作为选择性s1p4激动剂的吲哚丙氨酸衍生物的制作方法
专利名称：作为选择性s1p4激动剂的吲哚丙氨酸衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机化合物、它们的生产方法和包含它们的药物组合物。
在一个方面，本发明提供了作为1-磷酸-鞘氨醇(S1P4)受体激动剂的化合物，其中的化合物对于S1P4受体拥有比对S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受体中的一种或多种更高的选择性。S1P受体被描述在如WO 03/061567中。优选该化合物对于S1P4受体有超过上述的S1P受体的选择性。该化合物优选显示对S1P4受体的选择性是上述的一种或多种S1P受体的至少10倍、更优选20倍、最优选100倍。通过测定该化合物对S1P4受体的EC50与该化合物对S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受体的EC50之间的比率而确定选择性。EC50值可例如根据下述的GTPγ35S结合测定法或钙动员测定法而获得。在更优选的实施方案中，该化合物在GTPγ35S结合测定法或钙动员测定法中显示对S1P4受体的EC50为1μM或更小。
在优选的实施方案中，本发明涉及游离形式或盐形式的式I化合物 其中R1为苯基或萘基，其中苯基被一个或两个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或苯基C1-6烷基所取代；且R2为氢或C1-6烷基。
任何烷基部分可为直链或支链。C1-6烷基优选是C1-4烷基。C1-6烷氧基优选是C1-4烷氧基。
卤素可为F、Cl、Br或I。
R1优选是式Ia的基团
其中R3、R4和R5中的一个或两个为氢；且R3、R4和R5中的一个或两个为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或苯基C1-6烷基；或者，R3及R4或R4及R5与它们所连接的碳原子共同形成苯环。
在式I和Ia中，独立地、共同地或以任何组合或亚组合优选下列意义a)R4或R5中的一个不为氢，更优选R5不为氢且R4为氢；b)R4或R5为苄基、乙基、丁氧基、丙基、异丙基或氯，更优选R5为上述基团中的一个且R4为氢；b)R3为氢或氯，更优选氢；c)R2为氢或甲基。
式I化合物可形成无机或有机酸的酸加成盐，所述的酸例如是盐酸、氢溴酸或马来酸。式I化合物也可形成衍生于羧基的阳离子盐，更特别是碱金属或碱土金属盐，如钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，以及衍生于氨或有机胺的铵盐。
式I化合物在连接伯氨基的碳原子上含有手性中心。所以式I化合物以两种对映异构体形式存在。应该理解本发明包含式I的外消旋物和任何对映异构体。
式I化合物也可以它们的水合物形式被得到。水合物也构成本发明的一部分。
本发明还提供了式I化合物的生产方法，其包含使式II化合物去保护， 其中R1和R2如上所定义，R6为C1-6烷基或苄基，
R7为氨基保护基，并且如有需要将式I化合物转换成其盐。
使用常规的方法进行该生产方法。适宜的氨基保护基团的实例如“有机合成中的保护基”(T.W.Greene，J.Wiley & Sons NY，第2版，第7章，1991)以及其中的参考文献所公开，例如酰基如叔丁氧羰基、苯甲氧羰基、9-芴基甲氧羰基、三氟乙酰基、三甲基甲硅烷基乙磺酰基等等。当R7为苯甲氧羰基和R6为苄基时，可通过例如氢解而去保护。反应可在室温下在有机溶剂如四氢呋喃、二氯甲烷或二烷中进行，使用披钯炭作为催化剂。如果R6为C1-6烷基，可用两个步骤方便地实现该生产方法。在第一步，式II化合物的羧基基团可通过用如NaOH水溶液或在有机溶剂如四氢呋喃、二烷、甲醇或乙醇中的碱性离子交换树脂的温和水解而在室温下去保护。在第二步，氨基基团用如在二氯甲烷中的碘代三甲硅烷而去保护。如果R7为苯甲氧羰基也可采用氢解反应。当R3至R5中的一个或两个为卤素时，适宜于采用两个步骤的生产方法。
任选的盐形成可按照常规方法进行。
式I化合物的外消旋混合物可用已知的方法拆分，例如使用旋光活性的酸作为拆分剂。或者，通过使用旋光活性原料生产纯的对映异构形式。
用作原料的式II化合物可通过式III化合物与式IV化合物的反应而制得， 其中R6和R7如上所定义， 其中R1和R2如上所定义，并且X为离去基团。
可用常规的方法实现本反应。例如，该反应可在有机溶剂如二氯甲烷中在-15℃至25℃之间的温度下进行。离去基团X为如卤素且特别是氯或羟基。
适宜地存在酸结合剂，例如叔胺，如吡啶。
只要上述方法的原料的生产没有进行具体的描述，那么它们可用与已知化合物类似的方法或本文所描述的方法进行生产。
在下列的实施例中，所有温度以摄氏度给出并且未作校正。[α]D20值也未作校正。
实施例13-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-D-丙氨酸a)4-(2-乙苯基)-吲哚-2-甲酸向0.28g 4-溴-吲哚-2-甲酸和0.069g四三苯膦钯在11ml甲苯和2ml 2M碳酸钠中的混合物中加入0.300g 2-乙基苯基硼酸在3ml乙醇中的溶液。混合物回流16h，过滤，水相用2N HCl进行酸化，并用乙酸乙酯萃取。浓缩有机相，给出棕色粉末状的产品，m.p.230-233℃，纯度足以用于下一步。
b)3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-N(2)-Z-D-丙氨酸甲酯在2.11g 4-(2-乙苯基)-吲哚-2-甲酸在32ml吡啶中的溶液中加入1.41g羰二咪唑。在气体挥发停止后，加入2.29g N(2)-Z-D-2，3-二氨基丙酸甲酯，混合物在室温下搅拌4天。在蒸发溶剂后，残留物用水/乙酸乙酯萃取，干燥有机相，浓缩，粗产品在硅胶中层析，流动相为乙酸异丙酯/甲苯4∶1，得到黄色无定形粉末状的所需化合物。
c)3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-D-丙氨酸将2.03g 3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-N(2)-Z-D-丙氨酸甲酯、4.1ml 2N NaOH和10ml二烷的混合物在室温下搅拌2小时。以常规方式处理后，将获得的酸溶于22ml二氯甲烷并在0℃用1.03ml碘代三甲硅烷进行处理。在搅拌50分钟后，混合物浓缩至于，并将残留物用水吸收。粗品析出并用过滤法收集，用水洗涤，在通过加入0.2N NaOH调节pH至6的水/异丙醇中重结晶，产生白色粉末状的标题化合物，m.p.258-265℃。
式I化合物，其中R1和R2如表1所定义，可通过上述方法之一而制备，但使用适宜的原料。
表1
本文所公开的作为选择性S1P4受体激动剂的游离形式或可药用盐形式的化合物(下文称为本发明的化合物)，例如式I化合物，呈现出有价值的药理学性质，例如淋巴细胞再循环调整性质，这一点正如在体外和体内实验中显示的那样，所以适应用于治疗。特别地，本发明的化合物作为人S1P4(EDG6)受体的功能激动剂是有用的，这一点通过下列的测定而证实。
确定S1P4化合物体外药理学的测定a)编码人S1P受体的表达载体用于被融合于c-myc肽标记的C末端的人S1P4基因(HSEDG4；GenBank登录号AJ000479)的表达载体如Van Brocklyn等人，2000，Blood95(8)，2624中所述获得。用于S1P4-myc融合蛋白的编码DNA在哺乳动物表达载体pRc/CMV(Invitrogen)中被克隆，该载体赋予G418抗性，用于筛选稳定的哺乳动物细胞。在两条链上确定S1P4插入片段的DNA序列。与HSEDG4的GenBank登录条目比较，没有发现可导致氨基酸变化的核苷酸差异。使用HindIII/Xbal将S1P4-myc cDNA插入pRc/CMV载体中。
使用下列载体。
