一种丹皮总苷提取物及其制备方法和用途的制作方法
专利名称：一种丹皮总苷提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种丹皮总苷提取物及其制备方法，以及丹皮总苷提取物在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。
背景技术：
牡丹皮，别名丹皮、粉丹皮、木芍药、条丹皮、洛阳花，系毛茛科芍药属植物牡丹的根皮。用于温毒发斑、吐、衄、便血，骨蒸劳热，经闭痛经，痈肿疮毒，跌扑伤痛。牡丹皮含芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚苷、丹皮酚原苷、丹皮酚、苯甲酸、挥发油、糖类及甾醇等多种成份。研究发现芍药苷具有扩张冠状动脉，增加冠脉流量，对抗急性心肌缺血，抑制血小板凝聚及降低血压等药理作用刘芳，杨广德，白芍中芍药苷的提取方法研究，中成药，2003年10期。
中国专利CN1418673A提供了一种丹皮总苷的制备方法，按其所述方法制备的丹皮总苷，成分复杂，除包含有芍药苷类成份外，还含有易挥发性成份丹皮酚及其它杂质成分，成份含量不稳定，并且水溶性不好，难以满足药物质量稳定和多剂型应用开发的要求。中国专利CN1420122提供了制备芍药苷单体的方法，但制备方法非常复杂，不利于工业上的推广应用。因此开发一种水溶性好、质量稳定可控、制备方法简单，易于操作，有利于工业上推广应用，且药效与芍药苷单体相当的丹皮总苷提取物具有深远的临床意义。
发明内容
本发明提供了一种丹皮总苷提取物，主要含有芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚苷、丹皮酚原苷，总苷含量不低于80％，100％＞芍药苷含量≥60％。
本发明提供了丹皮总苷提取物的制备方法。
本发明提供了丹皮总苷提取物在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。
本发明提供了丹皮总苷提取物在制备治疗或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
本发明提供了丹皮总苷提取物在制备治疗或预防脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
本发明提供了丹皮总苷提取物在制备治疗或预防脑外伤的药物中的应用。
本发明提供了丹皮总苷提取物在制备抗休克、抗心衰、抗心肌缺血、抗脑缺血(厥脱、胸痹、中风)及老年性痴呆的药物中的应用。
本发明提供了以丹皮总苷提取物为活性成分的药物组合物。
本发明提供的丹皮总苷提取物的制备方法为将牡丹皮药材粉碎，用0～95％乙醇水溶液提取药材1～3次，合并提取液，减压浓缩，上大孔树脂柱层析，先用水洗脱，再用10～50％乙醇洗脱，收集10％-50％乙醇洗脱液，减压浓缩，有机溶剂萃取去除杂质，水溶液加乙醇使浓度达80～90％，滤去沉淀物，滤液浓缩、干燥，得丹皮总苷粗品，粗品用70～100％乙醇溶解，上氧化铝柱层析，用70～100％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇、干燥即得。其中大孔树脂选自弱极性或极性的大孔树脂，优选为D101、D-3520或AB-8。
本发明所述的丹皮总苷提取物在用于上述任一用途时，其使用剂量范围为30mg～8000mg/天，优选90mg～3000mg/天，更优选为300mg～1000mg/天。
本发明中使用的丹皮总苷可以单独使用或以药物组合物形式使用。药物组合物可以是丹皮总苷提取物和药用辅料组成，也可以是丹皮总苷提取物与其它药物组成。药物组合物可以通过口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉途径给药。药物组合物可以以粉针剂、注射液、片剂、胶囊、软胶囊、滴丸或口服液的形式存在。本发明所述各种剂型均可以以药学常规方法制备而成。
本发明人通过下列试验证实了丹皮总苷提取物具有治疗或预防心脑血管疾病的作用，且作用与芍药苷单体相当。
具体实施例方式实施例1制备丹皮总苷取丹皮药材(产地铜陵)20kg，粉碎成粗粉，放入提取罐中；加200L的水沸提2次，每次2h，过滤后，减压浓缩至约30L；上AB-8型大孔吸附树脂柱，用水充分洗脱至流出液为澄清且无还原糖反应后，再用40％乙醇洗脱；收集洗脱液，减压浓缩，氯仿萃取2次，回收氯仿，水溶液加入95％乙醇，使醇浓度为80％。放冷静置0.5h，滤去沉淀物，将滤液减压回收至干，即得丹皮总苷原料1kg。经HPLC检测有效部位丹皮总苷中总苷含量为66％，主要成分芍药苷含量为42％。将丹皮总苷原料溶于无水乙醇，上氧化铝柱层析，用无水乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇、干燥，得精制丹皮总苷，有效部位丹皮总苷中总苷含量为85％，主要成分芍药苷含量为71％。
实施例2制备丹皮总苷冻干粉针在洁净条件下，取精制丹皮总苷50g，加适量注射用水溶解后，搅拌溶解，超滤，得到无热源的澄清液，加注射用水至1000ml，分装为1000支，按冻干粉针工艺冻干，制成含丹皮总苷50mg的冻干粉针。
实施例3制备丹皮总苷胶囊取上述丹皮总苷原料100g，淀粉50g，β环糊精100g混匀，制粒，过筛，干燥后装成1000粒胶囊(100mg/粒)，即得。
实施例4制备丹皮总苷片取上述丹皮总苷原料100g，淀粉50g，β环糊精100g混匀，制粒，过筛，干燥后压成1000片(100mg/片)，即得。
试验例1丹皮总苷对大鼠局部脑缺血损伤的影响1.1材料丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量为90％。
红四氮唑美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。
实验动物普通级Wistar大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
