槲皮素二聚体黄酮用于制备抗氧化药物的用途的制作方法
专利名称：槲皮素二聚体黄酮用于制备抗氧化药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一个槲皮素二聚体黄酮或其可 药用盐用于制备抗氧化剂的药物用途。对该化合物的药理学试验表明该化合物具有体外 清除超氧阴离子自由基的活性；此外，该化合物还表现出很强的对抗自由基引起的大鼠肾 上腺嗜铬瘤PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用， 说明其对保护脑细胞组织抗氧化和脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症有积极作用，可以预 期用于制备该类药物的用途。再者，该化合物还对黄嘌呤氧化酶显示一定的抑制作用，可以 预期用于制备治疗由黄嘌呤氧化酶引起的痛风病的药物。
背景技术：
众多研究表明自由基与神经系统疾病如老年性痴呆症(阿兹海莫症，AD)、帕 金森症、脑卒中等密切相关。其原因主要与脑组织代谢特点有关脑组织耗氧量大，脂肪 含量高，而各种抗氧化酶的含量相对于其它组织而言偏少，因而易受自由基攻击造成损伤 (GiIgun-Sherki,Y.等,Antioxidant therapy in acute central nervoussystem injury current state, Pharmacol. Rev.，2002，54，271-284)。因而，目前认为自由基参与了 AD 患者的病理过程。此外，自由基还可引起β淀粉样蛋白沉积，与细胞膜产生反应，导致细 胞内氧化损伤。因此，研发脑中枢神经系统抗氧化剂是治疗老年性痴呆的有效途径之一， 从近期褪黑素(Melatonin)的风靡可略见一斑(Green, K.N.等，Melatonin, aging, and age-related diseases -perspectives for prevention, intervention, and therapy, J. Physiol (Lond)，2002，541 (3) 1013-1023)。因此，寻找新型有效抑制脑细胞氧化损伤的 先导化合物或药物既有巨大的社会效益又有显著的经济效益。近年来，国际医药界持续不断地投入了大量的人力、物力、财力，努力寻找抗氧化 作用显著、具有强效神经细胞保护作用的抗氧化剂先导化合物。目前比较肯定的用于研究 老年性痴呆症(主要是胆碱能神经系统)的体外细胞模型主要有3种原代培养的海马、皮 层、基底前脑神经细胞，PC12细胞和海马HT22细胞株。本试验采用的PC12细胞以其在培 养过程中的易获得性和细胞均一性成为神经科学离体研究中的重要工具细胞，并用于研究 多种神经系统疾病，如老年痴呆症、帕金森病等[王健，陈沙维，调心方对H2O2氧化损伤PC12 细胞的保护作用研究，中华医药杂志，2004年4卷7期；崔旭等，复方益智散对PC12细胞增 值和抗凋亡作用，中华老年心脑血管杂志，2006，8 (3)，198-201 ；徐鹰等，大豆苷元对氧自由 基所致PC12细胞细胞毒作用的影响，中药药理与临床，2007，5期]。此外，现代医学理论证实痛风病的致病因素之一是黄嘌呤氧化酶(EC1. 2. 3. 2，简 称为X0)。此酶是体内核酸代谢的一个重要酶，能催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸和超氧阴 离子，若机体不能及时清除产生的尿酸，使尿酸结晶盐在关节处沉积，就会引起痛风；产生 过多的超氧阴离子也可引起多组织受损，因此测定化合物对XO的作用对发现新的XO抑制 剂和其抗氧化作用有重要意义。从天然产物以及其衍生物中筛选出黄嘌呤氧化酶抑制剂先 导化合物也是开发治疗痛风病新药的重要任务。
槲皮素是药用价值很高的一个天然黄酮醇类化合物，关于其抗氧化作用等药理学 研究可参见综述[王玉强等，槲皮素抗氧化作用研究，齐鲁药事，2006年25卷8期；王艳芳， 王新华等，槲皮素药理作用研究进展，天然产物研究与开发，2003年15卷2期]。然而，槲 皮素二聚体却鲜有人研究。该黄酮二聚体是由Hirose等于1999年报道，其发现槲皮素在 脂质过氧化过程中可以形成二聚体[Hirose等，Chemistry Letters，1999，8，775-776]。该 二聚体结构比槲皮素分子量大几乎一倍，分子中含有更多羟基等活性基团，或许会比槲皮 素具有更强的保护脑神经细胞、抗氧化损伤的能力。至今为止，未见到该槲皮素二聚体应用于研发清除自由基、保护PC12细胞免受氧 化损伤、以及用于制备防治脑神经氧化受损造成的老年性痴呆症之药物的报道；也未见到 该二聚体化合物抑制黄嘌呤氧化酶活性制备防治由黄嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛风病 的药物或药物组合物的报道。因此发明人制备了此二聚体黄酮醇并将其作为保护脑神经细 胞、抗氧化损伤活性先导物测试对象，据此完成本发明。 本发明的目的是提供一种下式所示的槲皮素二聚体黄酮即化合物l，3，lla_三羟 基-9-(3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮-2)-5a-(3,4- 二羟基苯基)-5，6，11-六 氢-5，6，11-三氧-并四苯-12-酮或其可药用盐用于制备一种氧自由基清除剂暨抗氧化剂 药物的用途。 具体而言，本发明的目的之一是提供了式(1)所示结构之槲皮素二聚体黄酮或其 可药用盐用于制备防治由氧自由基引起或与氧自由基有关的老年性痴呆症药物的用途。本发明的另一目的是提供了式(1)所示结构之槲皮素二聚体黄酮或其可药用盐 用于制备防治由黄嘌呤氧化酶引起的痛风病之药物的用途。本发明的又一目的是提供了一种用于防治自由基引起的老年性痴呆症以及由黄 嘌呤氧化酶引起的痛风病药物组合物，其中含有治疗有效量的式(1)所示结构之槲皮素二 聚体黄酮或其可药用盐和药用辅料。本发明还提供了一种制备式(1)所示的槲皮素二聚体黄酮类化合物的方法，其特 征是用市售或者自制的槲皮素在无水条件下，有银盐催化进行自由基偶合反应偶联而得。本发明的槲皮素二聚体黄酮化合物(1)与天然黄酮木脂素类化合物槲皮素相比 较，具有诸多结构和物化性质上差异化的特征，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氢键 受体、电性、分子间范德华力、以及3D构象、伸展方向、分子重心、共轭程度、电性分布中心 等特质均与槲皮素有着明显不同；且化合物(1)分子量比槲皮素增大了 300个质量单位。 上述特征都决定了式(1)所示化合物之三维构象与靶标受体或酶之3D空间结构相结合之 配体-受体结合复合物形态和结合方式都可能产生较大的差别，其结合位点和结合模式、