在人S1P1和S1P3序列之前含有myc序列的人S1P1(GenBankTM登录号M31210)和S1P3(GenBankTM登录号X83864)cDNA被插入pcDNA3.1载体中。对载体进行完全测序以确认构造正确。通过基于PCR的方法克隆人S1P2(GI4090955，TREMBL0195136)。获得肺cDNA(marathon cDNA)(BD Biosciences Chontech，Palo Alto，CA 94303，美国)。下列低聚核苷酸被用于PCR反应正向引物CAC CAT GGG CAG CTTGTA CTC GGA GTA CCT GAA CCC CAA CAA GGT CCA G(1至45，GenBankTM登录号AF034780)和反向引物5‘-GAT TCA GAC CAC CGTGTT GCC CTC CAG(1062至1039，GenBankTM登录号AF034780)，在翻译的起始(ATG)和终止密码子下面划线。PCR在存在0.2-0.4μg cDNA、1×反应缓冲液(10×PfuTurbo DNA聚合酶缓冲液，Stratagene，La Jolla，CA 92037，美国)、0.5μM引物、0.25mM dNTP’s和2.5单位PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)的条件下进行，第一步在95℃进行2分钟，经历30个周期(在95℃30秒，在60℃30秒，在72℃90秒)，最后一步在72℃进行10分钟。通过标准的琼脂糖凝胶电泳分析约1100bp的扩增产物。在克隆位于pcDNA 3.1 Topo V(Invitrogen Corporation)中的PCR产物后，对来自不同细菌菌落的DNA插入物进行测序。由在两个方向测序的三个独立的质粒制备物装配最终序列。
通过基于PCR的方法克隆出人S1P5(GI30171332或GenBankTM登录号AY262689，TREMBLQ9H228)。从BD Biosciences Chlontech(BDBiosciences Chlontech，Palo Alto，CA 94303，USA)获得肺和脾cDNA(marathon cDNA)；使用标准的方法从HeLa细胞中分离出基因组DNA。下列低聚核苷酸被用于PCR反应正向引物CAC CATGGA GTC GGGGCT GCT GCG(-4至20，GenBankTM登录号AY262689)和反向引物5‘-TCAGTC TGC AGC CGG TTC TGA TAC CAG AGT C(1197至1131，AY262689)，在翻译的起始(ATG)和终止密码子下面划线。PCR在存在0.2-0.4μg cDNA、1x反应缓冲液(10×PfuTurbo DNA聚合酶缓冲液，Stratagene，La Jolla，CA 92037，美国)、0.5μM引物、0.25mM dNTP’s和2.5单位PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)的条件下进行，第一步在95℃进行2分钟，经历30个周期(在95℃30秒，在60℃30秒，在72℃90秒)，最后一步在72℃进行10分钟。通过标准的琼脂糖凝胶电泳分析约1100bp的扩增产物。在克隆位于pcDNA 3.1 Topo V(Invitrogen Corporation)中的PCR产物后，对来自不同细菌菌落的DNA插入物进行测序。由在两个方向测序的来自三个独立的质粒制备物装配的最终序列。
b)稳定表达S1P4的CHO-K1细胞系的开发为了开发表达c-myc标记的S1P4受体的稳定细胞系，使用可切割质粒一次的限制性核酸内切酶Pvul切割5μg质粒pRc/CMV myc-S1P4。然后使用最终浓度为0.3M醋酸钠(pH5.0)和66％的乙醇将线性化的质粒沉淀。在离心和洗涤后，将DNA沉淀物溶解于30μl水中。对于转染，CHO-K1(ATCC号CCL-61)细胞在转染前一天被铺于含有10％FCS(胎牛血清)的MEMα介质(极限必需培养基α改变型)中，细胞密度为在100mm细胞培养皿(Falcon)中1×106个细胞/孔，并在37℃、5％CO2环境下孵育24小时。在转染当天，向270μl RPMI培养基中加入5μg线性化pRC/CMVmyc-S1P4质粒。在DNA溶液中加入60μl SuperFect转染试剂(Qiagen)并混合10秒钟后，孵育样品10分钟以便形成复合物。DNA-SuperFect复合物与另外的3ml RPMI/10％FCS混合，然后转移至细胞单层。在孵育3小时后，移去转染培养基，细胞用PBS洗涤。加入补充有10％FCS的新鲜RPMI培养基，在37℃和5％CO2的条件下孵育细胞72小时。在加入500μg/ml G418(Lifetechnologies)后进行稳定转化克隆的选择。在约12-14天后，使用FACStar Plus细胞分类器(BectonDickinson)，根据它们向前和向侧面散开进入96孔细胞培养板的单个孔中的特性进行单个细胞分类，获得细胞克隆。在分类和选择步骤后生长的单个克隆被扩大，以TaqMan定量PCR分析确定的S1P4mRNA水平为基础最终选定一个克隆。
c)细胞培养的维持亲代CHO-K1细胞在补充有10％FBS和10μg/ml庆大霉素(Lifetechnologies)的RPMI培养基(Life technologies)中维持。S1P4/myc转染的CHO-K1细胞，包括最终选定的克隆，在MEMα培养基中维持，该培养基补充有10％FBS、10μg/ml庆大霉素和0.5mg/ml G418(Lifetechnologies)。
d)在CHO稳定的克隆中S1P4转录水平的确定借助于RNeasy Mini kit(Qiagen)，从细胞中分离总RNA。在培养皿(对于35mm培养皿，使用350μl根据Qiagen的方案制备的缓冲液)中直接破裂细胞(以单层生长)后，移取裂解物至qiashredder旋转柱中并在21’000×g下离心2分钟。向液流中加入350μl 70％乙醇，充分混合，加至RNeasy小柱中，在10’000×g下离心15秒。弃去液流，向RNeasy柱中加入700μl缓冲液RW1(Qiagen)并离心15秒以漂洗该柱。该柱进一步通过两次加入500μl缓冲液RPE(Qiagen)并在10000xg离心15秒而洗涤。通过直接在RNeasy柱上加入不合RNAse的30-50μl水并在10’000xg下离心1分钟而洗脱RNA。
用Qiagen的Omniscript试剂盒(Qiagen)逆转录RNA。约2μg RNA与2μl 10x缓冲液、2μl dNTP Mix、1μl RNase抑制剂(10单位/μl)、0.5μg随机六聚体、1μl Omniscript逆转录酶和不含RNase的水混合至最终体积为20μl，并在37℃孵育60分钟，另外在42℃培养30分钟。在93℃使该反应物灭活5分钟，在冰上冷却，在-20℃储藏备用。
为了确定S1P4 mRNA在所选择的克隆中的相对转录水平，进行实时PCR(聚合酶链反应)分析。采用包含质粒的人S1P4作为模板，如PE(Perkin/Elmer)Biosystems提供的“用户公告”所述，确定引物和探针的最佳浓度。用于实时PCR的人S1P4低聚核苷酸以及它们的最佳浓度如下(基于HSEDG4；GenBank登录号AJ000479)
cDNA的第一条链然后被用于在ABI7700TaqMan机(PE Biosystems)上的定量PCR。作为各样品中存在的RNA量的内部对照，采用TaqMan核糖体RNA对照试剂(PE Biosystems，P/N4308310，VIC-标记探针)，通过用核糖体RNA PCR在同一试管中使S1P4 PCR反应倍增(multiplex)，使用18S核糖体RNA。虽然没有在形式上确定S1P4和核糖体RNA的两种独立扩增的类似有效性，但是在不同细胞克隆中的S1P4转录水平的半定量测定足以选择细胞克隆，以进一步在功能测定中表征。