1.2方法与结果动物随机分为假手术组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)，芍药苷组(3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg)、丹皮总苷组(3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg、810mg/kg)剂量组，每组10只。禁食12小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成左侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。术后各组动物静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。24小时后按文献刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的大鼠脑中动脉模型，药学学报，1995，30662所述方法及标准观察并记录大鼠的行为障碍(A)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑千，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。结果如表1所示，缺血24小时后，模型对照组大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右给予不同剂量的丹皮总苷动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性；相同剂量下丹皮总苷与芍药苷在抗脑缺血方面作用相当。
1.3结论丹皮总苷具有显著的脑保护作用，能有效的抑制缺氧对脑组织的损伤，其作用与相同剂量的芍药苷相当。
表1 丹皮总苷对大鼠局部脑缺血损伤的影响(n＝10，X±s)
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
试验例2丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠生理指标的影响2.1试验材料普通级SD大鼠，雄性，体重250～300g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106005号。
红花注射液万荣三九药业有限公司，规格5ml/只，批号040130，国药准字Z14021640
受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
心电图机单道心电图机(FX-2111)，北京福田电子医疗仪器有限公司2.2方法与结果取雄性健康大鼠90只，随机分为9组，模型组给予等体积的生理盐水，红花注射液组按150mg/kg尾静脉注射给药，芍药苷组按3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg尾静脉注射给药，丹皮总苷组分别按3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg、810mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药10min后腹腔注射20％乌拉坦1.2g/kg麻醉，背位固定，记录正常心电图。胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸壁，该手术在30秒内完成。记录缺血后心电图变化。
数据用X±sD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表2.丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠心电图J点的影响
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，结果显示，与模型组比较丹皮总苷组(3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg、810mg/kg)与芍药苷组在60min均能明显降低J点抬高的幅度(P＜0.05)。随着剂量的增加，丹皮总苷对心肌缺血的改善作用也显著提高，810mg/kg、27mg/kg均能对缺血大鼠初始心电图有明显的作用(P＜0.05或P＜0.01)。
2.3结论丹皮总苷对心肌具有保护作用，能降低缺血引起的心肌损伤，其对心肌的保护作用与相同剂量的芍药苷相当。
试验例3丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠生化指标的影响3.1实验材料普通级SD大鼠，雄性，体重250～300g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106005号。
红花注射液万荣三九药业有限公司，规格5ml/只，批号040130，国药准字Z14021640受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
AST/GOT试剂盒中生北控生物科技股份有限公司，批号020101CK试剂盒中生北控生物科技股份有限公司，批号090091LDH试剂盒中生北控生物科技股份有限公司，批号130051紫外分析仪722E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司离心机台式高速离心机(TGL-16G)，上海医用分析仪器厂3.2方法与结果取雄性健康大鼠100只，随机分为10组，假手术组、模型组给予等体积的生理盐水，红花注射液组按150mg/kg剂量尾静脉注射给药，芍药苷组按3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg尾静脉注射给药，丹皮总苷组分别按3、9、27、810mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药10min后腹腔注射20％乌拉坦1.2g/kg麻醉，背位固定。胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸壁，该手术在30秒内完成。6h后将大鼠固定在解剖板上，分离颈总动脉，抽取血液，静置10min后，4500rpm离心15min，吸取血清，利用试剂盒检测CK、LDH、AST酶活。