发明内容其结合自由能等均会产生较大的改变，因而可能在清除自由基、保护PC12细胞免受氧化损 伤、抑制黄嘌呤氧化酶方面有着意想不到的效果。综上所述，本发明涉及一个槲皮素二聚体黄酮的多种抗氧化机制药效学活性及其 用于制备相关疾病药物的用途。经测试发现该化合物具有清除超氧阴离子自由基活性和对 抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，从而可以预期发展成为能于体内清除自由基的药物 或药物组合物，尤其是可以用于制备防治脑神经氧化受损造成的老年性痴呆症之药物。此 外，该化合物还表现出一定的抑制黄嘌呤氧化酶活性，因而还可以预期进一步开发成为治 疗由黄嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛风病的药物或药物组合物。本发明的有益之处在于槲皮素二聚体黄酮类衍生物具有强效清除自由基、对抗 自由基引起的PC12细胞损伤和黄嘌呤氧化酶抑制等药效作用，且其活性强于槲皮素，显示 该化合物可以预期应用于制备治疗新的适应症药物，对于开发新的抗老年性痴呆症和痛风 病这两种常见病及多发病创新型药物提供了新的物质基础，具有潜在的社会效益和经济效 益。再一特点是该化合物来源于天然产物的半合成结构改造，制备步骤简便，成本低，污染 小，利于大规模生产。
具体实施例方式为了更好地理解本发明的实质，下面首先用实施例的形式说明化合物制备的过 程，实施例给出了化合物的部分物理和化学及波谱学数据，其中OEt是指乙氧基(OCH2CH3)。 必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质 对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例1 化合物(1)的制备 在干燥的反应瓶中加入343毫克槲皮素(本室自行制备，HPLC检测纯度98%)， 550毫克碳酸银，于氮气保护下加入20毫升干燥过的丙酮和60毫升无水苯溶液，在 55-60°C之间搅拌20小时。混合物静置，滤除不溶物。母液减压浓缩，得黄色固体。以 200 300目硅胶柱层析，以氯仿/甲醇(20 1)洗脱。得黄色固体182mg。Rf (氯仿甲 醇=10 1) = 0. 18 ；红外 IR(KBr 压片)CnT1 :3195，1689，1647，1588，1495 ；核磁共振氢谱 1H NMR (400MHz，氘代丙酮)6.05(双峰，J = 2. OHz, 1H, Η_6' )，6· 10 (双峰，J = 2. OHz, 1Η, Η-8' )，6· 28 (双峰，J = 2. OHz, 1Η, Η_6)，6· 62 (双峰，J = 2. OHz, 1Η, Η_8)，6· 81 (双 峰，J = 8· 4Hz, 1Η, Η-13)，7· 16 (双双峰，J = 2. 4,8. 4Hz, 1Η, Η-14 ' )，7· 29 (双峰，J = 8. OHz, 1Η, Η-13' )，7· 35 (双峰，J = 2. 4Hz, H-IO' )，7· 96 (双峰，J = 2. OHz, 1Η, H-10)， 8. 00(双双峰，J = 2.0，8.8Hz，lH，H-14)；核磁共振碳谱 13C NMR(100MHz，氘代丙酮，Sppm) 91. 4(C-3 ‘ )，94. 6 (C-8)，97. 3 (C-8 ‘ )，98.0(C_6 ‘ )，99. 3 (C—6)，100. 9 (C—4 ‘ a)，101. 6(C-2' )，104. 2(c-4a)，115. 4(C-9' )，116. 5 (C_14' )，117. 7 (C—10)，118. 2 (C—13)， 121. KC-10 ‘ )，123. 4(C-14)，126. 2(C-9 ‘ )，126. 9 (C—13)，137. 6 (C—3)，141. 8 (C—11)， 143. 0(C-12)，145. 4(C-2，C-Il ‘ )，147.6(C_12 ‘ )，157. 8 (C_8a)，160. 7 (C—8 ‘ a)， 162. 3(C-4a)，165. 1(C-5 ‘ )，165. 2(C-7)，169.2 (C-7 ‘ )，176. 7(C-4)，189. 0(C-4 ‘)；电 喷雾质谱 ESI-MS :m/z 603[M+H] + (100)。式(1)化合物具有多种重要的生物活性，本发明通过多种药效学试验模型对该化 合物抗氧自由基活性进行了测试，发现其具有确切的体外清除超氧阴离子自由基的活性。 此外，该类化合物还表现出很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经 细胞的大鼠肾上嗜铬细胞瘤PC12细胞有抗氧化损伤保护作用。说明其对保护脑神经抗氧 化、防治老年性痴呆症有积极作用，可以用于制备保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症药 物的用途。此外，该化合物还被发现具有强效抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用，因而可以预期 作为治疗痛风类疾病的药物。本发明的式(1)化合物或其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备 用于治疗自由基引起的老年性痴呆症之药物或药物组合物。上述药物或药物组合物可以采 用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型。本发明的式(1)化合物或其可药用盐还可以与现已上市的抗自由基氧化剂药物 如超氧化物歧化酶(SOD)等联合使用，制备得到具有防御自由基引起的损害活性的抗氧化 药物组合物，用于治疗上述疾病。其也可与其他保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症之药 物联合使用，得到抗老年性痴呆药物组合物。上述药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊 剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型。本发明的式(1)化合物或其可药用盐还可以与现已上市的治疗痛风病药物如黄 嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇等联合使用，制备得到具有治疗痛风病的药物组合物，用于痛风 病的临床治疗。上述各类药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴 丸剂、外用搽剂等剂型。本发明中所述剂型如片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂和外用搽 剂以及其各种缓释、控释剂型或纳米制剂都可以根据现已公认的药剂学常识经由常规制备 而得，在这些公知知识和技术基础上制备出的含有本发明权利要求化合物或其可药用盐的 药物或药物组合物之其他剂型都在本发明的保护范围内。为了更好地理解本发明的实质，下面分别用药理相关实施例的形式列举式(1)化 合物对超氧阴离子自由基抑制作用试验、对双氧水H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用试验 以及对黄嘌呤氧化酶XO的抑制作用试验之结果，说明其在制药领域中的用途以及用于制 备相关抗氧化剂药物的根据。药理相关实施例给出了化合物的部分活性数据。同样必须说 明，本发明列举的这些实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实 质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例2 式⑴化合物体外清除超氧阴离子自由基的活性试验2. 1实验材料与样品2. 1. 1实验试剂2. 1. 1. 1 吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate, PMS)、硝基四氮唑兰 (nitroblue tetrazolium, NBT)、菲口各嗪(ferrozine)购自 Sigma 公司；
