顺式藁本内酯的提取方法及其药用用途的制作方法
专利名称：顺式藁本内酯的提取方法及其药用用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及药用植物中的顺式藁本内酯的提取方法，尤其是川芎中的顺式藁本内酯的提取方法，以及顺式藁本内酯的药用用途。
背景技术：
顺式藁本内酯的结构及物理性质结构式 分子式及分子量C12H14O2190，不饱和度为6。
化学名(10Z)-3-亚丁基-4，5-二氢苯酞英文化学名(10Z)-3-butylidene-4，5-dihydrophthalide英文名ligustilide性状描述微黄色带香味的油状物，沸点168～169℃/6mmHg。可溶于正己烷、环己烷、石油醚、乙醚、醋酸乙酯、甲醇等。
藁本内酯提取及应用的现状藁本内酯具有两个同分异构体，一个是顺式，一个是反式。这两种同分异构体在天然植物中的存在具有选择性，从而决定了分别含有顺式和反式的天然药物具有不同的药用用途。如川芎中的藁本内酯主要以顺式存在，而当归中的藁本内酯主要以反式存在，川芎为活血药的代表，当归为补血药的代表。目前，对藁本内酯进行的药理学研究，其藁本内酯主要从当归中提取而得，药理学研究主要集中在平喘、解痉、镇静、抑制平滑肌细胞增殖、抑菌等方面，而从川芎中提取的顺式藁本内酯，有关药理学的研究还未见报道。由于川芎中获取的顺式藁本内酯的药理学研究的缺乏，以致于误认为两种不同物质的药理作用是相同的。
目前，当归中的藁本内酯的提取方法有药材(当归)粉碎，正己烷冷浸提取，减压浓缩，得提取物，将提取物溶于乙醚中，5％NaOH液萃取，乙醚层水洗，脱水，回收，得中性油，桂胶柱层析，以氯仿洗脱，收集相应部分即得藁本内酯。[陆蕴如，中药化学，学苑出版社，1995；337]药材(当归)粉碎，以石油醚(60-90℃)加热回流提取三次，每次4小时，合并提取液，减压回收溶剂，浸膏置冰箱冷冻一昼夜，将析出的固体与液体分开，油液拌以适量粗孔硅胶，室温凉干，低温干燥。粗孔桂胶用湿法装柱后，样品置层析柱顶端，以冷冻过的石油醚快速冲洗，除去挥发油等低极性组分，以石油醚-乙醚洗脱，此部分减压回收溶剂后得橙黄色油状物，将此粗品再拌以硅胶，以石油醚-乙酸乙酯洗脱。重复分离两次，得一淡黄色油状物，即藁本内酯。[陶静仪，等，当归成分藁本内酯平喘作用的实验研究，药学学报，1984，19(8)561-565。
川芎中的顺式藁本内酯的提取方法有如下报道将药材(川芎)粉碎，用80℃热水浸泡20小时，过滤，滤液用苯提取三次，苯提取后水层，乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析，苯-乙酸乙酯洗脱出组分3，经硅胶柱层析，苯-乙酸乙酯(2∶3)洗脱，分割成7个组分，其中组分2经制备薄层层析，正己烷-乙醚(4∶1)展开得藁本内酯。[王普善，等。中药川芎的化学成分研究-五种内酯类化合物，中草药，1985，16(3)137]上述方法在提取和分离顺式藁本内酯的过程中不仅大量使用了毒性很大的苯，而且所采用的分离手段只适用于实验室研究，无法进行工业化生产。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺点，本发明的目的在于提供一种顺式藁本内酯的提取方法，该方法采用低毒、低成本的有机溶剂结合高剪切技术的方法来提取、分离药材中的顺式藁本内酯的，所得产物收率高，产物纯度在90％以上，而且提取工艺简单可靠，适用于工业化生产。
本发明的另一目的在于提供顺式藁本内酯在制备治疗和预防与微循环障碍有关的疾病的药物中的应用。
本发明的上述目的是这样实现的一种顺式藁本内酯的提取方法，该方法包括如下步骤1.预处理及粉碎步骤将待提取的药材进行去杂质、清洗后，粉碎成细粉。
2.高剪切提取步骤在提取罐中加入提取溶剂乙醇、乙酸乙酯或石油醚中的任意之一或任意组合，在高剪切仪器的运转下，于提取罐中连续加入粉碎的药材，在提取温度下进行提取，达到提取时间后提取完成。
3.分离、纯化步骤收集提取液，弃去残渣，减压回收提取液中的溶剂，液体剩余物直接上样于硅胶柱，用洗脱剂洗脱，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚的混合物。收集第二色带，减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物采用同样的硅胶柱层析的方法多次纯化，直至纯度达到90％以上。将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去残余溶剂，即得产物顺式藁本内酯。
本发明的提取方法具体实施于药材川芎中的顺式藁本内酯的提取，因为川芎中的顺式藁本内酯含量高，提取到的产物顺式藁本内酯的收率高，当然，本提取方法也可用于其它药材的顺式藁本内酯有效成分的提取，诸如当归等。
采用本发明的提取方法进行提取时，首先需要将待提取药材进行预处理及粉碎，即将药材去杂质、清洗后，粉碎成细粉，细粉粒径为0.1-1mm。一般情况下，粒度越小越有利于缩短提取时间和提高提取收率。需要注意的是，由于有效成分顺式藁本内酯的不稳定性，粉碎后的药材需尽早进行提取，最迟不能超过一天。
其次，在提取罐中加入提取溶剂，提取溶剂的用量与待提取药材的用量的质量比主要由待提取药材中的有效成分含量的高低决定，即药材中藁本内酯含量越高，提取溶剂量就越大，通常质量比为3∶1-15∶1。在高剪切仪器的运转下，于提取罐中连续加入粉碎的药材。在提取过程中，高剪切仪器的转速从2000/分逐渐升高至20000/分。在提取过程中，提取溶剂与待提取药材的混合体系的温度即提取温度随提取时间和提取环境温度的改变而不尽相同。提取过程中提取温度从室温不断上升，但必须控制使其不超过60℃。如果在提取过程中，提取温度上升至60℃，则需停止提取工作，关闭高剪切仪，待温度下降以后，再继续进行提取。通常提取温度在20℃-60℃的范围内。所需的提取时间主要由被提取药材粉碎程度和药材中的有效成分含量的高低决定，药材中的顺式藁本内酯含量高，提取时间就长；药材粉碎得越细，提取时间就越短，提取时间通常为0.5-3小时。
最后，待提取完成后，收集提取液，弃去残渣，控制温度在20℃-60℃之间，减压回收提取液中的溶剂，液体剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，将硅胶柱装置避光放置，用洗脱剂石油醚和乙酸乙酯的混合物进行洗脱。洗脱剂石油醚和乙酸乙酯的比例必须视待分离的混合物中的杂质及其含量的多少而确定。杂质多，杂质含量高，该比例值就高，其比例的范围为100∶0-4∶1。收集第二色带，减压回收洗脱液中的溶剂，温度控制在20℃-60℃。采用同样的硅胶柱层析的方法多次分离、纯化，直至顺式藁本内酯的纯度达到90％以上。将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，液体剩余物用分子蒸馏法脱去残余溶剂，分子蒸馏的温度为20-40℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐上升，最高升至500Pa(分子蒸馏的真空度取决于设备本身，但不能高于500Pa)，最后得到产物顺式藁本内酯，纯化后的产物——顺式藁本内酯必须在-10℃以下避光储藏。
