者灵长类动物黑猩猩体内才能得以复制。该病毒通过乙肝病毒携带者和乙肝病人的血液、唾液、精液、阴道分泌物进行传播，具有慢性携带状态。乙肝在我国广泛流行，因其分为垂直传播、水平传播、家庭内传播、医源性传播和性传播等多种方式，对人群感染率高，在某些地区感染率达到35%以上。据有关资料，肝炎检测阳性的患者已经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿，是当前危害人民健康最严重的传染病之一。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化，少数病人可转变为原发性肝癌。近几年随着肝病的研究，发展了标准化的HBVDNA的分析，大大推进了对乙肝患者病情的了解。HBVDNA的定量分析能预测乙肝的严重性及其预后，因为HBVDNA持续阳性(即持续病毒血症)容易使乙肝病情进展和加重；高乙肝病毒(HBVDNA)含量容易促进肝硬化的形成；HBVDNA持续存在是肝细胞癌(HCC)发生的高危因素，特别是病毒含量较高、病程较长、年龄较大或合并其它肝病者；持续高浓度的HBVDNA存在，可导致失代偿性肝硬化及原发性肝重症的死亡率明显增加。同时必须认识到，HBVDNA水平与肝脏组织学的关系极其密切文献报道经抗病毒治疗，肝脏纤维化的改善和消除明显；近期国际肝病会议报导，强效和低耐药性的抗病毒治疗，随着HBVDNA的降低和转阴，而观察到肝硬化可出现不同程度的逆转，因此现在主张肝硬化也应进行抗病毒治疗。因此，HBVDNA指标在抗病毒治疗中的应用起着举足轻重的作用HBVDNA的水平是决定慢性乙型肝炎是否需要抗病毒治疗的重要指标；根据HBVDNA的不同情况分别制定出HBeAg阳性或HBeAg阴性的不同治疗标准和要求；在抗病毒治疗中，根据HBVDNA的治疗反应，判断是否病毒学早期应答进而决定长期用药的策略以取得持续性的病毒学应答，达到持续病毒抑制的目的；根据HBVDNA的病毒学的应答情况，创造HBeAg血清学的转换基础和条件，以达到其良好的中间治疗目标；根据HBVDNA持续抑制情况争取病毒持续阴性，以争取达到抗病毒最终治疗目标；根据HBVDNA持续完全受到抑制，也显示出了cccDNA的不同程度好转和消失；在抗病毒治疗中，以HBVDNA的变化来评估和预防抗病毒药物所引起的病毒变异及耐药发生的风险；一旦发生病毒变异或耐药时，HBVDNA的变化是唯一的最先的信号和诊断依据，也是治疗耐药和改变治疗策略的指导和依据。综上所述，对HBVDNA的抑制程度在乙肝的进一步诊断和治疗上有着新的重大意义，对疗效的观察，对评估乙肝预后及耐药危险性均有较大的指导作用。由上述因素可知抑制乙肝病毒在体内增殖的一个根本环节在于抑制HBVDNA的复制。HBVDNA水平的降低或者低于检测水平是检验抗病毒药物的一把金钥匙。所以，亚太肝脏研究学会和欧洲肝脏研究学会均将HBVDNA检测不到作为乙型肝炎病毒患者治疗终点之一。我国新药开发指南中也将受测化合物对于HBVDNA的抑制强度视为必须完成的测试项目之一。拉米呋啶之所以能够成为首选核苷类药物便是因为其具有强效的抑制HBVDNA复制之活性。必须说明的是目前使用的抗病毒药物其实只是病毒复制的抑制剂，并不能直接杀灭病毒和破坏病毒体，否则就会损伤宿主细胞。这些抗病毒药物(多为核苷类药物)还存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突变、停药后易反跳等缺点。因此开发新型抗病毒药物是当今药物研发领域的当务之急，其对于治疗我国大量的乙肝患者和病毒携带者、控制传染源等都有着极其重要的社会意义和经济意义。所以，从民族民间长期使用的天然药物中发现新的非核苷类乙肝病毒抑制剂及此类能够抑制HBVDNA复制的先导化合物有着很大的指导性意义，并有着辽阔的发展前景。基于此目的，发明人以前曾完成多项抗乙肝病毒天然产物及其结构改造衍生物的专利和文章，发现了多种抑制乙肝病毒表面抗原HBsAg或乙肝病毒e抗原HBeAg活性、或抑制HBVDNA复制的化合物，从而说明从天然产物及其合成衍生物中筛选出能够抑制HBVDNA复制、防治乙肝病毒感染的创新性药物是可行的[参见“一类对映桉烷醇类倍半萜抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、刘光明、于荣敏、李海波等；ZL200610053827.4)；“2β-羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(李校堃、赵昱、黄可新、李海波等；ZL200610053749.8)；“2α，3β-二羟基-5，11(13)-二烯桉烷_12_酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、张礼和、孙汉董、李海波等；ZL200610053601.4)；“艾里莫芬烷内酯抑制乙肝病毒