衍生自人血纤维蛋白原的Aα或Bβ链的肽用于治疗休克的用途的制作方法
专利名称：衍生自人血纤维蛋白原的Aα或Bβ链的肽用于治疗休克的用途的制作方法
背景技术：
本发明涉及用于治疗休克的药物制剂。
休克是很多不同病理状态的急性并发症，特征在于心血管系统不能维持足够的灌注压。感染剂可直接或间接引起心血管系统衰竭。细菌、细菌毒素、病毒以及最后但并非最次要的涉及炎症与凝固作用的不充分细胞或体液宿主反应可导致血管紧张度损失、血管屏障作用损失、心肌收缩力损失和器官功能损失，其单独地或联合地导致休克并最终导致患者死亡。对细菌感染的治疗依耐于抗生素治疗，其杀死细菌但这并未治疗毒血症且并未矫正不充分的细胞或体液宿主反应。在革兰氏阴性菌中，脂多糖(LPS或内毒素)引起革兰氏阴性休克。革兰氏阳性菌可引起多种器官衰竭和无内毒素血症的败血性休克，但革兰氏阳性菌的细胞壁也包括例如脂磷壁酸质(LTA)和肽聚糖(PepG)的毒素。LTA和PepG协同作用以释放例如肿瘤坏死因子(TNF)α和干扰素(IFN)γ的细胞因子，以诱导iNOS且最终引起休克和器官衰竭。
内毒素血症、败血病和败血性休克与大量一氧化氮(NO)的产生相关。对与循环休克相关的升压剂的过度血管扩张和血管低活性可通过NO合酶的可诱导同工酶(iNOS)的抑制剂逆转(Southan and Szabo，Biochem Pharmacol.1996；51383-94，Thiemermann Gen Pharmacol1997；29159-66)，但是iNOS抑制剂并未减少由毒素引起的器官损伤(Wray等，Shock 1998；9329-335)。
由病毒感染引起的休克治疗甚至是更大的挑战，因为对于大多数感染的抗病毒药物都无法获得。在具有由于感染剂引起的休克的患者内，针对单独消除感染剂的治疗是不充分的，因为由涉及炎性反应和凝固系统中的改变的感染剂引发的继发事件可能变得独立且导致患者死亡，而与致病感染剂是否被中和无关。无法获得具体治疗，因此目前的程序旨在缓解症状，其包括机械通气、补液、使用心脏激活药物、严格控制氧饱和度、血红蛋白、葡萄糖、和肾脏功能。仅例如通过高剂量类固醇控制炎症反应或用抗凝血酶抑制凝固作用并未提高存活率。迄今唯一被证实能够显著有效用于减少死亡率的分子是激活蛋白C’，其与凝固作用/血纤维蛋白溶解和发炎过程相互作用。
感染过程中的休克通常与血浆血纤维蛋白原中明显或不明显的变化有关，伴随着血纤维蛋白的形成和血纤维蛋白片段的升高。该凝固活性和血纤维蛋白溶解途径可导致明显或不明显的弥散性血管内凝血(DIC)，其导致血管阻塞和终端器官损伤，并且导致凝血因子的消耗从而导致流血。败血病是DIC最常见的病因。重要的是，血纤维蛋白原、血纤维蛋白和血纤维蛋白片段在血液凝固中不仅起到作用，而且具有数个用于细胞和基质蛋白的结合部位，其允许它们与白细胞、血小板、内皮细胞和基质结构相互作用。这引起细胞活化、细胞迁移、细胞因子释放和最终引起炎性反应。血纤维蛋白原或血纤维蛋白在发炎过程中的作用已被广泛记载(在以下文献中进行了综述AltieriThromb Haemost 82781-786；Herrick等Int J Biochem Cell Biol31741-46)。该分子的D-区域包含许多结合部位用于结合基质分子、内皮细胞、血小板和炎性细胞。血纤维蛋白的E-区域结合CD 11c(Loike等Proc Natl Acad Sci USA 881044-48)。
我们最近描述了血纤维蛋白在发炎过程中Bβ15-42序列的新颖作用(WO02/48180)。该序列也位于血纤维蛋白的E-区域内，并且当血纤维蛋白肽断裂时才具有活性。在其β链的游离N-末端包含该序列的血纤维蛋白片段结合内皮且引起炎症，并且与血纤维蛋白的β链的氨基酸15-42配对的肽封阻血纤维蛋白片段与内皮表面的结合以及封阻体外发炎过程(WO02/48180)。在体内，在缺血/再灌注的情况下该肽预防心肌发炎并减少心肌梗塞尺寸。
血纤维蛋白片段在任何血纤维蛋白受损和血纤维蛋白溶解受损的情况下出现。具体而言，在由于感染剂引起的休克情况下，该被改变的血纤维蛋白形成和血纤维蛋白溶解是主要问题。对于很多疾病而言，在血纤维蛋白形成/血纤维蛋白溶解受损和其结果之间的直接联系已经得到文献记载。例如Dengue(van Gorp等，J Med Virol 2002，67549-54，Mairuhu等Lancet Inf Dis 2003；333-41)。成人呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种急性肺损伤，其特征在于旺盛血管外血纤维蛋白沉积(Idell Am J Respir Med.2002；1383-91)。肺血管系统中的血栓形成和弥漫性血管内凝血也与ARDS一起被观察到。
作为重大公众健康问题的登革热(DF)和出血登革热(DHF)的持续性/全球性出现的原因是复杂的，媒介控制测量对于消除DF/DHF而言并不成功。目前对于登革研究的公众部门基金(估计2001年为1500万美元)的主要焦点是在于分子流行病学、免疫病理生理学、第二代疫苗的探索研究、和对于媒介控制的新的或者改进方法。
数种候选疫苗在美国和泰国已处于临床试验阶段，但是在市场上仍旧没有药物来治疗被感染的患者，甚至更糟糕的是，目前看来没有商业化的化学疗法R&D活动在进行。世界健康组织已经出版了抗争DF/DHF的战略方向-其作为高度优先目标-包括发展关于蛋白酶或其它研究极少的酶的抗病毒物；发展关于增加的血管通透性或改变的止血作用原因的抗介质体。
发明概要本发明涉及使用通式I的肽在制备用于治疗休克的药物制剂中的用途 其中，R1和R2相同或不同，表示氢、包括1-10个，特别是1-3个碳原子的饱和的或者不饱和的烃基团，Z1表示组氨酸或者脯氨酸基团，Z2表示精氨酸基团、包含起始精氨酸基团的，特别是包含2-30个氨基酸的肽基团或者蛋白质基团，其中该肽具有与人血纤维蛋白Bβ链(即Bβ15-42)上可诱导VE-钙粘蛋白(Cadherin)结合模体匹配的生物学性能。
优选使用通式II的肽 其中Z1表示组氨酸基团或者脯氨酸基团，
Arg表示精氨酸基团，Z3表示脯氨酸基团或缬氨酸基团，Z4表示亮氨酸基团或者缬氨酸基团，Z5表示肽基团或者蛋白质基团，特别是包含2-30个氨基酸的肽基团或者蛋白质基团，或者含有1-10，特别是1-3个碳原子的醇基团，或者有机或无机碱基团。
而且，优选使用的肽中Z5是衍生自血纤维蛋白的Aα-链或Bβ-链。
