增进骨生长与抑制骨再吸收的方法
专利名称：增进骨生长与抑制骨再吸收的方法
相关申请本申请要求在2003年9月3日提出的美国临时申请号60/499,696的优先权，其内容结合于此作为参考。
背景本发明涉及增进骨生长与抑制骨再吸收的方法，更特别地，本发明涉及以稠合吡唑基化合物增进骨生长与抑制骨再吸收的方法。
现有技术骨胳是一种复杂组织，其持续性地进行更新与修复，即是所谓的“骨重塑作用(bone remodeling)”。负责骨重塑作用的两种主要细胞种类为破骨细胞以及成骨细胞，前者再吸收骨，后者形成新骨。骨重塑作用是由数种全身性激素(例如副甲状腺激素，1，25-二羟基维生素D3，性激素及降钙素)，以及局部因子(例如一氧化氮，前列腺素，生长因子及细胞因子)所调节。当骨的再吸收与形成不协调，且骨分解超过骨重建，就会造成骨质疏松症。骨质疏松症也可能由其它病症造成，例如，激素失调，疾病，或药物作用(例如皮质类固醇或抗癫痫剂)。
能调节骨重塑过程的化合物，不论是抑制骨再吸收或刺激骨形成，都具有增进骨生长的潜能，而可以用于治疗骨质疏松症。
发明内容
本发明基于以下出乎意料的发现一种稠合吡唑基化合物可抑制骨再吸收和增进骨生长。
本发明的一方面涉及一种增进骨生长或抑制骨再吸收的方法。上述方法包括向需要其的受试者施用有效量的下式的稠合吡唑基化合物
其中A为H，R，或 (之后称为“(CH2)nAr3(R5)(R6)”)；Ar1、Ar2、Ar3各自独立地为苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自独立地为H，卤素，R，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR’，ROH，ROR’，RSH，RSR’，NHR，NRR’，RNHR’，或RNR’R”；或R1与R2一起，R3与R4一起，或R5与R6一起为ORO；其中R，R’，R”各自独立地为C1～C6烷基；以及n为1、2、或3。
参考上式，式(I)化合物的一个子集其特征在于A是(CH2)nAr3(R5)(R6)。在一个实施方案中，Ar1为苯基，且R1与R2分别在苯基的4与5位上取代。在另一个实施方案中，Ar2为5’-呋喃基，且R3与R4之一在5’-呋喃基的2位上取代。在还有另外的实施方案中，Ar3为苯基且n为1。
上述化合物的另一子集其特征在于A为H。在一个实施方案中，Ar1为苯基，且R1与R2分别在苯基的4与5位上取代。在另一个实施方案中，Ar2为5’-呋喃基，且R3与R4之一在5’-呋喃基的2位上取代。
上述化合物的另一子集其特征在于Ar1为苯基或Ar2为5’-呋喃基。
术语“烷基”是指直链或支链烃，包括1-10个碳原子。烷基的实例包括但不限于，甲基，亚甲基，乙基，亚乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，及叔丁基。烷基可被任选地取代。取代基的实例包括但不限于，卤素，羟基，氨基，氰基，硝基，巯基，烷氧羰基，酰氨基，羧基(carboxy)，烷磺酰基，烷羰基，脲基，氨基甲酰基，羧基(carboxyl)，硫脲基，硫代氰酸根合，亚磺酰氨基，链烯基，炔基，烷氧基，芳基，杂芳基，环基，和杂环基，其中链烯基，炔基，烷氧基，芳基，杂芳基，环基，及杂环基可以再被取代。
上述稠合吡唑基化合物包括，如果适用，其盐及其前药。其盐，例如，可由稠合吡唑基化合物上带负电的取代基(如羧酸盐)与阳离子形成。适当的阳离子包括但不限于，钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，及铵离子如四甲基铵离子。类似地，带正电子的取代基(如氨基)可与带负电的抗衡离子形成盐。适当的抗衡离子包括但不限于，氯化物，溴化物，碘化物，硫酸盐，硝酸盐，磷酸盐，或醋酸盐。前药的实例包括酯和其它药学上可接受的衍生物，当将其施用于受试者时，可提供上述稠合吡唑基化合物。
本发明的另一方面涉及一种治疗骨质疏松症的方法。上述方法包括向需要其的受试者施用有效量的上述稠合吡唑基化合物。
以下所列为可用于实施本发明方法的稠合吡唑化合物的实例 吲唑1本发明范围也包括上述化合物在制备增进骨生长，抑制骨再吸收或治疗骨质疏松症的药物中的应用。
本发明的多种实施方案将详述于以下。本发明的其它特征、目的，及优点将经由以下的详细说明与权利要求中而更为明显。
发明详述用于实施本发明方法的稠合吡唑基化合物可以由本领域普通技术人员所熟知的方法制备(参见例如美国专利第5,574,168号)。它们包括以下合成路径首先将芳香基酮经由偶合芳香羰基氯化物与另一芳族化合物而制备。其中任一芳族化合物为任选地单或多取代。上述酮接着与芳基烷基肼反应，其中的芳基亦为任选地单或多取代，以形成含有三个芳基的腙。上述腙基团经由链烯烃接头转化为稠合吡唑核心化合物，另一芳香基稠合至吡唑核心的4-C与5-C，且第三芳基直接连接到吡唑核心的3-C。稠合吡唑基化合物的衍生物可经由修饰芳基的任何取代基而得到。
用于上述合成路径的化合物包括，例如溶剂，反应剂，催化剂，保护基及去保护基反应剂。上述方法可附加地包括其它步骤，不论是在上述特定步骤之前或之后，以增加或除去适当保护基团，而得以完成稠合吡唑化合物的合成。此外，也可以采用替换顺序进行各种合成步骤，以得到所需化合物。用于合成可应用的稠合吡唑化合物的合成化学转化与保护基团方法学(保护与去保护)是本领域所熟知的，并且包括，例如R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene及P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2d.Ed.JohnWiley and Sons(1991)；L.Fieser及M.Fieser，Fieser and Fieser’s Reagentsfor Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)；及L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其后续版本所叙。
如此合成的稠合吡唑化合物可以经由例如柱层析法，高压液相层析，或再结晶法进一步纯化。
本发明的一方面提供一种增进骨生长或抑制骨再吸收的方法。因此，上述方法包括但不限于，治疗骨质疏松症，骨折，身材矮小症，关节固定失败，软骨发育障碍(dyschondroplasia)，软骨发育不全(achondroplasia)，或先天性假关节。“骨质疏松症”的实例包括但不限于，经绝期后骨质疏松症，老年骨质疏松症，原发性骨质疏松症，皮质类固醇引发的骨质疏松症，肾衰竭，高副甲状腺机能症，维生素D缺乏相关的骨质疏松症，以及长期不动(immobilization)。“骨折”的实例包括但不限于，不愈合，延迟愈合，以及病理性骨折。上述方法包括向需要其的受试者施用有效量的一种或多种稠合吡唑化合物以及药用载体。如此处所述，术语“治疗”是指治愈，恢复，减轻，缓和，改变，补救，改善，或预防与不适当骨生长相关的疾病，如骨质疏松症。“有效量”定义为稠合吡唑基化合物的量，在施用于所需受试者后，其足以赋予该受试者治疗效果。有效量可以改变，如本领域技术人员所认可，依照给药途径，赋形剂的使用，及可能共同使用于增进骨生长，或治疗骨质疏松症的其它药剂而异。
为实施本发明的方法，可以将含有稠合吡唑基化合物与药用载体的组合物经由口服，非胃肠道途径，吸入式喷雾，或经由植入式储囊而施用。术语“非胃肠道途径”，如此处所述，包括皮下，皮内，静脉内，肌内，关节内，动脉内，滑液内，胸骨内，鞘内，伤口内及颅内注射，或输注技术。
