2,3-o去硫酸肝素在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-23  129

专利名称:2,3-o去硫酸肝素在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用的制作方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别是生物制品在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一,肿瘤细胞恶性化的重要步骤是由原发部位向新的组织中的转移。肿瘤细胞转移是一个高度受控、多因子参与的动态级联反应过程。在此过程中,进入血液中循环的肿瘤细胞与血小板的相互作用形成“微栓塞”是一个非常关键的环节。“微栓塞”的形成不仅为肿瘤细胞提供了一个保护罩,而且有利于肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附。许多研究已经证明,血小板与肿瘤细胞“微栓塞”的形成要求血小板的P-选择素与肿瘤细胞的P-选择素配体的相互作用。肝素是P-选择素的一种配体,可以干扰P-选择素与其天然配体的结合,从而阻断了血小板与肿瘤细胞的粘附。所以肝素抗肿瘤转移的一个重要机制就是阻断了由P-选择素介导的血小板与肿瘤细胞的粘附。肝素是一种带有高度负电荷的多硫酸化的糖胺聚糖,主要由糖醛酸-(1→4)-D-葡萄糖胺的重复二糖亚单位组成。但二糖亚单位上的N-硫酸化、O-硫酸化和N-乙酰化等多种方式的取代使肝素产生了巨大而复杂的结构。作为临床广泛应用的抗凝血药物肝素已被证明可以在多方面有效地抑制肿瘤转移,但是肝素的抗凝血活性带来的潜在出血危险极大地限制了其在预防和治疗肿瘤转移方面的应用。解决上述问题的有效途径一般是通过化学法或酶法制备低抗凝血活性的低分子量肝素。但由于这类肝素衍生物的分子量低,结构相对简单,失去了某些影响肿瘤转移活性的结构基础。另一个有效途径是通过化学修饰手段制备非抗凝血活性的肝素。本研究通过多种选择性化学修饰方法制备了8种非抗凝血肝素衍生物,选取了4种人肿瘤细胞系,系统地研究了这些人肿瘤细胞系与P-选择素、转染P-选择素的CHO细胞和表达P-选择素的血小板在静止和层流状态下的相互作用及各种非抗凝血肝素衍生物对这种相互作用的抑制。获得了具有良好抑制肿瘤细胞粘附活性的非抗凝血肝素衍生物(2,3-O去硫酸肝素),实现了本项发明预期的研究目标。到目前为止,将2,3-O去硫酸化的非抗凝血肝素衍生物用于抑制P-选择素介导的肿瘤细胞与血小板粘附的研究在国内外尚未见文献和专利报道。
目前,在临床上还没有特别有效的药物用于预防和治疗肿瘤细胞的转移。2,3-O去硫酸肝素的应用克服了肝素在临床应用中带来的潜在出血危险。同时,2,3-O去硫酸肝素制备工艺简单、成本低,具有更好的应用前景。

发明内容
本项发明是将经化学修饰获得的非抗凝血肝素衍生物用于体外抗肿瘤细胞粘附的研究,获得具有良好抑制肿瘤细胞粘附活性的非抗凝血肝素衍生物,目的是获得进一步应用于临床的预防和治疗肿瘤转移的新的药物。
本发明涉及2,3-O去硫酸肝素的制备、抗凝血活性分析及体外抗肿瘤细胞粘附等相关内容。2,3-O去硫酸肝素的获得是采用NaOH选择性去硫酸根法,得到的肝素衍生物经Sepharose CL-6B凝胶层析检验具有肝素主体结构的完整性。离子色谱分析显示其硫酸根含量明显降低(肝素样品为26.76%,2,3-O去硫酸肝素为18.19%)。经激活部分促凝血酶原激酶时间法(aPTT)测得2,3-O去硫酸肝素的抗凝血活性是肝素的1/250。