而且，优选使用的肽中，Z5是包含下列氨基酸序列的肽基团Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr ArgZ1是组氨酸基团，Arg表示精氨酸基团，Z3是脯氨酸基团，并且Z4是亮氨酸基团。
而且，优选使用的肽中，Z5是包含下列氨基酸序列的肽基团Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp AsnTyr LysZ1是脯氨酸基团，Arg是精氨酸基团，Z3是缬氨酸基团，和Z4是缬氨酸基团。
而且，本发明涉及具有以下N-末端序列的肽在制备用于治疗休克的药物制剂中的用途Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala--Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg且所述肽具有与人血纤维蛋白的Bβ-链(即Bβ15-42)上可诱导VE-钙粘蛋白结合模体匹配的生物学性能。
根据本发明的用途的进一步优选的实施方案特征在于该肽是Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala--Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg已经表明采用上述肽可治疗特定的休克状况，其中休克与包含以下情况的组中的一种或多种相关细菌毒素，弥散性血管内凝血病，坏死性筋膜炎，病毒感染后的出血性休克，尤其是由纤丝病毒、沙粒病毒、本扬病毒科、黄病毒属引起，登革热，由感染剂或自身免疫病引起的急性出血呼吸衰竭，器官损伤后的器官衰竭、尤其是心肌梗塞、血管外科手术、器官嵌夹、出血性休克、肺梗塞、肝梗塞、肠梗塞、手术操作和中风，和移植器官的器官功能障碍。
发明详述肽和蛋白质通过固相肽合成产生肽并且通过采用Nucleosil 100-10C18柱的反相HPLC纯化(PiChem，Graz，澳大利亚)。应当指出当允许保守氨基酸置换时该β15-42区域在各物种中100％相似。按照前述制备包括氨基酸Aα1-51、Bβ1-118和γ1-78的血纤维蛋白原的N-末端二硫结(NDSK)(WO0248180)。通过在37℃用凝血酶(20U/1mg的NDSK)处理NDSK 3小时制备血纤维蛋白的N-末端二硫结(NDSK-II，其缺乏血纤维蛋白肽A和B)，其由氨基酸Aα17-51、Bβ15-118和γ1-78组成。用10mM氟磷酸二异丙酯(Fluka，Milwaukee，WI)在37℃中和残余的凝血酶2小时。随后将所有产品透析到磷酸盐缓冲食盐溶液中(PBS)。
ELISA肽Bβ15-42结合到VE-钙粘蛋白血纤维蛋白的Bβ链(Bβ15-42)与内皮细胞的相互作用引起形态变化(Bunce等，J Clin Invest 89842-50；Bach等.Exp Cell Res 238324-34；Chalupowicz等，J Cell Biol 130207-15；Hamaguchi等.Blood812348-56；Francis等.Blood cells 19291-306)、增殖(Sporn等.Blood861802-10)、Von-Willebrand因子的释放(Ribes等.J Clin Invest79117-23，Ribes等.J Clin Invest 84435-42；Erban和Wagner，J BioChem 267，2451-58)和可能的IL-8的释放(Qi等.Blood 903593-3602)和CD54的膜表达(Harley等.Art Thromb Vasc Biol 20652-658)。VE-钙粘蛋白已被鉴定为序列Bβ15-42的结合配体并且已发展ELISAs来论证内皮细胞和/或VE-钙粘蛋白与血纤维蛋白或血纤维蛋白片段的相互作用。Martinez等已采用抗-pan钙粘蛋白抗体来从内皮细胞捕获钙粘蛋白，随后用血纤维蛋白培养(Martinez等，Ann NY Acad Sci936386-405)，用放射标记的血纤片段或肽Bβ15-42重叠HUVEC单层(其表达VE-钙粘蛋白)(Bach等，J Biol Chem 27330719-28；Harley等，Art Thromb Vasc Biol 20652-658)并且Gorlatov和Medved采用了重组VE-钙粘蛋白(Biochemistry 414107-16)。其他人采用ELISA来检测血液中的血纤片段，主要通过利用抗体作用于包括Bβ15-42模体抗体的血纤维蛋白原分子内的独特序列(Fareed等在Clin Chem81845-53进行了综述)。
我们已研发了一种改进的ELISA，其原理与其它所述的相同，但在此所述的ELISA的目的不是定量测定血纤维蛋白降解产物，而是寻求干扰Bβ15-42序列和VE-钙粘蛋白的结合的蛋白质、肽或化合物。其原理是允许VE-钙粘蛋白，无论是作为被截断的蛋白质、完整的蛋白质或与其它不干扰Bβ15-42结合位点的蛋白质偶联地，与血纤维蛋白的Bβ15-42序列相互作用。可向该体系引入任何其它额外物质并测量该物质是否抑制VE-钙粘蛋白/Bβ15-42结合。
具体而言，用PBS中重组人VE-钙粘蛋白FC融合蛋白(8nM；R&DSystems，Minneapolis)涂覆96孔蛋白质固定板(Exiqon，Vedaek，DK)，并且在4℃放置过夜。然后冲洗该板并用在该肽的C-末端标记了FLAG序列(DYKDDDDK)的肽Bβ15-42(GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR)或标记了FLAG的随机肽(DRGAPAHRPPRGPISGRSTPEKEKLLPG)在0-80μMol的浓度培养。冲洗之后，通过用过氧化物酶标记的抗FLAG抗体(Sigma，St.Louis，USA)和显色底物培养检测到被结合的标记了FLAG的肽。通过设定在450nm波长的ELISA板读数器确定光学密度。数据代表三个独立试验的平均值，每个重复三次。下表显示了以依赖于浓度方式结合于VE-钙粘蛋白的肽Bβ15-42。相比而言，该随机肽证明了仅有微弱的结合。
肽Bβ15-42对VE-钙粘蛋白的依耐于剂量的结合
