淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松药物中的应用的制作方法
专利名称：淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松药物中的应用。
背景技术：
骨质疏松症是老年医学的热门课题，随着世界人口的老化，患骨质疏松的人群在逐年增多，据统计我国目前65岁以上的老年人已达1.2亿，而患有骨质疏松的患者在这些人群中约占90％，因此防治骨质疏松是保证人民生活质量的一个十分迫切的研究课题。
产生骨质疏松的根本原因就是骨吸收与骨形成作用失衡，大量的骨吸收使骨量减少、质量下降。目前所用治疗骨质疏松症的疗法(如维生素D、激素替代、二膦酸类药物)都只能防止骨被吸收而不能促使骨形成。雌激素替代疗法，因其具有潜在的致癌危险性及不良反应，故临床应用受到限制；甲状旁腺激素虽能刺激骨形成，但缺点之一是必须注射给药；氟化物可通过刺激成骨细胞的活动起作用，但常常引起严重的胃肠道反应、骨矿化不良、髋关节骨折和椎体骨折的频率增加等；降钙素可以短期改善骨质疏松患者的疼痛，但在预防密质骨的丢失和髋部骨折效果不好。
中药淫羊藿是传统的补肾壮阳药，《本草纲要》中有“补命门，益精气，坚筋骨”之说。淫羊藿很早即被应用于治疗骨质疏松症的复方中药中，但其抗骨质疏松作用直到近年来才引起人们的高度重视，并开展了大量基础实验和临床应用研究。李青南等用去睾丸法造成SD大鼠的骨质疏松症模型，然后给模型大鼠灌服淫羊藿水煎提取液，每周6次。持续7周后发现，灌药组胫骨近端骨小梁的骨吸收率明显降低，骨形成率和矿化沉积率则明显增加，同时发现该药具有促进骨髓细胞DNA合成的作用，见李青南，吴铁，谢华，等.中草药，1993年，第12期。淫羊藿富含黄酮类化合物，已被证明是淫羊藿药理作用的主要有效成分。季晖等在维A酸结合低钙饲料诱导的大鼠骨质疏松模型及去卵巢结合低钙饲料诱导的大鼠骨质疏松模型上分别验证淫羊藿总黄酮的抗骨质疏松作用，结果发现淫羊藿总黄酮能明显提高骨质疏松大鼠股骨表观面密度和骨密度，降低骨小梁吸收表面百分率和形成表面百分率，升高骨小梁体积百分率(TBV％)，并有提高骨Ca、骨P的趋势，见季晖，刘康，龚晓健，等.淫羊藿总黄酮对摘除卵巢大鼠骨质疏松症的防治作用.中国骨质疏松杂志，2001年，第1期及季晖，刘康，李绍平，等.淫羊藿总黄酮对维A酸诱导大鼠骨质疏松症的防治作用.中国药科大学学报，2000年，第3期。
虽然淫羊藿及淫羊藿总黄酮的抗骨质疏松作用已得到医药界的广泛认同，但由于科研能力所限及资金、技术壁垒等原因，淫羊藿及淫羊藿总黄酮中真正起作用的是何种成分，至今尚未有结论。尽管中国专利公开文本CN1282584A中公开了淫羊藿苷具有预防或治疗性功能障碍和血管收缩的作用，但关于淫羊藿苷具有预防或治疗骨质疏松的作用未见报道，鉴于此，本发明人通过大量的实验研究，惊奇地发现淫羊藿总黄酮中具有治疗骨质疏松作用的成分是淫羊藿苷，即淫羊藿苷具有预防或治疗骨质疏松的医药用途。
发明内容
本发明提供了淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松的药物中的应用。
本发明提供了含有淫羊藿苷的治疗骨质疏松的药物组合物。
本发明所述的淫羊藿苷在治疗或预防骨质疏松症的医药用途是通过对淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷在治疗骨质疏松作用上进行对比研究而得出的。
本发明人通过下列试验证实了淫羊藿苷具有治疗或预防骨质疏松症的作用，但并不限于此试验。试验所用的“淫羊藿总黄酮”主要包括朝藿定A、hexandraside A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，其中淫羊藿苷含量为20％；“淫羊藿苷”含淫羊藿苷90％。分别按文献王昌利，宋小妹，武新华，等.淫羊藿总黄酮提取分离工艺研究.中成药，1996年，第5期和辛钟成，Euy Kyung Kim，田贞姬，等.淫羊藿苷对阴茎海绵体的松弛效应及其作用机制.科学通报，2001年，第6期中所述方法提取分离制备。
通过试验，本发明人发现淫羊藿苷可提高骨质疏松大鼠自主活动能力，股骨、胫骨最大负荷和结构强度；增加股骨和椎骨骨密度，改善骨指数和股骨灰分指数。“淫羊藿苷”和“淫羊藿总黄酮”剂量按纯淫羊藿苷量计算，剂量相等时(如“淫羊藿苷”20mg/kg与“淫羊藿总黄酮”90mg/kg；“淫羊藿苷”40mg/kg与“淫羊藿总黄酮”180mg/kg)，对骨质疏松的治疗作用基本相同。由此证明了淫羊藿苷是淫羊藿总黄酮中治疗骨质疏松的有效成分。
淫羊藿苷分子式C33H40O15，分子量676.67，熔点225～230℃，化学结构式 淫羊藿苷用于治疗或预防骨质疏松时，其剂量为10mg～1000mg，优选为100mg～500mg。
本发明所述的淫羊藿苷在用于治疗或预防骨质疏松疾病时，可以单独使用或以含有淫羊藿苷的药物组合物的形式使用。
本发明提供的药物组合物可按本领域已知方法制备并可以通过口服、舌下、经皮、肌肉或皮下、皮肤粘膜、尿道、阴道或静脉等途径给药。口服制剂可以制成如片剂、胶囊、颗粒剂、口嚼剂、丸剂、悬浮液、溶液等，非肠道给药制剂可以制成注射液、冻干粉针等剂型，局部给药可以制成如霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。但并不限于此。
具体实施例方式试验例1淫羊藿苷对维甲酸所致雌性大鼠骨质疏松症的治疗作用1.材料淫羊藿总黄酮(含淫羊藿苷20％)，按文献王昌利，宋小妹，武新华，等.淫羊藿总黄酮提取分离工艺研究.中成药，1996年第5期制备。
淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文献辛钟成，Euy Kyung Kim，等.淫羊藿苷对阴茎海绵体的松弛效应及其作用机制.科学通报，2001年第6期中所述方法提取分离制备。
维甲酸胶囊，重庆华邦制药公司生产，批号990701；低钙饲料，中国医学科学院动物所生产。
普通级Wistar大鼠，雌性，3～4月龄，体重150～210g，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
SX-2.5-10型马福炉(天津市中环实验电炉有限公司生产)；BP210S型电子分析天平(德国sartorius公司生产)；QDR-4000型双能线骨密度测定仪(美国HOLOGIC公司生产)；CSS-1101C电子万能试验机(长春试验机研究所生产)。
2.方法2.1大鼠骨质疏松模型的制备、动物分组及用药取健康3～4月龄雌性大鼠，随机分为6组正常对照组，骨质疏松模型组，淫羊藿苷小剂量组(20mg/kg)，淫羊藿苷大剂量组(40mg/kg)，淫羊藿总黄酮小剂量组(90mg/kg)，淫羊藿总黄酮大剂量组(180mg/kg)。除正常对照组外，各组大鼠均以维甲酸70mg/kg剂量灌胃给药，1次/日，连续三周。造模三周后，停服维甲酸，各组动物分别按上述药物剂量灌胃给药。1次/日，连续给药一个月。正常对照组和骨质疏松模型组给予与给药组等容量的生理盐水(10ml/kg)。饲养室温度22℃～25℃，湿度50％～70％，喂以低钙饲料(含钙量＜0.3％)，自由饮水。
2.2大鼠活动能力的测定末次给药24h后，取大鼠置于实验盒中，记录5min内大鼠自主活动次数。
2.3大鼠骨密度测定末次给药24h后以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型双能线骨密度测定仪探头下，仰位固定于检测台上，头与身体呈直线，线球管对准身体纵轴中点，选择大鼠骨质疏松敏感区域单侧(左侧)股骨中点(F50)的皮质骨和第三腰椎骨测定骨密度。