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2. 1. 1. 2槲皮素(quercetin)由浙江大学药学院中药与天然药物研究室实验室提 供(纯度为99% )；2. 1. 1. 3Tris 碱，DMEM 培养基购自 Gibco 公司；2. 1. 1. 43- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-dipheny 11etrazo 1 ium bromide (MTT)和NADH (还原型辅酶I)购自Amresco公司；2. 1. 1.5其它试剂均为国产分析纯试剂，购自杭州华东医药试剂有限公司。2. 1. 2 仪器2. 1. 2. 1 酶标仪=Synergy-HT 型，BIO-TEK 公司；2. 1. 2. 2立式自动电热压力蒸汽灭菌器LDZX_40BI型，上海申安医疗器材厂；2. 1. 2. 3紫外分光光度计UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；2. 1. 2. 4超纯水系统UPWS-I_60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；2. 1. 2. 5 除菌过滤器:Sterifil500 型，Millipore 公司；2. 1. 2. 6气浴恒温振荡器THZ_C，江苏省金坛市医疗仪器厂。2. 2实验方法2.2.1式(1)化合物清除超氧阴离子自由基能力的检测乃使用吩嗪-N甲硫酸 4k-NADH(phenazine methosulfate-NADH) ΜΜ,^Β^ΜΜ. (nitroblue tetrazolium) 原方法检定。2. 2. 2用3毫升含有78 μ M的NADH、50 μ M四唑氮蓝和10 μ M吩嗪-N甲硫酸盐在 PH值为8.0的16mM Tris-HCl缓冲液中产生出超氧阴离子自由基，对不同浓度的式(1)化 合物检测其活性。超氧阴离子自由基和四唑氮蓝反应生成物的颜色用分光光度计在560nm 波长下监测，槲皮素被用作阳性对照药物。2. 3实验结果试验结果见表一。表一 2.4结论试验结果表明，式(1)化合物具有相当强效的超氧阴离子自由基清除作 用，在同一浓度下，其清除能力甚至高于槲皮素11%。结论该槲皮素二聚体属于具有相当 强效的清除超氧阴离子自由基的抗氧化物质，可预期进一步发展成为强效抗氧化损伤、抗 老年痴呆药物。实施例3 式(1)化合物对双氧水H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用活性试验3. 1实验材料与样品3. 1. 1细胞大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)购自中科院上海细胞所。3. 1.2实验试剂:3·1·2·1 双氧水(hydrogen peroxide，H2O2)、硝基四氮唑兰(nitrobluetetrazolium, NBT)、菲口各嗪(ferrozine)购自 Sigma 公司；3. 1. 2. 2槲皮素(quercetin)由浙江大学药学院中药与天然药物研究室实验室提 供(纯度为99% )；3. 1. 2. 3Tris 碱，DMEM 培养基购自 Gibco 公司；3. 1. 2. 43- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-dipheny 11etrazo 1 ium bromide (MTT)购自 Amresco 公司；3. 1. 2. 5小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；3. 1. 2. 6青霉素和链霉素由石家庄制药集团有限公司生产；3. 1. 2. 7其它试剂均为国产分析纯，购自杭州华东医药试剂有限公司。3. 1. 3 仪器3. 1. 3. 1 酶标仪=Synergy-HT 型，BIO-TEK 公司；3. 1. 3. 2立式自动电热压力蒸汽灭菌器LDZX_40BI型，上海申安医疗器材厂；3. 1. 3. 3紫外分光光度计UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；3. 1. 3. 4超纯水系统UPWS-I_60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；3. 1. 3. 5 除菌过滤器:Sterifil500 型，Millipore 公司；3. 1. 3. 6气浴恒温振荡器THZ_C，江苏省金坛市医疗仪器厂；3. 1. 3. ICO2细胞培养箱MMM，德国公司；3. 1. 3. 8倒置显微镜XD_2型，重庆光电仪器有限公司。3. 2实验原理=H2O2是一种主要的活性自由基的前体，它可引起中枢神经系统细胞 的凋亡，PC12细胞(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)可模拟脑神经细胞，因此常用它来作为研究药 物与神经细胞之间关系的模型，用MTT测细胞的存活率，如果待测化合物有清除由H2O2引起 的自由基、保护神经细胞的作用，则其细胞存活率高，OD值就高；反之就低。本发明采用对 唐希灿所报道的方法(Xiaoqiu Xiao等，NeurosciLetter，1999，275 :73_76)并对之加以改 进，用以测定化合物对PC12细胞的抗氧化损伤保护作用。3. 3细胞培养PC12细胞用含10%小牛血清，IOOU/毫升青霉素和100微克/毫升 链霉素的DMEM培养基培养，于37°C、5% CO2细胞培养箱中孵育，常规方法传代培养。3. 4实验方法3. 4. 1细胞毒性的测定首先用改良的MTT法测定了待测化合物对PC12细胞增殖 的作用。PC12细胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集细胞，计数，用含10%小牛血清的DMEM 培养基稀释至8000个/毫升的密度，然后接种于96孔细胞板中，细胞培养箱中继续培养， 24小时后，分别将新配的待测的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物的 最终浓度分别为16、8和4微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT (5毫克/毫升)的生 理盐水溶液，继续在37°C，5% CO2潮湿空气的培养箱中培养3小时，弃去原液，每孔中加入 150微升二甲亚砜，振荡溶解生成的MTT晶体甲臜，用酶标仪在570nm波长下比色，细胞生长 抑制率计算公式如下%细胞生长抑制率=(0D溶剂对照-OD样品)/OD溶剂对照X 100%。3. 4. 2式(1)化合物对H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用的测定PC12细胞用 DMEM培养基培养，培养基中含10%牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素。细胞 以每孔8000个的密度加到96孔板中，在37°C，50% CO2潮湿空气的培养箱中培养36小时。