本发明提供的提取方法与现有技术的提取方法相比，提取溶剂和洗脱溶剂的毒性低、安全性高，溶剂用量大幅度降低，产物收率高，适合于大工业生产；所得产物顺式藁本内酯不含残留溶剂，产物纯度高，达到我国《药品注册管理办法》中规定的一类中药新药的纯度要求。
发明人发现顺式藁本内酯有治疗和预防与微循环障碍有关的疾病的作用。药理试验的结果表明该化合物具有以下药理作用1、显示良好的改善微循环作用，对高分子右旋糖酐所致急性微循环障碍模型的影响如下对血液流速流态的影响表现为3.0、1.5、0.75mg/kg三个剂量组均能明显改善血液流动状态(P＜0.01)，使血液流态粒缓流改善为线粒流和粒流；微血管造影法显示各剂量组均能增加血流速度，缩小耳眼循环时间(P＜0.01)。此外，微血管造影法显示出还可明显减少微血管渗漏，降低微血管通透性(P＜0.01)，进而阻止水肿的发生。顺式藁本内酯各剂量组血液鲜红程度强于模型组，与正常组相似。因此可用于微循环障碍疾病的治疗和预防，包括休克、糖尿病并发症、心肺功能障碍、脑功能障碍及多脏器衰竭等的治疗和预防。
2、顺式藁本内酯具有显著降低内毒素休克小鼠死亡率的作用，其作用强度强于地塞米松。其最大特点是可有效避免由于大剂量内毒素所致循环障碍，主要表现在可维持小鼠体温正常，而模型组和地塞米松组动物体温急剧下降。藁本内酯组死亡率为30％，地塞米松组死亡率为60％，模型组死亡率为80％。
3、顺式藁本内酯具有显著的对抗油酸所致大鼠呼吸窘迫综合征的作用，具体表现为显著降低肺水肿、肺瘀血，改善呼吸功能及减慢心率的作用。
4、顺式藁本内酯具有显著的对抗心绞痛、心肌梗死的作用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细阐述。
具体实施例方式
实施例1将川芎药材100Kg粉碎成细粉，粒径为0.1-1mm。在提取罐中加入1500kg的95％乙醇，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，提取温度从室温20℃逐渐升高，控制其在60℃以下，提取时间为3小时。收集提取液，于60℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(98∶2)洗脱，收集第二色带，于40℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化3次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为40℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至10Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯0.98kg，收率为0.98％，纯度为93.2％。
实施例2将川芎药材115Kg粉碎成细粉0.1-1mm，在提取罐中装入800kg乙酸乙酯，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，提取温度为20℃-60℃，提取时间为1.5小时，收集提取液，于50℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(9∶1)洗脱，收集第二色带，于50℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化2次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为40℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至100Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯1.18kg，收率为1.03％，纯度为92.82％。
实施例3将川芎药材110Kg粉碎成细粉0.1-1mm，在提取罐中装入330kg石油醚，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，提取温度控制在20-60℃之间，提取时间为0.5小时，收集提取液，于20℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(4∶1)洗脱，收集第二色带，于50℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物同法反复纯化2次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为40℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至500Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯1.02kg，收率为0.93％，纯度为92.82％。
实施例4将川芎药材90 Kg粉碎成细粉，粒径为0.1-1mm。在提取罐中加入450kg的石油醚和乙酸乙酯的混合物，其比例为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，控制提取温度在20-60℃，提取时间为40分钟。收集提取液，于40℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(99∶1)洗脱，收集第二色带，于40℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化2次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为20℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至10Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯0.81kg，收率为90％，纯度为95.4％。