2.4大鼠骨指数、骨矿成分(骨Ca、P)的测定末次给药24h后，取大鼠右侧股骨于120℃烘箱中干燥2h，电子天平测定骨重量(W)、游标卡尺测定骨长(L)、骨直径(D)，计算表观线密度(W/L)，表观面密度(W/LD)。将上述股骨置于800℃马福炉中灰化8h，使骨呈白色粉末状，称灰重(Wash)，其灰重即为无机物质重量。用等离子光量计测定骨灰中钙、磷等元素的含量，并计算骨灰分的灰分表观线密度(Wash/L)及灰分表观面密度(Wash/LD)。
2.5大鼠骨生物力学的测定末次给药24h后，左侧股骨、胫骨剔除肌肉和周围组织，放入液体石蜡中7天之内测定其生物力学特征，用电子万能试验机做三点折断试验，参数为标定1/50，加载速度6mm/min，最大负荷200牛顿(N)，跨距20mm，描记负荷—变形曲线，计算最大负荷及结构强度(引起1mm变形需要的负荷，相当于曲线上的斜率)。
3结果3.1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响由表1可见，与正常组相比，模型组大鼠自主活动次数显著下降；淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠自主活动次数，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。表1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 自主活动次数正常组NS 214.8±36.7模型组NS 115.4±29.3**淫羊藿苷大40 191.6±21.8ΔΔ淫羊藿苷小20 159.5±31.0Δ淫羊藿总黄酮大180 180.8±32.4Δ淫羊藿总黄酮小90 161.2±34.1Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响由表2可见，与正常组相比模型组大鼠股骨密度和椎骨密度显著下降，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 股骨密度(g/cm2) 椎骨密度(g/cm2)正常组NS 0.77±0.08 0.75±0.03模型组NS 0.52±0.06**0.50±0.05**淫羊藿苷大40 0.70±0.02ΔΔ0.68±0.02ΔΔ淫羊藿苷小20 0.61±0.04Δ0.62±0.03Δ淫羊藿总黄酮大1800.72±0.03ΔΔ0.69±0.02ΔΔ淫羊藿总黄酮小90 0.63±0.07Δ0.64±0.06Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.3淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨指数的影响由表3可见，与正常组相比模型组大鼠股骨重量、长度、表观线密度、表观面密度均明显下降，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表3淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量 骨灰重量(g)灰分表观线密 灰分表观面密度(mg/kg) 度(g/cm)(g/cm2)正常组NS0.36±0.03 0.10±0.00 0.26±0.01模型组NS0.22±0.02**0.06±0.00**0.20±0.01**淫羊藿苷大400.33±0.03ΔΔ0.08±0.01ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿苷小200.26±0.03Δ0.07±0.02Δ0.23±0.01Δ淫羊藿总黄酮大180 0.34±0.05ΔΔ0.08±0.01ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿总黄酮小900.27±0.03Δ0.07±0.01Δ0.23±0.02Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.4淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨矿成分含量的影响由表4可见，与正常组相比模型组大鼠股骨Ca、P含量显著降低，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨Ca、P含量，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表4淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量 钙(mg/g) 磷(mg/g)(mg/kg)正常组NS34.39±2.13 15.44±0.75模型组NS21.41±2.51**9.62±0.56**淫羊藿苷大4030.36±3.52ΔΔ13.28±1.54ΔΔ淫羊藿苷小2026.45±3.22Δ12.67±1.21Δ淫羊藿总黄酮大180 31.33±3.64ΔΔ13.62±1.10ΔΔ淫羊藿总黄酮小9027.69±3.58Δ12.36±1.38Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组
3.5淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的测定由表5可见，与正常组相比模型组大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度显著降低，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表5淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的影响(n＝10，X±s)组别 剂量 股骨最大负荷 股骨结构强度 胫骨最大负荷胫骨结构强度(mg/kg)(N) (N/mm) (N) (N/mm)正常组 NS 108.5±5.7357.6±22.2 71.8±12.8 511.3±134.9模型组 NS 71.6±8.7**250.7±18.9**48.2±13.1**369.6±86.5**淫羊藿苷大 40 98.7±6.4ΔΔ315.4±26.9ΔΔ67.2±10.4ΔΔ464.8±65.3**淫羊藿苷小 20 83.6±9.6Δ278.6±25.7Δ61.8±10.6Δ449.6±74.4Δ淫羊藿总黄酮大 180 101.5±6.2ΔΔ318.6±33.4ΔΔ68.6±15.3ΔΔ473.6±101.9ΔΔ淫羊藿总黄酮小 90 85.6±9.1Δ281.7±35.9Δ62.8±14.9Δ452.9±80.5Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组4结论以上试验结果表明，给予骨质疏松大鼠等剂量的淫羊藿苷(含20％淫羊藿苷的淫羊藿总黄酮90mg/kg、180mg/kg或含淫羊藿苷90％的淫羊藿苷20mg/kg、40mg/kg)，对大鼠骨质疏松的治疗作用基本相同，即淫羊藿总黄酮治疗骨质疏松的有效成分是淫羊藿苷。
试验例2淫羊藿苷对切除睾丸所致大鼠肾虚骨质疏松症的治疗作用1.材料淫羊藿总黄酮(含淫羊藿苷20％)，按文献王昌利，宋小妹，武新华，等.淫羊藿总黄酮提取分离工艺研究.中成药，1996年，第5期制备。
淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文献辛钟成，Euy Kyung Kim，等.淫羊藿苷对阴茎海绵体的松弛效应及其作用机制.科学通报，2001年，第6期中所述方法提取分离制备。
维甲酸胶囊，重庆华邦制药公司生产，批号990701；低钙饲料，中国医学科学院动物所生产。
普通级Wistar大鼠，雄性，3～4月龄，体重150～210g，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