肽Bβ15-42和血纤维蛋白片段竞争结合VE-钙粘蛋白下一步，我们分析了该ELISA是否可用于筛选其它肽/化合物来与Bβ15-42序列竞争结合VE-钙粘蛋白。如预期那样，肽Bβ15-42完全抑制了标记了flag的肽Bβ15-42的结合并且用作正控制，并且随机肽或溶剂丝毫没有影响并用作负控制。更短的肽部分地抑制Bβ15-42和VE-钙粘蛋白的结合。NDSK-II以依赖于浓度的方式抑制Bβ15-42结合。Bβ15-42和NDSK-II之间(50％抑制)在24∶1的摩尔比达到平衡。NDSK影响小或没有影响。
将VE-钙粘蛋白以8nM浓度涂覆到塑料表面。随后将所示的肽以200μM的浓度加入，以所示浓度加入NDSK或NDSK-II。如前所述实施对FLAG-标记的Bβ15-42(12μM)结合的检测。
阻滞剂15-42FLAG与VE钙粘蛋白结合的％抑制平均值±标准偏差肽15-42(28mer) 100±10随机肽(4mer)3±3随机肽(28mer) 10±3溶剂0+0肽15-18(4mer)200μM 65±12肽15-26(12mer)200μM64±10肽15-30(16mer)200μM61±13肽15-34(20mer)200μM67±17肽15-37(24mer)200μM17±19肽16-42(27mer)200μM55±13肽15-18(4mer)12μM 7±2肽15-26(12mer)12μM 6±1肽15-30(16mer)12μM 6±3肽15-34(20mer)12μM 7±1肽15-37(24mer)12μM 7±2肽16-42(27mer)12μM 5±2NDSK-II0.06μM 1+0NDSK-II0.12μM 39+18NDSK-II0.20μM 42+14NDSK-II0.60μM 52+16NDSK-II1.2μM 63+13NDSK-II2.4μM 79+9NDSK-II4.0μM 82+12NDSK0.06μM 0+0NDSK0.12μM 2+1NDSK0.20μM 1+1NDSK0.60μM 7+6NDSK1.2μM 15+13NDSK2.4μM 16+9NDSK4.0μM 20+10抗VE钙粘蛋白Ab(TEA1/31，1mg/ml) 2+1肽bβ15-42用于治疗感染登革热病毒小鼠的有效性材料和方法从State Collection of Viruses，Moscow，Russia以被感染的ICR小鼠大脑冻干悬浮液的形式获得登革热病毒2型(DEN-2)，毒株P23085。所得登革热病毒在ICR乳鼠脑中如之前所述进行传代(Atrasheuskaya等，FEMS Immunology and Medical Microbiology.35，33-423)。10％大脑悬浮液用作病毒原种并在-40℃储存。通过对大脑悬浮液的一系列稀释确定病毒滴度。大脑悬浮液腹腔注射到每组10只小鼠(4周龄BALB/c)的各组并记录死亡率。计算病毒滴度，其为7.4lg LD50/ml。所有对感染病毒的工作都是在SRC VB《Vector》(Russia)实验室中最高生物安全3级水平(BSL-3)的安全室中进行。
动物从State Research Center of Virology andBiotechnology《Vector》获得4周龄近交雄性BALB/c小鼠(单元型H-2d)。将动物置于单独笼子，可随意获取食物和水。
分析在注射之前与使用DEN-2攻击之后从处于甲氧氟烷麻醉中的小鼠眶窦中取出血液。每一时间点使用3只小鼠来获取血液。
通过Cell-Dyn 900 Hematology分析器(Sequoia-Turner公司，USA，CA)测定循环血小板(PLT)，红细胞(RBC)，白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)和血细胞比容(HCT)。
部分获取的血液进行离心以获得血清，其储存在-80℃直至试验结束。通过使用R&D系统(Minneapolis，USA)生产的酶免疫分析试剂盒根据生产商指示进行细胞因子血清水平的测量。监测限如下TNF-α少于5.1pg/ml；白细胞介素(IL)-1β，3.0pg/ml；IL-6，3.1pg/ml；IFNγ少于20pg/ml。
动物血液中的登革热病毒通过前述的RT-PCR测量(Harris等，J.Clin.Microbiol.36，2634-2639)。来自血液的总RNA通过使用Quiagen(德国)的试剂盒进行分离。引物是上方5’AATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCG(136-161位)，下方5’AAGGAACGCCACCAAGGCCATG(237-258位)，扩增119bp产物。为定量测定该病毒负载，将DEN-2按前述方法滴定到Vero E6细胞培养基上(Harris等，J.Clin.Microbiol.36，2634-2639)。在攻击的0天和22天时，为抗-DEN-2抗体而分析存活小鼠血液，通过前述的ELISA(Ignatyev等.J.Biotechnology.44，111-118)。
试验设计将4周龄近交老雄性BALB/c小鼠分为6大组。每组包含50只小鼠。所有动物经腹腔注射(i.p.)感染小鼠适应DEN-2毒株P23085(如前所述)，剂量为1LD50并每日检查标出发病率。来自所有大组的第一亚组(A1-F1)的小鼠用于死亡率参照。每个亚组包含20小鼠。第二亚组(A2-F2)的动物用于获得血清样品。每一亚组包含30小鼠。组说明，每一组中n＝50参照组仅接收病毒。
用肽Bβ15-42的治疗每日执行两次，感染第3天后-感染第8天后各腹腔注射4800μg/kg。在选定时间点获得血液和血清样品攻击之后第1、3、5、7、11、22天。
使用Student’s t或Chi-square试验进行统计分析。P值＜0.05则视为意义显著。
表1 死亡率和IgG-滴度。各组之间p＜0.05
表2
病毒血症1gPFU/ml