口服给药的组合物可以为任何口服可接受的剂型，其包括但不限于，胶囊，片剂，乳剂及水混悬剂，分散剂及溶液。口服使用的片剂中，常用的载体包括乳糖与玉米淀粉。润滑剂，如硬脂酸镁，也典型地添加。口服使用的胶囊中，有用的稀释剂包括乳糖与干玉米淀粉。当以水混悬剂或分散剂形式口服给药时，活性成分可以悬浮于或溶解于油相，并结合乳化或悬浮剂。若有需要，某些甜味剂，调味剂，或着色剂亦可添加。吸入式组合物可以依药学配方技术领域所熟知的技术制备，而可制备为盐水溶液，采用苯甲基醇或其它适当防腐剂，增强生物利用度的吸收促进剂，甲醛，和/或其它本领域所熟知的溶解或分散剂。
无菌注射组合物，例如，无菌注射水溶性或油状混悬剂，可以依照本领域所熟知的技术，采用适当分散或湿润剂(如吐温80)以及悬浮剂配制。无菌注射制剂也可以为无菌注射液或混悬剂，其在无毒、非胃肠道可接受稀释剂或溶剂中，例如，溶于1，3-丁二醇的溶液。在可接受载体与溶剂中，可采用甘露醇，水，林格氏液及等渗氯化钠溶液。此外，无菌、固定油也常规用作溶剂或混悬介质(如合成单或双甘油脂)。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物用于注射剂的制备，其为天然药用油，如橄榄油或蓖麻油，特别是其多氧乙烷化物。这些油溶液或混悬剂也可以包含长链醇稀释剂或分散剂，或羧酸甲基纤维素或类似的分散剂。
药学组合物的载体必须是“可接受的”，也就是与制剂中的活性成分可相容(优选地，能够使它稳定)，且不会对治疗的受试者有害。例如，加溶剂如环糊精，可与稠合吡唑基化合物形成特异性的，更可溶性的复合物，或一种或多种加溶剂，可以用作药物赋形剂以传递稠合吡唑基化合物。其它载体的实例包括胶状二氧化硅，硬脂酸镁，纤维素，十二烷基硫酸钠，及D&C黄色10号。
适当的体外试验可以用于预先评估稠合吡唑基化合物增加骨小结形成的能力。体内筛选也可以经由本领域所熟知的以下步骤进行。参考以下具体实施例。
不需详加阐述，相信上述说明已提供本发明实施的适当说明。因此，以下特定实施例仅是用于说明本发明，并非用以限制限定本发明的范围。所有此处所引用的出版物，包括专利，皆以其完整内容并入本案作为参考。
化学合成首先制备硼氢化钙，其经由于无水THF(20mL)中搅拌无水氯化钙(88.8mg，0.8mmole)与硼氢化钠(60mg，1.6mmole)4小时。将30mL含有88.0mg的1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)-吲唑(0.27mmole)的THF溶液，于30±2℃滴入上述硼氢化钙溶液。将混合物于回流下加热6小时，冷却，淬灭至碎冰中，置于减压状态以除去THF，并过滤以得到固体产物。上述固体再以二氯甲烷萃取。将上述萃取物浓缩至50mL，加入石油醚后沉淀出固体。收集此沉淀物并以柱层析(硅胶-苯)纯化以得到70.0mg的1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-吲唑，产率87％。以下称此化合物为“吲唑1”。
熔点108-109℃MS(％)，m/z304(M+)IR(KBr)λmax3350cm-1(-OH)1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ4.51(2H，d，J＝5.5Hz，-CH2O-)，5.31(1H，t，J＝5.5Hz，-OH)，5.70(2H，s，＝NCH2-)，6.48(1H，d，J＝3.4Hz，H-4’)，6.97(1H，d，J＝3.4Hz，H-3’)，7.21-7.31(6H，m，H-5，苯基)，7.45(1H，t，J＝8.2Hz，H-6)，7.75(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，H-7)，8.12(1H，dd，J＝8.2.1.0Hz.C4-H)。
生物试验方法原代破骨细胞培养由18日龄胎儿Sprague-Dawley(简称SD)种大鼠的颅顶制备原代破骨细胞，依照以下方法采用腹膜内注射三氯乙醛(200mg/kg)麻醉怀孕的大鼠。接着以无菌操作剖开大鼠胎儿的颅顶。于解剖显微镜下除去软组织。将颅顶分成小碎片并以0.1％胶原蛋白酶(SigmaChemical，St.Louis，MO)溶液于37℃下处理10分钟。收集经两次20分钟连续胶原蛋白酶消化处理而由颅顶释出的细胞，并经过70μm尼龙过滤器(Falcon，BD BioSciences，San Jose，CA)过滤。再使细胞于塑料细胞培养皿，在95∶5的空气-二氧化碳下，补加20mM HEPES与10％热失活的FCS，2mM-谷氨酰胺，青霉素(100U/ml)与链霉素(100μg/ml)(将pH调整至7.6)的度别克氏修正过的伊葛氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，简称DMEM)(Gibco，Grand Island，NY)培养。一周换两次细胞培养基。以形态学与碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)的表达确认破骨细胞。为检验破骨细胞的成熟度，将细胞于含有抗坏血酸(50μg/ml)(SigmaChemical，St.Louis，MO)与β-甘油磷酸(10mM)(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的生长培养液培养14天，并每3天换一次培养基。
碱性磷酸酶活性的试验将细胞培养于存有或不存在吲唑1的6孔平板中，再于1ml的0.2％Nonidet P-40中收集，使细胞悬浮液经超声波处理破碎。于1500g离心5分钟后，以Lowry等(1954)J Biol Chem 20719-37的方法测量上清液中的ALP活性。
von Kossa染色将破骨细胞培养于含有50μg/ml的维生素C与10mMβ-甘油磷酸的DMEM中2周，且每3天换一次培养基。为检验骨小结的形成，将细胞以4％多聚甲醛固定10分钟，水清洗后，以1％硝酸银染色，置于紫外光下30分钟，再以水清洗后，才以5％硫代硫酸钠处理2分钟。将细胞以水清洗两次，并以1％Safranin-O对染以便显现基质。于光学显微镜下计数每孔的骨小结形成的数目。经由测量培养的破骨细胞中4-羟脯氨酸含量确认胶原蛋白的合成。将细胞培养于含有50μg/ml的维生素C与10mM β-甘油磷酸的DMEM中2周后，再于116℃下以6N HCl水解16小时。冷冻干燥并于蒸馏水重建溶胞产物后，于550nm的分光光度测定法测定4-羟脯氨酸的含量，如Berg(1982)的Meth Enzymol.82372-398所述。
细胞增殖试验将破骨细胞(2×104细胞/孔)接种于24-孔平板(Costar，Cambridge，MA)。细胞在加入吲唑1前先培养于无血清培养基中24小时。于吲唑1下温育24小时后，加入BrdU成为10μM再温育24小时。BrdU的掺入是依照酶联免疫吸附测定化学发光检测试剂盒(Roche MolecularBiochemicals)的步骤进行测试，并采用发光计数器(TopCount；PackardInstruments，Meriden，CT)。每秒计数量直接与DNA合成量相关，由此而推知增生的细胞量。