SX-2.5-10型马福炉(天津市中环实验电炉有限公司生产)；BP210S型电子分析天平(德国sartorius公司生产)；QDR-4000型双能线骨密度测定仪(美国HOLOGIC公司生产)；CSS-1101C电子万能试验机(长春试验机研究所生产)。
2.方法2.1大鼠骨质疏松模型的制备、动物分组及用药动物随机分为假手术组，骨质疏松模型组，淫羊藿苷小剂量组(20mg/kg)，淫羊藿苷大剂量组(40mg/kg)，淫羊藿总黄酮小剂量组(90mg/kg)，淫羊藿总黄酮大剂量组(180mg/kg)。大鼠水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，仰位固定，碘酒消毒阴囊部，沿阴囊正中纵行切开一小口，分开切口，卵圆形睾丸即露出，丝线结扎，在结扎线与睾丸之间剪下睾丸，缝合切口，用75％酒精棉球消毒。假手术组动物用同法剥离出睾丸，但不摘除，放回缝合。手术三周后各组动物分别按上述药物剂量灌胃给药。1次/日，连续给药一个月。正常对照组和骨质疏松模型组给予与给药组等容量的生理盐水(10ml/kg)。饲养室温度22℃～25℃，湿度50％～70％，喂以低钙饲料(含钙量＜0.3％)，自由饮水。
2.2大鼠活动能力的测定末次给药24h后，取大鼠置于实验盒中，记录5min内大鼠自主活动次数。
2.3大鼠骨密度测定末次给药24h后以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型双能线骨密度测定仪探头下，仰位固定于检测台上，头与身体呈直线，线球管对准身体纵轴中点，选择大鼠骨质疏松敏感区域单侧(左侧)股骨中点(F50)的皮质骨和第三腰椎骨测定骨密度。
2.4大鼠骨指数、骨矿成分(骨Ca、P)的测定末次给药24h后，取大鼠右侧股骨于120℃烘箱中干燥2h，电子天平测定骨重量(W)、游标卡尺测定骨长(L)、骨直径(D)，计算表观线密度(W/L)，表观面密度(W/LD)。将上述股骨置于800℃马福炉中灰化8h，使骨呈白色粉末状，称灰重(Wash)，其灰重即为无机物质重量。用等离子光量计测定骨灰中钙、磷等元素的含量，并计算骨灰分的灰分表观线密度(Wash/L)及灰分表观面密度(Wash/LD)。
2.5大鼠骨生物力学的测定末次给药24h后，左侧股骨、胫骨剔除肌肉和周围组织，放入液体石蜡中7天之内测定其生物力学特征，用电子万能试验机做三点折断试验，参数为标定1/50，加载速度6mm/min，最大负荷200牛顿(N)，跨距20mm，描记负荷—变形曲线，计算最大负荷及结构强度(引起1mm变形需要的负荷，相当于曲线上的斜率)。
3.结果3.1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响由表1可见，与正常组相比，模型组大鼠自主活动次数显著下降；淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠自主活动次数，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 自主活动次数正常组NS232.5±32.7模型组NS126.1±35.4**淫羊藿苷大40205.0±34.6ΔΔ淫羊藿苷小20167.5±33.5Δ淫羊藿总黄酮大180 215.8±32.6ΔΔ淫羊藿总黄酮小90168.2±38.1Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响由表2可见，与正常组相比模型组大鼠股骨密度和椎骨密度显著下降，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 股骨密度(g/cm2) 椎骨密度(g/cm2)正常组NS 0.78±0.02 0.75±0.02模型组NS 0.53±0.07**0.49±0.05**淫羊藿苷大40 0.71±0.03ΔΔ0.67±0.02ΔΔ淫羊藿苷小20 0.62±0.04Δ0.61±0.03Δ淫羊藿总黄酮大1800.75±0.03ΔΔ0.68±0.02ΔΔ淫羊藿总黄酮小90 0.63±0.07Δ0.61±0.05Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.3淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨指数的影响由表3可见，与正常组相比模型组大鼠股骨重量、长度、表观线密度、表观面密度均明显下降，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表3淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量 骨灰重量(g) 灰分表观线密度灰分表观面密度(mg/kg) (g/cm)(g/cm2)正常组NS 0.36±0.02 0.14±0.00 0.25±0.01模型组NS 0.24±0.02**0.08±0.01**0.21±0.01**淫羊藿苷大40 0.33±0.03ΔΔ0.11±0.01ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿苷小20 0.28±0.03Δ0.09±0.02Δ0.23±0.01Δ淫羊藿总黄酮大1800.34±0.05ΔΔ0.11±0.03ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿总黄酮小90 0.28±0.03Δ0.09±0.01Δ0.23±0.02Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.4淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨矿成分含量的影响由表4可见，与正常组相比模型组大鼠股骨Ca、P含量显著降低，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨Ca、P含量，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表4淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 钙(mg/g) 磷(mg/g)正常组NS 34.66±3.51 14.64±1.35模型组NS 22.37±2.63**9.31±0.87**淫羊藿苷大40 31.38±3.58ΔΔ13.16±1.45ΔΔ淫羊藿苷小20 27.82±3.55Δ12.58±1.07Δ淫羊藿总黄酮大18032.36±3.73ΔΔ13.39±1.13ΔΔ淫羊藿总黄酮小90 28.65±3.22Δ12.64±1.32Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.5淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的测定由表5可见，与正常组相比模型组大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度显著降低，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表5淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的影响(n＝10，X±s)组别剂量 股骨最大负荷 股骨结构强度 胫骨最大负荷 胫骨结构强度(mg/kg) (N) (N/mm) (N) (N/mm)正常组 NS 118.8±7.5 367.6±22.8 79.2±8.9 648.9±138.8模型组 NS 87.4±19.6**255.8±16.3**53.2±13.2**468±108.2**淫羊藿苷大 40 102.2±9.3ΔΔ311.2±25.4ΔΔ73.6±10.5ΔΔ588.4±84.7ΔΔ淫羊藿苷小 20 99.6±15.1Δ279.4±26.1Δ64.7±10.2Δ509.6±94.3Δ淫羊藿总黄酮大 180 102.3±7.9ΔΔ317.2±34.5ΔΔ75.2±15.4ΔΔ582.6±123.9ΔΔ淫羊藿总黄酮小 90 97.6±9.1Δ283.3±34.8Δ66.5±14.1Δ512.9±91.2Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组4结论以上试验结果表明，给予骨质疏松大鼠等剂量的淫羊藿苷(含20％淫羊藿苷的淫羊藿总黄酮90mg/kg、180mg/kg或含淫羊藿苷90％的淫羊藿苷20mg/kg、40mg/kg)，对大鼠骨质疏松的治疗作用基本相同，即淫羊藿总黄酮治疗骨质疏松的有效成分是淫羊藿苷。