e)膜的制备从野生型CHO-K1和表达人S1P4的CHO细胞克隆制备膜蛋白。为了获得10-30mg膜蛋白，将细胞在一个大的培养皿(500cm2)/细胞克隆中生长至80％和90％汇合。移去培养基，通过在20ml冷的10mM HEPES(pH7.5)中刮取，从培养皿上收集细胞，其中HEPES补充有0.1％不含脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)和蛋白酶抑制剂合剂(每50ml一片，RocheDiagnostics，Rotkreuz)。细胞在4℃于750xg离心10分钟，重新混悬在10ml冷的膜缓冲液(20mM HEPES，pH 7.4；100mM NaCl；10mM MgCl2；1mMEDTA；0.1％BSA和蛋白酶抑制剂合剂)中。将细胞混悬液在冰上采用Polytron匀浆器匀化，转速为25000转/分钟，暂停三次，每次20秒。匀浆在4℃和26’900xg下离心30分钟，膜蛋白沉淀物通过涡旋在2ml冷的膜缓冲液中重新混悬。使用Bio Rad Protein Assay确定蛋白质浓度，使用人IgG作为标准品。调整膜蛋白混悬液的体积，使所得终浓度为2至3mg蛋白/ml。然后再次在冰上于25000转/分钟匀化20秒(Polytron)，然后将溶液等分入Eppendorf管，每管0.8-1ml。
f)表达hS1P4的细胞的活性测定f1)GTPγ35S结合测定在选择将在GTPγS测定中被测试的克隆时以实时PCR测定为基础。在这些实验中使用表达大量人S1P4的CHO克隆。如上所述制备膜蛋白。所用的GTPγ35S结合测定的基本方案在近期出版物(Brinkmann等人，2002，J.Biol.Chem，277，21453)中有描述，进行如下所述的修改。为了表征来自表达S1P的CHO细胞的膜蛋白质的GTPγ35S结合，使用WGA包被的PVT珠(SPA珠，Amersham Biosciences)。因为GTPγ35S的β射线显著穿透水溶液，所以将板进行离心，以使得由未结合GTPγ35S造成的非特异性作用降至最低。在96孔Optiplates(Packard，目录号6005190)中进行测定，终体积为225μl/孔。短暂匀化后，将膜蛋白以不同浓度(25至150μg/ml)重新悬浮在50mM HEPS、100mM NaCl、10mM MgCl2、20μg/ml皂草甙(Riedel-de-Haen目录号16109)、0.1％不含脂肪的BSA(Sigma目录号A0281)(pH7.4)中。将膜蛋白与1mg/孔的SPA珠、10μM GDP、不同浓度的激动剂混合，在室温下孵育10-15分钟。通过加入200pM GTPγ35S(Amersham，目录号SJ1308，＞1000Ci/mmol)引发GTPγ35S结合反应。将Optiplates密封，在持续振摇下于室温孵育110-120分钟。然后将板以2000转/分钟离心10分钟，用TopCount仪器(Packard)计数。用Origin 7 RS2软件包(Origin Lab Corporation，One Roundhouse Plaza，Northampton，MA 01060，美国)中可得的非线性回归拟合程序计算EC50。
f2)钙动员测定将CHO细胞铺在黑色Costar板(96或384孔，分别为50’000或12500个细胞)上的含有FCS的αMEM中，在CO2培养箱中于37℃培养20-24小时。移去培养基后，将细胞在含有2μM Fluo4AM(分子探针，目录号F-1241；1mg/ml贮备于DMSO中)、5mM丙磺舒(probenicid)的HBSS培养基中于37℃培养1小时，用HBSS缓冲液、2.5mM丙磺舒漂洗，并用相同培养基(96孔板用75μl，384孔板用50μl)覆盖。将板转移至FLIPR。测定基线40秒后，加入存在于HBSS中的激动剂，以2秒间隔测定荧光3至5分钟。在某些情况下细胞用50ng/ml百日咳毒素(Sigma，目录号P2980)预处理5小时。在测定前20-40分钟，以50μM和/或150μM向细胞培养基中直接加入2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯(2-APB，Calbiochem，JuroSupply，Bleicherstr.11，Lucerne，瑞士，目录号100065)，它是钙从内质网释放的阻滞剂(Ascher-Landsberg等人，1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.264，979)。用可从诺华获得的Origin 7RS2软件包(OriginLabCorporation)提供的非线性回归拟合程序计算EC50。
S1P4激动剂的特异性和选择性的体外测定测定本申请提及的化合物的特异性，例如它们在用S1P4 cDNA转化之前在亲代细胞系中具有的活性，以及测定它们对用S1P1、S1P2、S1P3和S1P5转化的CHO细胞系的选择性。其它S1P受体的稳定细胞系的产生如S1P4中所述进行，使用如上所述的已发表的人cDNA序列。优选选取的化合物拥有100x的选择性和特异性。例如，S1P4特异性和选择性化合物在S1P4中测定的EC50(表观EC50)比在野生型CHO细胞或在表达其它四种S1P受体中任一种的细胞中测定的EC50低10倍，优选100倍。例如，如果对S1P4而言测定的EC50为200nM，则在CHO细胞或表达S1P1、2、3、5的细胞中测定的EC50优选≥20μM。实施例1的化合物在本测定中对S1P4的EC50为432nM。
实施例2的化合物在CHO细胞或表达多种S1P受体的CHO细胞中的EC50值(以μM为单位)如下表2所示表2
所以，本发明的化合物在治疗和/或预防由淋巴细胞相互作用介导的疾病或紊乱中是有用的，例如移植，如细胞、组织或器官的同种异体或异种移植物的急性或慢性排斥或者延迟的移植物功能，移植物抗宿主病，自身免疫疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、多发硬化症、重症肌无力、I型或II型糖尿病以及与之有关的疾病、脉管炎、恶性贫血、舍格伦综合征、眼色素层炎、牛皮癣、Graves眼病、斑形脱发和其它，过敏性疾病如过敏性哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎/结膜炎、过敏性接触性皮炎，任选有潜在异常反应的炎性疾病如炎性肠病、节段性回肠炎或溃疡性结肠炎、内因性哮喘、炎性肺损伤、炎性肝损伤、炎性肾小球损伤、动脉粥样硬化、骨关节炎、刺激性接触性皮炎和其它湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、免疫介导疾病的皮肤表现、炎性眼病、角膜结膜炎、心肌炎或肝炎，缺血/再灌注损伤如心肌梗塞、中风、消化道缺血、肾衰竭或出血性休克、创伤性休克，其它，癌症如T细胞淋巴瘤或T细胞白血病，感染性疾病如中毒性休克(如超抗原诱导的)、败血症性休克、成人呼吸窘迫综合征或病毒性感染如AIDS、病毒性肝炎或慢性细菌感染。细胞、组织或实体器官移植物包括如胰岛、干细胞、骨髓、角膜组织、神经元组织、心、肺、心肺联合、肾、肝、肠、胰、气管或食管。
对于上述的用途，所要求的剂量当然取决于施用的方式、被治疗的具体病症以及预期作用而变化。通常，当全身施用的日剂量为约0.03至2.5mg/kg体重时可获得满意的结果。在较大的哺乳动物如人类中，指示日剂量为约0.5mg至约100mg，例如以至多一日四次的分开剂量或以延缓释放剂型方便地施用。口服施用的适宜单位剂型包含约1至50mg活性成分。
本发明的化合物可通过任何常规的途径施用，尤其是经肠途径(例如口服，如以片剂或胶囊形式施用)，或者经胃肠道外途径(例如以可注射的溶液或混悬液形式)，局部途径(如以洗剂、凝胶、软膏或乳膏形式，或者是经鼻或栓剂形式)。包含游离形式或可药用盐形式的本发明化合物以及至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可用常规方式通过与可药用载体或稀释剂混合而制造。