数据用X±SD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表3丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠血液中酶活的影响
*表示与模型组比较*p＜0.05，***p＜0.001；#表示与假手术组比较，###p＜0.001结果显示，该心肌缺血模型能显著提高缺血大鼠血清中CK、AST、LDH酶活的活性(P＜0.001)，与模型组比较丹皮总苷组均能显著降低上述三种酶的活性(P＜0.05或P＜0.01)，其作用与相同剂量的芍药苷相当。
3.3结论丹皮总苷对心肌组织具有保护作用，能有效地改善机体因心肌缺血引起的组织损伤，使机体血清中CK、AST、LDH酶活性显著降低。
试验例4丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠形态学指标的影响4.1试验材料普通级SD大鼠，雄性，体重250～300g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106005号。
红花注射液万荣三九药业有限公司，规格5ml/只，批号040130，国药准字Z14021640受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
氯化硝基四氮唑兰，前进化学试剂厂(上海)，批号20010801电子天平，BP 210S，Sartorius(德国)4.2方法与结果取雄性健康大鼠90只，随机分为9组，模型组给予等体积的生理盐水，红花注射液组按150mg/kg剂量尾静脉注射给药，芍药苷组按3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg尾静脉注射给药，丹皮总苷组分别按3、9、27、810mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药10min后腹腔注射20％乌拉坦1.2g/kg麻醉，背位固定。胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，该手术在30秒内完成。在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸壁，6h后将大鼠固定在解剖板上，打开胸腔，剥离心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管脂肪等非心肌组织，沿冠状沟切除心房，留下心室，称重。顺房室沟从心尖到心基部平行将心室切成0.1cm厚的心肌片，将心肌片放在0.3％的NBT，在37℃孵育4min，染色后立即用水冲洗去多余的染料，减去各心肌片被染色的非梗死区心肌，称量未染色的梗死区心肌，利用下列公式算出心肌梗死面积(％)
数据用X±SD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表4.丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠心肌梗死重量百分率的影响
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01结果显示与模型组比较，丹皮总苷(3、9、27、810mg/kg)均能显著降低心肌梗死百分率(P＜0.05)，在相同剂量下与芍药苷的药效作用相当。
4.3结论丹皮总苷在一定剂量下具有保护心肌组织的作用，能缓解缺血对心肌细胞的损伤。
试验例5丹皮总苷对小鼠凝血时间的影响5.1实验材料清洁级昆明种小鼠，雄性，体重20～22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106003号。
受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
5.2方法与结果取雄性健康小鼠70只，随机分为7组，正常对照组按0.2ml/只尾静脉注射生理盐水，芍药苷组按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg尾静脉注射给药，丹皮总苷分别按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药0.2h后，眼眶采血，玻片法测定血液凝固时间。
数据用X±SD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表5丹皮总苷对小鼠凝血时间的影响
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01 ***p＜0.001结果显示丹皮总苷(6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg)、芍药苷(6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg)与模型组比较具有显著的抗凝血作用(p＜0.05)。
5.3结论丹皮总苷在一定剂量下能显著延长凝血时间，有一定的活血化瘀作用，与相同剂量的芍药苷作用相当。
试验例6丹皮总苷对小鼠亚硝酸钠中毒的影响6.1实验材料清洁级昆明种小鼠，雄性，体重20～22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106003号。
受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