革兰氏阴性休克重量230-280g的雄性Wistar大鼠置于Tierversuchsanlage(University of Düsseldorf)并喂以标准饮食和任意取水。所有程序都根据AAALAC指南和Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals(Department of Health and Human Services，National Institutesof Health，出版号No.86-23)执行。此外，所有试验均被University ofDüsseldorf和国家的伦理与研究委员会所批准。如前所述(Zacharowski等.Crit Care Med 2000，Zacharowski等.Crit Care Med 2001；291599-1608)，用硫喷妥钠(120mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠并且根据需要用补充剂量的硫喷妥钠维持麻醉状态。
将导管插入气管以帮助呼吸并且用恒温毯将直肠温度维持在37℃。将导管插入右颈动脉并连接到压强传感器用于测量阶段和平均动脉血液压力(MAP)和心率(HR)，其显示于安装在IBM电脑上的数据采集系统(MacLab 8e，ADI Instruments，Germany)。将导管插入右颈静脉以施用药物。还将导管插入膀胱以帮助尿流动且防止肾后性衰竭发展的可能性。所有动物在整个试验中受到1.0ml/kg/h(0.9％氯化钠，食盐溶液，作为静脉输注液入颈静脉)的总流体置换。完成手术过程之后，心血管参数稳定15分钟且持续记录6小时。在该LPS诱导的多器官衰竭模式中，为获得AST和ALT血清水平显著上升，6小时的时期是必不可少的，同时在2小时之后已经可以观察到尿素和肌酸酐的血清水平的显著上升。
研究了三组处于假手术的大鼠(假)
处于革兰氏阴性休克的大鼠。提供来自E.coli，血清型0.127B8的脂多糖(6mg/kg，静脉注射)5分钟，一小时后动物接受食盐溶液(2.4ml/kg)(LPS+食盐溶液)。
处于革兰氏阴性休克的大鼠。提供来自E.coli，血清型0.127B8的脂多糖(6mg/kg，静脉注射)5分钟，动物接受Bβ15-42(2.4mg/kg)(LPS+Bβ15-42)。
存活率每组中n＝20，p＜0.05
革兰氏休克诱导6小时后，从置于右颈动脉的导管中收集血液。血液样品离心(1610×g，3分钟，室温)以分离血浆。在血浆中测量下列标示酶作为多种器官损伤/功能障碍的生化指示通过测量丙氨酸氨基转移酶(ALT，肝实质损伤的特异性标示)和天冬氨酸氨基转移酶(AST，肝损伤的非特异性标示)血浆水平的上升而估计肝损伤。
通过测量尿素(肾排泄功能受损和/或分解代谢增加的标示)和肌酸酐(肾小球滤过速率减少且因此肾功能障碍的标示)的血浆水平的上升来估计肾功能障碍。测量葡萄糖和淀粉酶的血浆水平作为胰腺功能和损伤的间接标示。
此外，测量动脉pO2作为肺功能/损伤的间接标示。实验值如下
平均动脉压力
心率
实验结束时进行所有组的器官(肺、肝、心和肾)活组织检查。该活组织检查固定于室温的缓冲甲醛溶液(磷酸盐缓冲食盐溶液中4％)并送至Vienna。标准H&E染色部分丝毫没有显示出区别。然而，使用酸性品红-橙黄G的血纤维蛋白沉淀染色部分中，发现与用LPS+Bβ15-42治疗的动物相比，仅接受LPS的参照组中血纤维蛋白血栓数量大量提高(p＜0.05)。在假治疗动物中没有出现血纤维蛋白血栓。
容器中血纤维蛋白血栓的平均数
权利要求
1.通式I的肽在制备用于治疗休克的药物制剂中的用途 其中，R1和R2相同或不同，表示氢、包括1-10个，特别是1-3个碳原子的饱和的或者不饱和的烃基团，Z1表示组氨酸或者脯氨酸基团，Z2表示精氨酸基团、包含起始精氨酸基团的，特别是包含2-30个氨基酸的肽基团或者蛋白质基团，其中该肽具有与人血纤维蛋白Bβ链(即Bβ15-42)上可诱导VE-钙粘蛋白结合模体匹配的生物学性能。
2.权利要求1的用途，特征在于该肽表现为通式II 其中Z1表示组氨酸基团或者脯氨酸基团，Arg表示精氨酸基团，Z3表示脯氨酸基团或缬氨酸基团，Z4表示亮氨酸基团或者缬氨酸基团，Z5表示肽基团或者蛋白质基团，特别是包含2-30个氨基酸的肽基团或者蛋白质基团，或者含有1-10，特别是1-3个碳原子的醇基团，或者有机或无机碱基团。
3.权利要求2的用途，特征在于Z5是衍生自血纤维蛋白的Aα-链的肽基团。
4.权利要求2的用途，特征在于Z5是衍生自血纤维蛋白的Bβ-链的肽基团。
5.权利要求2的用途，特征在于Z5是包含下列氨基酸序列的肽基团Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr ArgZ1是组氨酸基团，Arg是精氨酸基团，Z3是脯氨酸基团，并且Z4是亮氨酸基团。
6.权利要求2的用途，特征在于Z5是包含下列氨基酸序列的肽基团Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp AsnTyr LysZ1是脯氨酸基团，Arg是精氨酸基团，Z3是缬氨酸基团，和Z4是缬氨酸基团。
7.具有以下N-末端序列的肽在制备用于治疗休克的药物制剂中的用途Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala--Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg其中该肽具有与人血纤维蛋白Bβ链(即Bβ15-42)上可诱导VE-钙粘蛋白结合模体匹配的生物学性能。
8.权利要求7的用途，特征在于该肽为Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala--Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg
9.权利要求1-8任一项的用途，其中休克与以下一种或多种情况相关细菌毒素，弥散性血管内凝血病，坏死性筋膜炎，病毒感染后的出血性休克，尤其是由纤丝病毒、沙粒病毒、本扬病毒科、黄病毒属引起，登革热，由感染剂或自身免疫病引起的急性出血呼吸衰竭，器官损伤后的器官衰竭、尤其是心肌梗塞、血管外科手术、器官嵌夹、出血性休克、肺梗塞、肝梗塞、肠梗塞、手术操作和中风，和移植器官的器官功能障碍。
全文摘要
本发明涉及通式I的肽在制备用于治疗休克的药物制剂中的用途其中，R1和R2相同或不同，表示氢、包括1－10个，特别是1－3个碳原子的饱和的或者不饱和的烃基团，Z
文档编号A61P7/00GK1842344SQ200580000993
公开日2006年10月4日 申请日期2005年6月24日 优先权日2004年6月25日
发明者P·佩策尔鲍尔, K·查哈洛夫斯基 申请人:菲布雷克斯医疗研究及开发有限责任公司