的用途及其药物组合物”(赵昱、李海波、杨雷香、周长新等；ZL03153691.3)；“一种艾里莫芬内酯酸天然产物及其应用”(赵昱、周长新、施树云、王晓雨等；ZL200610053575.5)；“一种桉烷型倍半萜酸及其用途”(赵昱、刘光明、李海波、巫秀美等；ZL200610053579.3)；“六棱菊属植物提取物抑制单纯疱疹病毒及乙肝病毒的用途”(赵昱、周长新、于荣敏、白骅；CN1989989Α)；“1β_氧代_5，11(13)-二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、李海波等；CN1927197Α)；“1β-羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、巫秀美等；CN1935131Α)；“对映艾里莫芬烷酸及其抑制乙肝表面抗原的医药用途”(黄可新、李校堃、王晓雨、赵昱等；CN101239054)；“1_氧-取代苯甲酰奎尼酸化合物及其抑制乙肝病毒用途”(李校堃、胡利红、巫秀美、赵昱等；CN101293836)；发明人已发表之抑制HBsAg/HBeAg和HBVDNA等活性文章参见“InVitroAntiviralActivityofThreeEnantiomericSesquiterpeneLactonesfromSenecioSpeciesAgainstHepatitisBVirus，，，HaiboLi(李海波)，ChangxinZhou(周长新)，XiumeiWu(巫秀美)，YuZhao*(赵昱)等,AntiviralChemistry&Chemotherapy，2005，16，277—282;“EvaluaitionofAntiviralActivityofCompoundsIsolatedfromRanunculussieboldiiMiq.andRanunculussceleratusL",HaiboLi(李海波)，ChangxinZhou(周长新)，XiumeiWu(巫秀美)，YuZhao*(赵昱)等，PlantaMedica，2005，71(12)，1128-1133；"Applicationofhigh-speedcounter-currentchromatographyfortheisolationofantiviraleremophiIenolidesfromLigulariaatroviolacea，，，Shi,Shu-Yun(施树云)，Hai-Bo(李海波)，Zhao，Yu(赵昱)等，BiomedicalChromatography,2008,22(9),985-991；"PurificationandidentificationofantiviralcomponentsfromLaggerapterodontabyhigh-speedcounter-currentchromatography",ShuyunShi(施树云)，YuZhao(MS)等，JournalofChromatographyB，2007，859，119-124]。毋庸置疑，继续从天然产物及其结构改造衍生物中寻找能够抑制HBVDNA复制的先导化合物是非常有必要性和紧迫性的，也因此被国家科技部列为新药研制重大专项之一。我们设计了一种分子内含有芳香醛基和苯丙素类的骈合体，该分子既有一定的共轭度，大小又合适；既属于酚类化合物，又属于松柏醇衍生物，分子内既有氢键给体，又有氢键供体。所以我们推测式(1)所示化合物之三维构象与HBsAg或或HBeAg乃至HBVDNA之3D空间结构相结合之配体_受体结合复合物形态和结合方式都可能产生较大的差别，其结合位点和结合模式、其结合自由能等均会产生较大的改变，因而可能在清除HBsAg或HBeAg、抑制HBVDNA复制方面有着意想不到的效果。左国营等(左国营，刘树玲，徐贵丽，世界华人消化杂志，2006年14卷13期，1241-1246页)综述了近20年来药用植物成分体外抗HBV活性的研究进展，文中论及多种天然产物，其中并没有报道任何苯骈苯丙素类化合物具有抗HBV活性的相关记录，尤其是具有式(1)所示结构的含芳香醛基的苯骈苯丙素及其衍生物，国内几乎无人涉及。因此，我们对其进行了前人未加注意的结构改造和抗HBV活性研究。我们的目的之一是希望发现能抑制HBVDNA复制的苯骈苯丙素先导化合物，从而将其进一步开发成具有能抑制HBVDNA复制、治疗CHB的创新性药物，据此完成本发明。