实施例5将川芎药材105Kg粉碎成细粉，粒径为0.1-1mm。在提取罐中加入840kg的乙醇和石油醚混合物，其比例为乙醇∶石油醚＝5∶1，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，控制提取温度在20-60℃，提取时间为1小时。收集提取液，于45℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(95∶5)洗脱，收集第二色带，于45℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化3次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为35℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至500Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯1.02kg，收率为0.97％，纯度为94.27％。
实施例6将川芎药材30Kg粉碎成细粉，粒径为0.1-1mm。在提取罐中加入180kg的乙醇和石油醚混合物，其比例为乙醇∶石油醚＝3∶1，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，控制提取温度在20-60℃，提取时间为1小时。收集提取液，于50℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(9∶1)洗脱，收集第二色带，于45℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化3次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为45℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至10Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯0.26kg，收率为0.86％，纯度为96.45％。
实施例7将川芎药材42Kg粉碎成细粉，粒径为0.1-1mm。在提取罐中加入210kg的石油醚，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，控制提取温度在20-60℃，提取时间为1小时。收集提取液，于45℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚洗脱，收集第二色带，于45℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化2次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为40℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至300Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯0.37kg，收率为0.88％，纯度为94.23％。
实施例8顺式藁本内酯对内毒素休克小鼠的保护作用。
昆明种小鼠，18±2g，100只，分为5组，分别为模型组、顺式藁本内酯小剂量(BT-L)组、顺式藁本内酯中剂量(BT-M)组、顺式藁本内酯大剂量(BT-H)组和地塞米松组，其中BT表示顺式藁本内酯，以上各表示方式同样适用于以下各实施例。
各组动物复制小鼠内毒素休克模型后，顺式藁本内酯各组灌胃给药，地塞米松组腹腔注射给药，观察24小时小鼠的存活率，及动物一般情况和活动状态。结果见表1。
表1 顺式藁本内酯对内毒素体克小鼠死亡率的影响组别 剂量(mg/kg)动物数死亡数模型组 - 2017BT-H 10(ig) 206BT-M 5(ig) 2010BT-L 2.5(ig)2014地塞米松 10(ip) 2012由表1可知，该模型是成功的。模型组和地塞米松组动物表现为周身发冷，唇色发紫，而各BT组动物体温正常，唇色与给药前无显著性变化。试验结果表明顺式藁本内酯具有显著降低内毒素休克小鼠死亡率的作用。
实施例9顺式藁本内酯对高分子右旋糖酐所致急性家兔微循环障碍模型的影响研究将受试新西兰家兔(体重2.0-2.5kg)，按体重随机分为6组，每组10只。包括①正常对照组(NS)；②模型组(CONTROL)；③BT-H组；④BT-M组；⑤BT-L组；⑥阳性药-脑得生组(NDSH)。
建立模型后，将对照组和模型组给等体积生理盐水，其它组灌胃给药，1小时后，观察记录给药后微循环情况。
①血液流态流速的观察根据田牛血流速度分级测定法测定。其方法为根据血流运动形式，将流速分成七级(1)线流 (2)线粒流 (3)粒线流 (4)粒流 (5)粒缓流 (6)粒摆流 (7)停滞。
试验结果通过计算机运用SAS软件进行RIDIT分析，测定结果见表2。
表2 对DEXTRAN T500所致急性家兔微循环障碍的流态流速分级的影响组别 动物剂量流态流速分级显著性(只)mg/kg 线流 线粒流 粒流 粒缓流NS 9 - 8 10 0 -CONTROL9 - 0 02 7 ★★BT-H 9 3 0 44 1 **BT-M 10 1.50 36 1 **BT-L 10 0.75 0 36 1 **NDSH 10 3270 26 2 **注给药组与模型组相比，**表示P＜0.01。
模型组与对照组相比，★★表示P＜0.01。
由表2可知，模型组与正常组相比，软脑膜微血管内血流速度明显减慢，由正常的线流、粒线流变为粒流或粒缓流(P＜0.01)；顺式藁本内酯各剂量组和脑得生组给药1小时后，与模型组相比，均能明显改善血流流态(P＜0.01)，顺式藁本内酯随着剂量的增加，药效有增强的趋势。
②对红细胞聚集的影响按田牛的三级分类法观察记录。其方法分为以下三级(1)红细胞轻度聚集 (2)红细胞中度聚集 (3)红细胞重度聚集。
试验结果通过计算机运用SAS软件进行RIDIT分析，测定结果见表3。
表3 对DEXTRAN T500所致急性家兔微循环障碍红细胞聚集的影响组别 动物剂量mg/kg红细胞聚集分级 显著性(只) 无 轻中重NS9 -9 1 0 0-CONTROL 9 -0 0 8 1★★BT-H 9 3.0 0 4 5 0**BT-M 10 1.5 0 3 6 1**BT-L 10 0.75 0 2 7 1**NDSH 10 327 0 3 6 1**注与模型组相比，**表示P＜0.01。
模型组与对照组相比，★★表示P＜0.01。
由表3可知，模型组微血管内红细胞出现中度聚集，个别出现重度聚集，与生理盐水对照组相比，红细胞聚集明显(P＜0.01)；顺式藁本内酯各剂量组和脑得生组给药1小时后，均能改善红细胞聚集(P＜0.01)。脑得生片对红细胞聚集的影响与顺式藁本内酯中剂量组相当。