背景技术：
本发明涉及用于治疗休克的药物制剂。
休克是很多不同病理状态的急性并发症，特征在于心血管系统不能维持足够的灌注压。感染剂可直接或间接引起心血管系统衰竭。细菌、细菌毒素、病毒以及最后但并非最次要的涉及炎症与凝固作用的不充分细胞或体液宿主反应可导致血管紧张度损失、血管屏障作用损失、心肌收缩力损失和器官功能损失，其单独地或联合地导致休克并最终导致患者死亡。对细菌感染的治疗依耐于抗生素治疗，其杀死细菌但这并未治疗毒血症且并未矫正不充分的细胞或体液宿主反应。在革兰氏阴性菌中，脂多糖(LPS或内毒素)引起革兰氏阴性休克。革兰氏阳性菌可引起多种器官衰竭和无内毒素血症的败血性休克，但革兰氏阳性菌的细胞壁也包括例如脂磷壁酸质(LTA)和肽聚糖(PepG)的毒素。LTA和PepG协同作用以释放例如肿瘤坏死因子(TNF)α和干扰素(IFN)γ的细胞因子，以诱导iNOS且最终引起休克和器官衰竭。
内毒素血症、败血病和败血性休克与大量一氧化氮(NO)的产生相关。对与循环休克相关的升压剂的过度血管扩张和血管低活性可通过NO合酶的可诱导同工酶(iNOS)的抑制剂逆转(Southan and Szabo，Biochem Pharmacol.1996；51383-94，Thiemermann Gen Pharmacol1997；29159-66)，但是iNOS抑制剂并未减少由毒素引起的器官损伤(Wray等，Shock 1998；9329-335)。
由病毒感染引起的休克治疗甚至是更大的挑战，因为对于大多数感染的抗病毒药物都无法获得。在具有由于感染剂引起的休克的患者内，针对单独消除感染剂的治疗是不充分的，因为由涉及炎性反应和凝固系统中的改变的感染剂引发的继发事件可能变得独立且导致患者死亡，而与致病感染剂是否被中和无关。无法获得具体治疗，因此目前的程序旨在缓解症状，其包括机械通气、补液、使用心脏激活药物、严格控制氧饱和度、血红蛋白、葡萄糖、和肾脏功能。仅例如通过高剂量类固醇控制炎症反应或用抗凝血酶抑制凝固作用并未提高存活率。迄今唯一被证实能够显著有效用于减少死亡率的分子是激活蛋白C’，其与凝固作用/血纤维蛋白溶解和发炎过程相互作用。
感染过程中的休克通常与血浆血纤维蛋白原中明显或不明显的变化有关，伴随着血纤维蛋白的形成和血纤维蛋白片段的升高。该凝固活性和血纤维蛋白溶解途径可导致明显或不明显的弥散性血管内凝血(DIC)，其导致血管阻塞和终端器官损伤，并且导致凝血因子的消耗从而导致流血。败血病是DIC最常见的病因。重要的是，血纤维蛋白原、血纤维蛋白和血纤维蛋白片段在血液凝固中不仅起到作用，而且具有数个用于细胞和基质蛋白的结合部位，其允许它们与白细胞、血小板、内皮细胞和基质结构相互作用。这引起细胞活化、细胞迁移、细胞因子释放和最终引起炎性反应。血纤维蛋白原或血纤维蛋白在发炎过程中的作用已被广泛记载(在以下文献中进行了综述AltieriThromb Haemost 82781-786；Herrick等Int J Biochem Cell Biol31741-46)。该分子的D-区域包含许多结合部位用于结合基质分子、内皮细胞、血小板和炎性细胞。血纤维蛋白的E-区域结合CD 11c(Loike等Proc Natl Acad Sci USA 881044-48)。
我们最近描述了血纤维蛋白在发炎过程中Bβ15-42序列的新颖作用(WO02/48180)。该序列也位于血纤维蛋白的E-区域内，并且当血纤维蛋白肽断裂时才具有活性。在其β链的游离N-末端包含该序列的血纤维蛋白片段结合内皮且引起炎症，并且与血纤维蛋白的β链的氨基酸15-42配对的肽封阻血纤维蛋白片段与内皮表面的结合以及封阻体外发炎过程(WO02/48180)。在体内，在缺血/再灌注的情况下该肽预防心肌发炎并减少心肌梗塞尺寸。
血纤维蛋白片段在任何血纤维蛋白受损和血纤维蛋白溶解受损的情况下出现。具体而言，在由于感染剂引起的休克情况下，该被改变的血纤维蛋白形成和血纤维蛋白溶解是主要问题。对于很多疾病而言，在血纤维蛋白形成/血纤维蛋白溶解受损和其结果之间的直接联系已经得到文献记载。例如Dengue(van Gorp等，J Med Virol 2002，67549-54，Mairuhu等Lancet Inf Dis 2003；333-41)。成人呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种急性肺损伤，其特征在于旺盛血管外血纤维蛋白沉积(Idell Am J Respir Med.2002；1383-91)。肺血管系统中的血栓形成和弥漫性血管内凝血也与ARDS一起被观察到。
作为重大公众健康问题的登革热(DF)和出血登革热(DHF)的持续性/全球性出现的原因是复杂的，媒介控制测量对于消除DF/DHF而言并不成功。目前对于登革研究的公众部门基金(估计2001年为1500万美元)的主要焦点是在于分子流行病学、免疫病理生理学、第二代疫苗的探索研究、和对于媒介控制的新的或者改进方法。
数种候选疫苗在美国和泰国已处于临床试验阶段，但是在市场上仍旧没有药物来治疗被感染的患者，甚至更糟糕的是，目前看来没有商业化的化学疗法R&D活动在进行。世界健康组织已经出版了抗争DF/DHF的战略方向-其作为高度优先目标-包括发展关于蛋白酶或其它研究极少的酶的抗病毒物；发展关于增加的血管通透性或改变的止血作用原因的抗介质体。
发明概要本发明涉及使用通式I的肽在制备用于治疗休克的药物制剂中的用途 其中，R1和R2相同或不同，表示氢、包括1-10个，特别是1-3个碳原子的饱和的或者不饱和的烃基团，Z1表示组氨酸或者脯氨酸基团，Z2表示精氨酸基团、包含起始精氨酸基团的，特别是包含2-30个氨基酸的肽基团或者蛋白质基团，其中该肽具有与人血纤维蛋白Bβ链(即Bβ15-42)上可诱导VE-钙粘蛋白(Cadherin)结合模体匹配的生物学性能。
优选使用通式II的肽 其中Z1表示组氨酸基团或者脯氨酸基团，
Arg表示精氨酸基团，Z3表示脯氨酸基团或缬氨酸基团，Z4表示亮氨酸基团或者缬氨酸基团，Z5表示肽基团或者蛋白质基团，特别是包含2-30个氨基酸的肽基团或者蛋白质基团，或者含有1-10，特别是1-3个碳原子的醇基团，或者有机或无机碱基团。
而且，优选使用的肽中Z5是衍生自血纤维蛋白的Aα-链或Bβ-链。