8用倒置显微镜观察细胞的形态变化以及用MTT法测定细胞的存活率。细胞经36小时的孵 育后，分别将新配的式(1)化合物的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中。作用2小时 后加入新配的H2O2 (终浓度为600 μ Μ)作用3小时，显微镜观察记录，弃去原培养液，加入新 的培养液100微升，然后加入MTT 10微升，3小时后，小心吸去培养液，加入150微升DMSO 溶解甲臜，于570nm处读数。采用槲皮素为阳性对照药物。3.4.3试验结果见表二。表二式(1)化合物及对照品对双氧水损伤PC12细胞保护作用 3. 5结论试验结果表明，式⑴化合物具有较强的对抗自由基引起的PC12细胞 损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有明确的抗氧化损伤保护作用。而且在同一浓 度下，其保护PC12细胞免受自由基损伤能力大大强于阳性对照槲皮素，是相同测试浓度下 槲皮素对PC12细胞保护能力的2.1倍。实属罕见的强效保护PC12细胞活性化合物。说明 该槲皮素二聚体黄酮醇属于具有极其强效保护模拟脑神经细胞的PC12细胞作用的抗氧化 物质。测定化合物对H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用可作为初步探讨其保护中枢脑 神经细胞的作用机理之依据。故据该化合物表现出对双氧水损伤所致PC12细胞的强效保 护作用，可以预期其对老年性痴呆症的治疗有非常积极的作用，有望进一步开发成抗氧化 损伤、防治老年性痴呆的先导化合物。实施例4 式(1)化合物对黄嘌呤氧化酶XO的抑制作用试验4. 1实验材料与样品4. 1. 1试验动物SD(Sprague-daWley)大鼠于浙江大学实验动物中心购得。合格 证号SCXK (浙 2007-0029)。4. 1. 2实验试剂4. 1. 2. 1 吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate, PMS)、硝基四氮唑兰 (nitroblue tetrazolium，NBT)、黄嘌呤、菲咯嗪(ferrozine)购自 Sigma 公司；4. 1. 2. 2Triton X-100 购自 Gibco 公司；
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4. 1. 2. 3阳性对照药物别嘌醇，泰州美通药业有限公司；4. 1. 2. 4磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其它试剂均为国产分析纯(杭州华东试剂公 司)。4. 1. 3 仪器4. 1. 3. 1 酶标仪=Synergy-HT 型，BIO-TEK 公司；4. 1. 3. 2立式自动电热压力蒸汽灭菌器LDZX_40BI型，上海申安医疗器材厂；4. 1. 3. 3紫外分光光度计UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；4. 1. 3. 4超纯水系统UPWS-I_60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；4. 1. 3. 5 除菌过滤器:Sterifil500 型，Millipore 公司；4. 1. 3. 6气浴恒温振荡器THZ_C，江苏省金坛市医疗仪器厂；4. 1.3. 7玻璃勻浆器国产。4. 2实验方法4. 2. 1取SD大鼠，断头处死，迅速取出肝脏至预冷的磷酸缓冲液(100mM，pH 8. 75) 中，去除血管，剪碎后用磷酸缓冲液1 l(w/v)稀释后在冰上直接勻浆，于-20°C保存，用前 用磷酸缓冲液(1 7)稀释，4°C条件下离心(8000rpm/10分钟)，取上清作为酶原。4.2.2 化合物对XO的抑制作用测定采用酶联免疫ELISA法样品孔中加入底物黄嘌呤(0. 1毫克 /毫升，600微升)，酶(30微升)，化合物1,3,11a-三羟基-9- (3,5,7-三羟基—4H-1-苯 并吡喃-4-酮-2)-5a-(3，4-二羟基苯基)-5，5a，6，11，Ila-六氢-5，6，11-三氧-并四 苯-12-酮用二甲亚砜溶解，用磷酸缓冲液稀释，每孔30微升，使其终浓度为40微克/毫升、 20微克/毫升和10微克/毫升，加入硝基兰四氮唑和吩嗪甲硫酸酯(30微升)，最后加入 Triton X-100 (0. 4%,10微升)，在37°C中水浴保温2小时，于550nm波长下比色测定。化 合物对黄嘌呤氧化酶抑制率由样品OD值对于空白和对照OD值计算。黄嘌呤氧化酶抑制率
(% ) = [(OD 标准管_0D空白管)_(〇D样品管_0D样品空白管)]/(0D标准管_0D空白管)X 100%。4. 3实验结果式(1)化合物对黄嘌呤氧化酶抑制率见表三。表三式(1)化合物及对照品对黄嘌呤氧化酶抑制作用 4. 4 结论:阳性对照药物别嘌醇对黄嘌呤氧化酶显示出极高的抑制活性。式(1)化合物在 各个浓度都没有别嘌醇得抑制活性高。但是令人欣喜的是在高浓度和低测试浓度时式 (1)化合物都显示出比槲皮素高效的抑制黄嘌呤氧化酶的活性，其在高浓度时的抑制活性 (85.7%)已经接近于相同浓度下别嘌醇的抑制活性(89.2%)；属于及其强效的黄嘌呤氧 化酶抑制剂，且其抑制活性呈显著的量效关系。说明该槲皮素二聚体黄酮醇类化合物具有 进一步发展成为疗效确切的黄嘌呤酶抑制剂的潜能。在上述说明书阐述本发明时，提供药理相关实施例的目的是举例说明本发明的实 际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际 应用包括所有一般变化、配合，或改进。
权利要求
式(1)所示的槲皮素二聚体黄酮或其可药用盐在制备防治老年性痴呆症药物中的应用。FSA00000134424900011.tif
2.式(I)所示的槲皮素二聚体黄酮或其可药用盐在制备防治痛风病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及槲皮素二聚体黄酮用于制备抗氧化药物的用途，具体涉及一个槲皮素二聚体黄酮类化合物用于制备防治老年性痴呆症或痛风病药物的用途。药效学试验证实该化合物具有强效清除超氧阴离子自由基、对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用，从而可以预期发展成为保护脑神经、防治由自由基损伤引起的老年性痴呆症的药物。该化合物还具有高效抑制黄嘌呤氧化酶的活性，因而可以预期其发展成为治疗痛风病的药物。
文档编号A61P19/06GK101912386SQ201010181800