③血液流速测定以微血管造影法测定耳-眼循环时间表示表4 对DEXTRAN T500所致急性家兔微循环障碍血液流速的影响(x±s)组别动物只剂量 耳眼循环时间(s)mg/kgNS 9 -5.90±0.42CONTROL9 -8.30±0.62★★BT-H 9 3.0 6.84±0.48**BT-M 10 1.5 7.51±0.44**BT-L 10 0.75 6.06±0.43**NDSH 10 327 7.22±0.85**注与模型组相比，**表示P＜0.01。
模型组与对照组相比，★★表示P＜0.01。
由表4可知，与对照组比，模型组静注高分子右旋糖酐后，耳眼循环时间明显延长(P＜0.01)；顺式藁本内酯各剂量组和脑得生组给药1小时后，均能明显缩短耳眼循环时间(P＜0.01)，藁本内酯各组间差异不显著。
④微血管通透性改变的观察——以微血管造影法来显示将已观察耳眼循环时间的动物，采用微循环观察仪观察微血管内外荧光物质的变化。参照上海医科大学病理生理教研室的分级方法，将荧光物质渗出分为四级(1)渗出不明显(-)(2)轻度渗出(+)(3)中度渗出(++)(4)重度渗出(+++)试验结果通过计算机运用SAS软件进行RIDIT分析，测定结果见表5。
表5 对DEXTRAN T500所致急性家兔微循环障碍微血管通透性的影响(x±s)组别 动物 剂量 通透性分级 显著性(只) mg/kg - + +++++NS 9- 8 1 0 0 -CONTROL9- 0 0 2 7 ★★BT-H 93.0 0 3 5 1 **BT-M 10 1.503 6 1 1 **BT-L 10 0.750 2 7 1 **NDSH 10 327 0 2 6 2 **注与模型组相比，**表示P＜0.01。
模型组与对照组相比，★★表示P＜0.01。
由表5可知，与对照组相比，模型组静注高分子右旋糖酐后，家兔微血管外荧光物质明显增多(P＜0.01)；顺式藁本内酯各剂量组和脑得生组给药1小时后，均能明显减少软脑膜微血管外荧光物质(P＜0.01)，各剂量组差异不显著。
⑤微血管形态观察通过对各组动物进行显微摄像观察，顺式藁本内酯各剂量组对红细胞聚集、血色、血液流动状态、微血管周围渗漏及毛细血管中红细胞的灌注情况均有明显的改善作用，而脑得生片除其血色无改善外，其余指标基本与顺式藁本内酯相同。同时，藁本内酯各剂量组血液鲜红程度强于模型组，与正常组相似。
实施例10顺式藁本内酯对油酸所致大鼠呼吸窘迫综合征的保护作用将实验动物-SD雄性大鼠随机分为正常对照组、油酸致伤组、油酸致伤+BT-H、油酸致伤+BT-M、油酸致伤+BT-L、油酸致伤+地塞米松六个组，致伤组按0.15ml/kg尾静脉缓慢注入，正常对照组注入等量生理盐水。注射后立即给予相应药物。观察各组动物一般表现，呼吸频率、幅度，于注射油酸6小时后，开胸取肺，进行病理学观察。
试验结果①呼吸频率与一般状态动物注射油酸后逐渐发生呼吸急促，口唇紫绀。顺式藁本内酯使动物处于较为安静的状态，呼吸频率趋于正常，口唇紫绀现象明显减轻。
②病理学观察油酸损伤组，肺体膨大，表面呈暗红色充血水肿状，见弥散大片状出血瘀斑，切面见多量红色泡沫状液体溢出；顺式藁本内酯各剂量组肺体积较小，表观为红褐色，充血程度较轻，散在点状出血和小片瘀血斑，切面仅见少量粉红色泡沫样液体溢出。地塞米松的瘀血状改善不如顺式藁本内酯组。
③肺系数和肺湿/干重比值油酸损伤组肺系数和肺湿重/干重比值显著增加；而顺式藁本内酯保护系数和肺湿重/干重比值均比油酸组显著降低，提示肺水肿被缓解。结果见表6。
表6 顺式藁本内酯对油酸所致大鼠肺损伤的影响(x±s)
☆☆与空白组比较；★★与模型组比较。
权利要求
1.一种顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)预处理及粉碎步骤将待提取的药材进行去杂质、清洗后，粉碎成细粉；(2)高剪切提取步骤在提取罐中加入提取溶剂乙醇、乙酸乙酯或石油醚中的任意之一或任意组合，在高剪切仪器的运转下，于提取罐中连续加入粉碎的药材，在提取温度下进行提取，达到提取时间后提取完成；(3)分离、纯化步骤收集提取液，弃去残渣，减压回收提取液中的溶剂，液体剩余物直接上样于硅胶柱，用洗脱剂洗脱，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合物，收集第二色带，减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物采用同样的硅胶柱层析的方法多次分离、纯化，直至纯度达到90％以上。将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去残余溶剂，即得产物顺式藁本内酯。
2.如权利要求1所述的顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，其中所述的药材为川芎。
3.如权利要求1所述的顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，步骤(1)中的药材粉碎的细粉粒径为0.1至1mm。
4.如权利要求1所述的顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，步骤(2)中提取溶剂的用量与待提取药材的用量的质量比为3∶1-15∶1。
5.如权利要求1所述的顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，步骤(2)中的高剪切仪器的转速从转速2000/分逐渐上升到最大转速20000/分，提取温度为20℃-60℃，提取时间为0.5-3小时。
6.如权利要求1所述的顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝100∶0-4∶1，硅胶柱所用的硅胶为200-400目，减压回收溶剂的温度为20℃-60℃。
7.如权利要求1所述的药用植物中顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的分子蒸馏的真空度为10-6-500Pa，温度为20-40℃。
8.顺式藁本内酯在制备治疗和预防与微循环障碍有关的疾病的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病为休克、糖尿病并发症、心肺功能障碍、脑功能障碍、多脏器衰竭、呼吸窘迫综合症、心绞痛、心肌梗死。
全文摘要
本发明提供了一种天然顺式藁本内酯的提取、分离方法，其步骤包括预处理及粉碎步骤、高剪切提取步骤和分离、纯化步骤。该方法毒性低、使用安全，产物收率高、纯度高，适用于工业化生产。本发明还提供了用上述提取方法获得的顺式藁本内酯在制备治疗和预防与微循环障碍有关的疾病的药物中的应用。
文档编号A61K36/236GK1552702SQ0312399