而且，优选使用的肽中，Z5是包含下列氨基酸序列的肽基团Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr ArgZ1是组氨酸基团，Arg表示精氨酸基团，Z3是脯氨酸基团，并且Z4是亮氨酸基团。
而且，优选使用的肽中，Z5是包含下列氨基酸序列的肽基团Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp AsnTyr LysZ1是脯氨酸基团，Arg是精氨酸基团，Z3是缬氨酸基团，和Z4是缬氨酸基团。
而且，本发明涉及具有以下N-末端序列的肽在制备用于治疗休克的药物制剂中的用途Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala--Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg且所述肽具有与人血纤维蛋白的Bβ-链(即Bβ15-42)上可诱导VE-钙粘蛋白结合模体匹配的生物学性能。
根据本发明的用途的进一步优选的实施方案特征在于该肽是Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala--Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg已经表明采用上述肽可治疗特定的休克状况，其中休克与包含以下情况的组中的一种或多种相关细菌毒素，弥散性血管内凝血病，坏死性筋膜炎，病毒感染后的出血性休克，尤其是由纤丝病毒、沙粒病毒、本扬病毒科、黄病毒属引起，登革热，由感染剂或自身免疫病引起的急性出血呼吸衰竭，器官损伤后的器官衰竭、尤其是心肌梗塞、血管外科手术、器官嵌夹、出血性休克、肺梗塞、肝梗塞、肠梗塞、手术操作和中风，和移植器官的器官功能障碍。
发明详述肽和蛋白质通过固相肽合成产生肽并且通过采用Nucleosil 100-10C18柱的反相HPLC纯化(PiChem，Graz，澳大利亚)。应当指出当允许保守氨基酸置换时该β15-42区域在各物种中100％相似。按照前述制备包括氨基酸Aα1-51、Bβ1-118和γ1-78的血纤维蛋白原的N-末端二硫结(NDSK)(WO0248180)。通过在37℃用凝血酶(20U/1mg的NDSK)处理NDSK 3小时制备血纤维蛋白的N-末端二硫结(NDSK-II，其缺乏血纤维蛋白肽A和B)，其由氨基酸Aα17-51、Bβ15-118和γ1-78组成。用10mM氟磷酸二异丙酯(Fluka，Milwaukee，WI)在37℃中和残余的凝血酶2小时。随后将所有产品透析到磷酸盐缓冲食盐溶液中(PBS)。
ELISA肽Bβ15-42结合到VE-钙粘蛋白血纤维蛋白的Bβ链(Bβ15-42)与内皮细胞的相互作用引起形态变化(Bunce等，J Clin Invest 89842-50；Bach等.Exp Cell Res 238324-34；Chalupowicz等，J Cell Biol 130207-15；Hamaguchi等.Blood812348-56；Francis等.Blood cells 19291-306)、增殖(Sporn等.Blood861802-10)、Von-Willebrand因子的释放(Ribes等.J Clin Invest79117-23，Ribes等.J Clin Invest 84435-42；Erban和Wagner，J BioChem 267，2451-58)和可能的IL-8的释放(Qi等.Blood 903593-3602)和CD54的膜表达(Harley等.Art Thromb Vasc Biol 20652-658)。VE-钙粘蛋白已被鉴定为序列Bβ15-42的结合配体并且已发展ELISAs来论证内皮细胞和/或VE-钙粘蛋白与血纤维蛋白或血纤维蛋白片段的相互作用。Martinez等已采用抗-pan钙粘蛋白抗体来从内皮细胞捕获钙粘蛋白，随后用血纤维蛋白培养(Martinez等，Ann NY Acad Sci936386-405)，用放射标记的血纤片段或肽Bβ15-42重叠HUVEC单层(其表达VE-钙粘蛋白)(Bach等，J Biol Chem 27330719-28；Harley等，Art Thromb Vasc Biol 20652-658)并且Gorlatov和Medved采用了重组VE-钙粘蛋白(Biochemistry 414107-16)。其他人采用ELISA来检测血液中的血纤片段，主要通过利用抗体作用于包括Bβ15-42模体抗体的血纤维蛋白原分子内的独特序列(Fareed等在Clin Chem81845-53进行了综述)。
我们已研发了一种改进的ELISA，其原理与其它所述的相同，但在此所述的ELISA的目的不是定量测定血纤维蛋白降解产物，而是寻求干扰Bβ15-42序列和VE-钙粘蛋白的结合的蛋白质、肽或化合物。其原理是允许VE-钙粘蛋白，无论是作为被截断的蛋白质、完整的蛋白质或与其它不干扰Bβ15-42结合位点的蛋白质偶联地，与血纤维蛋白的Bβ15-42序列相互作用。可向该体系引入任何其它额外物质并测量该物质是否抑制VE-钙粘蛋白/Bβ15-42结合。
具体而言，用PBS中重组人VE-钙粘蛋白FC融合蛋白(8nM；R&DSystems，Minneapolis)涂覆96孔蛋白质固定板(Exiqon，Vedaek，DK)，并且在4℃放置过夜。然后冲洗该板并用在该肽的C-末端标记了FLAG序列(DYKDDDDK)的肽Bβ15-42(GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR)或标记了FLAG的随机肽(DRGAPAHRPPRGPISGRSTPEKEKLLPG)在0-80μMol的浓度培养。冲洗之后，通过用过氧化物酶标记的抗FLAG抗体(Sigma，St.Louis，USA)和显色底物培养检测到被结合的标记了FLAG的肽。通过设定在450nm波长的ELISA板读数器确定光学密度。数据代表三个独立试验的平均值，每个重复三次。下表显示了以依赖于浓度方式结合于VE-钙粘蛋白的肽Bβ15-42。相比而言，该随机肽证明了仅有微弱的结合。
肽Bβ15-42对VE-钙粘蛋白的依耐于剂量的结合