公开日2010年12月15日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者宋丽艳, 巫秀美, 李海波, 白丽, 谭仁祥, 赵昱, 陈绍媛, 雷婷 申请人:大理学院
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一个槲皮素二聚体黄酮或其可 药用盐用于制备抗氧化剂的药物用途。对该化合物的药理学试验表明该化合物具有体外 清除超氧阴离子自由基的活性；此外，该化合物还表现出很强的对抗自由基引起的大鼠肾 上腺嗜铬瘤PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用， 说明其对保护脑细胞组织抗氧化和脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症有积极作用，可以预 期用于制备该类药物的用途。再者，该化合物还对黄嘌呤氧化酶显示一定的抑制作用，可以 预期用于制备治疗由黄嘌呤氧化酶引起的痛风病的药物。
背景技术：
众多研究表明自由基与神经系统疾病如老年性痴呆症(阿兹海莫症，AD)、帕 金森症、脑卒中等密切相关。其原因主要与脑组织代谢特点有关脑组织耗氧量大，脂肪 含量高，而各种抗氧化酶的含量相对于其它组织而言偏少，因而易受自由基攻击造成损伤 (GiIgun-Sherki,Y.等,Antioxidant therapy in acute central nervoussystem injury current state, Pharmacol. Rev.，2002，54，271-284)。因而，目前认为自由基参与了 AD 患者的病理过程。此外，自由基还可引起β淀粉样蛋白沉积，与细胞膜产生反应，导致细 胞内氧化损伤。因此，研发脑中枢神经系统抗氧化剂是治疗老年性痴呆的有效途径之一， 从近期褪黑素(Melatonin)的风靡可略见一斑(Green, K.N.等，Melatonin, aging, and age-related diseases -perspectives for prevention, intervention, and therapy, J. Physiol (Lond)，2002，541 (3) 1013-1023)。因此，寻找新型有效抑制脑细胞氧化损伤的 先导化合物或药物既有巨大的社会效益又有显著的经济效益。近年来，国际医药界持续不断地投入了大量的人力、物力、财力，努力寻找抗氧化 作用显著、具有强效神经细胞保护作用的抗氧化剂先导化合物。目前比较肯定的用于研究 老年性痴呆症(主要是胆碱能神经系统)的体外细胞模型主要有3种原代培养的海马、皮 层、基底前脑神经细胞，PC12细胞和海马HT22细胞株。本试验采用的PC12细胞以其在培 养过程中的易获得性和细胞均一性成为神经科学离体研究中的重要工具细胞，并用于研究 多种神经系统疾病，如老年痴呆症、帕金森病等[王健，陈沙维，调心方对H2O2氧化损伤PC12 细胞的保护作用研究，中华医药杂志，2004年4卷7期；崔旭等，复方益智散对PC12细胞增 值和抗凋亡作用，中华老年心脑血管杂志，2006，8 (3)，198-201 ；徐鹰等，大豆苷元对氧自由 基所致PC12细胞细胞毒作用的影响，中药药理与临床，2007，5期]。此外，现代医学理论证实痛风病的致病因素之一是黄嘌呤氧化酶(EC1. 2. 3. 2，简 称为X0)。此酶是体内核酸代谢的一个重要酶，能催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸和超氧阴 离子，若机体不能及时清除产生的尿酸，使尿酸结晶盐在关节处沉积，就会引起痛风；产生 过多的超氧阴离子也可引起多组织受损，因此测定化合物对XO的作用对发现新的XO抑制 剂和其抗氧化作用有重要意义。从天然产物以及其衍生物中筛选出黄嘌呤氧化酶抑制剂先 导化合物也是开发治疗痛风病新药的重要任务。
槲皮素是药用价值很高的一个天然黄酮醇类化合物，关于其抗氧化作用等药理学 研究可参见综述[王玉强等，槲皮素抗氧化作用研究，齐鲁药事，2006年25卷8期；王艳芳， 王新华等，槲皮素药理作用研究进展，天然产物研究与开发，2003年15卷2期]。然而，槲 皮素二聚体却鲜有人研究。该黄酮二聚体是由Hirose等于1999年报道，其发现槲皮素在 脂质过氧化过程中可以形成二聚体[Hirose等，Chemistry Letters，1999，8，775-776]。该 二聚体结构比槲皮素分子量大几乎一倍，分子中含有更多羟基等活性基团，或许会比槲皮 素具有更强的保护脑神经细胞、抗氧化损伤的能力。至今为止，未见到该槲皮素二聚体应用于研发清除自由基、保护PC12细胞免受氧 化损伤、以及用于制备防治脑神经氧化受损造成的老年性痴呆症之药物的报道；也未见到 该二聚体化合物抑制黄嘌呤氧化酶活性制备防治由黄嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛风病 的药物或药物组合物的报道。因此发明人制备了此二聚体黄酮醇并将其作为保护脑神经细 胞、抗氧化损伤活性先导物测试对象，据此完成本发明。 本发明的目的是提供一种下式所示的槲皮素二聚体黄酮即化合物l，3，lla_三羟 基-9-(3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮-2)-5a-(3,4- 二羟基苯基)-5，6，11-六 氢-5，6，11-三氧-并四苯-12-酮或其可药用盐用于制备一种氧自由基清除剂暨抗氧化剂 药物的用途。 具体而言，本发明的目的之一是提供了式(1)所示结构之槲皮素二聚体黄酮或其 可药用盐用于制备防治由氧自由基引起或与氧自由基有关的老年性痴呆症药物的用途。本发明的另一目的是提供了式(1)所示结构之槲皮素二聚体黄酮或其可药用盐 用于制备防治由黄嘌呤氧化酶引起的痛风病之药物的用途。本发明的又一目的是提供了一种用于防治自由基引起的老年性痴呆症以及由黄 嘌呤氧化酶引起的痛风病药物组合物，其中含有治疗有效量的式(1)所示结构之槲皮素二 聚体黄酮或其可药用盐和药用辅料。本发明还提供了一种制备式(1)所示的槲皮素二聚体黄酮类化合物的方法，其特 征是用市售或者自制的槲皮素在无水条件下，有银盐催化进行自由基偶合反应偶联而得。本发明的槲皮素二聚体黄酮化合物(1)与天然黄酮木脂素类化合物槲皮素相比 较，具有诸多结构和物化性质上差异化的特征，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氢键 受体、电性、分子间范德华力、以及3D构象、伸展方向、分子重心、共轭程度、电性分布中心 等特质均与槲皮素有着明显不同；且化合物(1)分子量比槲皮素增大了 300个质量单位。 上述特征都决定了式(1)所示化合物之三维构象与靶标受体或酶之3D空间结构相结合之 配体-受体结合复合物形态和结合方式都可能产生较大的差别，其结合位点和结合模式、