试验例3不同剂量淫羊藿苷对维甲酸所致雌性大鼠骨质疏松症的治疗作用1.材料淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文献辛钟成，Euy Kyung Kim，田贞姬，等.淫羊藿苷对阴茎海绵体的松弛效应及其作用机制.科学通报，2001年，第6期中所述方法提取分离制备。
维甲酸胶囊，重庆华邦制药公司生产，批号990701；低钙饲料，中国医学科学院动物所生产。
普通级Wistar大鼠，雌性，3～4月龄，体重150～210g，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
SX-2.5-10型马福炉(天津市中环实验电炉有限公司生产)；BP210S型电子分析天平(德国sartorius公司生产)；QDR-4000型双能线骨密度测定仪(美国HOLOGIC公司生产)；CSS-1101C电子万能试验机(长春试验机研究所生产)。
2.方法2.1大鼠骨质疏松模型的制备、动物分组及用药取健康3～4月龄雌性大鼠，随机分为5组正常对照组，骨质疏松模型组，淫羊藿苷大剂量组(20mg/kg)，淫羊藿苷中剂量组(10mg/kg)，淫羊藿苷小剂量组(5mg/kg)。除正常对照组外，各组大鼠均以维甲酸70mg/kg剂量灌胃给药，1次/日，连续三周。造模三周后，停服维甲酸，各组动物分别按上述药物剂量灌胃给药。1次/日，连续给药一个月。正常对照组和骨质疏松模型组给予与给药组等容量的生理盐水(10ml/kg)。饲养室温度22℃～25℃，湿度50％～70％，喂以低钙饲料(含钙量＜0.3％)，自由饮水。
2.2大鼠骨密度测定末次给药24h后以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型双能线骨密度测定仪探头下，仰位固定于检测台上，头与身体呈直线，线球管对准身体纵轴中点，选择大鼠骨质疏松敏感区域单侧(左侧)股骨中点(F50)的皮质骨和第三腰椎骨测定骨密度。
2.3大鼠骨生物力学的测定末次给药24h后，左侧股骨、胫骨剔除肌肉和周围组织，放入液体石蜡中7天之内测定其生物力学特征，用电子万能试验机做三点折断试验，参数为标定1/50，加载速度6mm/min，最大负荷200牛顿(N)，跨距20mm，描记负荷—变形曲线，计算最大负荷及结构强度(引起1mm变形需要的负荷，相当于曲线上的斜率)。
3结果3.1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响由表1可见，与正常组相比模型组大鼠股骨密度和椎骨密度显著下降，淫羊藿苷大、中剂量均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，而淫羊藿苷小剂量(5mg/kg)对此无明显影响。
表1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 股骨密度(g/cm2) 椎骨密度(g/cm2)正常对照组 NS 0.81±0.02 0.79±0.02模型对照组 NS 0.51±0.07**0.47±0.05**淫羊藿苷大 20 0.76±0.03ΔΔ0.71±0.02ΔΔ淫羊藿苷中 10 0.64±0.04Δ0.63±0.03Δ淫羊藿苷小 5 0.54±0.07 0.51±0.05**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组
3.2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的测定由表2可见，与正常组相比模型组大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度显著降低，淫羊藿苷大、中剂量均能显著提高骨质疏松大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度，而淫羊藿苷小剂量(5mg/kg)对此无明显影响。
表2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的影响(n＝10，X±s)组别剂量 股骨最大负荷 股骨结构强度 胫骨最大负荷胫骨结构强度(mg/kg) (N) (N/mm) (N)(N/mm)正常对照组 NS 119.8±7.7 373.6±22.8 81.3±8.5 653.2±133.1模型对照组 NS 67.4±19.3**205.7±16.3**41.2±12.2**447±99.2**淫羊藿苷大 20 103.2±18.3ΔΔ321.2±25.5ΔΔ76.6±12.3ΔΔ581.4±86.7ΔΔ淫羊藿苷中 10 89.6±15.1Δ265.4±29.1Δ62.7±10.2Δ498.6±94.5Δ淫羊藿苷小 573.6±12.3 231.3±34.81 51.2±14.8 459.9±128.2**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组试验例4淫羊藿苷急性毒性试验1材料淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文献辛钟成，Euy Kyung Kim，田贞姬，等.淫羊藿苷对阴茎海绵体的松弛效应及其作用机制。科学通报，2001年，第6期中所述方法提取分离制备。
清洁级昆明系小鼠，18～22g，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106003号。饲料由中国药品生物制品鉴定检验所提供。按SOP要求检疫一周，剔除不合格动物。试验室与饲养室条件一致。室温18～25℃，湿度40～60％，过滤送风，光照12小时。自由摄食和饮水，每日更换饮水瓶一次。
2方法2.1剂量设计动物药效试验显示大鼠口服10mg/kg即有明显的抗骨质疏松的作用。淫羊藿苷能够配制的可供灌胃用的混悬液为100mg/ml，小鼠灌胃给药的最大允许体积为1ml/只，故设计给药剂量为小鼠5.0g/kg，每日给药1次。
2.2分组、给药取健康小鼠40只，雌雄各半。随机分为生理盐水组和淫羊藿苷组，每组20只。称重后，按5.0g/kg的剂量、1ml/20g的给药体积灌胃，对照组灌胃等体积生理盐水。给药后密切观察小鼠的毒性反应和死亡情况；4小时后，改为每天观察一次，连续14天。每周测量体重1次。
3结果灌胃给予淫羊藿苷后，小鼠活动未见异常。4小时内，未见耳朵、眼睑、四足等部位颜色的改变，尿液颜色未见明显异常。14天内，小鼠毛色光亮，饮食、活动以及体重都与对照组无显著差异(表1)。
表1小鼠口服5.0g/kg淫羊藿苷体重的变化(X±s)；动物体重(g)组别性别数量 试验前第7天 第14天淫羊藿 ♀ 10 18.58±0.65 25.45±1.07 28.2±1.53苷组♂ 10 18.86±0.52 29.15±0.81 34.57±1.80生理盐 ♀ 10 18.52±0.63 26.04±2.19 29.38±3.19水组♂ 10 18.59±0.82 29.27±1.77 34.87±1.9权利要求