6.2方法与结果取雄性健康小鼠70只，随机分为7组，正常对照组按0.2ml/只尾静脉注射生理盐水，芍药苷组分别按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg剂量尾静脉注射给药，丹皮总苷分别按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药10min后，四组均腹腔注射2％亚硝酸钠溶液，剂量为0.02ml/g，然后记录小鼠死亡时间。
数据用X±SD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表6丹皮总苷对小鼠存活时间的影响
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001由表6可见，与模型组比较丹皮总苷在三个剂量下均能显著延长小鼠的存活时间(p＜0.05)，在相同剂量下丹皮总苷与芍药苷的药效作用相当。
6.3结论丹皮总苷在一定剂量下能显著缓解中毒性缺氧对组织的损伤，有一定的抗组织缺氧的作用。
试验例7丹皮总苷对小鼠脑缺血的影响7.1实验材料清洁级昆明种小鼠，雄性，体重20～22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106003号。
受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
7.2方法与结果取雄性健康小鼠90只，随机分为9组，正常对照组按0.2ml/只尾静脉注射生理盐水，芍药苷组按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg剂量尾静脉注射给药，丹皮总苷分别按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药10min后，不需麻醉，用大剪刀在耳下部快速断头，记录喘气时间。
数据用X±SD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表7丹皮总苷对小鼠脑缺血的影响
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001由表7可见，与模型组比较丹皮总苷、芍药苷在三个剂量下均能明显延长小鼠的喘息时间(p＜0.05)。
7.3结论丹皮总苷在一定剂量下能显著降低小鼠脑耗氧量，对小鼠脑组织具有保护作用，能有效的保护缺氧对脑组织的损伤，在相同剂量下丹皮总苷与芍药苷的药效作用相当。
试验例8丹皮总苷提取物的急性毒性试验8.1材料丹皮总苷提取物根据实施例1制备。
清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106003号。
饲料由中国药品生物制品鉴定检验所提供。
8.2方法实验动物按SOP要求检疫一周，剔除不合格动物。试验室与饲养室条件一致。室温18-25℃，湿度40-60％，过滤送风，光照12小时。自由摄食和饮水，每日更换饮水瓶一次。取健康小鼠40只，雌雄各半。随机分为4组，每组10只。称重后，按4000、3000、2250、1687mg/kg的剂量尾静脉注射给药。给药后密切观察72小时，记录小鼠的死亡情况。
8.3结果丹皮总苷的LD50为3756.4±148.6mg/kg，LD50的95％的可信限为3578.2～3912.2mg/kg。
权利要求
1.一种丹皮总苷提取物，主要含有芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚苷、丹皮酚原苷，其中100％＞丹皮总苷≥80％，100％＞芍药苷≥60％。
2.权利要求1所述的丹皮总苷提取物，优选为100％＞丹皮总苷≥90％，100％＞芍药苷≥70％。
3.根据权利要求1或2所述的丹皮总苷提取物的制备方法，其特征为取牡丹皮药材，粉碎，用0～95％乙醇水溶液提取药材1～3次，合并提取液，减压浓缩，上大孔树脂柱层析，先用水洗脱，再用10～50％乙醇洗脱，收集10～50％乙醇洗脱液，减压浓缩，有机溶剂萃取去除杂质，水溶液加乙醇使浓度达80～90％，滤去沉淀物，滤液浓缩、干燥，得丹皮总苷提取物粗品；所得丹皮总苷提取物粗品用70～100％乙醇溶解，上氧化铝柱层析，用70～100％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇、干燥。
4.含有权利要求1或2所述的丹皮总苷提取物的药物组合物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其可以以粉针剂、注射液、片剂、胶囊、软胶囊、滴丸和口服液的形式存在。
6.丹皮总苷提取物在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。
7.丹皮总苷提取物在制备治疗或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
8.丹皮总苷提取物在制备治疗或预防脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
9.丹皮总苷提取物再制备治疗或预防脑外伤的药物中的应用。
10.丹皮总苷提取物再制备抗休克、抗心衰、抗心肌缺血、抗脑缺血(厥脱、胸痹、中风)及老年性痴呆的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种丹皮总苷提取物及其制备方法。本发明还提供了丹皮总苷提取物在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用，具体涉及丹皮总苷提取物在制备治疗或预防缺血性脑中风、脑缺血/再灌注损伤、脑外伤、抗休克、抗心衰、抗心肌缺血、抗脑缺血(厥脱、胸痹、中风)及老年性痴呆的药物中的应用。
文档编号A61K9/08GK1788753SQ20041007549
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者高玉白, 王超云, 张太平, 孙芳 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司