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者刘俊, 魏玉平, 王永富, 邓颖杰, 俊 刘 申请人:北京九龙制药厂
技术领域：
本发明涉及药用植物中的顺式藁本内酯的提取方法，尤其是川芎中的顺式藁本内酯的提取方法，以及顺式藁本内酯的药用用途。
背景技术：
顺式藁本内酯的结构及物理性质结构式 分子式及分子量C12H14O2190，不饱和度为6。
化学名(10Z)-3-亚丁基-4，5-二氢苯酞英文化学名(10Z)-3-butylidene-4，5-dihydrophthalide英文名ligustilide性状描述微黄色带香味的油状物，沸点168～169℃/6mmHg。可溶于正己烷、环己烷、石油醚、乙醚、醋酸乙酯、甲醇等。
藁本内酯提取及应用的现状藁本内酯具有两个同分异构体，一个是顺式，一个是反式。这两种同分异构体在天然植物中的存在具有选择性，从而决定了分别含有顺式和反式的天然药物具有不同的药用用途。如川芎中的藁本内酯主要以顺式存在，而当归中的藁本内酯主要以反式存在，川芎为活血药的代表，当归为补血药的代表。目前，对藁本内酯进行的药理学研究，其藁本内酯主要从当归中提取而得，药理学研究主要集中在平喘、解痉、镇静、抑制平滑肌细胞增殖、抑菌等方面，而从川芎中提取的顺式藁本内酯，有关药理学的研究还未见报道。由于川芎中获取的顺式藁本内酯的药理学研究的缺乏，以致于误认为两种不同物质的药理作用是相同的。
目前，当归中的藁本内酯的提取方法有药材(当归)粉碎，正己烷冷浸提取，减压浓缩，得提取物，将提取物溶于乙醚中，5％NaOH液萃取，乙醚层水洗，脱水，回收，得中性油，桂胶柱层析，以氯仿洗脱，收集相应部分即得藁本内酯。[陆蕴如，中药化学，学苑出版社，1995；337]药材(当归)粉碎，以石油醚(60-90℃)加热回流提取三次，每次4小时，合并提取液，减压回收溶剂，浸膏置冰箱冷冻一昼夜，将析出的固体与液体分开，油液拌以适量粗孔硅胶，室温凉干，低温干燥。粗孔桂胶用湿法装柱后，样品置层析柱顶端，以冷冻过的石油醚快速冲洗，除去挥发油等低极性组分，以石油醚-乙醚洗脱，此部分减压回收溶剂后得橙黄色油状物，将此粗品再拌以硅胶，以石油醚-乙酸乙酯洗脱。重复分离两次，得一淡黄色油状物，即藁本内酯。[陶静仪，等，当归成分藁本内酯平喘作用的实验研究，药学学报，1984，19(8)561-565。
川芎中的顺式藁本内酯的提取方法有如下报道将药材(川芎)粉碎，用80℃热水浸泡20小时，过滤，滤液用苯提取三次，苯提取后水层，乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析，苯-乙酸乙酯洗脱出组分3，经硅胶柱层析，苯-乙酸乙酯(2∶3)洗脱，分割成7个组分，其中组分2经制备薄层层析，正己烷-乙醚(4∶1)展开得藁本内酯。[王普善，等。中药川芎的化学成分研究-五种内酯类化合物，中草药，1985，16(3)137]上述方法在提取和分离顺式藁本内酯的过程中不仅大量使用了毒性很大的苯，而且所采用的分离手段只适用于实验室研究，无法进行工业化生产。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺点，本发明的目的在于提供一种顺式藁本内酯的提取方法，该方法采用低毒、低成本的有机溶剂结合高剪切技术的方法来提取、分离药材中的顺式藁本内酯的，所得产物收率高，产物纯度在90％以上，而且提取工艺简单可靠，适用于工业化生产。
本发明的另一目的在于提供顺式藁本内酯在制备治疗和预防与微循环障碍有关的疾病的药物中的应用。
本发明的上述目的是这样实现的一种顺式藁本内酯的提取方法，该方法包括如下步骤1.预处理及粉碎步骤将待提取的药材进行去杂质、清洗后，粉碎成细粉。
2.高剪切提取步骤在提取罐中加入提取溶剂乙醇、乙酸乙酯或石油醚中的任意之一或任意组合，在高剪切仪器的运转下，于提取罐中连续加入粉碎的药材，在提取温度下进行提取，达到提取时间后提取完成。
3.分离、纯化步骤收集提取液，弃去残渣，减压回收提取液中的溶剂，液体剩余物直接上样于硅胶柱，用洗脱剂洗脱，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚的混合物。收集第二色带，减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物采用同样的硅胶柱层析的方法多次纯化，直至纯度达到90％以上。将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去残余溶剂，即得产物顺式藁本内酯。
本发明的提取方法具体实施于药材川芎中的顺式藁本内酯的提取，因为川芎中的顺式藁本内酯含量高，提取到的产物顺式藁本内酯的收率高，当然，本提取方法也可用于其它药材的顺式藁本内酯有效成分的提取，诸如当归等。
采用本发明的提取方法进行提取时，首先需要将待提取药材进行预处理及粉碎，即将药材去杂质、清洗后，粉碎成细粉，细粉粒径为0.1-1mm。一般情况下，粒度越小越有利于缩短提取时间和提高提取收率。需要注意的是，由于有效成分顺式藁本内酯的不稳定性，粉碎后的药材需尽早进行提取，最迟不能超过一天。
其次，在提取罐中加入提取溶剂，提取溶剂的用量与待提取药材的用量的质量比主要由待提取药材中的有效成分含量的高低决定，即药材中藁本内酯含量越高，提取溶剂量就越大，通常质量比为3∶1-15∶1。在高剪切仪器的运转下，于提取罐中连续加入粉碎的药材。在提取过程中，高剪切仪器的转速从2000/分逐渐升高至20000/分。在提取过程中，提取溶剂与待提取药材的混合体系的温度即提取温度随提取时间和提取环境温度的改变而不尽相同。提取过程中提取温度从室温不断上升，但必须控制使其不超过60℃。如果在提取过程中，提取温度上升至60℃，则需停止提取工作，关闭高剪切仪，待温度下降以后，再继续进行提取。通常提取温度在20℃-60℃的范围内。所需的提取时间主要由被提取药材粉碎程度和药材中的有效成分含量的高低决定，药材中的顺式藁本内酯含量高，提取时间就长；药材粉碎得越细，提取时间就越短，提取时间通常为0.5-3小时。
最后，待提取完成后，收集提取液，弃去残渣，控制温度在20℃-60℃之间，减压回收提取液中的溶剂，液体剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，将硅胶柱装置避光放置，用洗脱剂石油醚和乙酸乙酯的混合物进行洗脱。洗脱剂石油醚和乙酸乙酯的比例必须视待分离的混合物中的杂质及其含量的多少而确定。杂质多，杂质含量高，该比例值就高，其比例的范围为100∶0-4∶1。收集第二色带，减压回收洗脱液中的溶剂，温度控制在20℃-60℃。采用同样的硅胶柱层析的方法多次分离、纯化，直至顺式藁本内酯的纯度达到90％以上。将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，液体剩余物用分子蒸馏法脱去残余溶剂，分子蒸馏的温度为20-40℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐上升，最高升至500Pa(分子蒸馏的真空度取决于设备本身，但不能高于500Pa)，最后得到产物顺式藁本内酯，纯化后的产物——顺式藁本内酯必须在-10℃以下避光储藏。