破骨细胞生成(Osteoclastogenesis)骨髓细胞的制备是经由取得6-8周龄SD大鼠的股骨，并以含有20mM HEPES与10％热失活的FCS，2mM-谷氨酰胺，青霉素(100U/ml)及链霉素(100μg/ml)的DMEM冲洗骨髓腔。24小时后，收集未粘附的细胞(造血细胞)作为破骨细胞前体。将细胞接种于24孔平板成为1×106细胞/孔(0.5ml)，并同时存在人类重组可溶性RANKL(50ng/ml，Peprotech EC Ltd.，London，United Kingdom)以及鼠类M-CSF(20ng/ml，Genzyme，Cambridge，MA)。每3天换一次培养基。在8-10天后，以抗酒石酸盐酸磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，简称TRAP)试验(Kotake等人，1999)确认破骨细胞形成。简言的，附着的细胞以溶于磷酸盐缓冲盐水的10％甲醛固定3分钟。在以乙醇/丙酮(50∶50v/v)处理1分钟后，使细胞表面风干并于室温下温育于含有0.01％萘酚AS-MX磷酸盐(Sigma)与0.03％快红紫LB盐(fast red violet LB salt)(Sigma)的醋酸缓冲液(0.1M醋酸钠，pH5.0)，50mM酒石酸钠存在下10分钟。每孔的类破骨细胞TRAP阳性细胞是经由计算TRAP阳性与含有超过三个核的多核细胞数目而评分。
破骨细胞的骨再吸收试验破骨细胞前体由如上述的大鼠长骨分离。将细胞重新悬浮于完全DMEM培养基中，并接种至以磷酸钙磷灰石包被的24孔平板，OAAS(Oscotec，OCT USA Inc.)，细胞浓度为1×106细胞/0.5ml/孔。细胞培养于M-CSF(20ng/ml)加sRANKL(50ng/ml)存在下5天。在M-CSF与sRANKL不存在下另三天每天注入吲唑1。于第8天终止培养，孔中留下的细胞以1N NaOH裂解。采用倒置显微镜(200×)获得每孔5个影像，并采用影像分析仪测量吸收区域。
局部注射采用雄性SD大鼠，体重介于70-88gm。以戊巴比妥麻醉大鼠的两肢，由后侧方埋入套管(22G)至近端胫骨干骨后端。套管的外端在皮下组织。吲唑1经皮注射，由套管注入近端胫骨一天一次，连续一周。同样浓度的生理盐水稀释过的DMSO也注入右侧作为对照。在第14天，牺牲大鼠并以10％甲醛于4℃下固定48小时。
骨组织形态学分析在甲醛固定胫股完成后，将胫骨于0.5N盐酸中去钙，以浓度升高系列乙醇溶液与丙酮进行脱水，并包埋于石腊中。系列切片(5μm)是于长轴方向切割，并以玫尔氏苏木精-伊红溶液(Yang等(1993)Calcif Tissue Int 5257-61)染色。生长盘与近端胫股的影像是采用照相微图数字化插入系统(PhotoMicroGraphic Digitize integrate System，简称MGDS；Total-Integra Technology Co.，Ltd.，台北，台湾)。在整个次级松质上进行骨体积测量，其位于初级松质下并且特征在于较大的小梁。骨体积是采用影像分析软件计算。所有测量皆以单盲方式进行。
卵巢切除术与坐骨神经切除于成年雌性与雄性大鼠(三月龄)分别进行卵巢切除术与坐骨神经切除。手术后，每天对大鼠注射吲唑1(腹腔注射，1mg/kg)或载体共4周。最后注射的后一天，牺牲大鼠并移除其胫骨与股骨。
胫骨与股骨的制备在实验结束时，以断头术牺牲大鼠。移除胫骨，清洗软组织，并以精确卡尺(±0.05mm)量测胫骨长度，如Weinreb等(1991)J Bone Miner Res 6725-731所述。胫骨以10％甲醛于4℃下固定48小时，以便进行骨组织形态学分析。移除胫骨与股骨的部分并保存于-20℃以便进行矿物质分析。
骨矿物质密度(bone mineral density，简称BMD)与含量(简称BMC)的分析胫骨与股骨的BMD与BMC是以双能量X射线吸收仪(DEXA，XR-26；Norland，Fort Atkinson，WI)测量。采用适用于小个体的测量的形式。0.7％的变异系数是由每日测量腰部人体模型(phantom)的BMD，超过1年所计算得(Yang等人(1998)Calcif Tissue Int 6386-90)。进行骨矿物质分析前，将胫骨与股骨融解至室温。扫描整个胫骨与股骨，并以吸收仪测量BMD与BMC。
生物力学三点弯曲试验骨组织的力学特性是经由三点弯曲试验测量，采用MTS-858试验机(MTS System Inc.，Minneapolis，MN)。两支持点的跨度为20毫米且变形率为1mm/分钟。负重/变形曲线是由Team 490软件(第4.10版，Nicolet Instrument Technologies Inc.，Madison，WI)获得。采用SigmaPlot 6.0软件(SPSS Inc.，Chicago，IL)以计算骨样品的外在材料特性，包括最大负重，极限负重，最大负重的能量，极限负重的能量，及线性强直(Linearstiffness)。最大负重的能量与极限负重的能量是由负重/变形曲线下区域计算。强直是由负重/变形曲线的线性部分的斜率计算。惰性剖面距是假设剖面为椭圆形下计算(Turner等，The effect of fluoridated water on bone strength.Orthop Res(1992)10581-587)。
最大压力，极限压力，及弹性系数(杨氏系数)是采用Turner等人Basicbiomechanical measurements of bonea tutorial，Bone(1993)14595-608所述的方法计算。
结果骨生长将雄性年轻大鼠(SD)，体重介于70-90gm，分为六组。每组大鼠平均体重为73.9±1.1gm。将吲唑1溶解于DMSO并以生理盐水稀释至最终浓度为10μM。六组之一为对照组，而其它组分为仅植入套管针，采用套管针注射载体(第1天，一次)，注射吲唑1(第1天，一次)，采用套管针注射载体(第1-7天，每天)，以及注射吲唑1(第1-7天，每天)。在14天后牺牲大鼠，仅植入套管针(22G)或采用套管针注射载体并不影响骨体积。然而，大鼠注射吲唑1(0.1nmole)7天再喂饲7天后会显著地增加次级骨松质的体积。局部注射吲唑17天后，次级骨松质的骨小梁增加至90％。胫骨长度并未显著地受局部注射吲唑1影响(胫骨长度对照组为3.31±0.01cm，而吲唑1处理组为3.32±0.02cm，n＝9)。
雄性年轻大鼠仅注射吲唑1，或注射吲唑1与NG-硝基-L-精氨酸-甲酯(L-NAME，0.6nmole/天)，NO合成酶(NOS)抑制剂。对照于仅注射吲唑1者，同时给予吲唑1与L-NAME显著地减弱吲唑1对于次级骨松质中骨形成的增进作用。
骨损失的预防作用卵巢切除术(简称OVX)是于成年雌性大鼠进行(＝28)。在卵巢切除术后，卵巢切除的大鼠(n＝16)中的一组注射吲唑1(腹腔注射，1mg/kg/天)，其它组(n＝12)未注射。15只未进行卵巢切除术的成年雌性大鼠作为伪处理(sham-operated)对照组，且并未注射吲唑1。卵巢切除术并未显著地影响胫骨与股骨的长度，但减低两者的骨矿物质密度(BMD)与含量(BMC)。参见以下的表1。意外地，每日注射吲唑1可保护胫骨与股骨免于发生卵巢切除术诱发BMD与BMC损失。与伪处理组比较，卵巢切除术会造成胫骨次级骨松质的骨小梁的减少。在卵巢切除术后，可在4周观察到60％的骨体积减少。另一方面，每日注射吲唑1(1mg/kg)连续4周会减低骨小梁损失的情形。骨体积达到伪处理对照组的76％。
表1吲唑1对于骨矿物质密度与含量的效果
吲唑1是于成年雌性大鼠卵巢切除术的次日，经由腹腔注射(1mg/kg)每日施用连续1个月。对照组是施用载体(3％DMSO，0.3ml)。
ap＜0.05对照于伪处理组。
bp＜0.05对照于OVX组。
BMD骨矿物质密度BMC骨矿物质含量数据是以平均值±S.E.表示。
三点弯曲试验是于股骨进行。对照于伪处理对照组，OVX大鼠显示股骨显著较低的极限压力与杨氏系数。意外地，吲唑1处理OVX大鼠仅稍微降低股骨的极限压力与杨氏系数。参照以下表2表2股骨的生物力学特性
吲唑1是于成年雌性大鼠卵巢切除术的次日，经由腹腔注射(1mg/kg)每日施用连续4周。对照组是施用载体(3％DMSO，0.3ml)。
*p＜0.05对照于伪处理对照组。
§p＜0.05对照于OVX组。