发明内容其结合自由能等均会产生较大的改变，因而可能在清除自由基、保护PC12细胞免受氧化损 伤、抑制黄嘌呤氧化酶方面有着意想不到的效果。综上所述，本发明涉及一个槲皮素二聚体黄酮的多种抗氧化机制药效学活性及其 用于制备相关疾病药物的用途。经测试发现该化合物具有清除超氧阴离子自由基活性和对 抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，从而可以预期发展成为能于体内清除自由基的药物 或药物组合物，尤其是可以用于制备防治脑神经氧化受损造成的老年性痴呆症之药物。此 外，该化合物还表现出一定的抑制黄嘌呤氧化酶活性，因而还可以预期进一步开发成为治 疗由黄嘌呤氧化酶引起的疾病包括痛风病的药物或药物组合物。本发明的有益之处在于槲皮素二聚体黄酮类衍生物具有强效清除自由基、对抗 自由基引起的PC12细胞损伤和黄嘌呤氧化酶抑制等药效作用，且其活性强于槲皮素，显示 该化合物可以预期应用于制备治疗新的适应症药物，对于开发新的抗老年性痴呆症和痛风 病这两种常见病及多发病创新型药物提供了新的物质基础，具有潜在的社会效益和经济效 益。再一特点是该化合物来源于天然产物的半合成结构改造，制备步骤简便，成本低，污染 小，利于大规模生产。
具体实施例方式为了更好地理解本发明的实质，下面首先用实施例的形式说明化合物制备的过 程，实施例给出了化合物的部分物理和化学及波谱学数据，其中OEt是指乙氧基(OCH2CH3)。 必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质 对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例1 化合物(1)的制备 在干燥的反应瓶中加入343毫克槲皮素(本室自行制备，HPLC检测纯度98%)， 550毫克碳酸银，于氮气保护下加入20毫升干燥过的丙酮和60毫升无水苯溶液，在 55-60°C之间搅拌20小时。混合物静置，滤除不溶物。母液减压浓缩，得黄色固体。以 200 300目硅胶柱层析，以氯仿/甲醇(20 1)洗脱。得黄色固体182mg。Rf (氯仿甲 醇=10 1) = 0. 18 ；红外 IR(KBr 压片)CnT1 :3195，1689，1647，1588，1495 ；核磁共振氢谱 1H NMR (400MHz，氘代丙酮)6.05(双峰，J = 2. OHz, 1H, Η_6' )，6· 10 (双峰，J = 2. OHz, 1Η, Η-8' )，6· 28 (双峰，J = 2. OHz, 1Η, Η_6)，6· 62 (双峰，J = 2. OHz, 1Η, Η_8)，6· 81 (双 峰，J = 8· 4Hz, 1Η, Η-13)，7· 16 (双双峰，J = 2. 4,8. 4Hz, 1Η, Η-14 ' )，7· 29 (双峰，J = 8. OHz, 1Η, Η-13' )，7· 35 (双峰，J = 2. 4Hz, H-IO' )，7· 96 (双峰，J = 2. OHz, 1Η, H-10)， 8. 00(双双峰，J = 2.0，8.8Hz，lH，H-14)；核磁共振碳谱 13C NMR(100MHz，氘代丙酮，Sppm) 91. 4(C-3 ‘ )，94. 6 (C-8)，97. 3 (C-8 ‘ )，98.0(C_6 ‘ )，99. 3 (C—6)，100. 9 (C—4 ‘ a)，101. 6(C-2' )，104. 2(c-4a)，115. 4(C-9' )，116. 5 (C_14' )，117. 7 (C—10)，118. 2 (C—13)， 121. KC-10 ‘ )，123. 4(C-14)，126. 2(C-9 ‘ )，126. 9 (C—13)，137. 6 (C—3)，141. 8 (C—11)， 143. 0(C-12)，145. 4(C-2，C-Il ‘ )，147.6(C_12 ‘ )，157. 8 (C_8a)，160. 7 (C—8 ‘ a)， 162. 3(C-4a)，165. 1(C-5 ‘ )，165. 2(C-7)，169.2 (C-7 ‘ )，176. 7(C-4)，189. 0(C-4 ‘)；电 喷雾质谱 ESI-MS :m/z 603[M+H] + (100)。式(1)化合物具有多种重要的生物活性，本发明通过多种药效学试验模型对该化 合物抗氧自由基活性进行了测试，发现其具有确切的体外清除超氧阴离子自由基的活性。 此外，该类化合物还表现出很强的对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用，即对模拟脑神经 细胞的大鼠肾上嗜铬细胞瘤PC12细胞有抗氧化损伤保护作用。说明其对保护脑神经抗氧 化、防治老年性痴呆症有积极作用，可以用于制备保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症药 物的用途。此外，该化合物还被发现具有强效抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用，因而可以预期 作为治疗痛风类疾病的药物。本发明的式(1)化合物或其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备 用于治疗自由基引起的老年性痴呆症之药物或药物组合物。上述药物或药物组合物可以采 用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型。本发明的式(1)化合物或其可药用盐还可以与现已上市的抗自由基氧化剂药物 如超氧化物歧化酶(SOD)等联合使用，制备得到具有防御自由基引起的损害活性的抗氧化 药物组合物，用于治疗上述疾病。其也可与其他保护脑神经抗氧化、防治老年性痴呆症之药 物联合使用，得到抗老年性痴呆药物组合物。上述药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊 剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型。本发明的式(1)化合物或其可药用盐还可以与现已上市的治疗痛风病药物如黄 嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇等联合使用，制备得到具有治疗痛风病的药物组合物，用于痛风 病的临床治疗。上述各类药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴 丸剂、外用搽剂等剂型。本发明中所述剂型如片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂和外用搽 剂以及其各种缓释、控释剂型或纳米制剂都可以根据现已公认的药剂学常识经由常规制备 而得，在这些公知知识和技术基础上制备出的含有本发明权利要求化合物或其可药用盐的 药物或药物组合物之其他剂型都在本发明的保护范围内。为了更好地理解本发明的实质，下面分别用药理相关实施例的形式列举式(1)化 合物对超氧阴离子自由基抑制作用试验、对双氧水H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用试验 以及对黄嘌呤氧化酶XO的抑制作用试验之结果，说明其在制药领域中的用途以及用于制 备相关抗氧化剂药物的根据。药理相关实施例给出了化合物的部分活性数据。同样必须说 明，本发明列举的这些实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实 质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例2 式⑴化合物体外清除超氧阴离子自由基的活性试验2. 1实验材料与样品2. 1. 1实验试剂2. 1. 1. 1 吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate, PMS)、硝基四氮唑兰 (nitroblue tetrazolium, NBT)、菲口各嗪(ferrozine)购自 Sigma 公司；