1.淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于淫羊藿苷的使用剂量范围为10mg～1000mg。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于淫羊藿苷的使用剂量优选为100mg～500mg。
4.含有淫羊藿苷的用于治疗或预防骨质疏松的药物组合物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，该组合物可以通过口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、尿道、阴道或静脉途径给药。
6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于组合物可以以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液、糖浆、注射剂、霜剂、软膏、喷雾剂、口嚼剂或贴剂等形式存在。
全文摘要
本发明提供了淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松药物中的新用途，该用途的使用剂量为100－1000mg。本发明还提供了用于骨质疏松症的含淫羊藿苷的药物组合物，该组合物可以口服、经皮、舌下、皮下或静脉等多种途径给药。
文档编号A61K31/7048GK1539427SQ0312791
公开日2004年10月27日 申请日期2003年4月23日 优先权日2003年4月23日
发明者田京伟, 傅风华, 王振华, 徐本明, 刘珂 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司
技术领域：
本发明涉及淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松药物中的应用。
背景技术：
骨质疏松症是老年医学的热门课题，随着世界人口的老化，患骨质疏松的人群在逐年增多，据统计我国目前65岁以上的老年人已达1.2亿，而患有骨质疏松的患者在这些人群中约占90％，因此防治骨质疏松是保证人民生活质量的一个十分迫切的研究课题。
产生骨质疏松的根本原因就是骨吸收与骨形成作用失衡，大量的骨吸收使骨量减少、质量下降。目前所用治疗骨质疏松症的疗法(如维生素D、激素替代、二膦酸类药物)都只能防止骨被吸收而不能促使骨形成。雌激素替代疗法，因其具有潜在的致癌危险性及不良反应，故临床应用受到限制；甲状旁腺激素虽能刺激骨形成，但缺点之一是必须注射给药；氟化物可通过刺激成骨细胞的活动起作用，但常常引起严重的胃肠道反应、骨矿化不良、髋关节骨折和椎体骨折的频率增加等；降钙素可以短期改善骨质疏松患者的疼痛，但在预防密质骨的丢失和髋部骨折效果不好。
中药淫羊藿是传统的补肾壮阳药，《本草纲要》中有“补命门，益精气，坚筋骨”之说。淫羊藿很早即被应用于治疗骨质疏松症的复方中药中，但其抗骨质疏松作用直到近年来才引起人们的高度重视，并开展了大量基础实验和临床应用研究。李青南等用去睾丸法造成SD大鼠的骨质疏松症模型，然后给模型大鼠灌服淫羊藿水煎提取液，每周6次。持续7周后发现，灌药组胫骨近端骨小梁的骨吸收率明显降低，骨形成率和矿化沉积率则明显增加，同时发现该药具有促进骨髓细胞DNA合成的作用，见李青南，吴铁，谢华，等.中草药，1993年，第12期。淫羊藿富含黄酮类化合物，已被证明是淫羊藿药理作用的主要有效成分。季晖等在维A酸结合低钙饲料诱导的大鼠骨质疏松模型及去卵巢结合低钙饲料诱导的大鼠骨质疏松模型上分别验证淫羊藿总黄酮的抗骨质疏松作用，结果发现淫羊藿总黄酮能明显提高骨质疏松大鼠股骨表观面密度和骨密度，降低骨小梁吸收表面百分率和形成表面百分率，升高骨小梁体积百分率(TBV％)，并有提高骨Ca、骨P的趋势，见季晖，刘康，龚晓健，等.淫羊藿总黄酮对摘除卵巢大鼠骨质疏松症的防治作用.中国骨质疏松杂志，2001年，第1期及季晖，刘康，李绍平，等.淫羊藿总黄酮对维A酸诱导大鼠骨质疏松症的防治作用.中国药科大学学报，2000年，第3期。
虽然淫羊藿及淫羊藿总黄酮的抗骨质疏松作用已得到医药界的广泛认同，但由于科研能力所限及资金、技术壁垒等原因，淫羊藿及淫羊藿总黄酮中真正起作用的是何种成分，至今尚未有结论。尽管中国专利公开文本CN1282584A中公开了淫羊藿苷具有预防或治疗性功能障碍和血管收缩的作用，但关于淫羊藿苷具有预防或治疗骨质疏松的作用未见报道，鉴于此，本发明人通过大量的实验研究，惊奇地发现淫羊藿总黄酮中具有治疗骨质疏松作用的成分是淫羊藿苷，即淫羊藿苷具有预防或治疗骨质疏松的医药用途。
发明内容
本发明提供了淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松的药物中的应用。
本发明提供了含有淫羊藿苷的治疗骨质疏松的药物组合物。
本发明所述的淫羊藿苷在治疗或预防骨质疏松症的医药用途是通过对淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷在治疗骨质疏松作用上进行对比研究而得出的。
本发明人通过下列试验证实了淫羊藿苷具有治疗或预防骨质疏松症的作用，但并不限于此试验。试验所用的“淫羊藿总黄酮”主要包括朝藿定A、hexandraside A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，其中淫羊藿苷含量为20％；“淫羊藿苷”含淫羊藿苷90％。分别按文献王昌利，宋小妹，武新华，等.淫羊藿总黄酮提取分离工艺研究.中成药，1996年，第5期和辛钟成，Euy Kyung Kim，田贞姬，等.淫羊藿苷对阴茎海绵体的松弛效应及其作用机制.科学通报，2001年，第6期中所述方法提取分离制备。
通过试验，本发明人发现淫羊藿苷可提高骨质疏松大鼠自主活动能力，股骨、胫骨最大负荷和结构强度；增加股骨和椎骨骨密度，改善骨指数和股骨灰分指数。“淫羊藿苷”和“淫羊藿总黄酮”剂量按纯淫羊藿苷量计算，剂量相等时(如“淫羊藿苷”20mg/kg与“淫羊藿总黄酮”90mg/kg；“淫羊藿苷”40mg/kg与“淫羊藿总黄酮”180mg/kg)，对骨质疏松的治疗作用基本相同。由此证明了淫羊藿苷是淫羊藿总黄酮中治疗骨质疏松的有效成分。
淫羊藿苷分子式C33H40O15，分子量676.67，熔点225～230℃，化学结构式 淫羊藿苷用于治疗或预防骨质疏松时，其剂量为10mg～1000mg，优选为100mg～500mg。
本发明所述的淫羊藿苷在用于治疗或预防骨质疏松疾病时，可以单独使用或以含有淫羊藿苷的药物组合物的形式使用。
本发明提供的药物组合物可按本领域已知方法制备并可以通过口服、舌下、经皮、肌肉或皮下、皮肤粘膜、尿道、阴道或静脉等途径给药。口服制剂可以制成如片剂、胶囊、颗粒剂、口嚼剂、丸剂、悬浮液、溶液等，非肠道给药制剂可以制成注射液、冻干粉针等剂型，局部给药可以制成如霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。但并不限于此。
具体实施例方式试验例1淫羊藿苷对维甲酸所致雌性大鼠骨质疏松症的治疗作用1.材料淫羊藿总黄酮(含淫羊藿苷20％)，按文献王昌利，宋小妹，武新华，等.淫羊藿总黄酮提取分离工艺研究.中成药，1996年第5期制备。
淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文献辛钟成，Euy Kyung Kim，等.淫羊藿苷对阴茎海绵体的松弛效应及其作用机制.科学通报，2001年第6期中所述方法提取分离制备。
维甲酸胶囊，重庆华邦制药公司生产，批号990701；低钙饲料，中国医学科学院动物所生产。