坐骨神经切除是于成年雄性大鼠进行。结果显示于以下表3。对照于相对侧，在坐骨神经切除1个月后，胫骨与股骨两者于手术侧的长度并未显著地改变。然而，胫骨与股骨两者的重量，BMD，BMC及骨体积皆对应于坐骨神经切除而降低。意外地，在坐骨神经切除后立刻每日注射吲唑1(1mg/kg)连续4周会拮抗神经切除造成的骨损失。参见以下表3表3吲唑1防止坐骨神经切除造成的骨损失
吲唑1是于成年雄性大鼠坐骨神经切除的次日，经由腹腔注射(1mg/kg)每日施用连续1个月。对照组是施用载体(3％DMSO，0.3ml)。数据是以平均值±S.E.表示(对照组n＝14，吲唑1处理组n＝10)。
培养破骨细胞的效果测试吲唑1慢性处理对于碱性磷酸酶活性的效果。依照原代破骨细胞培养的方法培养破骨细胞，并以吲唑1(10μM)处理2周。由ALP染色显示，上述处理显著地增加ALP活性。吲唑1增加ALP活性是属浓度依存性，且可被L-NAME(60μM)，ODQ(20μM)或KT5823(2μM)所拮抗。同时测试吲唑1在体外对于骨小结形成的效果。发现当破骨细胞培养于含有维生素C与β-甘油磷酸的培养基会形成矿物化小结。在电子显微镜下，矿物化小结显示带有活性破骨细胞，陷入的破骨细胞，胞外胶原蛋白纤维及羟基磷灰石沉积的骨结构，使此系统成为研究体外骨形成的有效模型。意外地，吲唑1处理2周会以浓度依存性形式增加骨小结数目(经von Kossa染色观察的骨小结)。吲唑1在0.1与1μM的浓度下稍增加破骨细胞的增殖(分别为对照组的119.3％与126.1％)。
纤连蛋白(Fn)在调控破骨细胞的粘附，迁移，及成熟方面扮演重要角色。Fn纤维原生成涉及骨矿物化的过程。测试吲唑1对于培养破骨细胞中Fn纤维原生成的作用。经由单层3～5天的破骨细胞内原性释放Fn而得到的纤维原生成固定形式是采用免疫细胞化学法研究。第3天破骨细胞与吲唑1(10μM)温育24小时增加胞外Fn集合。采用流氏细胞仪分析吲唑1对于细胞表面α5与β1整合蛋白的表达的效力。意外地发现吲唑1处理24小时增加细胞表面两种整合蛋白的表达。另一方面，胶原蛋白合成只有在较高浓度如10μM的吲唑1处理下增加。
对于破骨细胞分化与活化的效果破骨细胞前体培养物于M-CSF(20ng/ml)与sRANKL(50ng/ml)存在下8天会诱发大型成熟、带有多核的破骨细胞的形成，其特征为获得成熟表现型标记，如TRAP。吲唑1意外地以浓度依存性形式抑制破骨细胞的分化。
还测试吲唑1对于破骨细胞再吸收活性的效果。破骨细胞前体培养于M-CSF与sRANKL存在下5天，接着由破骨细胞活性试验的基质平板的培养基中移除M-CSF与sRANKL。将不同浓度的吲唑1加入培养基再培养3天。相对于对照组，吲唑1会显著地以浓度依存性方式抑制破骨细胞再吸收活性。
其它实施例本说明书所公开的所有特征可组合为任何组合。本说明书所公开的每一特征可以由用作相同，等同，或类似目的的替代性特征所替换。因此，除非特别指出，此处所公开的每一特征仅为等同或类似特征的通用系列中的一例。
由上述说明书，本领域技术人员可容易确认本发明的基本特征，且在不背离本发明的精神与范围内，可对于本发明进行各种改变与修饰，以便更适于各种用途与状况。例如，构造上类似于稠合吡唑化合物的化合物亦可以用于实施本发明。因此，其它实施方案亦包括于本发明的权利要求利范围内。
权利要求
1.一种增进骨生长或抑制骨再吸收的方法，其包含向需要其的受试者施用有效量的下式化合物 A为H，R，或Ar1、Ar2、Ar3各自独立地为苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自独立地为H，硝基，卤素，R，OH，OR，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR’，ROH，ROR’，RSH，RSR’，ROC(O)R’OH，NHR，NRR’，RNHR’，或RNR’R”；或R1与R2一起，R3与R4一起，或R5与R6一起为ORO；其中R，R’，R”各自独立地为C1～C6烷基；以及n为1、2、或3。
2.权利要求1的方法，其中A为
3.权利要求2的方法，其中Ar1为苯基。
4.权利要求2的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
5.权利要求2的方法，其中Ar3为苯基且n为1。
6.权利要求5的方法，其中Ar1为苯基。
7.权利要求6的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
8.权利要求7的方法，其中R3与R4之一在呋喃基的2位上取代。
9.权利要求8的方法，其中R1，R2，R5与R6各自为H。
10.权利要求9的方法，其中R3与R4之一为H，另一个为CH2NHCH3，CH2OCH3，或COOCH3。
11.权利要求9的方法，其中R3与R4之一为H，另一个为CH2OH。
12.权利要求1的方法，其中Ar1为苯基。
13.权利要求1的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
14.权利要求1的方法，其中A为H。
15.权利要求14的方法，其中Ar1为苯基。
16.权利要求14的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
17.一种治疗骨质疏松症的方法，其包含向需要其的受试者施用有效量的下式化合物 其中 A为H，R，或Ar1、Ar2、Ar3各自独立地为苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自独立地为H，硝基，卤素，R，OH，OR，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR’，ROH，ROR’，RSH，RSR’，ROC(O)R’OH，NHR，NRR’，RNHR’，或RNR’R”；或R1与R2一起，R3与R4一起，或R5与R6一起为ORO；其中R，R’，R”各自独立地为C1～C6的烷基；以及n为1、2、或3。
18.权利要求17的方法，其中A为
19.权利要求18的方法，其中Ar1为苯基。
20.权利要求18的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
21.权利要求18的方法，其中Ar3为苯基且n为1。
22.权利要求21的方法，其中Ar1为苯基。
23.权利要求22的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
24.权利要求23的方法，其中R3与R4之一在呋喃基的2位上取代。
25.权利要求24的方法，其中R1，R2，R5与R6各自为H。
26.权利要求25的方法，其中R3与R4之一为H，另一个为CH2NHCH3，CH2OCH3，或COOCH3。
27.权利要求25的方法，其中R3与R4之一为H，另一个为CH2OH。
28.权利要求17的方法，其中Ar1为苯基。
29.权利要求17的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
30.权利要求17的方法，其中A为H。
31.权利要求30的方法，其中Ar1为苯基。
32.权利要求31的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
全文摘要
本发明特征为一种增进骨生长或抑制骨再吸收的方法。该方法包括向需要其的受试者施用(Ⅰ)式化合物A为H，R，或(Ⅱ)式，Ar
文档编号A61K31/416GK1615853SQ20041007516
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月2日 优先权日2003年9月3日
发明者符文美, 汤智昕, 杨荣森, 邓哲明, 郭盛助, 李芳裕 申请人:永信药品工业股份有限公司