2,3-0去硫酸肝素可以明显地抑制4种人的肿瘤细胞(人结肠癌细胞COLO320、LS174T和CW-2,人恶性黑素瘤细胞A375)与P-选择素在静止状态下的结合(以对COLO320的作用为例,在5mg/mL时的抑制率分别为90.4%、92.2%、84.8%和92.5%,而未修饰肝素为95.8%)、与转P-选择素基因的CHO细胞在层流下的结合(以对COLO320的作用为例,在5mg/mL浓度、层壁剪切力为0.3dyn/cm2时抑制率分别为77.4%、64%、64%和66%,未修饰肝素为79%)及与固定的血小板在层流下的结合(以对COLO320的作用为例,在5mg/mL浓度、层壁剪切力为0.3dyn/cm2时抑制率分别为92.3%、71.9%、56.3%和94.8%,未修饰肝素为96.8%)。
本发明解决了临床上使用未修饰肝素带来的潜在的出血危险,为临床应用肝素预防和治疗肿瘤转移提供了新途径。因为2,3-O去硫酸肝素具有制备工艺简单、成本低等优点,具有可观的应用前景。
具体实施例方式
2,3-O去硫酸肝素的制备400mg肝素(Sigma-Aldrich Inc.,150U/mg,MW约为20,000)溶于100mL水中。加入NaOH使其终浓度达到0.5mol/L,pH为13.0。溶液被冻干。少量水溶解后,蒸馏水透析72h,HCl调pH值至7.0,溶液再次被冻干。
2,3-O去硫酸肝素的抗凝血分析采用aPTT(激活部分促凝血酶原激酶时间)测定法。各种肝素衍生物用柠檬酸化的人新鲜血浆配制成不同浓度,然后使用Lyophilizedsilica aPTT试剂盒,经日本产ACL200凝聚仪测定。
体外抗肿瘤细胞粘附 用体外模拟毛细血管的层流实验测定肿瘤细胞与固定的血小板(或CHO-P)的粘附作用。所有用于层流实验的单细胞悬液密度均为1×106cells/mL。将覆盖有血小板的玻片(或长满CHO-P的35mm培养皿)装配于平行板流动小室,然后放置在倒置显微镜的载物台上。倒置显微镜连接有彩色视频摄像装置,可以将视频图像传送到录像机,并可用相连的计算机显示器同步观察。
首先用注射泵(Cole-Parmer Instrument Co.)注入PBS(0.1%BSA)冲洗平行板流动小室约2min,然后注入肿瘤细胞单细胞悬液。以适合的流速维持层壁剪切压0.3dyn/cm2,模拟体外微循环和后毛细血管静脉的流体机械环境。整个系统保持在22℃。当肿瘤细胞进入视野3min后,随机选定10-20个区域(0.1266mm2),记录粘附于血小板(或CHO-P)的肿瘤细胞,最后通过观看录像带人工计数。
2,3-0去硫酸肝素与未修饰肝素的抗凝血活性比较本实验采用激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定法。2,3-O去硫酸肝素和未修饰肝素分别用柠檬酸化的健康人外周血的血浆配制成不同浓度,经ACL200凝聚仪测定不同浓度的抗凝血时间(凝血时间以秒为单位,超过120秒不被统计)。结果表明,与未修饰肝素相比,2,3-O去硫酸肝素的抗凝血活性明显降低,只相当于未修饰肝素的1/250(表1)。
表1.2/3-O去硫酸肝素和肝素的抗凝血活性aPTT(s) 2μg/ 4μg/ 6μg/ 8μg/0.1mg/mL 1.0mg/mL 5.0mg/mLmL mL mL mLControl 30.330.330.330.330.3 30.3 30.3Heparin 72.9>120 - - ---2/3ODS-Heparin32.934.837.239.463.4 >120-