技术领域：
本发明涉及一种丹皮总苷提取物及其制备方法，以及丹皮总苷提取物在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。
背景技术：
牡丹皮，别名丹皮、粉丹皮、木芍药、条丹皮、洛阳花，系毛茛科芍药属植物牡丹的根皮。用于温毒发斑、吐、衄、便血，骨蒸劳热，经闭痛经，痈肿疮毒，跌扑伤痛。牡丹皮含芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚苷、丹皮酚原苷、丹皮酚、苯甲酸、挥发油、糖类及甾醇等多种成份。研究发现芍药苷具有扩张冠状动脉，增加冠脉流量，对抗急性心肌缺血，抑制血小板凝聚及降低血压等药理作用刘芳，杨广德，白芍中芍药苷的提取方法研究，中成药，2003年10期。
中国专利CN1418673A提供了一种丹皮总苷的制备方法，按其所述方法制备的丹皮总苷，成分复杂，除包含有芍药苷类成份外，还含有易挥发性成份丹皮酚及其它杂质成分，成份含量不稳定，并且水溶性不好，难以满足药物质量稳定和多剂型应用开发的要求。中国专利CN1420122提供了制备芍药苷单体的方法，但制备方法非常复杂，不利于工业上的推广应用。因此开发一种水溶性好、质量稳定可控、制备方法简单，易于操作，有利于工业上推广应用，且药效与芍药苷单体相当的丹皮总苷提取物具有深远的临床意义。
发明内容
本发明提供了一种丹皮总苷提取物，主要含有芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚苷、丹皮酚原苷，总苷含量不低于80％，100％＞芍药苷含量≥60％。
本发明提供了丹皮总苷提取物的制备方法。
本发明提供了丹皮总苷提取物在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。
本发明提供了丹皮总苷提取物在制备治疗或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
本发明提供了丹皮总苷提取物在制备治疗或预防脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
本发明提供了丹皮总苷提取物在制备治疗或预防脑外伤的药物中的应用。
本发明提供了丹皮总苷提取物在制备抗休克、抗心衰、抗心肌缺血、抗脑缺血(厥脱、胸痹、中风)及老年性痴呆的药物中的应用。
本发明提供了以丹皮总苷提取物为活性成分的药物组合物。
本发明提供的丹皮总苷提取物的制备方法为将牡丹皮药材粉碎，用0～95％乙醇水溶液提取药材1～3次，合并提取液，减压浓缩，上大孔树脂柱层析，先用水洗脱，再用10～50％乙醇洗脱，收集10％-50％乙醇洗脱液，减压浓缩，有机溶剂萃取去除杂质，水溶液加乙醇使浓度达80～90％，滤去沉淀物，滤液浓缩、干燥，得丹皮总苷粗品，粗品用70～100％乙醇溶解，上氧化铝柱层析，用70～100％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇、干燥即得。其中大孔树脂选自弱极性或极性的大孔树脂，优选为D101、D-3520或AB-8。
本发明所述的丹皮总苷提取物在用于上述任一用途时，其使用剂量范围为30mg～8000mg/天，优选90mg～3000mg/天，更优选为300mg～1000mg/天。
本发明中使用的丹皮总苷可以单独使用或以药物组合物形式使用。药物组合物可以是丹皮总苷提取物和药用辅料组成，也可以是丹皮总苷提取物与其它药物组成。药物组合物可以通过口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉途径给药。药物组合物可以以粉针剂、注射液、片剂、胶囊、软胶囊、滴丸或口服液的形式存在。本发明所述各种剂型均可以以药学常规方法制备而成。
本发明人通过下列试验证实了丹皮总苷提取物具有治疗或预防心脑血管疾病的作用，且作用与芍药苷单体相当。
具体实施例方式实施例1制备丹皮总苷取丹皮药材(产地铜陵)20kg，粉碎成粗粉，放入提取罐中；加200L的水沸提2次，每次2h，过滤后，减压浓缩至约30L；上AB-8型大孔吸附树脂柱，用水充分洗脱至流出液为澄清且无还原糖反应后，再用40％乙醇洗脱；收集洗脱液，减压浓缩，氯仿萃取2次，回收氯仿，水溶液加入95％乙醇，使醇浓度为80％。放冷静置0.5h，滤去沉淀物，将滤液减压回收至干，即得丹皮总苷原料1kg。经HPLC检测有效部位丹皮总苷中总苷含量为66％，主要成分芍药苷含量为42％。将丹皮总苷原料溶于无水乙醇，上氧化铝柱层析，用无水乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇、干燥，得精制丹皮总苷，有效部位丹皮总苷中总苷含量为85％，主要成分芍药苷含量为71％。
实施例2制备丹皮总苷冻干粉针在洁净条件下，取精制丹皮总苷50g，加适量注射用水溶解后，搅拌溶解，超滤，得到无热源的澄清液，加注射用水至1000ml，分装为1000支，按冻干粉针工艺冻干，制成含丹皮总苷50mg的冻干粉针。
实施例3制备丹皮总苷胶囊取上述丹皮总苷原料100g，淀粉50g，β环糊精100g混匀，制粒，过筛，干燥后装成1000粒胶囊(100mg/粒)，即得。
实施例4制备丹皮总苷片取上述丹皮总苷原料100g，淀粉50g，β环糊精100g混匀，制粒，过筛，干燥后压成1000片(100mg/片)，即得。
试验例1丹皮总苷对大鼠局部脑缺血损伤的影响1.1材料丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量为90％。
红四氮唑美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。
实验动物普通级Wistar大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