普通级Wistar大鼠，雌性，3～4月龄，体重150～210g，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
SX-2.5-10型马福炉(天津市中环实验电炉有限公司生产)；BP210S型电子分析天平(德国sartorius公司生产)；QDR-4000型双能线骨密度测定仪(美国HOLOGIC公司生产)；CSS-1101C电子万能试验机(长春试验机研究所生产)。
2.方法2.1大鼠骨质疏松模型的制备、动物分组及用药取健康3～4月龄雌性大鼠，随机分为6组正常对照组，骨质疏松模型组，淫羊藿苷小剂量组(20mg/kg)，淫羊藿苷大剂量组(40mg/kg)，淫羊藿总黄酮小剂量组(90mg/kg)，淫羊藿总黄酮大剂量组(180mg/kg)。除正常对照组外，各组大鼠均以维甲酸70mg/kg剂量灌胃给药，1次/日，连续三周。造模三周后，停服维甲酸，各组动物分别按上述药物剂量灌胃给药。1次/日，连续给药一个月。正常对照组和骨质疏松模型组给予与给药组等容量的生理盐水(10ml/kg)。饲养室温度22℃～25℃，湿度50％～70％，喂以低钙饲料(含钙量＜0.3％)，自由饮水。
2.2大鼠活动能力的测定末次给药24h后，取大鼠置于实验盒中，记录5min内大鼠自主活动次数。
2.3大鼠骨密度测定末次给药24h后以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型双能线骨密度测定仪探头下，仰位固定于检测台上，头与身体呈直线，线球管对准身体纵轴中点，选择大鼠骨质疏松敏感区域单侧(左侧)股骨中点(F50)的皮质骨和第三腰椎骨测定骨密度。
2.4大鼠骨指数、骨矿成分(骨Ca、P)的测定末次给药24h后，取大鼠右侧股骨于120℃烘箱中干燥2h，电子天平测定骨重量(W)、游标卡尺测定骨长(L)、骨直径(D)，计算表观线密度(W/L)，表观面密度(W/LD)。将上述股骨置于800℃马福炉中灰化8h，使骨呈白色粉末状，称灰重(Wash)，其灰重即为无机物质重量。用等离子光量计测定骨灰中钙、磷等元素的含量，并计算骨灰分的灰分表观线密度(Wash/L)及灰分表观面密度(Wash/LD)。
2.5大鼠骨生物力学的测定末次给药24h后，左侧股骨、胫骨剔除肌肉和周围组织，放入液体石蜡中7天之内测定其生物力学特征，用电子万能试验机做三点折断试验，参数为标定1/50，加载速度6mm/min，最大负荷200牛顿(N)，跨距20mm，描记负荷—变形曲线，计算最大负荷及结构强度(引起1mm变形需要的负荷，相当于曲线上的斜率)。
3结果3.1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响由表1可见，与正常组相比，模型组大鼠自主活动次数显著下降；淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠自主活动次数，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。表1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 自主活动次数正常组NS 214.8±36.7模型组NS 115.4±29.3**淫羊藿苷大40 191.6±21.8ΔΔ淫羊藿苷小20 159.5±31.0Δ淫羊藿总黄酮大180 180.8±32.4Δ淫羊藿总黄酮小90 161.2±34.1Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响由表2可见，与正常组相比模型组大鼠股骨密度和椎骨密度显著下降，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 股骨密度(g/cm2) 椎骨密度(g/cm2)正常组NS 0.77±0.08 0.75±0.03模型组NS 0.52±0.06**0.50±0.05**淫羊藿苷大40 0.70±0.02ΔΔ0.68±0.02ΔΔ淫羊藿苷小20 0.61±0.04Δ0.62±0.03Δ淫羊藿总黄酮大1800.72±0.03ΔΔ0.69±0.02ΔΔ淫羊藿总黄酮小90 0.63±0.07Δ0.64±0.06Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.3淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨指数的影响由表3可见，与正常组相比模型组大鼠股骨重量、长度、表观线密度、表观面密度均明显下降，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表3淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量 骨灰重量(g)灰分表观线密 灰分表观面密度(mg/kg) 度(g/cm)(g/cm2)正常组NS0.36±0.03 0.10±0.00 0.26±0.01模型组NS0.22±0.02**0.06±0.00**0.20±0.01**淫羊藿苷大400.33±0.03ΔΔ0.08±0.01ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿苷小200.26±0.03Δ0.07±0.02Δ0.23±0.01Δ淫羊藿总黄酮大180 0.34±0.05ΔΔ0.08±0.01ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿总黄酮小900.27±0.03Δ0.07±0.01Δ0.23±0.02Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.4淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨矿成分含量的影响由表4可见，与正常组相比模型组大鼠股骨Ca、P含量显著降低，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨Ca、P含量，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表4淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量 钙(mg/g) 磷(mg/g)(mg/kg)正常组NS34.39±2.13 15.44±0.75模型组NS21.41±2.51**9.62±0.56**淫羊藿苷大4030.36±3.52ΔΔ13.28±1.54ΔΔ淫羊藿苷小2026.45±3.22Δ12.67±1.21Δ淫羊藿总黄酮大180 31.33±3.64ΔΔ13.62±1.10ΔΔ淫羊藿总黄酮小9027.69±3.58Δ12.36±1.38Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组