本发明化合物可以以游离形式或可药用盐形式施用，例如如上所述。这样的盐可用常规方式制备，并呈现与游离化合物相同级别的活性。
根据前述内容，本发明还提供了1.1在需要该治疗的受治疗者中预防或治疗由淋巴细胞介导的紊乱或疾病、例如如上所述的紊乱或疾病的方法，该方法包含给所述受治疗者施用有效量的本发明化合物，如式I化合物，或其可药用盐；1.2在需要该治疗的受治疗者中预防或治疗急性或慢性移植排斥或由T细胞介导的炎性或自身免疫性疾病的方法，该方法包含给所述受治疗者施用有效量的本发明化合物，例如式I化合物，或其可药用盐；2.游离形式或可药用盐形式的本发明化合物，如式I化合物，用作药物，例如在上文1.1和1.2中所述的任一方法中用作药物；3.药物组合物，例如用于上文1.1和1.2中的任一方法，包含游离形式或可药用盐形式的本发明化合物，如式I化合物，以及可药用的稀释剂或载体。
本发明的化合物，如式I化合物，可作为唯一的活性成分或如作为佐剂与其它药物如免疫抑制剂或免疫调节剂或其它抗炎剂一起施用，例如用于治疗或预防同种异体或异种移植物急性或慢性排斥或者炎性或自身免疫性疾病，或者与化疗剂如恶性细胞抗增殖剂一起施用。例如，本发明的化合物可与下述药物组合物使用钙调磷酸酶抑制剂，如环孢菌素A或FK506；mTOR抑制剂，如雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI1779或ABT578；拥有免疫抑制性质的子囊霉素，如ABT-281、ASM981等等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；来氟米特；咪唑立宾；麦考酚酸；麦考酚酸吗乙酯；15-脱氧精胍菌素或其免疫抑制同系物、类似物或衍生物；免疫抑制单克隆抗体，如白细胞受体的单克隆抗体，如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或它们的配体；其它免疫调节化合物，如具有CTLA4或其突变体的胞外域的至少一部分、如与非CTLA4蛋白序列结合的CTLA4或其突变体的至少胞外部分、如CTLA4Ig(例如所谓的ATCC 68629)或其突变体、如LEA29Y的重组结合分子；粘合分子抑制剂，如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化疗剂，如紫杉醇、吉西他滨、顺铂、阿霉素或5-氟尿嘧啶。
当本发明的化合物，如式I化合物，与其它免疫抑制/免疫调节、抗炎或化疗疗法组合施用时，共同施用的免疫抑制、免疫调节、抗炎或化疗化合物的剂量当然取决于共同药物的类型(例如它是类固醇还是钙调磷酸酶抑制剂)、所用的具体药物、被治疗的病症等等。根据前述，本发明另一方面还提供了4.如上所定义的方法，包含共同使用、例如并行或依次施用治疗有效的无毒量的本发明化合物，如式I化合物，以及至少第二种药物物质，例如如上所示的免疫抑制药物、免疫调节药物、抗炎药物、化疗药物。
5.药物组合，如药盒，包含a)第一种药物，其为游离形式或可药用盐形式的本发明化合物，如本文所公开的式I化合物，和b)至少一种共同药物，如免疫抑制药物、免疫调节药物、抗炎药物或化疗药物，该药盒可包含施用说明。
本文所用的术语“共同施用”或“组合施用”等表示囊括所选治疗药物对单一患者的施用，并意欲包括其中药物不一定以相同施用途径或在同一时间施用的治疗方案。
本文所用的术语“药物组合”表示将多于一种的活性成分混合或合并所得的产品，包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”表示活性成分如本发明的化合物和共同药物以单一实体或剂型同时施用于患者。术语“非固定组合”表示活性成分如本发明的化合物和共同药物以单独的实体无特定时间限制地同时、并行或依次施用于患者，其中这样的施用在患者体内提供了2种化合物的治疗有效水平。后者还适用于组合疗法，如3种或更多种成分的施用。
权利要求
1.游离形式或可药用盐形式的作为S1P4受体激动剂的化合物，其中所述的化合物对S1P4受体的选择性是对S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受体中的一种或多种的至少10倍，这一点通过测定该化合物对S1P4受体的EC50与该化合物对S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受体的EC50之间的比率而得出。
2.游离、水合物或盐形式的式I化合物， 其中R1为苯基或萘基，其中苯基被一个或两个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或苯基C1-6烷基所取代；且R2为氢或C1-6烷基。
3.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其选自3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-苄基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(萘-2-基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(萘-1-基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-丁氧基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-丙基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-异丙基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸和3-(4-(2，4-二氯-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸，或它们的可药用盐。
4.根据权利要求3的化合物，为3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-D-丙氨酸，为游离形式或可药用盐形式。
5.根据权利要求1至4中任一项的化合物，为游离形式或可药用盐形式，用作药物。
6.药物组合物，包含如权利要求1至4中任一项所定义的游离形式或可药用盐形式的化合物以及可药用的稀释剂或载体。
7.权利要求1至4中任一项的游离形式或可药用盐形式的化合物或者权利要求4的药物组合物在制造药物中的用途，所述的药物用于治疗或预防由淋巴细胞介导的紊乱或疾病、急性或慢性移植物排斥、T细胞介导的炎性或自身免疫性疾病、糖尿病、过敏性疾病、心肌炎、肝炎、缺血/再灌注损伤、肾衰竭、出血性休克、创伤性休克、癌症或感染性疾病。
8.药物组合，包含权利要求1至4中任一项的游离形式或可药用盐形式的化合物以及选自免疫抑制、免疫调节、抗炎和化疗药物的其它药物。
9.权利要求2的化合物的生产方法，该方法包含使式II化合物去保护， 其中R1和R2如权利要求2所定义，R6为C1-6烷基或苄基，R7为氨基保护基，并且任选将所得的游离形式的式I化合物转换成盐形式，或反之亦然。
10.在需要该治疗的受治疗者中治疗或预防由淋巴细胞介导的紊乱或疾病、急性或慢性移植物排斥、T细胞介导的炎性或自身免疫性疾病、糖尿病、过敏性疾病、心肌炎、肝炎、缺血/再灌注损伤、肾衰竭、出血性休克、创伤性休克、癌症或感染性疾病的方法，该方法包含给所述受治疗者施用有效量的权利要求1至4中任一项的化合物或其可药用盐。
全文摘要
本发明涉及S1P4受体的激动剂，其对S1P4受体的选择性是对S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受体中一种或多种的至少10倍，特别是新的具有结构(I)的吲哚－丙氨酸衍生物，为游离或盐形式，以及它们的生产方法、它们的用途且特别是在移植中的用途，以及包含它们的药物组合物，其中R
文档编号A61K31/404GK1910148SQ200580002685
公开日2007年2月7日 申请日期2005年1月20日 优先权日2004年1月21日