1.2方法与结果动物随机分为假手术组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)，芍药苷组(3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg)、丹皮总苷组(3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg、810mg/kg)剂量组，每组10只。禁食12小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成左侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。术后各组动物静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。24小时后按文献刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的大鼠脑中动脉模型，药学学报，1995，30662所述方法及标准观察并记录大鼠的行为障碍(A)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑千，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。结果如表1所示，缺血24小时后，模型对照组大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右给予不同剂量的丹皮总苷动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性；相同剂量下丹皮总苷与芍药苷在抗脑缺血方面作用相当。
1.3结论丹皮总苷具有显著的脑保护作用，能有效的抑制缺氧对脑组织的损伤，其作用与相同剂量的芍药苷相当。
表1 丹皮总苷对大鼠局部脑缺血损伤的影响(n＝10，X±s)
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
试验例2丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠生理指标的影响2.1试验材料普通级SD大鼠，雄性，体重250～300g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106005号。
红花注射液万荣三九药业有限公司，规格5ml/只，批号040130，国药准字Z14021640
受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
心电图机单道心电图机(FX-2111)，北京福田电子医疗仪器有限公司2.2方法与结果取雄性健康大鼠90只，随机分为9组，模型组给予等体积的生理盐水，红花注射液组按150mg/kg尾静脉注射给药，芍药苷组按3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg尾静脉注射给药，丹皮总苷组分别按3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg、810mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药10min后腹腔注射20％乌拉坦1.2g/kg麻醉，背位固定，记录正常心电图。胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸壁，该手术在30秒内完成。记录缺血后心电图变化。
数据用X±sD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表2.丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠心电图J点的影响
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，结果显示，与模型组比较丹皮总苷组(3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg、810mg/kg)与芍药苷组在60min均能明显降低J点抬高的幅度(P＜0.05)。随着剂量的增加，丹皮总苷对心肌缺血的改善作用也显著提高，810mg/kg、27mg/kg均能对缺血大鼠初始心电图有明显的作用(P＜0.05或P＜0.01)。
2.3结论丹皮总苷对心肌具有保护作用，能降低缺血引起的心肌损伤，其对心肌的保护作用与相同剂量的芍药苷相当。
试验例3丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠生化指标的影响3.1实验材料普通级SD大鼠，雄性，体重250～300g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106005号。
红花注射液万荣三九药业有限公司，规格5ml/只，批号040130，国药准字Z14021640受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
AST/GOT试剂盒中生北控生物科技股份有限公司，批号020101CK试剂盒中生北控生物科技股份有限公司，批号090091LDH试剂盒中生北控生物科技股份有限公司，批号130051紫外分析仪722E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司离心机台式高速离心机(TGL-16G)，上海医用分析仪器厂3.2方法与结果取雄性健康大鼠100只，随机分为10组，假手术组、模型组给予等体积的生理盐水，红花注射液组按150mg/kg剂量尾静脉注射给药，芍药苷组按3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg尾静脉注射给药，丹皮总苷组分别按3、9、27、810mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药10min后腹腔注射20％乌拉坦1.2g/kg麻醉，背位固定。胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸壁，该手术在30秒内完成。6h后将大鼠固定在解剖板上，分离颈总动脉，抽取血液，静置10min后，4500rpm离心15min，吸取血清，利用试剂盒检测CK、LDH、AST酶活。