3.5淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的测定由表5可见，与正常组相比模型组大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度显著降低，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表5淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的影响(n＝10，X±s)组别 剂量 股骨最大负荷 股骨结构强度 胫骨最大负荷胫骨结构强度(mg/kg)(N) (N/mm) (N) (N/mm)正常组 NS 108.5±5.7357.6±22.2 71.8±12.8 511.3±134.9模型组 NS 71.6±8.7**250.7±18.9**48.2±13.1**369.6±86.5**淫羊藿苷大 40 98.7±6.4ΔΔ315.4±26.9ΔΔ67.2±10.4ΔΔ464.8±65.3**淫羊藿苷小 20 83.6±9.6Δ278.6±25.7Δ61.8±10.6Δ449.6±74.4Δ淫羊藿总黄酮大 180 101.5±6.2ΔΔ318.6±33.4ΔΔ68.6±15.3ΔΔ473.6±101.9ΔΔ淫羊藿总黄酮小 90 85.6±9.1Δ281.7±35.9Δ62.8±14.9Δ452.9±80.5Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组4结论以上试验结果表明，给予骨质疏松大鼠等剂量的淫羊藿苷(含20％淫羊藿苷的淫羊藿总黄酮90mg/kg、180mg/kg或含淫羊藿苷90％的淫羊藿苷20mg/kg、40mg/kg)，对大鼠骨质疏松的治疗作用基本相同，即淫羊藿总黄酮治疗骨质疏松的有效成分是淫羊藿苷。
试验例2淫羊藿苷对切除睾丸所致大鼠肾虚骨质疏松症的治疗作用1.材料淫羊藿总黄酮(含淫羊藿苷20％)，按文献王昌利，宋小妹，武新华，等.淫羊藿总黄酮提取分离工艺研究.中成药，1996年，第5期制备。
淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文献辛钟成，Euy Kyung Kim，等.淫羊藿苷对阴茎海绵体的松弛效应及其作用机制.科学通报，2001年，第6期中所述方法提取分离制备。
维甲酸胶囊，重庆华邦制药公司生产，批号990701；低钙饲料，中国医学科学院动物所生产。
普通级Wistar大鼠，雄性，3～4月龄，体重150～210g，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
SX-2.5-10型马福炉(天津市中环实验电炉有限公司生产)；BP210S型电子分析天平(德国sartorius公司生产)；QDR-4000型双能线骨密度测定仪(美国HOLOGIC公司生产)；CSS-1101C电子万能试验机(长春试验机研究所生产)。
2.方法2.1大鼠骨质疏松模型的制备、动物分组及用药动物随机分为假手术组，骨质疏松模型组，淫羊藿苷小剂量组(20mg/kg)，淫羊藿苷大剂量组(40mg/kg)，淫羊藿总黄酮小剂量组(90mg/kg)，淫羊藿总黄酮大剂量组(180mg/kg)。大鼠水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，仰位固定，碘酒消毒阴囊部，沿阴囊正中纵行切开一小口，分开切口，卵圆形睾丸即露出，丝线结扎，在结扎线与睾丸之间剪下睾丸，缝合切口，用75％酒精棉球消毒。假手术组动物用同法剥离出睾丸，但不摘除，放回缝合。手术三周后各组动物分别按上述药物剂量灌胃给药。1次/日，连续给药一个月。正常对照组和骨质疏松模型组给予与给药组等容量的生理盐水(10ml/kg)。饲养室温度22℃～25℃，湿度50％～70％，喂以低钙饲料(含钙量＜0.3％)，自由饮水。
2.2大鼠活动能力的测定末次给药24h后，取大鼠置于实验盒中，记录5min内大鼠自主活动次数。
2.3大鼠骨密度测定末次给药24h后以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型双能线骨密度测定仪探头下，仰位固定于检测台上，头与身体呈直线，线球管对准身体纵轴中点，选择大鼠骨质疏松敏感区域单侧(左侧)股骨中点(F50)的皮质骨和第三腰椎骨测定骨密度。
2.4大鼠骨指数、骨矿成分(骨Ca、P)的测定末次给药24h后，取大鼠右侧股骨于120℃烘箱中干燥2h，电子天平测定骨重量(W)、游标卡尺测定骨长(L)、骨直径(D)，计算表观线密度(W/L)，表观面密度(W/LD)。将上述股骨置于800℃马福炉中灰化8h，使骨呈白色粉末状，称灰重(Wash)，其灰重即为无机物质重量。用等离子光量计测定骨灰中钙、磷等元素的含量，并计算骨灰分的灰分表观线密度(Wash/L)及灰分表观面密度(Wash/LD)。
2.5大鼠骨生物力学的测定末次给药24h后，左侧股骨、胫骨剔除肌肉和周围组织，放入液体石蜡中7天之内测定其生物力学特征，用电子万能试验机做三点折断试验，参数为标定1/50，加载速度6mm/min，最大负荷200牛顿(N)，跨距20mm，描记负荷—变形曲线，计算最大负荷及结构强度(引起1mm变形需要的负荷，相当于曲线上的斜率)。
3.结果3.1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响由表1可见，与正常组相比，模型组大鼠自主活动次数显著下降；淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠自主活动次数，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠自主活动次数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 自主活动次数正常组NS232.5±32.7模型组NS126.1±35.4**淫羊藿苷大40205.0±34.6ΔΔ淫羊藿苷小20167.5±33.5Δ淫羊藿总黄酮大180 215.8±32.6ΔΔ淫羊藿总黄酮小90168.2±38.1Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响由表2可见，与正常组相比模型组大鼠股骨密度和椎骨密度显著下降，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 股骨密度(g/cm2) 椎骨密度(g/cm2)正常组NS 0.78±0.02 0.75±0.02模型组NS 0.53±0.07**0.49±0.05**淫羊藿苷大40 0.71±0.03ΔΔ0.67±0.02ΔΔ淫羊藿苷小20 0.62±0.04Δ0.61±0.03Δ淫羊藿总黄酮大1800.75±0.03ΔΔ0.68±0.02ΔΔ淫羊藿总黄酮小90 0.63±0.07Δ0.61±0.05Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.3淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨指数的影响由表3可见，与正常组相比模型组大鼠股骨重量、长度、表观线密度、表观面密度均明显下降，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表3淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量 骨灰重量(g) 灰分表观线密度灰分表观面密度(mg/kg) (g/cm)(g/cm2)正常组NS 0.36±0.02 0.14±0.00 0.25±0.01模型组NS 0.24±0.02**0.08±0.01**0.21±0.01**淫羊藿苷大40 0.33±0.03ΔΔ0.11±0.01ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿苷小20 0.28±0.03Δ0.09±0.02Δ0.23±0.01Δ淫羊藿总黄酮大1800.34±0.05ΔΔ0.11±0.03ΔΔ0.24±0.01ΔΔ淫羊藿总黄酮小90 