发明者K·阿扎奥伊, R·鲍赫拉尔, P·比尔迈耶, D·古尔里尼, M·科洛 申请人:诺瓦提斯公司
技术领域：
本发明涉及有机化合物、它们的生产方法和包含它们的药物组合物。
在一个方面，本发明提供了作为1-磷酸-鞘氨醇(S1P4)受体激动剂的化合物，其中的化合物对于S1P4受体拥有比对S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受体中的一种或多种更高的选择性。S1P受体被描述在如WO 03/061567中。优选该化合物对于S1P4受体有超过上述的S1P受体的选择性。该化合物优选显示对S1P4受体的选择性是上述的一种或多种S1P受体的至少10倍、更优选20倍、最优选100倍。通过测定该化合物对S1P4受体的EC50与该化合物对S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受体的EC50之间的比率而确定选择性。EC50值可例如根据下述的GTPγ35S结合测定法或钙动员测定法而获得。在更优选的实施方案中，该化合物在GTPγ35S结合测定法或钙动员测定法中显示对S1P4受体的EC50为1μM或更小。
在优选的实施方案中，本发明涉及游离形式或盐形式的式I化合物 其中R1为苯基或萘基，其中苯基被一个或两个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或苯基C1-6烷基所取代；且R2为氢或C1-6烷基。
任何烷基部分可为直链或支链。C1-6烷基优选是C1-4烷基。C1-6烷氧基优选是C1-4烷氧基。
卤素可为F、Cl、Br或I。
R1优选是式Ia的基团
其中R3、R4和R5中的一个或两个为氢；且R3、R4和R5中的一个或两个为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或苯基C1-6烷基；或者，R3及R4或R4及R5与它们所连接的碳原子共同形成苯环。
在式I和Ia中，独立地、共同地或以任何组合或亚组合优选下列意义a)R4或R5中的一个不为氢，更优选R5不为氢且R4为氢；b)R4或R5为苄基、乙基、丁氧基、丙基、异丙基或氯，更优选R5为上述基团中的一个且R4为氢；b)R3为氢或氯，更优选氢；c)R2为氢或甲基。
式I化合物可形成无机或有机酸的酸加成盐，所述的酸例如是盐酸、氢溴酸或马来酸。式I化合物也可形成衍生于羧基的阳离子盐，更特别是碱金属或碱土金属盐，如钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，以及衍生于氨或有机胺的铵盐。
式I化合物在连接伯氨基的碳原子上含有手性中心。所以式I化合物以两种对映异构体形式存在。应该理解本发明包含式I的外消旋物和任何对映异构体。
式I化合物也可以它们的水合物形式被得到。水合物也构成本发明的一部分。
本发明还提供了式I化合物的生产方法，其包含使式II化合物去保护， 其中R1和R2如上所定义，R6为C1-6烷基或苄基，
R7为氨基保护基，并且如有需要将式I化合物转换成其盐。
使用常规的方法进行该生产方法。适宜的氨基保护基团的实例如“有机合成中的保护基”(T.W.Greene，J.Wiley & Sons NY，第2版，第7章，1991)以及其中的参考文献所公开，例如酰基如叔丁氧羰基、苯甲氧羰基、9-芴基甲氧羰基、三氟乙酰基、三甲基甲硅烷基乙磺酰基等等。当R7为苯甲氧羰基和R6为苄基时，可通过例如氢解而去保护。反应可在室温下在有机溶剂如四氢呋喃、二氯甲烷或二烷中进行，使用披钯炭作为催化剂。如果R6为C1-6烷基，可用两个步骤方便地实现该生产方法。在第一步，式II化合物的羧基基团可通过用如NaOH水溶液或在有机溶剂如四氢呋喃、二烷、甲醇或乙醇中的碱性离子交换树脂的温和水解而在室温下去保护。在第二步，氨基基团用如在二氯甲烷中的碘代三甲硅烷而去保护。如果R7为苯甲氧羰基也可采用氢解反应。当R3至R5中的一个或两个为卤素时，适宜于采用两个步骤的生产方法。
任选的盐形成可按照常规方法进行。
式I化合物的外消旋混合物可用已知的方法拆分，例如使用旋光活性的酸作为拆分剂。或者，通过使用旋光活性原料生产纯的对映异构形式。
用作原料的式II化合物可通过式III化合物与式IV化合物的反应而制得， 其中R6和R7如上所定义， 其中R1和R2如上所定义，并且X为离去基团。
可用常规的方法实现本反应。例如，该反应可在有机溶剂如二氯甲烷中在-15℃至25℃之间的温度下进行。离去基团X为如卤素且特别是氯或羟基。
适宜地存在酸结合剂，例如叔胺，如吡啶。
只要上述方法的原料的生产没有进行具体的描述，那么它们可用与已知化合物类似的方法或本文所描述的方法进行生产。
在下列的实施例中，所有温度以摄氏度给出并且未作校正。[α]D20值也未作校正。
实施例13-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-D-丙氨酸a)4-(2-乙苯基)-吲哚-2-甲酸向0.28g 4-溴-吲哚-2-甲酸和0.069g四三苯膦钯在11ml甲苯和2ml 2M碳酸钠中的混合物中加入0.300g 2-乙基苯基硼酸在3ml乙醇中的溶液。混合物回流16h，过滤，水相用2N HCl进行酸化，并用乙酸乙酯萃取。浓缩有机相，给出棕色粉末状的产品，m.p.230-233℃，纯度足以用于下一步。
b)3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-N(2)-Z-D-丙氨酸甲酯在2.11g 4-(2-乙苯基)-吲哚-2-甲酸在32ml吡啶中的溶液中加入1.41g羰二咪唑。在气体挥发停止后，加入2.29g N(2)-Z-D-2，3-二氨基丙酸甲酯，混合物在室温下搅拌4天。在蒸发溶剂后，残留物用水/乙酸乙酯萃取，干燥有机相，浓缩，粗产品在硅胶中层析，流动相为乙酸异丙酯/甲苯4∶1，得到黄色无定形粉末状的所需化合物。
c)3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-D-丙氨酸将2.03g 3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-N(2)-Z-D-丙氨酸甲酯、4.1ml 2N NaOH和10ml二烷的混合物在室温下搅拌2小时。以常规方式处理后，将获得的酸溶于22ml二氯甲烷并在0℃用1.03ml碘代三甲硅烷进行处理。在搅拌50分钟后，混合物浓缩至于，并将残留物用水吸收。粗品析出并用过滤法收集，用水洗涤，在通过加入0.2N NaOH调节pH至6的水/异丙醇中重结晶，产生白色粉末状的标题化合物，m.p.258-265℃。
式I化合物，其中R1和R2如表1所定义，可通过上述方法之一而制备，但使用适宜的原料。
表1
本文所公开的作为选择性S1P4受体激动剂的游离形式或可药用盐形式的化合物(下文称为本发明的化合物)，例如式I化合物，呈现出有价值的药理学性质，例如淋巴细胞再循环调整性质，这一点正如在体外和体内实验中显示的那样，所以适应用于治疗。特别地，本发明的化合物作为人S1P4(EDG6)受体的功能激动剂是有用的，这一点通过下列的测定而证实。
确定S1P4化合物体外药理学的测定a)编码人S1P受体的表达载体用于被融合于c-myc肽标记的C末端的人S1P4基因(HSEDG4；GenBank登录号AJ000479)的表达载体如Van Brocklyn等人，2000，Blood95(8)，2624中所述获得。用于S1P4-myc融合蛋白的编码DNA在哺乳动物表达载体pRc/CMV(Invitrogen)中被克隆，该载体赋予G418抗性，用于筛选稳定的哺乳动物细胞。在两条链上确定S1P4插入片段的DNA序列。与HSEDG4的GenBank登录条目比较，没有发现可导致氨基酸变化的核苷酸差异。使用HindIII/Xbal将S1P4-myc cDNA插入pRc/CMV载体中。
使用下列载体。