相关申请本申请要求在2003年9月3日提出的美国临时申请号60/499,696的优先权，其内容结合于此作为参考。
背景本发明涉及增进骨生长与抑制骨再吸收的方法，更特别地，本发明涉及以稠合吡唑基化合物增进骨生长与抑制骨再吸收的方法。
现有技术骨胳是一种复杂组织，其持续性地进行更新与修复，即是所谓的“骨重塑作用(bone remodeling)”。负责骨重塑作用的两种主要细胞种类为破骨细胞以及成骨细胞，前者再吸收骨，后者形成新骨。骨重塑作用是由数种全身性激素(例如副甲状腺激素，1，25-二羟基维生素D3，性激素及降钙素)，以及局部因子(例如一氧化氮，前列腺素，生长因子及细胞因子)所调节。当骨的再吸收与形成不协调，且骨分解超过骨重建，就会造成骨质疏松症。骨质疏松症也可能由其它病症造成，例如，激素失调，疾病，或药物作用(例如皮质类固醇或抗癫痫剂)。
能调节骨重塑过程的化合物，不论是抑制骨再吸收或刺激骨形成，都具有增进骨生长的潜能，而可以用于治疗骨质疏松症。
发明内容
本发明基于以下出乎意料的发现一种稠合吡唑基化合物可抑制骨再吸收和增进骨生长。
本发明的一方面涉及一种增进骨生长或抑制骨再吸收的方法。上述方法包括向需要其的受试者施用有效量的下式的稠合吡唑基化合物
其中A为H，R，或 (之后称为“(CH2)nAr3(R5)(R6)”)；Ar1、Ar2、Ar3各自独立地为苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自独立地为H，卤素，R，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR’，ROH，ROR’，RSH，RSR’，NHR，NRR’，RNHR’，或RNR’R”；或R1与R2一起，R3与R4一起，或R5与R6一起为ORO；其中R，R’，R”各自独立地为C1～C6烷基；以及n为1、2、或3。
参考上式，式(I)化合物的一个子集其特征在于A是(CH2)nAr3(R5)(R6)。在一个实施方案中，Ar1为苯基，且R1与R2分别在苯基的4与5位上取代。在另一个实施方案中，Ar2为5’-呋喃基，且R3与R4之一在5’-呋喃基的2位上取代。在还有另外的实施方案中，Ar3为苯基且n为1。
上述化合物的另一子集其特征在于A为H。在一个实施方案中，Ar1为苯基，且R1与R2分别在苯基的4与5位上取代。在另一个实施方案中，Ar2为5’-呋喃基，且R3与R4之一在5’-呋喃基的2位上取代。
上述化合物的另一子集其特征在于Ar1为苯基或Ar2为5’-呋喃基。
术语“烷基”是指直链或支链烃，包括1-10个碳原子。烷基的实例包括但不限于，甲基，亚甲基，乙基，亚乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，及叔丁基。烷基可被任选地取代。取代基的实例包括但不限于，卤素，羟基，氨基，氰基，硝基，巯基，烷氧羰基，酰氨基，羧基(carboxy)，烷磺酰基，烷羰基，脲基，氨基甲酰基，羧基(carboxyl)，硫脲基，硫代氰酸根合，亚磺酰氨基，链烯基，炔基，烷氧基，芳基，杂芳基，环基，和杂环基，其中链烯基，炔基，烷氧基，芳基，杂芳基，环基，及杂环基可以再被取代。
上述稠合吡唑基化合物包括，如果适用，其盐及其前药。其盐，例如，可由稠合吡唑基化合物上带负电的取代基(如羧酸盐)与阳离子形成。适当的阳离子包括但不限于，钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，及铵离子如四甲基铵离子。类似地，带正电子的取代基(如氨基)可与带负电的抗衡离子形成盐。适当的抗衡离子包括但不限于，氯化物，溴化物，碘化物，硫酸盐，硝酸盐，磷酸盐，或醋酸盐。前药的实例包括酯和其它药学上可接受的衍生物，当将其施用于受试者时，可提供上述稠合吡唑基化合物。
本发明的另一方面涉及一种治疗骨质疏松症的方法。上述方法包括向需要其的受试者施用有效量的上述稠合吡唑基化合物。
以下所列为可用于实施本发明方法的稠合吡唑化合物的实例 吲唑1本发明范围也包括上述化合物在制备增进骨生长，抑制骨再吸收或治疗骨质疏松症的药物中的应用。
本发明的多种实施方案将详述于以下。本发明的其它特征、目的，及优点将经由以下的详细说明与权利要求中而更为明显。
发明详述用于实施本发明方法的稠合吡唑基化合物可以由本领域普通技术人员所熟知的方法制备(参见例如美国专利第5,574,168号)。它们包括以下合成路径首先将芳香基酮经由偶合芳香羰基氯化物与另一芳族化合物而制备。其中任一芳族化合物为任选地单或多取代。上述酮接着与芳基烷基肼反应，其中的芳基亦为任选地单或多取代，以形成含有三个芳基的腙。上述腙基团经由链烯烃接头转化为稠合吡唑核心化合物，另一芳香基稠合至吡唑核心的4-C与5-C，且第三芳基直接连接到吡唑核心的3-C。稠合吡唑基化合物的衍生物可经由修饰芳基的任何取代基而得到。
用于上述合成路径的化合物包括，例如溶剂，反应剂，催化剂，保护基及去保护基反应剂。上述方法可附加地包括其它步骤，不论是在上述特定步骤之前或之后，以增加或除去适当保护基团，而得以完成稠合吡唑化合物的合成。此外，也可以采用替换顺序进行各种合成步骤，以得到所需化合物。用于合成可应用的稠合吡唑化合物的合成化学转化与保护基团方法学(保护与去保护)是本领域所熟知的，并且包括，例如R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene及P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2d.Ed.JohnWiley and Sons(1991)；L.Fieser及M.Fieser，Fieser and Fieser’s Reagentsfor Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)；及L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其后续版本所叙。
如此合成的稠合吡唑化合物可以经由例如柱层析法，高压液相层析，或再结晶法进一步纯化。
本发明的一方面提供一种增进骨生长或抑制骨再吸收的方法。因此，上述方法包括但不限于，治疗骨质疏松症，骨折，身材矮小症，关节固定失败，软骨发育障碍(dyschondroplasia)，软骨发育不全(achondroplasia)，或先天性假关节。“骨质疏松症”的实例包括但不限于，经绝期后骨质疏松症，老年骨质疏松症，原发性骨质疏松症，皮质类固醇引发的骨质疏松症，肾衰竭，高副甲状腺机能症，维生素D缺乏相关的骨质疏松症，以及长期不动(immobilization)。“骨折”的实例包括但不限于，不愈合，延迟愈合，以及病理性骨折。上述方法包括向需要其的受试者施用有效量的一种或多种稠合吡唑化合物以及药用载体。如此处所述，术语“治疗”是指治愈，恢复，减轻，缓和，改变，补救，改善，或预防与不适当骨生长相关的疾病，如骨质疏松症。“有效量”定义为稠合吡唑基化合物的量，在施用于所需受试者后，其足以赋予该受试者治疗效果。有效量可以改变，如本领域技术人员所认可，依照给药途径，赋形剂的使用，及可能共同使用于增进骨生长，或治疗骨质疏松症的其它药剂而异。
为实施本发明的方法，可以将含有稠合吡唑基化合物与药用载体的组合物经由口服，非胃肠道途径，吸入式喷雾，或经由植入式储囊而施用。术语“非胃肠道途径”，如此处所述，包括皮下，皮内，静脉内，肌内，关节内，动脉内，滑液内，胸骨内，鞘内，伤口内及颅内注射，或输注技术。