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2. 1. 1. 2槲皮素(quercetin)由浙江大学药学院中药与天然药物研究室实验室提 供(纯度为99% )；2. 1. 1. 3Tris 碱，DMEM 培养基购自 Gibco 公司；2. 1. 1. 43- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-dipheny 11etrazo 1 ium bromide (MTT)和NADH (还原型辅酶I)购自Amresco公司；2. 1. 1.5其它试剂均为国产分析纯试剂，购自杭州华东医药试剂有限公司。2. 1. 2 仪器2. 1. 2. 1 酶标仪=Synergy-HT 型，BIO-TEK 公司；2. 1. 2. 2立式自动电热压力蒸汽灭菌器LDZX_40BI型，上海申安医疗器材厂；2. 1. 2. 3紫外分光光度计UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；2. 1. 2. 4超纯水系统UPWS-I_60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；2. 1. 2. 5 除菌过滤器:Sterifil500 型，Millipore 公司；2. 1. 2. 6气浴恒温振荡器THZ_C，江苏省金坛市医疗仪器厂。2. 2实验方法2.2.1式(1)化合物清除超氧阴离子自由基能力的检测乃使用吩嗪-N甲硫酸 4k-NADH(phenazine methosulfate-NADH) ΜΜ,^Β^ΜΜ. (nitroblue tetrazolium) 原方法检定。2. 2. 2用3毫升含有78 μ M的NADH、50 μ M四唑氮蓝和10 μ M吩嗪-N甲硫酸盐在 PH值为8.0的16mM Tris-HCl缓冲液中产生出超氧阴离子自由基，对不同浓度的式(1)化 合物检测其活性。超氧阴离子自由基和四唑氮蓝反应生成物的颜色用分光光度计在560nm 波长下监测，槲皮素被用作阳性对照药物。2. 3实验结果试验结果见表一。表一 2.4结论试验结果表明，式(1)化合物具有相当强效的超氧阴离子自由基清除作 用，在同一浓度下，其清除能力甚至高于槲皮素11%。结论该槲皮素二聚体属于具有相当 强效的清除超氧阴离子自由基的抗氧化物质，可预期进一步发展成为强效抗氧化损伤、抗 老年痴呆药物。实施例3 式(1)化合物对双氧水H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用活性试验3. 1实验材料与样品3. 1. 1细胞大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)购自中科院上海细胞所。3. 1.2实验试剂:3·1·2·1 双氧水(hydrogen peroxide，H2O2)、硝基四氮唑兰(nitrobluetetrazolium, NBT)、菲口各嗪(ferrozine)购自 Sigma 公司；3. 1. 2. 2槲皮素(quercetin)由浙江大学药学院中药与天然药物研究室实验室提 供(纯度为99% )；3. 1. 2. 3Tris 碱，DMEM 培养基购自 Gibco 公司；3. 1. 2. 43- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-dipheny 11etrazo 1 ium bromide (MTT)购自 Amresco 公司；3. 1. 2. 5小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；3. 1. 2. 6青霉素和链霉素由石家庄制药集团有限公司生产；3. 1. 2. 7其它试剂均为国产分析纯，购自杭州华东医药试剂有限公司。3. 1. 3 仪器3. 1. 3. 1 酶标仪=Synergy-HT 型，BIO-TEK 公司；3. 1. 3. 2立式自动电热压力蒸汽灭菌器LDZX_40BI型，上海申安医疗器材厂；3. 1. 3. 3紫外分光光度计UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；3. 1. 3. 4超纯水系统UPWS-I_60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；3. 1. 3. 5 除菌过滤器:Sterifil500 型，Millipore 公司；3. 1. 3. 6气浴恒温振荡器THZ_C，江苏省金坛市医疗仪器厂；3. 1. 3. ICO2细胞培养箱MMM，德国公司；3. 1. 3. 8倒置显微镜XD_2型，重庆光电仪器有限公司。3. 2实验原理=H2O2是一种主要的活性自由基的前体，它可引起中枢神经系统细胞 的凋亡，PC12细胞(大鼠肾上嗜铬细胞瘤)可模拟脑神经细胞，因此常用它来作为研究药 物与神经细胞之间关系的模型，用MTT测细胞的存活率，如果待测化合物有清除由H2O2引起 的自由基、保护神经细胞的作用，则其细胞存活率高，OD值就高；反之就低。本发明采用对 唐希灿所报道的方法(Xiaoqiu Xiao等，NeurosciLetter，1999，275 :73_76)并对之加以改 进，用以测定化合物对PC12细胞的抗氧化损伤保护作用。3. 3细胞培养PC12细胞用含10%小牛血清，IOOU/毫升青霉素和100微克/毫升 链霉素的DMEM培养基培养，于37°C、5% CO2细胞培养箱中孵育，常规方法传代培养。3. 4实验方法3. 4. 1细胞毒性的测定首先用改良的MTT法测定了待测化合物对PC12细胞增殖 的作用。PC12细胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集细胞，计数，用含10%小牛血清的DMEM 培养基稀释至8000个/毫升的密度，然后接种于96孔细胞板中，细胞培养箱中继续培养， 24小时后，分别将新配的待测的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物的 最终浓度分别为16、8和4微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT (5毫克/毫升)的生 理盐水溶液，继续在37°C，5% CO2潮湿空气的培养箱中培养3小时，弃去原液，每孔中加入 150微升二甲亚砜，振荡溶解生成的MTT晶体甲臜，用酶标仪在570nm波长下比色，细胞生长 抑制率计算公式如下%细胞生长抑制率=(0D溶剂对照-OD样品)/OD溶剂对照X 100%。3. 4. 2式(1)化合物对H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用的测定PC12细胞用 DMEM培养基培养，培养基中含10%牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素。细胞 以每孔8000个的密度加到96孔板中，在37°C，50% CO2潮湿空气的培养箱中培养36小时。