在人S1P1和S1P3序列之前含有myc序列的人S1P1(GenBankTM登录号M31210)和S1P3(GenBankTM登录号X83864)cDNA被插入pcDNA3.1载体中。对载体进行完全测序以确认构造正确。通过基于PCR的方法克隆人S1P2(GI4090955，TREMBL0195136)。获得肺cDNA(marathon cDNA)(BD Biosciences Chontech，Palo Alto，CA 94303，美国)。下列低聚核苷酸被用于PCR反应正向引物CAC CAT GGG CAG CTTGTA CTC GGA GTA CCT GAA CCC CAA CAA GGT CCA G(1至45，GenBankTM登录号AF034780)和反向引物5‘-GAT TCA GAC CAC CGTGTT GCC CTC CAG(1062至1039，GenBankTM登录号AF034780)，在翻译的起始(ATG)和终止密码子下面划线。PCR在存在0.2-0.4μg cDNA、1×反应缓冲液(10×PfuTurbo DNA聚合酶缓冲液，Stratagene，La Jolla，CA 92037，美国)、0.5μM引物、0.25mM dNTP’s和2.5单位PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)的条件下进行，第一步在95℃进行2分钟，经历30个周期(在95℃30秒，在60℃30秒，在72℃90秒)，最后一步在72℃进行10分钟。通过标准的琼脂糖凝胶电泳分析约1100bp的扩增产物。在克隆位于pcDNA 3.1 Topo V(Invitrogen Corporation)中的PCR产物后，对来自不同细菌菌落的DNA插入物进行测序。由在两个方向测序的三个独立的质粒制备物装配最终序列。
通过基于PCR的方法克隆出人S1P5(GI30171332或GenBankTM登录号AY262689，TREMBLQ9H228)。从BD Biosciences Chlontech(BDBiosciences Chlontech，Palo Alto，CA 94303，USA)获得肺和脾cDNA(marathon cDNA)；使用标准的方法从HeLa细胞中分离出基因组DNA。下列低聚核苷酸被用于PCR反应正向引物CAC CATGGA GTC GGGGCT GCT GCG(-4至20，GenBankTM登录号AY262689)和反向引物5‘-TCAGTC TGC AGC CGG TTC TGA TAC CAG AGT C(1197至1131，AY262689)，在翻译的起始(ATG)和终止密码子下面划线。PCR在存在0.2-0.4μg cDNA、1x反应缓冲液(10×PfuTurbo DNA聚合酶缓冲液，Stratagene，La Jolla，CA 92037，美国)、0.5μM引物、0.25mM dNTP’s和2.5单位PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)的条件下进行，第一步在95℃进行2分钟，经历30个周期(在95℃30秒，在60℃30秒，在72℃90秒)，最后一步在72℃进行10分钟。通过标准的琼脂糖凝胶电泳分析约1100bp的扩增产物。在克隆位于pcDNA 3.1 Topo V(Invitrogen Corporation)中的PCR产物后，对来自不同细菌菌落的DNA插入物进行测序。由在两个方向测序的来自三个独立的质粒制备物装配的最终序列。
b)稳定表达S1P4的CHO-K1细胞系的开发为了开发表达c-myc标记的S1P4受体的稳定细胞系，使用可切割质粒一次的限制性核酸内切酶Pvul切割5μg质粒pRc/CMV myc-S1P4。然后使用最终浓度为0.3M醋酸钠(pH5.0)和66％的乙醇将线性化的质粒沉淀。在离心和洗涤后，将DNA沉淀物溶解于30μl水中。对于转染，CHO-K1(ATCC号CCL-61)细胞在转染前一天被铺于含有10％FCS(胎牛血清)的MEMα介质(极限必需培养基α改变型)中，细胞密度为在100mm细胞培养皿(Falcon)中1×106个细胞/孔，并在37℃、5％CO2环境下孵育24小时。在转染当天，向270μl RPMI培养基中加入5μg线性化pRC/CMVmyc-S1P4质粒。在DNA溶液中加入60μl SuperFect转染试剂(Qiagen)并混合10秒钟后，孵育样品10分钟以便形成复合物。DNA-SuperFect复合物与另外的3ml RPMI/10％FCS混合，然后转移至细胞单层。在孵育3小时后，移去转染培养基，细胞用PBS洗涤。加入补充有10％FCS的新鲜RPMI培养基，在37℃和5％CO2的条件下孵育细胞72小时。在加入500μg/ml G418(Lifetechnologies)后进行稳定转化克隆的选择。在约12-14天后，使用FACStar Plus细胞分类器(BectonDickinson)，根据它们向前和向侧面散开进入96孔细胞培养板的单个孔中的特性进行单个细胞分类，获得细胞克隆。在分类和选择步骤后生长的单个克隆被扩大，以TaqMan定量PCR分析确定的S1P4mRNA水平为基础最终选定一个克隆。
c)细胞培养的维持亲代CHO-K1细胞在补充有10％FBS和10μg/ml庆大霉素(Lifetechnologies)的RPMI培养基(Life technologies)中维持。S1P4/myc转染的CHO-K1细胞，包括最终选定的克隆，在MEMα培养基中维持，该培养基补充有10％FBS、10μg/ml庆大霉素和0.5mg/ml G418(Lifetechnologies)。
d)在CHO稳定的克隆中S1P4转录水平的确定借助于RNeasy Mini kit(Qiagen)，从细胞中分离总RNA。在培养皿(对于35mm培养皿，使用350μl根据Qiagen的方案制备的缓冲液)中直接破裂细胞(以单层生长)后，移取裂解物至qiashredder旋转柱中并在21’000×g下离心2分钟。向液流中加入350μl 70％乙醇，充分混合，加至RNeasy小柱中，在10’000×g下离心15秒。弃去液流，向RNeasy柱中加入700μl缓冲液RW1(Qiagen)并离心15秒以漂洗该柱。该柱进一步通过两次加入500μl缓冲液RPE(Qiagen)并在10000xg离心15秒而洗涤。通过直接在RNeasy柱上加入不合RNAse的30-50μl水并在10’000xg下离心1分钟而洗脱RNA。
用Qiagen的Omniscript试剂盒(Qiagen)逆转录RNA。约2μg RNA与2μl 10x缓冲液、2μl dNTP Mix、1μl RNase抑制剂(10单位/μl)、0.5μg随机六聚体、1μl Omniscript逆转录酶和不含RNase的水混合至最终体积为20μl，并在37℃孵育60分钟，另外在42℃培养30分钟。在93℃使该反应物灭活5分钟，在冰上冷却，在-20℃储藏备用。
为了确定S1P4 mRNA在所选择的克隆中的相对转录水平，进行实时PCR(聚合酶链反应)分析。采用包含质粒的人S1P4作为模板，如PE(Perkin/Elmer)Biosystems提供的“用户公告”所述，确定引物和探针的最佳浓度。用于实时PCR的人S1P4低聚核苷酸以及它们的最佳浓度如下(基于HSEDG4；GenBank登录号AJ000479)
cDNA的第一条链然后被用于在ABI7700TaqMan机(PE Biosystems)上的定量PCR。作为各样品中存在的RNA量的内部对照，采用TaqMan核糖体RNA对照试剂(PE Biosystems，P/N4308310，VIC-标记探针)，通过用核糖体RNA PCR在同一试管中使S1P4 PCR反应倍增(multiplex)，使用18S核糖体RNA。虽然没有在形式上确定S1P4和核糖体RNA的两种独立扩增的类似有效性，但是在不同细胞克隆中的S1P4转录水平的半定量测定足以选择细胞克隆，以进一步在功能测定中表征。