发明内容本发明的目的是提供式(1)所示结构的苯骈苯丙素或其可药用盐用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物以及用于制备抑制HBVDNA复制药物之用途；819(^V0十、w\0HOCH3R=OCH3或OH⑴式(1)化合物选自(士)-2，3-tranS-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2_羟甲基-2，3_二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛或(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛。本发明还提供了两种制备式(1)所示的苯骈苯丙素类化合物的方法，第一种制备方法特征是取代苯甲醛在银盐催化下，与3，4-二甲氧基肉桂醇进行偶合反应而得；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中，银盐可以是碳酸银或硝酸银等，本发明中报告了使用碳酸银的例子；无水溶剂可以使无水苯、无水丙酮、无水四氢呋喃等无水非质子溶剂或它们的混合物，本发明中报告了无水苯、无水丙酮的混合溶剂。第二种制备方法是咖啡酸乙酯与3，4_二甲氧基肉桂醇在银盐存在下直接氧化偶合成新木脂素，该新木脂素再于臭氧与二硫甲醚共同作用下生成化合物(1)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>本发明的另一个目的是提供了一种用于抑制HBVDNA复制、治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物，其特征为含有由治疗有效量的作为活性成分的式(1)化合物或者它的可药用盐和可药用辅料组成的混合物。其药物剂型可以是片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、贴片剂、皮下植埋剂、外用搽剂、口服液或软膏剂，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。本发明的式(1)化合物是一种分子内含有芳香醛基和苯丙素类的骈合体，该分子既有一定的共轭度，大小又合适；既属于酚类化合物，又属于松柏醇衍生物；分子内既有氢键给体，又有氢键供体。因而可能在抗乙肝病毒方面有着意想不到的效果。我们测试了该化合物对H印G2.2.15细胞的生长抑制作用，同时测试了其对H印G2.2.15细胞分泌的HBVDNA复制的抑制活性。试验结果发现式(1)所示之苯骈苯丙素化合物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的复制具有比较强的抑制作用，其在高剂量(100微克/毫升)时对HBVDNA的复制抑制活性是α-干扰素在最高浓度10000单位/毫升浓度时的抑制活性的1.3至2.2倍，因此该化合物属于具有显著效果的非核苷类抑制乙肝病毒天然产物。以上均说明式(1)化合物有着意想不到的抗HBV效果，从而可以预期其可以作为抑制HBVDNA复制、治疗乙型病毒性肝炎之活性先导化合物继续开发。经本发明人详细的文献查阅，到目前为止，尚无有关该化合物治疗乙肝病毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物的报道。苯骈苯丙素式(1)化合物对于HBVDNA强效抑制均属于意想不到的发现，有着确切的原创性。综上所述，我们制备的该苯骈苯丙素既有结构上的独特性，又有抗病毒作用方面研究的新颖性，并在抗乙肝病毒活性测试中发现了不寻常的抑制HBVDNA的活性，有望成为抑制HBVDNA复制及治疗CHB之先导化合物。本发明有益之处在于首次发现式(1)所示之苯骈苯丙素具有抑制HBVDNA复制的功效，并在防治乙肝病毒方面的成药潜力；为开发成为治疗乙肝病毒创新药物，开发抑制HBVDNA复制之创新药物提供了新的物质基础。具有潜在巨大的社会效益和经济效益。本发明再一特点为本发明之合成起始物来源方便，合成方便。其制备方法简单易行，原料来源方便易得，成本低，污染小，利于节能减排条件下的大规模生产。产业化前景十分明确。具体实施例方式本发明人通过多步简单合成，并通过层析手段得到该能有效抑制HBVDNA复制活性的一个苯骈苯丙素类活性化合物，又经质谱和核磁共振波谱等综合解析推导出其化学结构。本发明人发现，式(1)化合物对H印G2.2.15细胞的生长无明显抑制作用，而对H印G2.2.15细胞分泌的HBVDNA之复制具有显著的抑制作用，提示该化合物具有用药安全、抑制HBVDNA复制高效的特点。因此，根据本发明人的研究，发明人所设计并合成的式(1)所示之苯骈苯丙素化合物可以用于制备治疗乙肝病毒感染性疾病的药物和用于治疗乙肝病毒感染性疾病。为了更好地理解本发明的实质，下面分别用式(1)化合物的制备及其对H印G2.2.15细胞生长抑制作用以及对H印G2.2.15细胞分泌的HBVDNA复制之抑制作用试验的结果，说明其在制药领域中的新用途。