肽Bβ15-42和血纤维蛋白片段竞争结合VE-钙粘蛋白下一步，我们分析了该ELISA是否可用于筛选其它肽/化合物来与Bβ15-42序列竞争结合VE-钙粘蛋白。如预期那样，肽Bβ15-42完全抑制了标记了flag的肽Bβ15-42的结合并且用作正控制，并且随机肽或溶剂丝毫没有影响并用作负控制。更短的肽部分地抑制Bβ15-42和VE-钙粘蛋白的结合。NDSK-II以依赖于浓度的方式抑制Bβ15-42结合。Bβ15-42和NDSK-II之间(50％抑制)在24∶1的摩尔比达到平衡。NDSK影响小或没有影响。
将VE-钙粘蛋白以8nM浓度涂覆到塑料表面。随后将所示的肽以200μM的浓度加入，以所示浓度加入NDSK或NDSK-II。如前所述实施对FLAG-标记的Bβ15-42(12μM)结合的检测。
阻滞剂15-42FLAG与VE钙粘蛋白结合的％抑制平均值±标准偏差肽15-42(28mer) 100±10随机肽(4mer)3±3随机肽(28mer) 10±3溶剂0+0肽15-18(4mer)200μM 65±12肽15-26(12mer)200μM64±10肽15-30(16mer)200μM61±13肽15-34(20mer)200μM67±17肽15-37(24mer)200μM17±19肽16-42(27mer)200μM55±13肽15-18(4mer)12μM 7±2肽15-26(12mer)12μM 6±1肽15-30(16mer)12μM 6±3肽15-34(20mer)12μM 7±1肽15-37(24mer)12μM 7±2肽16-42(27mer)12μM 5±2NDSK-II0.06μM 1+0NDSK-II0.12μM 39+18NDSK-II0.20μM 42+14NDSK-II0.60μM 52+16NDSK-II1.2μM 63+13NDSK-II2.4μM 79+9NDSK-II4.0μM 82+12NDSK0.06μM 0+0NDSK0.12μM 2+1NDSK0.20μM 1+1NDSK0.60μM 7+6NDSK1.2μM 15+13NDSK2.4μM 16+9NDSK4.0μM 20+10抗VE钙粘蛋白Ab(TEA1/31，1mg/ml) 2+1肽bβ15-42用于治疗感染登革热病毒小鼠的有效性材料和方法从State Collection of Viruses，Moscow，Russia以被感染的ICR小鼠大脑冻干悬浮液的形式获得登革热病毒2型(DEN-2)，毒株P23085。所得登革热病毒在ICR乳鼠脑中如之前所述进行传代(Atrasheuskaya等，FEMS Immunology and Medical Microbiology.35，33-423)。10％大脑悬浮液用作病毒原种并在-40℃储存。通过对大脑悬浮液的一系列稀释确定病毒滴度。大脑悬浮液腹腔注射到每组10只小鼠(4周龄BALB/c)的各组并记录死亡率。计算病毒滴度，其为7.4lg LD50/ml。所有对感染病毒的工作都是在SRC VB《Vector》(Russia)实验室中最高生物安全3级水平(BSL-3)的安全室中进行。
动物从State Research Center of Virology andBiotechnology《Vector》获得4周龄近交雄性BALB/c小鼠(单元型H-2d)。将动物置于单独笼子，可随意获取食物和水。
分析在注射之前与使用DEN-2攻击之后从处于甲氧氟烷麻醉中的小鼠眶窦中取出血液。每一时间点使用3只小鼠来获取血液。
通过Cell-Dyn 900 Hematology分析器(Sequoia-Turner公司，USA，CA)测定循环血小板(PLT)，红细胞(RBC)，白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)和血细胞比容(HCT)。
部分获取的血液进行离心以获得血清，其储存在-80℃直至试验结束。通过使用R&D系统(Minneapolis，USA)生产的酶免疫分析试剂盒根据生产商指示进行细胞因子血清水平的测量。监测限如下TNF-α少于5.1pg/ml；白细胞介素(IL)-1β，3.0pg/ml；IL-6，3.1pg/ml；IFNγ少于20pg/ml。
动物血液中的登革热病毒通过前述的RT-PCR测量(Harris等，J.Clin.Microbiol.36，2634-2639)。来自血液的总RNA通过使用Quiagen(德国)的试剂盒进行分离。引物是上方5’AATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCG(136-161位)，下方5’AAGGAACGCCACCAAGGCCATG(237-258位)，扩增119bp产物。为定量测定该病毒负载，将DEN-2按前述方法滴定到Vero E6细胞培养基上(Harris等，J.Clin.Microbiol.36，2634-2639)。在攻击的0天和22天时，为抗-DEN-2抗体而分析存活小鼠血液，通过前述的ELISA(Ignatyev等.J.Biotechnology.44，111-118)。
试验设计将4周龄近交老雄性BALB/c小鼠分为6大组。每组包含50只小鼠。所有动物经腹腔注射(i.p.)感染小鼠适应DEN-2毒株P23085(如前所述)，剂量为1LD50并每日检查标出发病率。来自所有大组的第一亚组(A1-F1)的小鼠用于死亡率参照。每个亚组包含20小鼠。第二亚组(A2-F2)的动物用于获得血清样品。每一亚组包含30小鼠。组说明，每一组中n＝50参照组仅接收病毒。
用肽Bβ15-42的治疗每日执行两次，感染第3天后-感染第8天后各腹腔注射4800μg/kg。在选定时间点获得血液和血清样品攻击之后第1、3、5、7、11、22天。
使用Student’s t或Chi-square试验进行统计分析。P值＜0.05则视为意义显著。
表1 死亡率和IgG-滴度。各组之间p＜0.05
表2
病毒血症1gPFU/ml
革兰氏阴性休克重量230-280g的雄性Wistar大鼠置于Tierversuchsanlage(University of Düsseldorf)并喂以标准饮食和任意取水。所有程序都根据AAALAC指南和Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals(Department of Health and Human Services，National Institutesof Health，出版号No.86-23)执行。此外，所有试验均被University ofDüsseldorf和国家的伦理与研究委员会所批准。如前所述(Zacharowski等.Crit Care Med 2000，Zacharowski等.Crit Care Med 2001；291599-1608)，用硫喷妥钠(120mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠并且根据需要用补充剂量的硫喷妥钠维持麻醉状态。