数据用X±SD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表3丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠血液中酶活的影响
*表示与模型组比较*p＜0.05，***p＜0.001；#表示与假手术组比较，###p＜0.001结果显示，该心肌缺血模型能显著提高缺血大鼠血清中CK、AST、LDH酶活的活性(P＜0.001)，与模型组比较丹皮总苷组均能显著降低上述三种酶的活性(P＜0.05或P＜0.01)，其作用与相同剂量的芍药苷相当。
3.3结论丹皮总苷对心肌组织具有保护作用，能有效地改善机体因心肌缺血引起的组织损伤，使机体血清中CK、AST、LDH酶活性显著降低。
试验例4丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠形态学指标的影响4.1试验材料普通级SD大鼠，雄性，体重250～300g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106005号。
红花注射液万荣三九药业有限公司，规格5ml/只，批号040130，国药准字Z14021640受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
氯化硝基四氮唑兰，前进化学试剂厂(上海)，批号20010801电子天平，BP 210S，Sartorius(德国)4.2方法与结果取雄性健康大鼠90只，随机分为9组，模型组给予等体积的生理盐水，红花注射液组按150mg/kg剂量尾静脉注射给药，芍药苷组按3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg尾静脉注射给药，丹皮总苷组分别按3、9、27、810mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药10min后腹腔注射20％乌拉坦1.2g/kg麻醉，背位固定。胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，该手术在30秒内完成。在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸壁，6h后将大鼠固定在解剖板上，打开胸腔，剥离心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管脂肪等非心肌组织，沿冠状沟切除心房，留下心室，称重。顺房室沟从心尖到心基部平行将心室切成0.1cm厚的心肌片，将心肌片放在0.3％的NBT，在37℃孵育4min，染色后立即用水冲洗去多余的染料，减去各心肌片被染色的非梗死区心肌，称量未染色的梗死区心肌，利用下列公式算出心肌梗死面积(％)
数据用X±SD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表4.丹皮总苷对冠状动脉结扎大鼠心肌梗死重量百分率的影响
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01结果显示与模型组比较，丹皮总苷(3、9、27、810mg/kg)均能显著降低心肌梗死百分率(P＜0.05)，在相同剂量下与芍药苷的药效作用相当。
4.3结论丹皮总苷在一定剂量下具有保护心肌组织的作用，能缓解缺血对心肌细胞的损伤。
试验例5丹皮总苷对小鼠凝血时间的影响5.1实验材料清洁级昆明种小鼠，雄性，体重20～22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106003号。
受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
5.2方法与结果取雄性健康小鼠70只，随机分为7组，正常对照组按0.2ml/只尾静脉注射生理盐水，芍药苷组按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg尾静脉注射给药，丹皮总苷分别按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药0.2h后，眼眶采血，玻片法测定血液凝固时间。
数据用X±SD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表5丹皮总苷对小鼠凝血时间的影响
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01 ***p＜0.001结果显示丹皮总苷(6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg)、芍药苷(6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg)与模型组比较具有显著的抗凝血作用(p＜0.05)。
5.3结论丹皮总苷在一定剂量下能显著延长凝血时间，有一定的活血化瘀作用，与相同剂量的芍药苷作用相当。
试验例6丹皮总苷对小鼠亚硝酸钠中毒的影响6.1实验材料清洁级昆明种小鼠，雄性，体重20～22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106003号。
受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