实施例给出了式(1)化合物的部分合成、结构鉴定、和活性数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例1化合物(士)-2，3-仕￡11^-3-(3，4-二甲氧基苯基-2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛的制备仪器与试剂紫外光谱用ShimadzuUV-240紫外分光光度计测定；核磁共振氢谱1H-NMR由INOVA型超导核磁共振波谱仪(VARIANIN0VA-400MHz)测定(四甲基硅醚TMS为内标)；电喷雾质谱ESI-MS由BrukerEsquire3000+质谱仪测定，柱层析用硅胶(100-200，200-300和300-400目)以及薄层层析用硅胶GF254(10-40目)均由青岛海洋化工厂生产；所用试剂均为分析纯，薄层制备层析(PTLC)用Merck公司的铝箔硅胶板；柱色谱用葡聚糖凝胶SephadexLH-20采用瑞典AmershamPharmaciaBiotechAB公司产品；反相硅胶RP-18采用日本FujiSilysiaChemical公司的Chromatorex产品；MCI为日本三菱化工公司产品，薄板(TLC)检测用254nm和365nm的紫外灯；显色剂用碘蒸气、10%硫酸-乙醇以及磷钼酸溶液。1.1制备方法1(银盐催化下直接氧化偶合法)在干燥500毫升三口瓶中，加入0.38克3，4_二羟基苯甲醛和0.62克3，4_二甲氧基肉桂醇，氩气保护下加入80毫升无水苯和20毫升无水丙酮。于60°C搅拌20分钟，再加入0.765克碳酸银剧烈搅拌7小时。混合物过滤，滤液减压浓缩，加硅胶拌样后，用16克200-300目硅胶柱层析，石油醚醋酸乙酯(31)反复洗脱，得到黄色固体0.354克。Rf(氯仿/甲醇=251):0.35;核磁共振氢谱(400MHz，氘代丙酮)δ:3.58(单峰，3Η，OMe)，3.65(单峰，3Η,OMe)，3.88(多重峰，1Η,H_9a)，4.08(多重峰，1H,H_9b)，4.41(多重峰，1Η，Η-2)，5.35(双峰，J=11.2Ηζ，1Η，Η-3)，6.777.13(多重峰，3H，H-2'，5'，6')，7.15(双峰，J=8.4Ηζ,1Η，Η-8)，7·38(双峰，J=1.2Ηζ,1Η，Η_5)，7·47(双双峰，J=8.4，1.2Hz,1Η,Η-7)；电喷雾质谱ESI-MS329[Μ-Η]+。1.2制备方法2:向干燥的反应瓶中投入碳酸银667毫克，478毫克咖啡酸乙酯和480克3，4_二甲氧基肉桂醇，氩气保护下加入16毫升无水苯和8毫升无水丙酮，在45°C时保温反应12小时。冷至室温后静置，滤去不溶物，母液减压浓缩，得黄色油状物，经20克200-300目硅胶柱层析，石油醚/醋酸乙酯(31)洗脱，得到343毫克中间体化合物。Rf(氯仿/甲醇/甲酸=2510.5):0.40；电喷雾质谱ESI-MS:m/z399[Μ-Η]+0直接用于下一步反应。中间体酯300毫克溶于15毫升甲醇中，向三口瓶中通臭氧，后降温至_70°C，再通入臭氧1小时，薄层检测反应毕，停止反应。通入氩气5分钟后，加入1毫升二甲硫醚，于-30°C下搅拌一小时。减压蒸除溶剂，醋酸乙酯萃取有机相，蒸除醋酸乙酯后得790毫克油状物。以200-300目硅胶12克柱层析，石油醚/醋酸乙酯(21)反复纯化，最终得到186毫克(士)-2，3-^^仙-3-(3，4-二甲氧基苯基)2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][1,4]二氧六环-6-基-甲醛。Rf(氯仿/甲醇=251):0.35;核磁共振氢谱(400MHz，氘代丙酮)δ3.58(单峰，3Η,OMe)，3.65(单峰，3Η,OMe)，3.88(多重峰，1Η,H_9a)，4.08(多重峰，1H,H-9b),4.41(多重峰，1H,H-2)，5.35(双峰，J=11.2Hz,1H,Η_3)，6·777.13(多重峰，3Η,Η-2‘，5'，6')，7·15(双峰，J=8.4Hz，1Η，Η-8)，7·38(双峰，J=1.2Hz，1Η，Η-5)，7.47(双双峰，J=8.4，1.2Ηζ，1Η，Η-7)；电喷雾质谱ESI-MS:m/z329[M-H]+。实施例2化合物(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-2_羟甲基-2，3_二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛的制备仪器与试剂同实施例1。2.1制备方法1(银盐催化下直接氧化偶合法)在干燥500毫升三口瓶中，加入0.38克3，4-二羟基苯甲醛和0.52克松柏醇，氩气保护下加入80毫升无水苯和20毫升无水丙酮。于60°C搅拌20分钟，再加入0.765克碳酸银剧烈搅拌7小时。混合物过滤，滤液减压浓缩，加硅胶拌样后，用16克200-300目硅胶柱层析，石油醚醋酸乙酯(31)反复洗脱，得到黄色固体0.328克，产率38%。