e)膜的制备从野生型CHO-K1和表达人S1P4的CHO细胞克隆制备膜蛋白。为了获得10-30mg膜蛋白，将细胞在一个大的培养皿(500cm2)/细胞克隆中生长至80％和90％汇合。移去培养基，通过在20ml冷的10mM HEPES(pH7.5)中刮取，从培养皿上收集细胞，其中HEPES补充有0.1％不含脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)和蛋白酶抑制剂合剂(每50ml一片，RocheDiagnostics，Rotkreuz)。细胞在4℃于750xg离心10分钟，重新混悬在10ml冷的膜缓冲液(20mM HEPES，pH 7.4；100mM NaCl；10mM MgCl2；1mMEDTA；0.1％BSA和蛋白酶抑制剂合剂)中。将细胞混悬液在冰上采用Polytron匀浆器匀化，转速为25000转/分钟，暂停三次，每次20秒。匀浆在4℃和26’900xg下离心30分钟，膜蛋白沉淀物通过涡旋在2ml冷的膜缓冲液中重新混悬。使用Bio Rad Protein Assay确定蛋白质浓度，使用人IgG作为标准品。调整膜蛋白混悬液的体积，使所得终浓度为2至3mg蛋白/ml。然后再次在冰上于25000转/分钟匀化20秒(Polytron)，然后将溶液等分入Eppendorf管，每管0.8-1ml。
f)表达hS1P4的细胞的活性测定f1)GTPγ35S结合测定在选择将在GTPγS测定中被测试的克隆时以实时PCR测定为基础。在这些实验中使用表达大量人S1P4的CHO克隆。如上所述制备膜蛋白。所用的GTPγ35S结合测定的基本方案在近期出版物(Brinkmann等人，2002，J.Biol.Chem，277，21453)中有描述，进行如下所述的修改。为了表征来自表达S1P的CHO细胞的膜蛋白质的GTPγ35S结合，使用WGA包被的PVT珠(SPA珠，Amersham Biosciences)。因为GTPγ35S的β射线显著穿透水溶液，所以将板进行离心，以使得由未结合GTPγ35S造成的非特异性作用降至最低。在96孔Optiplates(Packard，目录号6005190)中进行测定，终体积为225μl/孔。短暂匀化后，将膜蛋白以不同浓度(25至150μg/ml)重新悬浮在50mM HEPS、100mM NaCl、10mM MgCl2、20μg/ml皂草甙(Riedel-de-Haen目录号16109)、0.1％不含脂肪的BSA(Sigma目录号A0281)(pH7.4)中。将膜蛋白与1mg/孔的SPA珠、10μM GDP、不同浓度的激动剂混合，在室温下孵育10-15分钟。通过加入200pM GTPγ35S(Amersham，目录号SJ1308，＞1000Ci/mmol)引发GTPγ35S结合反应。将Optiplates密封，在持续振摇下于室温孵育110-120分钟。然后将板以2000转/分钟离心10分钟，用TopCount仪器(Packard)计数。用Origin 7 RS2软件包(Origin Lab Corporation，One Roundhouse Plaza，Northampton，MA 01060，美国)中可得的非线性回归拟合程序计算EC50。
f2)钙动员测定将CHO细胞铺在黑色Costar板(96或384孔，分别为50’000或12500个细胞)上的含有FCS的αMEM中，在CO2培养箱中于37℃培养20-24小时。移去培养基后，将细胞在含有2μM Fluo4AM(分子探针，目录号F-1241；1mg/ml贮备于DMSO中)、5mM丙磺舒(probenicid)的HBSS培养基中于37℃培养1小时，用HBSS缓冲液、2.5mM丙磺舒漂洗，并用相同培养基(96孔板用75μl，384孔板用50μl)覆盖。将板转移至FLIPR。测定基线40秒后，加入存在于HBSS中的激动剂，以2秒间隔测定荧光3至5分钟。在某些情况下细胞用50ng/ml百日咳毒素(Sigma，目录号P2980)预处理5小时。在测定前20-40分钟，以50μM和/或150μM向细胞培养基中直接加入2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯(2-APB，Calbiochem，JuroSupply，Bleicherstr.11，Lucerne，瑞士，目录号100065)，它是钙从内质网释放的阻滞剂(Ascher-Landsberg等人，1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.264，979)。用可从诺华获得的Origin 7RS2软件包(OriginLabCorporation)提供的非线性回归拟合程序计算EC50。
S1P4激动剂的特异性和选择性的体外测定测定本申请提及的化合物的特异性，例如它们在用S1P4 cDNA转化之前在亲代细胞系中具有的活性，以及测定它们对用S1P1、S1P2、S1P3和S1P5转化的CHO细胞系的选择性。其它S1P受体的稳定细胞系的产生如S1P4中所述进行，使用如上所述的已发表的人cDNA序列。优选选取的化合物拥有100x的选择性和特异性。例如，S1P4特异性和选择性化合物在S1P4中测定的EC50(表观EC50)比在野生型CHO细胞或在表达其它四种S1P受体中任一种的细胞中测定的EC50低10倍，优选100倍。例如，如果对S1P4而言测定的EC50为200nM，则在CHO细胞或表达S1P1、2、3、5的细胞中测定的EC50优选≥20μM。实施例1的化合物在本测定中对S1P4的EC50为432nM。
实施例2的化合物在CHO细胞或表达多种S1P受体的CHO细胞中的EC50值(以μM为单位)如下表2所示表2
所以，本发明的化合物在治疗和/或预防由淋巴细胞相互作用介导的疾病或紊乱中是有用的，例如移植，如细胞、组织或器官的同种异体或异种移植物的急性或慢性排斥或者延迟的移植物功能，移植物抗宿主病，自身免疫疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、多发硬化症、重症肌无力、I型或II型糖尿病以及与之有关的疾病、脉管炎、恶性贫血、舍格伦综合征、眼色素层炎、牛皮癣、Graves眼病、斑形脱发和其它，过敏性疾病如过敏性哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎/结膜炎、过敏性接触性皮炎，任选有潜在异常反应的炎性疾病如炎性肠病、节段性回肠炎或溃疡性结肠炎、内因性哮喘、炎性肺损伤、炎性肝损伤、炎性肾小球损伤、动脉粥样硬化、骨关节炎、刺激性接触性皮炎和其它湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、免疫介导疾病的皮肤表现、炎性眼病、角膜结膜炎、心肌炎或肝炎，缺血/再灌注损伤如心肌梗塞、中风、消化道缺血、肾衰竭或出血性休克、创伤性休克，其它，癌症如T细胞淋巴瘤或T细胞白血病，感染性疾病如中毒性休克(如超抗原诱导的)、败血症性休克、成人呼吸窘迫综合征或病毒性感染如AIDS、病毒性肝炎或慢性细菌感染。细胞、组织或实体器官移植物包括如胰岛、干细胞、骨髓、角膜组织、神经元组织、心、肺、心肺联合、肾、肝、肠、胰、气管或食管。
对于上述的用途，所要求的剂量当然取决于施用的方式、被治疗的具体病症以及预期作用而变化。通常，当全身施用的日剂量为约0.03至2.5mg/kg体重时可获得满意的结果。在较大的哺乳动物如人类中，指示日剂量为约0.5mg至约100mg，例如以至多一日四次的分开剂量或以延缓释放剂型方便地施用。口服施用的适宜单位剂型包含约1至50mg活性成分。
本发明的化合物可通过任何常规的途径施用，尤其是经肠途径(例如口服，如以片剂或胶囊形式施用)，或者经胃肠道外途径(例如以可注射的溶液或混悬液形式)，局部途径(如以洗剂、凝胶、软膏或乳膏形式，或者是经鼻或栓剂形式)。包含游离形式或可药用盐形式的本发明化合物以及至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可用常规方式通过与可药用载体或稀释剂混合而制造。
本发明化合物可以以游离形式或可药用盐形式施用，例如如上所述。这样的盐可用常规方式制备，并呈现与游离化合物相同级别的活性。