本发明提供的提取方法与现有技术的提取方法相比，提取溶剂和洗脱溶剂的毒性低、安全性高，溶剂用量大幅度降低，产物收率高，适合于大工业生产；所得产物顺式藁本内酯不含残留溶剂，产物纯度高，达到我国《药品注册管理办法》中规定的一类中药新药的纯度要求。
发明人发现顺式藁本内酯有治疗和预防与微循环障碍有关的疾病的作用。药理试验的结果表明该化合物具有以下药理作用1、显示良好的改善微循环作用，对高分子右旋糖酐所致急性微循环障碍模型的影响如下对血液流速流态的影响表现为3.0、1.5、0.75mg/kg三个剂量组均能明显改善血液流动状态(P＜0.01)，使血液流态粒缓流改善为线粒流和粒流；微血管造影法显示各剂量组均能增加血流速度，缩小耳眼循环时间(P＜0.01)。此外，微血管造影法显示出还可明显减少微血管渗漏，降低微血管通透性(P＜0.01)，进而阻止水肿的发生。顺式藁本内酯各剂量组血液鲜红程度强于模型组，与正常组相似。因此可用于微循环障碍疾病的治疗和预防，包括休克、糖尿病并发症、心肺功能障碍、脑功能障碍及多脏器衰竭等的治疗和预防。
2、顺式藁本内酯具有显著降低内毒素休克小鼠死亡率的作用，其作用强度强于地塞米松。其最大特点是可有效避免由于大剂量内毒素所致循环障碍，主要表现在可维持小鼠体温正常，而模型组和地塞米松组动物体温急剧下降。藁本内酯组死亡率为30％，地塞米松组死亡率为60％，模型组死亡率为80％。
3、顺式藁本内酯具有显著的对抗油酸所致大鼠呼吸窘迫综合征的作用，具体表现为显著降低肺水肿、肺瘀血，改善呼吸功能及减慢心率的作用。
4、顺式藁本内酯具有显著的对抗心绞痛、心肌梗死的作用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细阐述。
具体实施例方式
实施例1将川芎药材100Kg粉碎成细粉，粒径为0.1-1mm。在提取罐中加入1500kg的95％乙醇，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，提取温度从室温20℃逐渐升高，控制其在60℃以下，提取时间为3小时。收集提取液，于60℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(98∶2)洗脱，收集第二色带，于40℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化3次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为40℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至10Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯0.98kg，收率为0.98％，纯度为93.2％。
实施例2将川芎药材115Kg粉碎成细粉0.1-1mm，在提取罐中装入800kg乙酸乙酯，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，提取温度为20℃-60℃，提取时间为1.5小时，收集提取液，于50℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(9∶1)洗脱，收集第二色带，于50℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化2次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为40℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至100Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯1.18kg，收率为1.03％，纯度为92.82％。
实施例3将川芎药材110Kg粉碎成细粉0.1-1mm，在提取罐中装入330kg石油醚，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，提取温度控制在20-60℃之间，提取时间为0.5小时，收集提取液，于20℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(4∶1)洗脱，收集第二色带，于50℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物同法反复纯化2次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为40℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至500Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯1.02kg，收率为0.93％，纯度为92.82％。
实施例4将川芎药材90 Kg粉碎成细粉，粒径为0.1-1mm。在提取罐中加入450kg的石油醚和乙酸乙酯的混合物，其比例为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，控制提取温度在20-60℃，提取时间为40分钟。收集提取液，于40℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(99∶1)洗脱，收集第二色带，于40℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化2次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为20℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至10Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯0.81kg，收率为90％，纯度为95.4％。