Rf(氯仿/甲醇=251):0.32；核磁共振氢谱(400MHz，氘代丙酮)3.58(单峰，3H，OMe)，3.89(多重峰，1H,H-9a)，4.08(多重峰，1H,H_9b)，4.40(多重峰，1H,H-2)，5.32(双峰，J=11.2Hz,1Η，Η-3)，5·59(单峰，1H，4'-OH)，6·787·13(多重峰，3H，H_2‘，5'，6')，7.15(双峰，J=8.4Hz,1H,Η-8)，7.39(双峰，J=L2Hz,1Η,Η-5)，7.47(双双峰，J=8.4，1.2Hz,1Η,Η-7)；电喷雾质谱ESI-MS:m/z315[M_H]+。2.2制备方法2向干燥的反应瓶中投入碳酸银667毫克，478毫克咖啡酸乙酯和420克松柏醇，氩气保护下加入16毫升无水苯和8毫升无水丙酮，在45°C时保温反应12小时。冷至室温后静置，滤去不溶物，母液减压浓缩，得黄色油状物，经20克200300目硅胶柱层析，石油醚/醋酸乙酯(31)洗脱，得到322毫克中间体化合物。Rf(氯仿/甲醇/甲酸=2510.5):0.38；电喷雾质谱ESI-MS:385[M-H]+。直接用于下一步反应。中间体酯300毫克溶于15毫升甲醇中，向三口瓶中通臭氧，后降温至_70°C，再通入臭氧1小时，薄层检测反应毕，停止反应。通入氩气5分钟后，加入1毫升二甲硫醚，于-30°C下搅拌一小时。减压蒸除溶剂，醋酸乙酯萃取有机相，整除醋酸乙酯后的780毫克油状物。以200-300目硅胶12克过柱，石油醚/醋酸乙酯=21反复纯化，最终得到180毫克(士)-2，3-廿皿8-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛。Rf(氯仿/甲醇=251):0.32;核磁共振氢谱(400MHz，氘代丙酮)3·58(单峰，3H,OMe),3.89(多重峰，1H,H-9a),4.08(多重峰，1H,H-9b)，4.40(多重峰，1Η，Η-2)，5·32(双峰，J=11.2Hz，1Η，Η-3)，5.59(单峰，1H，4'-OH),6.787.13(多重峰，3Η，Η-2'，5'，6')，7·15(双峰，J=8.4Hz，1Η，Η-8)，7·39(双峰，J=1.2Hz，1Η，Η-5)，7.47(双双峰，J=8.4，1.2Hz，1Η，Η-7)；电喷雾质谱ESI-MS:m/z315[M-H]+。实施例3(士)-2,3-trans~3-(3,4-二甲氧基苯基)2_羟甲基_2,3_二氢苯并[b][1,4]二氧六环-6-基-甲醛对H印G2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的抑制作用3.1细胞培养将H印G2.2.15细胞培养于含10%灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37°C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养。3.2采用MTT法测定化合物(士)_2，3-tranS-3-(3，4_二甲氧基苯基)2_羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环6-基-甲醛对H印G2.2.15细胞生长的抑制作用取对数生长期的H印G2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1XIO5个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物(士)_2，3-trans-3-(3,4-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-2，3_二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛(样品编号化合物(Ι-a))，浓度分别为1000微克/毫升，200微克/毫升，40微克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C，5%CO2,100%相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入DMSO200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD值。以只加培养基的培养孔为对照孔。抑制率(％)=(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值X100%。实验重复三次。