根据前述内容，本发明还提供了1.1在需要该治疗的受治疗者中预防或治疗由淋巴细胞介导的紊乱或疾病、例如如上所述的紊乱或疾病的方法，该方法包含给所述受治疗者施用有效量的本发明化合物，如式I化合物，或其可药用盐；1.2在需要该治疗的受治疗者中预防或治疗急性或慢性移植排斥或由T细胞介导的炎性或自身免疫性疾病的方法，该方法包含给所述受治疗者施用有效量的本发明化合物，例如式I化合物，或其可药用盐；2.游离形式或可药用盐形式的本发明化合物，如式I化合物，用作药物，例如在上文1.1和1.2中所述的任一方法中用作药物；3.药物组合物，例如用于上文1.1和1.2中的任一方法，包含游离形式或可药用盐形式的本发明化合物，如式I化合物，以及可药用的稀释剂或载体。
本发明的化合物，如式I化合物，可作为唯一的活性成分或如作为佐剂与其它药物如免疫抑制剂或免疫调节剂或其它抗炎剂一起施用，例如用于治疗或预防同种异体或异种移植物急性或慢性排斥或者炎性或自身免疫性疾病，或者与化疗剂如恶性细胞抗增殖剂一起施用。例如，本发明的化合物可与下述药物组合物使用钙调磷酸酶抑制剂，如环孢菌素A或FK506；mTOR抑制剂，如雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI1779或ABT578；拥有免疫抑制性质的子囊霉素，如ABT-281、ASM981等等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；来氟米特；咪唑立宾；麦考酚酸；麦考酚酸吗乙酯；15-脱氧精胍菌素或其免疫抑制同系物、类似物或衍生物；免疫抑制单克隆抗体，如白细胞受体的单克隆抗体，如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或它们的配体；其它免疫调节化合物，如具有CTLA4或其突变体的胞外域的至少一部分、如与非CTLA4蛋白序列结合的CTLA4或其突变体的至少胞外部分、如CTLA4Ig(例如所谓的ATCC 68629)或其突变体、如LEA29Y的重组结合分子；粘合分子抑制剂，如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化疗剂，如紫杉醇、吉西他滨、顺铂、阿霉素或5-氟尿嘧啶。
当本发明的化合物，如式I化合物，与其它免疫抑制/免疫调节、抗炎或化疗疗法组合施用时，共同施用的免疫抑制、免疫调节、抗炎或化疗化合物的剂量当然取决于共同药物的类型(例如它是类固醇还是钙调磷酸酶抑制剂)、所用的具体药物、被治疗的病症等等。根据前述，本发明另一方面还提供了4.如上所定义的方法，包含共同使用、例如并行或依次施用治疗有效的无毒量的本发明化合物，如式I化合物，以及至少第二种药物物质，例如如上所示的免疫抑制药物、免疫调节药物、抗炎药物、化疗药物。
5.药物组合，如药盒，包含a)第一种药物，其为游离形式或可药用盐形式的本发明化合物，如本文所公开的式I化合物，和b)至少一种共同药物，如免疫抑制药物、免疫调节药物、抗炎药物或化疗药物，该药盒可包含施用说明。
本文所用的术语“共同施用”或“组合施用”等表示囊括所选治疗药物对单一患者的施用，并意欲包括其中药物不一定以相同施用途径或在同一时间施用的治疗方案。
本文所用的术语“药物组合”表示将多于一种的活性成分混合或合并所得的产品，包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”表示活性成分如本发明的化合物和共同药物以单一实体或剂型同时施用于患者。术语“非固定组合”表示活性成分如本发明的化合物和共同药物以单独的实体无特定时间限制地同时、并行或依次施用于患者，其中这样的施用在患者体内提供了2种化合物的治疗有效水平。后者还适用于组合疗法，如3种或更多种成分的施用。
权利要求
1.游离形式或可药用盐形式的作为S1P4受体激动剂的化合物，其中所述的化合物对S1P4受体的选择性是对S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受体中的一种或多种的至少10倍，这一点通过测定该化合物对S1P4受体的EC50与该化合物对S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受体的EC50之间的比率而得出。
2.游离、水合物或盐形式的式I化合物， 其中R1为苯基或萘基，其中苯基被一个或两个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或苯基C1-6烷基所取代；且R2为氢或C1-6烷基。
3.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其选自3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-苄基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(萘-2-基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(萘-1-基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-丁氧基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-丙基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸、3-(4-(2-异丙基-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸和3-(4-(2，4-二氯-苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-丙氨酸，或它们的可药用盐。
4.根据权利要求3的化合物，为3-(4-(2-乙苯基)-2-甲酰氨基-吲哚)-D-丙氨酸，为游离形式或可药用盐形式。
5.根据权利要求1至4中任一项的化合物，为游离形式或可药用盐形式，用作药物。
6.药物组合物，包含如权利要求1至4中任一项所定义的游离形式或可药用盐形式的化合物以及可药用的稀释剂或载体。
7.权利要求1至4中任一项的游离形式或可药用盐形式的化合物或者权利要求4的药物组合物在制造药物中的用途，所述的药物用于治疗或预防由淋巴细胞介导的紊乱或疾病、急性或慢性移植物排斥、T细胞介导的炎性或自身免疫性疾病、糖尿病、过敏性疾病、心肌炎、肝炎、缺血/再灌注损伤、肾衰竭、出血性休克、创伤性休克、癌症或感染性疾病。
8.药物组合，包含权利要求1至4中任一项的游离形式或可药用盐形式的化合物以及选自免疫抑制、免疫调节、抗炎和化疗药物的其它药物。
9.权利要求2的化合物的生产方法，该方法包含使式II化合物去保护， 其中R1和R2如权利要求2所定义，R6为C1-6烷基或苄基，R7为氨基保护基，并且任选将所得的游离形式的式I化合物转换成盐形式，或反之亦然。
10.在需要该治疗的受治疗者中治疗或预防由淋巴细胞介导的紊乱或疾病、急性或慢性移植物排斥、T细胞介导的炎性或自身免疫性疾病、糖尿病、过敏性疾病、心肌炎、肝炎、缺血/再灌注损伤、肾衰竭、出血性休克、创伤性休克、癌症或感染性疾病的方法，该方法包含给所述受治疗者施用有效量的权利要求1至4中任一项的化合物或其可药用盐。
全文摘要
本发明涉及S1P4受体的激动剂，其对S1P4受体的选择性是对S1P1、S1P2、S1P3或S1P5受体中一种或多种的至少10倍，特别是新的具有结构(I)的吲哚－丙氨酸衍生物，为游离或盐形式，以及它们的生产方法、它们的用途且特别是在移植中的用途，以及包含它们的药物组合物，其中R
文档编号A61K31/404GK1910148SQ200580002685
公开日2007年2月7日 申请日期2005年1月20日 优先权日2004年1月21日
发明者K·阿扎奥伊, R·鲍赫拉尔, P·比尔迈耶, D·古尔里尼, M·科洛 申请人:诺瓦提斯公司
最新回复(0)