口服给药的组合物可以为任何口服可接受的剂型，其包括但不限于，胶囊，片剂，乳剂及水混悬剂，分散剂及溶液。口服使用的片剂中，常用的载体包括乳糖与玉米淀粉。润滑剂，如硬脂酸镁，也典型地添加。口服使用的胶囊中，有用的稀释剂包括乳糖与干玉米淀粉。当以水混悬剂或分散剂形式口服给药时，活性成分可以悬浮于或溶解于油相，并结合乳化或悬浮剂。若有需要，某些甜味剂，调味剂，或着色剂亦可添加。吸入式组合物可以依药学配方技术领域所熟知的技术制备，而可制备为盐水溶液，采用苯甲基醇或其它适当防腐剂，增强生物利用度的吸收促进剂，甲醛，和/或其它本领域所熟知的溶解或分散剂。
无菌注射组合物，例如，无菌注射水溶性或油状混悬剂，可以依照本领域所熟知的技术，采用适当分散或湿润剂(如吐温80)以及悬浮剂配制。无菌注射制剂也可以为无菌注射液或混悬剂，其在无毒、非胃肠道可接受稀释剂或溶剂中，例如，溶于1，3-丁二醇的溶液。在可接受载体与溶剂中，可采用甘露醇，水，林格氏液及等渗氯化钠溶液。此外，无菌、固定油也常规用作溶剂或混悬介质(如合成单或双甘油脂)。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物用于注射剂的制备，其为天然药用油，如橄榄油或蓖麻油，特别是其多氧乙烷化物。这些油溶液或混悬剂也可以包含长链醇稀释剂或分散剂，或羧酸甲基纤维素或类似的分散剂。
药学组合物的载体必须是“可接受的”，也就是与制剂中的活性成分可相容(优选地，能够使它稳定)，且不会对治疗的受试者有害。例如，加溶剂如环糊精，可与稠合吡唑基化合物形成特异性的，更可溶性的复合物，或一种或多种加溶剂，可以用作药物赋形剂以传递稠合吡唑基化合物。其它载体的实例包括胶状二氧化硅，硬脂酸镁，纤维素，十二烷基硫酸钠，及D&C黄色10号。
适当的体外试验可以用于预先评估稠合吡唑基化合物增加骨小结形成的能力。体内筛选也可以经由本领域所熟知的以下步骤进行。参考以下具体实施例。
不需详加阐述，相信上述说明已提供本发明实施的适当说明。因此，以下特定实施例仅是用于说明本发明，并非用以限制限定本发明的范围。所有此处所引用的出版物，包括专利，皆以其完整内容并入本案作为参考。
化学合成首先制备硼氢化钙，其经由于无水THF(20mL)中搅拌无水氯化钙(88.8mg，0.8mmole)与硼氢化钠(60mg，1.6mmole)4小时。将30mL含有88.0mg的1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)-吲唑(0.27mmole)的THF溶液，于30±2℃滴入上述硼氢化钙溶液。将混合物于回流下加热6小时，冷却，淬灭至碎冰中，置于减压状态以除去THF，并过滤以得到固体产物。上述固体再以二氯甲烷萃取。将上述萃取物浓缩至50mL，加入石油醚后沉淀出固体。收集此沉淀物并以柱层析(硅胶-苯)纯化以得到70.0mg的1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-吲唑，产率87％。以下称此化合物为“吲唑1”。
熔点108-109℃MS(％)，m/z304(M+)IR(KBr)λmax3350cm-1(-OH)1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ4.51(2H，d，J＝5.5Hz，-CH2O-)，5.31(1H，t，J＝5.5Hz，-OH)，5.70(2H，s，＝NCH2-)，6.48(1H，d，J＝3.4Hz，H-4’)，6.97(1H，d，J＝3.4Hz，H-3’)，7.21-7.31(6H，m，H-5，苯基)，7.45(1H，t，J＝8.2Hz，H-6)，7.75(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，H-7)，8.12(1H，dd，J＝8.2.1.0Hz.C4-H)。
生物试验方法原代破骨细胞培养由18日龄胎儿Sprague-Dawley(简称SD)种大鼠的颅顶制备原代破骨细胞，依照以下方法采用腹膜内注射三氯乙醛(200mg/kg)麻醉怀孕的大鼠。接着以无菌操作剖开大鼠胎儿的颅顶。于解剖显微镜下除去软组织。将颅顶分成小碎片并以0.1％胶原蛋白酶(SigmaChemical，St.Louis，MO)溶液于37℃下处理10分钟。收集经两次20分钟连续胶原蛋白酶消化处理而由颅顶释出的细胞，并经过70μm尼龙过滤器(Falcon，BD BioSciences，San Jose，CA)过滤。再使细胞于塑料细胞培养皿，在95∶5的空气-二氧化碳下，补加20mM HEPES与10％热失活的FCS，2mM-谷氨酰胺，青霉素(100U/ml)与链霉素(100μg/ml)(将pH调整至7.6)的度别克氏修正过的伊葛氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，简称DMEM)(Gibco，Grand Island，NY)培养。一周换两次细胞培养基。以形态学与碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)的表达确认破骨细胞。为检验破骨细胞的成熟度，将细胞于含有抗坏血酸(50μg/ml)(SigmaChemical，St.Louis，MO)与β-甘油磷酸(10mM)(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的生长培养液培养14天，并每3天换一次培养基。
碱性磷酸酶活性的试验将细胞培养于存有或不存在吲唑1的6孔平板中，再于1ml的0.2％Nonidet P-40中收集，使细胞悬浮液经超声波处理破碎。于1500g离心5分钟后，以Lowry等(1954)J Biol Chem 20719-37的方法测量上清液中的ALP活性。
von Kossa染色将破骨细胞培养于含有50μg/ml的维生素C与10mMβ-甘油磷酸的DMEM中2周，且每3天换一次培养基。为检验骨小结的形成，将细胞以4％多聚甲醛固定10分钟，水清洗后，以1％硝酸银染色，置于紫外光下30分钟，再以水清洗后，才以5％硫代硫酸钠处理2分钟。将细胞以水清洗两次，并以1％Safranin-O对染以便显现基质。于光学显微镜下计数每孔的骨小结形成的数目。经由测量培养的破骨细胞中4-羟脯氨酸含量确认胶原蛋白的合成。将细胞培养于含有50μg/ml的维生素C与10mM β-甘油磷酸的DMEM中2周后，再于116℃下以6N HCl水解16小时。冷冻干燥并于蒸馏水重建溶胞产物后，于550nm的分光光度测定法测定4-羟脯氨酸的含量，如Berg(1982)的Meth Enzymol.82372-398所述。
细胞增殖试验将破骨细胞(2×104细胞/孔)接种于24-孔平板(Costar，Cambridge，MA)。细胞在加入吲唑1前先培养于无血清培养基中24小时。于吲唑1下温育24小时后，加入BrdU成为10μM再温育24小时。BrdU的掺入是依照酶联免疫吸附测定化学发光检测试剂盒(Roche MolecularBiochemicals)的步骤进行测试，并采用发光计数器(TopCount；PackardInstruments，Meriden，CT)。每秒计数量直接与DNA合成量相关，由此而推知增生的细胞量。