6.2方法与结果取雄性健康小鼠70只，随机分为7组，正常对照组按0.2ml/只尾静脉注射生理盐水，芍药苷组分别按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg剂量尾静脉注射给药，丹皮总苷分别按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药10min后，四组均腹腔注射2％亚硝酸钠溶液，剂量为0.02ml/g，然后记录小鼠死亡时间。
数据用X±SD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表6丹皮总苷对小鼠存活时间的影响
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001由表6可见，与模型组比较丹皮总苷在三个剂量下均能显著延长小鼠的存活时间(p＜0.05)，在相同剂量下丹皮总苷与芍药苷的药效作用相当。
6.3结论丹皮总苷在一定剂量下能显著缓解中毒性缺氧对组织的损伤，有一定的抗组织缺氧的作用。
试验例7丹皮总苷对小鼠脑缺血的影响7.1实验材料清洁级昆明种小鼠，雄性，体重20～22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106003号。
受试样品丹皮总苷由实施例1制得，其中总苷含量为85％。
芍药苷购自宣城百草植物工贸有限公司，经HPLC检测含量大于90％。
7.2方法与结果取雄性健康小鼠90只，随机分为9组，正常对照组按0.2ml/只尾静脉注射生理盐水，芍药苷组按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg剂量尾静脉注射给药，丹皮总苷分别按6mg/kg、18mg/kg、54mg/kg剂量尾静脉注射给药，给药10min后，不需麻醉，用大剪刀在耳下部快速断头，记录喘气时间。
数据用X±SD表示，并与模型组比较，以t检验进行统计学处理。
表7丹皮总苷对小鼠脑缺血的影响
*表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001由表7可见，与模型组比较丹皮总苷、芍药苷在三个剂量下均能明显延长小鼠的喘息时间(p＜0.05)。
7.3结论丹皮总苷在一定剂量下能显著降低小鼠脑耗氧量，对小鼠脑组织具有保护作用，能有效的保护缺氧对脑组织的损伤，在相同剂量下丹皮总苷与芍药苷的药效作用相当。
试验例8丹皮总苷提取物的急性毒性试验8.1材料丹皮总苷提取物根据实施例1制备。
清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106003号。
饲料由中国药品生物制品鉴定检验所提供。
8.2方法实验动物按SOP要求检疫一周，剔除不合格动物。试验室与饲养室条件一致。室温18-25℃，湿度40-60％，过滤送风，光照12小时。自由摄食和饮水，每日更换饮水瓶一次。取健康小鼠40只，雌雄各半。随机分为4组，每组10只。称重后，按4000、3000、2250、1687mg/kg的剂量尾静脉注射给药。给药后密切观察72小时，记录小鼠的死亡情况。
8.3结果丹皮总苷的LD50为3756.4±148.6mg/kg，LD50的95％的可信限为3578.2～3912.2mg/kg。
权利要求
1.一种丹皮总苷提取物，主要含有芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚苷、丹皮酚原苷，其中100％＞丹皮总苷≥80％，100％＞芍药苷≥60％。
2.权利要求1所述的丹皮总苷提取物，优选为100％＞丹皮总苷≥90％，100％＞芍药苷≥70％。
3.根据权利要求1或2所述的丹皮总苷提取物的制备方法，其特征为取牡丹皮药材，粉碎，用0～95％乙醇水溶液提取药材1～3次，合并提取液，减压浓缩，上大孔树脂柱层析，先用水洗脱，再用10～50％乙醇洗脱，收集10～50％乙醇洗脱液，减压浓缩，有机溶剂萃取去除杂质，水溶液加乙醇使浓度达80～90％，滤去沉淀物，滤液浓缩、干燥，得丹皮总苷提取物粗品；所得丹皮总苷提取物粗品用70～100％乙醇溶解，上氧化铝柱层析，用70～100％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇、干燥。
4.含有权利要求1或2所述的丹皮总苷提取物的药物组合物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其可以以粉针剂、注射液、片剂、胶囊、软胶囊、滴丸和口服液的形式存在。
6.丹皮总苷提取物在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。
7.丹皮总苷提取物在制备治疗或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
8.丹皮总苷提取物在制备治疗或预防脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
9.丹皮总苷提取物再制备治疗或预防脑外伤的药物中的应用。
10.丹皮总苷提取物再制备抗休克、抗心衰、抗心肌缺血、抗脑缺血(厥脱、胸痹、中风)及老年性痴呆的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种丹皮总苷提取物及其制备方法。本发明还提供了丹皮总苷提取物在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用，具体涉及丹皮总苷提取物在制备治疗或预防缺血性脑中风、脑缺血/再灌注损伤、脑外伤、抗休克、抗心衰、抗心肌缺血、抗脑缺血(厥脱、胸痹、中风)及老年性痴呆的药物中的应用。
文档编号A61K9/08GK1788753SQ20041007549
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者高玉白, 王超云, 张太平, 孙芳 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司
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