8用倒置显微镜观察细胞的形态变化以及用MTT法测定细胞的存活率。细胞经36小时的孵 育后，分别将新配的式(1)化合物的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中。作用2小时 后加入新配的H2O2 (终浓度为600 μ Μ)作用3小时，显微镜观察记录，弃去原培养液，加入新 的培养液100微升，然后加入MTT 10微升，3小时后，小心吸去培养液，加入150微升DMSO 溶解甲臜，于570nm处读数。采用槲皮素为阳性对照药物。3.4.3试验结果见表二。表二式(1)化合物及对照品对双氧水损伤PC12细胞保护作用 3. 5结论试验结果表明，式⑴化合物具有较强的对抗自由基引起的PC12细胞 损伤作用，即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有明确的抗氧化损伤保护作用。而且在同一浓 度下，其保护PC12细胞免受自由基损伤能力大大强于阳性对照槲皮素，是相同测试浓度下 槲皮素对PC12细胞保护能力的2.1倍。实属罕见的强效保护PC12细胞活性化合物。说明 该槲皮素二聚体黄酮醇属于具有极其强效保护模拟脑神经细胞的PC12细胞作用的抗氧化 物质。测定化合物对H2O2所致PC12细胞损伤的保护作用可作为初步探讨其保护中枢脑 神经细胞的作用机理之依据。故据该化合物表现出对双氧水损伤所致PC12细胞的强效保 护作用，可以预期其对老年性痴呆症的治疗有非常积极的作用，有望进一步开发成抗氧化 损伤、防治老年性痴呆的先导化合物。实施例4 式(1)化合物对黄嘌呤氧化酶XO的抑制作用试验4. 1实验材料与样品4. 1. 1试验动物SD(Sprague-daWley)大鼠于浙江大学实验动物中心购得。合格 证号SCXK (浙 2007-0029)。4. 1. 2实验试剂4. 1. 2. 1 吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate, PMS)、硝基四氮唑兰 (nitroblue tetrazolium，NBT)、黄嘌呤、菲咯嗪(ferrozine)购自 Sigma 公司；4. 1. 2. 2Triton X-100 购自 Gibco 公司；
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4. 1. 2. 3阳性对照药物别嘌醇，泰州美通药业有限公司；4. 1. 2. 4磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其它试剂均为国产分析纯(杭州华东试剂公 司)。4. 1. 3 仪器4. 1. 3. 1 酶标仪=Synergy-HT 型，BIO-TEK 公司；4. 1. 3. 2立式自动电热压力蒸汽灭菌器LDZX_40BI型，上海申安医疗器材厂；4. 1. 3. 3紫外分光光度计UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；4. 1. 3. 4超纯水系统UPWS-I_60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；4. 1. 3. 5 除菌过滤器:Sterifil500 型，Millipore 公司；4. 1. 3. 6气浴恒温振荡器THZ_C，江苏省金坛市医疗仪器厂；4. 1.3. 7玻璃勻浆器国产。4. 2实验方法4. 2. 1取SD大鼠，断头处死，迅速取出肝脏至预冷的磷酸缓冲液(100mM，pH 8. 75) 中，去除血管，剪碎后用磷酸缓冲液1 l(w/v)稀释后在冰上直接勻浆，于-20°C保存，用前 用磷酸缓冲液(1 7)稀释，4°C条件下离心(8000rpm/10分钟)，取上清作为酶原。4.2.2 化合物对XO的抑制作用测定采用酶联免疫ELISA法样品孔中加入底物黄嘌呤(0. 1毫克 /毫升，600微升)，酶(30微升)，化合物1,3,11a-三羟基-9- (3,5,7-三羟基—4H-1-苯 并吡喃-4-酮-2)-5a-(3，4-二羟基苯基)-5，5a，6，11，Ila-六氢-5，6，11-三氧-并四 苯-12-酮用二甲亚砜溶解，用磷酸缓冲液稀释，每孔30微升，使其终浓度为40微克/毫升、 20微克/毫升和10微克/毫升，加入硝基兰四氮唑和吩嗪甲硫酸酯(30微升)，最后加入 Triton X-100 (0. 4%,10微升)，在37°C中水浴保温2小时，于550nm波长下比色测定。化 合物对黄嘌呤氧化酶抑制率由样品OD值对于空白和对照OD值计算。黄嘌呤氧化酶抑制率
(% ) = [(OD 标准管_0D空白管)_(〇D样品管_0D样品空白管)]/(0D标准管_0D空白管)X 100%。4. 3实验结果式(1)化合物对黄嘌呤氧化酶抑制率见表三。表三式(1)化合物及对照品对黄嘌呤氧化酶抑制作用 4. 4 结论:阳性对照药物别嘌醇对黄嘌呤氧化酶显示出极高的抑制活性。式(1)化合物在 各个浓度都没有别嘌醇得抑制活性高。但是令人欣喜的是在高浓度和低测试浓度时式 (1)化合物都显示出比槲皮素高效的抑制黄嘌呤氧化酶的活性，其在高浓度时的抑制活性 (85.7%)已经接近于相同浓度下别嘌醇的抑制活性(89.2%)；属于及其强效的黄嘌呤氧 化酶抑制剂，且其抑制活性呈显著的量效关系。说明该槲皮素二聚体黄酮醇类化合物具有 进一步发展成为疗效确切的黄嘌呤酶抑制剂的潜能。在上述说明书阐述本发明时，提供药理相关实施例的目的是举例说明本发明的实 际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际 应用包括所有一般变化、配合，或改进。
权利要求
式(1)所示的槲皮素二聚体黄酮或其可药用盐在制备防治老年性痴呆症药物中的应用。FSA00000134424900011.tif
2.式(I)所示的槲皮素二聚体黄酮或其可药用盐在制备防治痛风病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及槲皮素二聚体黄酮用于制备抗氧化药物的用途，具体涉及一个槲皮素二聚体黄酮类化合物用于制备防治老年性痴呆症或痛风病药物的用途。药效学试验证实该化合物具有强效清除超氧阴离子自由基、对抗自由基引起的PC12细胞损伤作用即对模拟脑神经细胞的PC12细胞有抗氧化损伤保护作用，从而可以预期发展成为保护脑神经、防治由自由基损伤引起的老年性痴呆症的药物。该化合物还具有高效抑制黄嘌呤氧化酶的活性，因而可以预期其发展成为治疗痛风病的药物。
文档编号A61P19/06GK101912386SQ201010181800
公开日2010年12月15日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者宋丽艳, 巫秀美, 李海波, 白丽, 谭仁祥, 赵昱, 陈绍媛, 雷婷 申请人:大理学院
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