破骨细胞生成(Osteoclastogenesis)骨髓细胞的制备是经由取得6-8周龄SD大鼠的股骨，并以含有20mM HEPES与10％热失活的FCS，2mM-谷氨酰胺，青霉素(100U/ml)及链霉素(100μg/ml)的DMEM冲洗骨髓腔。24小时后，收集未粘附的细胞(造血细胞)作为破骨细胞前体。将细胞接种于24孔平板成为1×106细胞/孔(0.5ml)，并同时存在人类重组可溶性RANKL(50ng/ml，Peprotech EC Ltd.，London，United Kingdom)以及鼠类M-CSF(20ng/ml，Genzyme，Cambridge，MA)。每3天换一次培养基。在8-10天后，以抗酒石酸盐酸磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，简称TRAP)试验(Kotake等人，1999)确认破骨细胞形成。简言的，附着的细胞以溶于磷酸盐缓冲盐水的10％甲醛固定3分钟。在以乙醇/丙酮(50∶50v/v)处理1分钟后，使细胞表面风干并于室温下温育于含有0.01％萘酚AS-MX磷酸盐(Sigma)与0.03％快红紫LB盐(fast red violet LB salt)(Sigma)的醋酸缓冲液(0.1M醋酸钠，pH5.0)，50mM酒石酸钠存在下10分钟。每孔的类破骨细胞TRAP阳性细胞是经由计算TRAP阳性与含有超过三个核的多核细胞数目而评分。
破骨细胞的骨再吸收试验破骨细胞前体由如上述的大鼠长骨分离。将细胞重新悬浮于完全DMEM培养基中，并接种至以磷酸钙磷灰石包被的24孔平板，OAAS(Oscotec，OCT USA Inc.)，细胞浓度为1×106细胞/0.5ml/孔。细胞培养于M-CSF(20ng/ml)加sRANKL(50ng/ml)存在下5天。在M-CSF与sRANKL不存在下另三天每天注入吲唑1。于第8天终止培养，孔中留下的细胞以1N NaOH裂解。采用倒置显微镜(200×)获得每孔5个影像，并采用影像分析仪测量吸收区域。
局部注射采用雄性SD大鼠，体重介于70-88gm。以戊巴比妥麻醉大鼠的两肢，由后侧方埋入套管(22G)至近端胫骨干骨后端。套管的外端在皮下组织。吲唑1经皮注射，由套管注入近端胫骨一天一次，连续一周。同样浓度的生理盐水稀释过的DMSO也注入右侧作为对照。在第14天，牺牲大鼠并以10％甲醛于4℃下固定48小时。
骨组织形态学分析在甲醛固定胫股完成后，将胫骨于0.5N盐酸中去钙，以浓度升高系列乙醇溶液与丙酮进行脱水，并包埋于石腊中。系列切片(5μm)是于长轴方向切割，并以玫尔氏苏木精-伊红溶液(Yang等(1993)Calcif Tissue Int 5257-61)染色。生长盘与近端胫股的影像是采用照相微图数字化插入系统(PhotoMicroGraphic Digitize integrate System，简称MGDS；Total-Integra Technology Co.，Ltd.，台北，台湾)。在整个次级松质上进行骨体积测量，其位于初级松质下并且特征在于较大的小梁。骨体积是采用影像分析软件计算。所有测量皆以单盲方式进行。
卵巢切除术与坐骨神经切除于成年雌性与雄性大鼠(三月龄)分别进行卵巢切除术与坐骨神经切除。手术后，每天对大鼠注射吲唑1(腹腔注射，1mg/kg)或载体共4周。最后注射的后一天，牺牲大鼠并移除其胫骨与股骨。
胫骨与股骨的制备在实验结束时，以断头术牺牲大鼠。移除胫骨，清洗软组织，并以精确卡尺(±0.05mm)量测胫骨长度，如Weinreb等(1991)J Bone Miner Res 6725-731所述。胫骨以10％甲醛于4℃下固定48小时，以便进行骨组织形态学分析。移除胫骨与股骨的部分并保存于-20℃以便进行矿物质分析。
骨矿物质密度(bone mineral density，简称BMD)与含量(简称BMC)的分析胫骨与股骨的BMD与BMC是以双能量X射线吸收仪(DEXA，XR-26；Norland，Fort Atkinson，WI)测量。采用适用于小个体的测量的形式。0.7％的变异系数是由每日测量腰部人体模型(phantom)的BMD，超过1年所计算得(Yang等人(1998)Calcif Tissue Int 6386-90)。进行骨矿物质分析前，将胫骨与股骨融解至室温。扫描整个胫骨与股骨，并以吸收仪测量BMD与BMC。
生物力学三点弯曲试验骨组织的力学特性是经由三点弯曲试验测量，采用MTS-858试验机(MTS System Inc.，Minneapolis，MN)。两支持点的跨度为20毫米且变形率为1mm/分钟。负重/变形曲线是由Team 490软件(第4.10版，Nicolet Instrument Technologies Inc.，Madison，WI)获得。采用SigmaPlot 6.0软件(SPSS Inc.，Chicago，IL)以计算骨样品的外在材料特性，包括最大负重，极限负重，最大负重的能量，极限负重的能量，及线性强直(Linearstiffness)。最大负重的能量与极限负重的能量是由负重/变形曲线下区域计算。强直是由负重/变形曲线的线性部分的斜率计算。惰性剖面距是假设剖面为椭圆形下计算(Turner等，The effect of fluoridated water on bone strength.Orthop Res(1992)10581-587)。
最大压力，极限压力，及弹性系数(杨氏系数)是采用Turner等人Basicbiomechanical measurements of bonea tutorial，Bone(1993)14595-608所述的方法计算。
结果骨生长将雄性年轻大鼠(SD)，体重介于70-90gm，分为六组。每组大鼠平均体重为73.9±1.1gm。将吲唑1溶解于DMSO并以生理盐水稀释至最终浓度为10μM。六组之一为对照组，而其它组分为仅植入套管针，采用套管针注射载体(第1天，一次)，注射吲唑1(第1天，一次)，采用套管针注射载体(第1-7天，每天)，以及注射吲唑1(第1-7天，每天)。在14天后牺牲大鼠，仅植入套管针(22G)或采用套管针注射载体并不影响骨体积。然而，大鼠注射吲唑1(0.1nmole)7天再喂饲7天后会显著地增加次级骨松质的体积。局部注射吲唑17天后，次级骨松质的骨小梁增加至90％。胫骨长度并未显著地受局部注射吲唑1影响(胫骨长度对照组为3.31±0.01cm，而吲唑1处理组为3.32±0.02cm，n＝9)。
雄性年轻大鼠仅注射吲唑1，或注射吲唑1与NG-硝基-L-精氨酸-甲酯(L-NAME，0.6nmole/天)，NO合成酶(NOS)抑制剂。对照于仅注射吲唑1者，同时给予吲唑1与L-NAME显著地减弱吲唑1对于次级骨松质中骨形成的增进作用。
骨损失的预防作用卵巢切除术(简称OVX)是于成年雌性大鼠进行(＝28)。在卵巢切除术后，卵巢切除的大鼠(n＝16)中的一组注射吲唑1(腹腔注射，1mg/kg/天)，其它组(n＝12)未注射。15只未进行卵巢切除术的成年雌性大鼠作为伪处理(sham-operated)对照组，且并未注射吲唑1。卵巢切除术并未显著地影响胫骨与股骨的长度，但减低两者的骨矿物质密度(BMD)与含量(BMC)。参见以下的表1。意外地，每日注射吲唑1可保护胫骨与股骨免于发生卵巢切除术诱发BMD与BMC损失。与伪处理组比较，卵巢切除术会造成胫骨次级骨松质的骨小梁的减少。在卵巢切除术后，可在4周观察到60％的骨体积减少。另一方面，每日注射吲唑1(1mg/kg)连续4周会减低骨小梁损失的情形。骨体积达到伪处理对照组的76％。
表1吲唑1对于骨矿物质密度与含量的效果
吲唑1是于成年雌性大鼠卵巢切除术的次日，经由腹腔注射(1mg/kg)每日施用连续1个月。对照组是施用载体(3％DMSO，0.3ml)。
ap＜0.05对照于伪处理组。
bp＜0.05对照于OVX组。
BMD骨矿物质密度BMC骨矿物质含量数据是以平均值±S.E.表示。
三点弯曲试验是于股骨进行。对照于伪处理对照组，OVX大鼠显示股骨显著较低的极限压力与杨氏系数。意外地，吲唑1处理OVX大鼠仅稍微降低股骨的极限压力与杨氏系数。参照以下表2表2股骨的生物力学特性
吲唑1是于成年雌性大鼠卵巢切除术的次日，经由腹腔注射(1mg/kg)每日施用连续4周。对照组是施用载体(3％DMSO，0.3ml)。
*p＜0.05对照于伪处理对照组。
§p＜0.05对照于OVX组。