3.3测定化合物(士)-2，3-tranS-3-(3，4-二甲氧基苯基)2_羟甲基-2，3_二氢苯并[b][1,4]二氧六环-6-基-甲醛对HBVDNA复制的抑制作用取对数生长期的H印G2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1XIO5个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物(士)_2，3-trans-3-(3,4-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-2，3_二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛(样品编号化合物(Ι-a))，浓度分别为100、20和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C，5%CO2,100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混勻，作为待测样品。第8天时用HBVDNA定量PCR试剂盒测定培养基中HBVDNA浓度。以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照1(测试浓度为100、20和4微克/毫升)，以α-干扰素为阳性对照2(测试浓度为10000、5000和1000单位/毫升)。3.4实验结果实验结果如表1所示，化合物(士)-2，3_廿￡11^-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛具有强效的抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的作用。表1样品第8天时对H印G2.2.15细胞的HBVDNA复制的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>该实施例结果说明化合物(士)-2，3-tranS-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2_羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的复制具有比较强的抑制作用，其在高剂量(100微克/毫升)时对HBVDNA的复制抑制活性是α-干扰素在最高浓度10000单位/毫升浓度时的抑制活性的2.2倍，且超过同样浓度下阳性对照药物拉米呋啶对HBVDNA的抑制活性(见表1)，属于极其强效的非核苷类抑制乙肝病毒天然产物，值得进一步关注和深入研究，并可预期进一步优化发展为抑制HBVDNA复制的药物。实施例4化合物(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-2_羟甲基-2，3_二氢苯并[b][1,4]二氧六环-6-基-甲醛对H印G2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的抑制作用4.1细胞培养同实施例3。4.2采用MTT法测定化合物(士)_2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)_2_羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛对H印G2.2.15细胞生长的抑制作用取对数生长期的H印G2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1XIO5个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物(士)-2，3-trans-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛(样品编号化合物(1-b))，浓度分别为1000微克/毫升，200微克/毫升，40微克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C,5%CO2,100%相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入DMSO200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD值。以只加培养基的培养孔为对照孔。抑制率(％)=(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值X100%。实验重复三次。4.3测定化合物(士)_2，3-trans-3-(3_甲氧基_4_羟基苯基)_2_羟甲基_2，3_二氢苯并[b][1,4]二氧六环-6-基-甲醛对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的抑制作用取对数生长期的H印G2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成IXIO5个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物(士)-2，3-trans-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛(样品编号化合物(1-b))，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混勻，作为待测样品。