将导管插入气管以帮助呼吸并且用恒温毯将直肠温度维持在37℃。将导管插入右颈动脉并连接到压强传感器用于测量阶段和平均动脉血液压力(MAP)和心率(HR)，其显示于安装在IBM电脑上的数据采集系统(MacLab 8e，ADI Instruments，Germany)。将导管插入右颈静脉以施用药物。还将导管插入膀胱以帮助尿流动且防止肾后性衰竭发展的可能性。所有动物在整个试验中受到1.0ml/kg/h(0.9％氯化钠，食盐溶液，作为静脉输注液入颈静脉)的总流体置换。完成手术过程之后，心血管参数稳定15分钟且持续记录6小时。在该LPS诱导的多器官衰竭模式中，为获得AST和ALT血清水平显著上升，6小时的时期是必不可少的，同时在2小时之后已经可以观察到尿素和肌酸酐的血清水平的显著上升。
研究了三组处于假手术的大鼠(假)
处于革兰氏阴性休克的大鼠。提供来自E.coli，血清型0.127B8的脂多糖(6mg/kg，静脉注射)5分钟，一小时后动物接受食盐溶液(2.4ml/kg)(LPS+食盐溶液)。
处于革兰氏阴性休克的大鼠。提供来自E.coli，血清型0.127B8的脂多糖(6mg/kg，静脉注射)5分钟，动物接受Bβ15-42(2.4mg/kg)(LPS+Bβ15-42)。
存活率每组中n＝20，p＜0.05
革兰氏休克诱导6小时后，从置于右颈动脉的导管中收集血液。血液样品离心(1610×g，3分钟，室温)以分离血浆。在血浆中测量下列标示酶作为多种器官损伤/功能障碍的生化指示通过测量丙氨酸氨基转移酶(ALT，肝实质损伤的特异性标示)和天冬氨酸氨基转移酶(AST，肝损伤的非特异性标示)血浆水平的上升而估计肝损伤。
通过测量尿素(肾排泄功能受损和/或分解代谢增加的标示)和肌酸酐(肾小球滤过速率减少且因此肾功能障碍的标示)的血浆水平的上升来估计肾功能障碍。测量葡萄糖和淀粉酶的血浆水平作为胰腺功能和损伤的间接标示。
此外，测量动脉pO2作为肺功能/损伤的间接标示。实验值如下
平均动脉压力
心率
实验结束时进行所有组的器官(肺、肝、心和肾)活组织检查。该活组织检查固定于室温的缓冲甲醛溶液(磷酸盐缓冲食盐溶液中4％)并送至Vienna。标准H&E染色部分丝毫没有显示出区别。然而，使用酸性品红-橙黄G的血纤维蛋白沉淀染色部分中，发现与用LPS+Bβ15-42治疗的动物相比，仅接受LPS的参照组中血纤维蛋白血栓数量大量提高(p＜0.05)。在假治疗动物中没有出现血纤维蛋白血栓。
容器中血纤维蛋白血栓的平均数
权利要求
1.通式I的肽在制备用于治疗休克的药物制剂中的用途 其中，R1和R2相同或不同，表示氢、包括1-10个，特别是1-3个碳原子的饱和的或者不饱和的烃基团，Z1表示组氨酸或者脯氨酸基团，Z2表示精氨酸基团、包含起始精氨酸基团的，特别是包含2-30个氨基酸的肽基团或者蛋白质基团，其中该肽具有与人血纤维蛋白Bβ链(即Bβ15-42)上可诱导VE-钙粘蛋白结合模体匹配的生物学性能。
2.权利要求1的用途，特征在于该肽表现为通式II 其中Z1表示组氨酸基团或者脯氨酸基团，Arg表示精氨酸基团，Z3表示脯氨酸基团或缬氨酸基团，Z4表示亮氨酸基团或者缬氨酸基团，Z5表示肽基团或者蛋白质基团，特别是包含2-30个氨基酸的肽基团或者蛋白质基团，或者含有1-10，特别是1-3个碳原子的醇基团，或者有机或无机碱基团。
3.权利要求2的用途，特征在于Z5是衍生自血纤维蛋白的Aα-链的肽基团。
4.权利要求2的用途，特征在于Z5是衍生自血纤维蛋白的Bβ-链的肽基团。
5.权利要求2的用途，特征在于Z5是包含下列氨基酸序列的肽基团Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr ArgZ1是组氨酸基团，Arg是精氨酸基团，Z3是脯氨酸基团，并且Z4是亮氨酸基团。
6.权利要求2的用途，特征在于Z5是包含下列氨基酸序列的肽基团Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp AsnTyr LysZ1是脯氨酸基团，Arg是精氨酸基团，Z3是缬氨酸基团，和Z4是缬氨酸基团。
7.具有以下N-末端序列的肽在制备用于治疗休克的药物制剂中的用途Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala--Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg其中该肽具有与人血纤维蛋白Bβ链(即Bβ15-42)上可诱导VE-钙粘蛋白结合模体匹配的生物学性能。
8.权利要求7的用途，特征在于该肽为Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-Lys-Arg-Glu-Glu-Ala-Pro-Ser-Leu-Arg-Pro-Ala--Pro-Pro-Pro-Ile-Ser-Gly-Gly-Gly-Tyr-Arg
9.权利要求1-8任一项的用途，其中休克与以下一种或多种情况相关细菌毒素，弥散性血管内凝血病，坏死性筋膜炎，病毒感染后的出血性休克，尤其是由纤丝病毒、沙粒病毒、本扬病毒科、黄病毒属引起，登革热，由感染剂或自身免疫病引起的急性出血呼吸衰竭，器官损伤后的器官衰竭、尤其是心肌梗塞、血管外科手术、器官嵌夹、出血性休克、肺梗塞、肝梗塞、肠梗塞、手术操作和中风，和移植器官的器官功能障碍。
全文摘要
本发明涉及通式I的肽在制备用于治疗休克的药物制剂中的用途其中，R1和R2相同或不同，表示氢、包括1－10个，特别是1－3个碳原子的饱和的或者不饱和的烃基团，Z
文档编号A61P7/00GK1842344SQ200580000993
公开日2006年10月4日 申请日期2005年6月24日 优先权日2004年6月25日
发明者P·佩策尔鲍尔, K·查哈洛夫斯基 申请人:菲布雷克斯医疗研究及开发有限责任公司
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