实施例5将川芎药材105Kg粉碎成细粉，粒径为0.1-1mm。在提取罐中加入840kg的乙醇和石油醚混合物，其比例为乙醇∶石油醚＝5∶1，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，控制提取温度在20-60℃，提取时间为1小时。收集提取液，于45℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(95∶5)洗脱，收集第二色带，于45℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化3次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为35℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至500Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯1.02kg，收率为0.97％，纯度为94.27％。
实施例6将川芎药材30Kg粉碎成细粉，粒径为0.1-1mm。在提取罐中加入180kg的乙醇和石油醚混合物，其比例为乙醇∶石油醚＝3∶1，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，控制提取温度在20-60℃，提取时间为1小时。收集提取液，于50℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚∶乙酸乙酯(9∶1)洗脱，收集第二色带，于45℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化3次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为45℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至10Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯0.26kg，收率为0.86％，纯度为96.45％。
实施例7将川芎药材42Kg粉碎成细粉，粒径为0.1-1mm。在提取罐中加入210kg的石油醚，启动高剪切仪，于提取罐中连续加入药粉进行提取，高剪切仪的转速从2000/分逐渐上升至20000/分，控制提取温度在20-60℃，提取时间为1小时。收集提取液，于45℃减压回收溶剂，剩余物直接上样于硅胶(200-400目)柱，用石油醚洗脱，收集第二色带，于45℃减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物用上述硅胶柱层析方法反复分离、纯化2次，将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去溶剂，分子蒸馏的温度为40℃，真空度在脱溶剂的过程中从10-6逐渐升至300Pa，脱去残余溶剂后得到顺式藁本内酯0.37kg，收率为0.88％，纯度为94.23％。
实施例8顺式藁本内酯对内毒素休克小鼠的保护作用。
昆明种小鼠，18±2g，100只，分为5组，分别为模型组、顺式藁本内酯小剂量(BT-L)组、顺式藁本内酯中剂量(BT-M)组、顺式藁本内酯大剂量(BT-H)组和地塞米松组，其中BT表示顺式藁本内酯，以上各表示方式同样适用于以下各实施例。
各组动物复制小鼠内毒素休克模型后，顺式藁本内酯各组灌胃给药，地塞米松组腹腔注射给药，观察24小时小鼠的存活率，及动物一般情况和活动状态。结果见表1。
表1 顺式藁本内酯对内毒素体克小鼠死亡率的影响组别 剂量(mg/kg)动物数死亡数模型组 - 2017BT-H 10(ig) 206BT-M 5(ig) 2010BT-L 2.5(ig)2014地塞米松 10(ip) 2012由表1可知，该模型是成功的。模型组和地塞米松组动物表现为周身发冷，唇色发紫，而各BT组动物体温正常，唇色与给药前无显著性变化。试验结果表明顺式藁本内酯具有显著降低内毒素休克小鼠死亡率的作用。
实施例9顺式藁本内酯对高分子右旋糖酐所致急性家兔微循环障碍模型的影响研究将受试新西兰家兔(体重2.0-2.5kg)，按体重随机分为6组，每组10只。包括①正常对照组(NS)；②模型组(CONTROL)；③BT-H组；④BT-M组；⑤BT-L组；⑥阳性药-脑得生组(NDSH)。
建立模型后，将对照组和模型组给等体积生理盐水，其它组灌胃给药，1小时后，观察记录给药后微循环情况。
①血液流态流速的观察根据田牛血流速度分级测定法测定。其方法为根据血流运动形式，将流速分成七级(1)线流 (2)线粒流 (3)粒线流 (4)粒流 (5)粒缓流 (6)粒摆流 (7)停滞。
试验结果通过计算机运用SAS软件进行RIDIT分析，测定结果见表2。
表2 对DEXTRAN T500所致急性家兔微循环障碍的流态流速分级的影响组别 动物剂量流态流速分级显著性(只)mg/kg 线流 线粒流 粒流 粒缓流NS 9 - 8 10 0 -CONTROL9 - 0 02 7 ★★BT-H 9 3 0 44 1 **BT-M 10 1.50 36 1 **BT-L 10 0.75 0 36 1 **NDSH 10 3270 26 2 **注给药组与模型组相比，**表示P＜0.01。
模型组与对照组相比，★★表示P＜0.01。
由表2可知，模型组与正常组相比，软脑膜微血管内血流速度明显减慢，由正常的线流、粒线流变为粒流或粒缓流(P＜0.01)；顺式藁本内酯各剂量组和脑得生组给药1小时后，与模型组相比，均能明显改善血流流态(P＜0.01)，顺式藁本内酯随着剂量的增加，药效有增强的趋势。
②对红细胞聚集的影响按田牛的三级分类法观察记录。其方法分为以下三级(1)红细胞轻度聚集 (2)红细胞中度聚集 (3)红细胞重度聚集。
试验结果通过计算机运用SAS软件进行RIDIT分析，测定结果见表3。
表3 对DEXTRAN T500所致急性家兔微循环障碍红细胞聚集的影响组别 动物剂量mg/kg红细胞聚集分级 显著性(只) 无 轻中重NS9 -9 1 0 0-CONTROL 9 -0 0 8 1★★BT-H 9 3.0 0 4 5 0**BT-M 10 1.5 0 3 6 1**BT-L 10 0.75 0 2 7 1**NDSH 10 327 0 3 6 1**注与模型组相比，**表示P＜0.01。
模型组与对照组相比，★★表示P＜0.01。
由表3可知，模型组微血管内红细胞出现中度聚集，个别出现重度聚集，与生理盐水对照组相比，红细胞聚集明显(P＜0.01)；顺式藁本内酯各剂量组和脑得生组给药1小时后，均能改善红细胞聚集(P＜0.01)。脑得生片对红细胞聚集的影响与顺式藁本内酯中剂量组相当。