第8天时用HBVDNA定量PCR试剂盒测定培养基中HBVDNA浓度。以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照1(测试浓度为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)，以α-干扰素为阳性对照2(测试浓度为10000单位/毫升，5000单位/毫升和1000单位/毫升)。4.4实验结果实验结果如表2所示，化合物(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基-甲醛具有强效的抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸复制的作用。表2样品第8天时对H印G2.2.15细胞的HBVDNA复制的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>该实施例结果说明黄酮木脂素化合物(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环-6-基-甲醛对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的复制具有比较强的抑制作用，其在高剂量(100微克/毫升)时对HBVDNA的复制抑制活性是α-干扰素在最高浓度10000单位/毫升浓度时的抑制活性的1.3倍，达到拉米呋啶抑制HBVDNA活性的60%，属于强效的非核苷类抑制乙肝病毒天然产物，值得进一步关注和深入研究，并可预期进一步优化发展为抑制HBVDNA复制的药物。在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。权利要求具有式(1)所示结构的苯骈苯丙素或其可药用盐用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物之用途；R＝OCH3或OH(1)其特征为式(1)化合物选自(±)-2，3-trans-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基-甲醛或(±)-2，3-trans-3-(3-甲氧基4-羟基苯基)-2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧六环-6-基-甲醛。FSA00000134348800011.tif2.具有式(1)所示结构的苯骈苯丙素或其可药用盐用于制备抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸HBVDNA复制药物之用途；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其特征为式(1)化合物选自(士)-2，3-廿皿8-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2-羟甲基-2，3_二氢苯并[b][1,4]二氧六环-6-基-甲醛或(士)-2，3-tranS-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-2，3-二氢苯并[b][l，4]二氧六环6-基-甲醛。全文摘要本发明涉及一种苯骈苯丙素用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途，具体而言，本发明涉及两个苯骈苯丙素或其可药用盐用于制备抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸HBVDNA复制、治疗乙型肝炎病毒感染疾病药物的用途，该二苯骈苯丙素具有确切抑制HBVDNA活性，其在高剂量(100微克/毫升)时对HBVDNA的复制抑制活性是α-干扰素在最高浓度10000单位/毫升浓度时的抑制活性的1.3至2.2倍，属于强效的非核苷类抑制乙肝病毒天然产物，以上药效学结果表明该类苯骈苯丙素或其可药用盐可预期用于制备抑制HBVDNA复制、治疗乙型肝炎病毒感染疾病药物的用途。文档编号A61K31/357GK101829093SQ20101018153公开日2010年9月15日申请日期2010年5月25日优先权日2010年5月25日发明者吴俊珠,孙莲莉,巫秀美,廖晓辉,李凤贤,杨雷香,赵昱,郝小江申请人:大理学院