坐骨神经切除是于成年雄性大鼠进行。结果显示于以下表3。对照于相对侧，在坐骨神经切除1个月后，胫骨与股骨两者于手术侧的长度并未显著地改变。然而，胫骨与股骨两者的重量，BMD，BMC及骨体积皆对应于坐骨神经切除而降低。意外地，在坐骨神经切除后立刻每日注射吲唑1(1mg/kg)连续4周会拮抗神经切除造成的骨损失。参见以下表3表3吲唑1防止坐骨神经切除造成的骨损失
吲唑1是于成年雄性大鼠坐骨神经切除的次日，经由腹腔注射(1mg/kg)每日施用连续1个月。对照组是施用载体(3％DMSO，0.3ml)。数据是以平均值±S.E.表示(对照组n＝14，吲唑1处理组n＝10)。
培养破骨细胞的效果测试吲唑1慢性处理对于碱性磷酸酶活性的效果。依照原代破骨细胞培养的方法培养破骨细胞，并以吲唑1(10μM)处理2周。由ALP染色显示，上述处理显著地增加ALP活性。吲唑1增加ALP活性是属浓度依存性，且可被L-NAME(60μM)，ODQ(20μM)或KT5823(2μM)所拮抗。同时测试吲唑1在体外对于骨小结形成的效果。发现当破骨细胞培养于含有维生素C与β-甘油磷酸的培养基会形成矿物化小结。在电子显微镜下，矿物化小结显示带有活性破骨细胞，陷入的破骨细胞，胞外胶原蛋白纤维及羟基磷灰石沉积的骨结构，使此系统成为研究体外骨形成的有效模型。意外地，吲唑1处理2周会以浓度依存性形式增加骨小结数目(经von Kossa染色观察的骨小结)。吲唑1在0.1与1μM的浓度下稍增加破骨细胞的增殖(分别为对照组的119.3％与126.1％)。
纤连蛋白(Fn)在调控破骨细胞的粘附，迁移，及成熟方面扮演重要角色。Fn纤维原生成涉及骨矿物化的过程。测试吲唑1对于培养破骨细胞中Fn纤维原生成的作用。经由单层3～5天的破骨细胞内原性释放Fn而得到的纤维原生成固定形式是采用免疫细胞化学法研究。第3天破骨细胞与吲唑1(10μM)温育24小时增加胞外Fn集合。采用流氏细胞仪分析吲唑1对于细胞表面α5与β1整合蛋白的表达的效力。意外地发现吲唑1处理24小时增加细胞表面两种整合蛋白的表达。另一方面，胶原蛋白合成只有在较高浓度如10μM的吲唑1处理下增加。
对于破骨细胞分化与活化的效果破骨细胞前体培养物于M-CSF(20ng/ml)与sRANKL(50ng/ml)存在下8天会诱发大型成熟、带有多核的破骨细胞的形成，其特征为获得成熟表现型标记，如TRAP。吲唑1意外地以浓度依存性形式抑制破骨细胞的分化。
还测试吲唑1对于破骨细胞再吸收活性的效果。破骨细胞前体培养于M-CSF与sRANKL存在下5天，接着由破骨细胞活性试验的基质平板的培养基中移除M-CSF与sRANKL。将不同浓度的吲唑1加入培养基再培养3天。相对于对照组，吲唑1会显著地以浓度依存性方式抑制破骨细胞再吸收活性。
其它实施例本说明书所公开的所有特征可组合为任何组合。本说明书所公开的每一特征可以由用作相同，等同，或类似目的的替代性特征所替换。因此，除非特别指出，此处所公开的每一特征仅为等同或类似特征的通用系列中的一例。
由上述说明书，本领域技术人员可容易确认本发明的基本特征，且在不背离本发明的精神与范围内，可对于本发明进行各种改变与修饰，以便更适于各种用途与状况。例如，构造上类似于稠合吡唑化合物的化合物亦可以用于实施本发明。因此，其它实施方案亦包括于本发明的权利要求利范围内。
权利要求
1.一种增进骨生长或抑制骨再吸收的方法，其包含向需要其的受试者施用有效量的下式化合物 A为H，R，或Ar1、Ar2、Ar3各自独立地为苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自独立地为H，硝基，卤素，R，OH，OR，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR’，ROH，ROR’，RSH，RSR’，ROC(O)R’OH，NHR，NRR’，RNHR’，或RNR’R”；或R1与R2一起，R3与R4一起，或R5与R6一起为ORO；其中R，R’，R”各自独立地为C1～C6烷基；以及n为1、2、或3。
2.权利要求1的方法，其中A为
3.权利要求2的方法，其中Ar1为苯基。
4.权利要求2的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
5.权利要求2的方法，其中Ar3为苯基且n为1。
6.权利要求5的方法，其中Ar1为苯基。
7.权利要求6的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
8.权利要求7的方法，其中R3与R4之一在呋喃基的2位上取代。
9.权利要求8的方法，其中R1，R2，R5与R6各自为H。
10.权利要求9的方法，其中R3与R4之一为H，另一个为CH2NHCH3，CH2OCH3，或COOCH3。
11.权利要求9的方法，其中R3与R4之一为H，另一个为CH2OH。
12.权利要求1的方法，其中Ar1为苯基。
13.权利要求1的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
14.权利要求1的方法，其中A为H。
15.权利要求14的方法，其中Ar1为苯基。
16.权利要求14的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
17.一种治疗骨质疏松症的方法，其包含向需要其的受试者施用有效量的下式化合物 其中 A为H，R，或Ar1、Ar2、Ar3各自独立地为苯基，噻吩基，呋喃基，或吡咯基；R1，R2，R3，R4，R5，及R6各自独立地为H，硝基，卤素，R，OH，OR，C(O)OH，C(O)OR，C(O)SH，C(O)SR，C(O)NH2，C(O)NHR，C(O)NRR’，ROH，ROR’，RSH，RSR’，ROC(O)R’OH，NHR，NRR’，RNHR’，或RNR’R”；或R1与R2一起，R3与R4一起，或R5与R6一起为ORO；其中R，R’，R”各自独立地为C1～C6的烷基；以及n为1、2、或3。
18.权利要求17的方法，其中A为
19.权利要求18的方法，其中Ar1为苯基。
20.权利要求18的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
21.权利要求18的方法，其中Ar3为苯基且n为1。
22.权利要求21的方法，其中Ar1为苯基。
23.权利要求22的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
24.权利要求23的方法，其中R3与R4之一在呋喃基的2位上取代。
25.权利要求24的方法，其中R1，R2，R5与R6各自为H。
26.权利要求25的方法，其中R3与R4之一为H，另一个为CH2NHCH3，CH2OCH3，或COOCH3。
27.权利要求25的方法，其中R3与R4之一为H，另一个为CH2OH。
28.权利要求17的方法，其中Ar1为苯基。
29.权利要求17的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
30.权利要求17的方法，其中A为H。
31.权利要求30的方法，其中Ar1为苯基。
32.权利要求31的方法，其中Ar2为5’-呋喃基。
全文摘要
本发明特征为一种增进骨生长或抑制骨再吸收的方法。该方法包括向需要其的受试者施用(Ⅰ)式化合物A为H，R，或(Ⅱ)式，Ar
文档编号A61K31/416GK1615853SQ20041007516
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月2日 优先权日2003年9月3日
发明者符文美, 汤智昕, 杨荣森, 邓哲明, 郭盛助, 李芳裕 申请人:永信药品工业股份有限公司
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