③血液流速测定以微血管造影法测定耳-眼循环时间表示表4 对DEXTRAN T500所致急性家兔微循环障碍血液流速的影响(x±s)组别动物只剂量 耳眼循环时间(s)mg/kgNS 9 -5.90±0.42CONTROL9 -8.30±0.62★★BT-H 9 3.0 6.84±0.48**BT-M 10 1.5 7.51±0.44**BT-L 10 0.75 6.06±0.43**NDSH 10 327 7.22±0.85**注与模型组相比，**表示P＜0.01。
模型组与对照组相比，★★表示P＜0.01。
由表4可知，与对照组比，模型组静注高分子右旋糖酐后，耳眼循环时间明显延长(P＜0.01)；顺式藁本内酯各剂量组和脑得生组给药1小时后，均能明显缩短耳眼循环时间(P＜0.01)，藁本内酯各组间差异不显著。
④微血管通透性改变的观察——以微血管造影法来显示将已观察耳眼循环时间的动物，采用微循环观察仪观察微血管内外荧光物质的变化。参照上海医科大学病理生理教研室的分级方法，将荧光物质渗出分为四级(1)渗出不明显(-)(2)轻度渗出(+)(3)中度渗出(++)(4)重度渗出(+++)试验结果通过计算机运用SAS软件进行RIDIT分析，测定结果见表5。
表5 对DEXTRAN T500所致急性家兔微循环障碍微血管通透性的影响(x±s)组别 动物 剂量 通透性分级 显著性(只) mg/kg - + +++++NS 9- 8 1 0 0 -CONTROL9- 0 0 2 7 ★★BT-H 93.0 0 3 5 1 **BT-M 10 1.503 6 1 1 **BT-L 10 0.750 2 7 1 **NDSH 10 327 0 2 6 2 **注与模型组相比，**表示P＜0.01。
模型组与对照组相比，★★表示P＜0.01。
由表5可知，与对照组相比，模型组静注高分子右旋糖酐后，家兔微血管外荧光物质明显增多(P＜0.01)；顺式藁本内酯各剂量组和脑得生组给药1小时后，均能明显减少软脑膜微血管外荧光物质(P＜0.01)，各剂量组差异不显著。
⑤微血管形态观察通过对各组动物进行显微摄像观察，顺式藁本内酯各剂量组对红细胞聚集、血色、血液流动状态、微血管周围渗漏及毛细血管中红细胞的灌注情况均有明显的改善作用，而脑得生片除其血色无改善外，其余指标基本与顺式藁本内酯相同。同时，藁本内酯各剂量组血液鲜红程度强于模型组，与正常组相似。
实施例10顺式藁本内酯对油酸所致大鼠呼吸窘迫综合征的保护作用将实验动物-SD雄性大鼠随机分为正常对照组、油酸致伤组、油酸致伤+BT-H、油酸致伤+BT-M、油酸致伤+BT-L、油酸致伤+地塞米松六个组，致伤组按0.15ml/kg尾静脉缓慢注入，正常对照组注入等量生理盐水。注射后立即给予相应药物。观察各组动物一般表现，呼吸频率、幅度，于注射油酸6小时后，开胸取肺，进行病理学观察。
试验结果①呼吸频率与一般状态动物注射油酸后逐渐发生呼吸急促，口唇紫绀。顺式藁本内酯使动物处于较为安静的状态，呼吸频率趋于正常，口唇紫绀现象明显减轻。
②病理学观察油酸损伤组，肺体膨大，表面呈暗红色充血水肿状，见弥散大片状出血瘀斑，切面见多量红色泡沫状液体溢出；顺式藁本内酯各剂量组肺体积较小，表观为红褐色，充血程度较轻，散在点状出血和小片瘀血斑，切面仅见少量粉红色泡沫样液体溢出。地塞米松的瘀血状改善不如顺式藁本内酯组。
③肺系数和肺湿/干重比值油酸损伤组肺系数和肺湿重/干重比值显著增加；而顺式藁本内酯保护系数和肺湿重/干重比值均比油酸组显著降低，提示肺水肿被缓解。结果见表6。
表6 顺式藁本内酯对油酸所致大鼠肺损伤的影响(x±s)
☆☆与空白组比较；★★与模型组比较。
权利要求
1.一种顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)预处理及粉碎步骤将待提取的药材进行去杂质、清洗后，粉碎成细粉；(2)高剪切提取步骤在提取罐中加入提取溶剂乙醇、乙酸乙酯或石油醚中的任意之一或任意组合，在高剪切仪器的运转下，于提取罐中连续加入粉碎的药材，在提取温度下进行提取，达到提取时间后提取完成；(3)分离、纯化步骤收集提取液，弃去残渣，减压回收提取液中的溶剂，液体剩余物直接上样于硅胶柱，用洗脱剂洗脱，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合物，收集第二色带，减压回收洗脱液中的溶剂，剩余物采用同样的硅胶柱层析的方法多次分离、纯化，直至纯度达到90％以上。将最后一次柱层析的洗脱液减压回收溶剂后，剩余物用分子蒸馏法脱去残余溶剂，即得产物顺式藁本内酯。
2.如权利要求1所述的顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，其中所述的药材为川芎。
3.如权利要求1所述的顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，步骤(1)中的药材粉碎的细粉粒径为0.1至1mm。
4.如权利要求1所述的顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，步骤(2)中提取溶剂的用量与待提取药材的用量的质量比为3∶1-15∶1。
5.如权利要求1所述的顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，步骤(2)中的高剪切仪器的转速从转速2000/分逐渐上升到最大转速20000/分，提取温度为20℃-60℃，提取时间为0.5-3小时。
6.如权利要求1所述的顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝100∶0-4∶1，硅胶柱所用的硅胶为200-400目，减压回收溶剂的温度为20℃-60℃。
7.如权利要求1所述的药用植物中顺式藁本内酯的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的分子蒸馏的真空度为10-6-500Pa，温度为20-40℃。
8.顺式藁本内酯在制备治疗和预防与微循环障碍有关的疾病的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病为休克、糖尿病并发症、心肺功能障碍、脑功能障碍、多脏器衰竭、呼吸窘迫综合症、心绞痛、心肌梗死。
全文摘要
本发明提供了一种天然顺式藁本内酯的提取、分离方法，其步骤包括预处理及粉碎步骤、高剪切提取步骤和分离、纯化步骤。该方法毒性低、使用安全，产物收率高、纯度高，适用于工业化生产。本发明还提供了用上述提取方法获得的顺式藁本内酯在制备治疗和预防与微循环障碍有关的疾病的药物中的应用。
文档编号A61K36/236GK1552702SQ0312399
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者刘俊, 魏玉平, 王永富, 邓颖杰, 俊 刘 申请人:北京九龙制药厂
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