2,3-O去硫酸肝素对肿瘤细胞与CHO-P在层流状态下结合的抑制用体外模拟毛细血管的层流实验测定肿瘤细胞与固定的CHO-P的粘附作用。将长满CHO-P的35mm培养皿装配于平行板流动小室,然后放置在倒置显微镜的载物台上(在与肿瘤细胞作用前,表达P-selectin的CHO-P细胞先与5.0mg/mL的2,3-O去硫酸肝素或未修饰肝素作用30分钟)。用注射泵注入肿瘤细胞单细胞悬液(1×106cells/mL),以适合的流速维持层壁剪切压0.3dyn/cm2,整个系统保持在22℃,当肿瘤细胞进入视野3min后记录粘附于CHO-P表面的肿瘤细胞,最后通过观看录像带人工计数。结果显示,2,3-O去硫酸肝素可以明显地抑制肿瘤细胞与CHO-P在层流状态下的结合。与阳性对照相比,其抑制效果分别达到64%(COLO320细胞)、57.5%(CW-2细胞)和72.7%(A375细胞)。2,3-O去硫酸肝素抑制肿瘤细胞(人结肠癌细胞COLO320和CW-2,人恶性黑素瘤细胞A375)与CHO-P在层流状态下的结合。肿瘤细胞在0.3dyn/cm2壁层剪切压条件下与静止的CHO细胞的粘附设为(-),与CHO-P细胞的粘附设为(+)。2,3-O去硫酸肝素和未修饰肝素的作用浓度为5.0mg/mL。数据来自3-6组独立实验的结果,每次实验选择10-20个视野进行统计,以平均值表示(±SD),*p<0.05,**p<0.012,3-O去硫酸肝素对肿瘤细胞与血小板在层流状态下结合的抑制用含5%自体血浆的PBS稀释富含血小板的血浆沉淀物,以1×106cells/mL的密度将血小板铺于直径35mm的圆形盖片上,室温作用1h,0.1%BSA封闭10min,然后将覆盖血小板盖片装配于平行板流动小室,放置在倒置显微镜的载物台上(在与肿瘤细胞作用前,血小板先与5.0mg/mL的2,3-O去硫酸肝素或未修饰肝素作用30min)。用注射泵注入肿瘤细胞单细胞悬液(1×106cells/mL),以适合的流速维持层壁剪切压0.3dyn/cm2,整个系统保持在22℃,当肿瘤细胞进入视野3min后记录粘附于CHO-P表面的肿瘤细胞,最后通过观看录像带人工计数。结果显示,2,3-O去硫酸肝素可以明显地抑制肿瘤细胞与血小板在层流状态下的结合。与阳性对照相比,其抑制效果分别达到92.3%(COLO320细胞)、56.3%(CW-2细胞)和94.8%(A375细胞)。即使在1.0mg/mL的较低浓度下,抑制率也可以分别达到88.8%(COLO320细胞)、47.3%(CW-2细胞)和89.4%(A375细胞)。2,3-O去硫酸肝素抑制肿瘤细胞(人结肠癌细胞COLO320和CW-2,人恶性黑素瘤细胞A375)与血小板在层流状态下的结合。肿瘤细胞在0.3dyn/cm2壁层剪切压条件下与未活化的血小板之间的粘附设为(-),与活化的血小板之间的粘附设为(+)。2,3-O去硫酸肝素和未修饰肝素的作用浓度分别为5.0mg/mL、1.0mg/mL和0.1mg/mL。数据来自3-6组独立实验的结果,每次实验选者10-20个视野进行统计,以平均值表示(±SD),*p<0.05,**p<0.01。
权利要求
1.2,3-0去硫酸肝素在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。
全文摘要
2,3-O去硫酸肝素在预防和治疗肿瘤转移中的应用。本发明属于生物技术领域,特别是生物制品在预防和治疗肿瘤转移中的应用。本发明是将经化学修饰获得的非抗凝血的2,3-O去硫酸肝素用于抗肿瘤细胞的转移,主要基于2,3-O去硫酸肝素抑制P-选择素介导的肿瘤细胞与血小板的粘附的实验结果。2,3-O去硫酸肝素具有肝素的完整结构,抗肿瘤细胞粘附的活性与肝素相当,但只有极低的抗凝血活性。2,3-O去硫酸肝素用于预防和治疗肿瘤转移,解决了临床上使用肝素带来的潜在的出血危险,同时2,3-O去硫酸肝素具有制备工艺简单、成本低等优点。
文档编号A61K31/726GK1522708SQ0312713
公开日2004年8月25日 申请日期2003年9月5日 优先权日2003年9月5日
发明者曾宪录, 魏民 申请人:东北师范大学

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