0.28±0.03Δ0.09±0.01Δ0.23±0.02Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.4淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨矿成分含量的影响由表4可见，与正常组相比模型组大鼠股骨Ca、P含量显著降低，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨Ca、P含量，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表4淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨灰分指数的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 钙(mg/g) 磷(mg/g)正常组NS 34.66±3.51 14.64±1.35模型组NS 22.37±2.63**9.31±0.87**淫羊藿苷大40 31.38±3.58ΔΔ13.16±1.45ΔΔ淫羊藿苷小20 27.82±3.55Δ12.58±1.07Δ淫羊藿总黄酮大18032.36±3.73ΔΔ13.39±1.13ΔΔ淫羊藿总黄酮小90 28.65±3.22Δ12.64±1.32Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组3.5淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的测定由表5可见，与正常组相比模型组大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度显著降低，淫羊藿苷大小剂量组均能显著提高骨质疏松大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度，效果与相当剂量(按淫羊藿苷计)的淫羊藿总黄酮基本相同。
表5淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的影响(n＝10，X±s)组别剂量 股骨最大负荷 股骨结构强度 胫骨最大负荷 胫骨结构强度(mg/kg) (N) (N/mm) (N) (N/mm)正常组 NS 118.8±7.5 367.6±22.8 79.2±8.9 648.9±138.8模型组 NS 87.4±19.6**255.8±16.3**53.2±13.2**468±108.2**淫羊藿苷大 40 102.2±9.3ΔΔ311.2±25.4ΔΔ73.6±10.5ΔΔ588.4±84.7ΔΔ淫羊藿苷小 20 99.6±15.1Δ279.4±26.1Δ64.7±10.2Δ509.6±94.3Δ淫羊藿总黄酮大 180 102.3±7.9ΔΔ317.2±34.5ΔΔ75.2±15.4ΔΔ582.6±123.9ΔΔ淫羊藿总黄酮小 90 97.6±9.1Δ283.3±34.8Δ66.5±14.1Δ512.9±91.2Δ**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组4结论以上试验结果表明，给予骨质疏松大鼠等剂量的淫羊藿苷(含20％淫羊藿苷的淫羊藿总黄酮90mg/kg、180mg/kg或含淫羊藿苷90％的淫羊藿苷20mg/kg、40mg/kg)，对大鼠骨质疏松的治疗作用基本相同，即淫羊藿总黄酮治疗骨质疏松的有效成分是淫羊藿苷。
试验例3不同剂量淫羊藿苷对维甲酸所致雌性大鼠骨质疏松症的治疗作用1.材料淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文献辛钟成，Euy Kyung Kim，田贞姬，等.淫羊藿苷对阴茎海绵体的松弛效应及其作用机制.科学通报，2001年，第6期中所述方法提取分离制备。
维甲酸胶囊，重庆华邦制药公司生产，批号990701；低钙饲料，中国医学科学院动物所生产。
普通级Wistar大鼠，雌性，3～4月龄，体重150～210g，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
SX-2.5-10型马福炉(天津市中环实验电炉有限公司生产)；BP210S型电子分析天平(德国sartorius公司生产)；QDR-4000型双能线骨密度测定仪(美国HOLOGIC公司生产)；CSS-1101C电子万能试验机(长春试验机研究所生产)。
2.方法2.1大鼠骨质疏松模型的制备、动物分组及用药取健康3～4月龄雌性大鼠，随机分为5组正常对照组，骨质疏松模型组，淫羊藿苷大剂量组(20mg/kg)，淫羊藿苷中剂量组(10mg/kg)，淫羊藿苷小剂量组(5mg/kg)。除正常对照组外，各组大鼠均以维甲酸70mg/kg剂量灌胃给药，1次/日，连续三周。造模三周后，停服维甲酸，各组动物分别按上述药物剂量灌胃给药。1次/日，连续给药一个月。正常对照组和骨质疏松模型组给予与给药组等容量的生理盐水(10ml/kg)。饲养室温度22℃～25℃，湿度50％～70％，喂以低钙饲料(含钙量＜0.3％)，自由饮水。
2.2大鼠骨密度测定末次给药24h后以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型双能线骨密度测定仪探头下，仰位固定于检测台上，头与身体呈直线，线球管对准身体纵轴中点，选择大鼠骨质疏松敏感区域单侧(左侧)股骨中点(F50)的皮质骨和第三腰椎骨测定骨密度。
2.3大鼠骨生物力学的测定末次给药24h后，左侧股骨、胫骨剔除肌肉和周围组织，放入液体石蜡中7天之内测定其生物力学特征，用电子万能试验机做三点折断试验，参数为标定1/50，加载速度6mm/min，最大负荷200牛顿(N)，跨距20mm，描记负荷—变形曲线，计算最大负荷及结构强度(引起1mm变形需要的负荷，相当于曲线上的斜率)。
3结果3.1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响由表1可见，与正常组相比模型组大鼠股骨密度和椎骨密度显著下降，淫羊藿苷大、中剂量均能显著提高骨质疏松大鼠股骨密度和椎骨密度，而淫羊藿苷小剂量(5mg/kg)对此无明显影响。
表1淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨密度的影响(n＝10，X±s)组别 剂量(mg/kg) 股骨密度(g/cm2) 椎骨密度(g/cm2)正常对照组 NS 0.81±0.02 0.79±0.02模型对照组 NS 0.51±0.07**0.47±0.05**淫羊藿苷大 20 0.76±0.03ΔΔ0.71±0.02ΔΔ淫羊藿苷中 10 0.64±0.04Δ0.63±0.03Δ淫羊藿苷小 5 0.54±0.07 0.51±0.05**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组
3.2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的测定由表2可见，与正常组相比模型组大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度显著降低，淫羊藿苷大、中剂量均能显著提高骨质疏松大鼠股骨和胫骨的最大负荷、结构强度，而淫羊藿苷小剂量(5mg/kg)对此无明显影响。
表2淫羊藿苷对骨质疏松大鼠股骨、胫骨生物力学的影响(n＝10，X±s)组别剂量 股骨最大负荷 股骨结构强度 胫骨最大负荷胫骨结构强度(mg/kg) (N) (N/mm) (N)(N/mm)正常对照组 NS 119.8±7.7 373.6±22.8 81.3±8.5 653.2±133.1模型对照组 NS 67.4±19.3**205.7±16.3**41.2±12.2**447±99.2**淫羊藿苷大 20 103.2±18.3ΔΔ321.2±25.5ΔΔ76.6±12.3ΔΔ581.4±86.7ΔΔ淫羊藿苷中 10 89.6±15.1Δ265.4±29.1Δ62.7±10.2Δ498.6±94.5Δ淫羊藿苷小 573.6±12.3 231.3±34.81 51.2±14.8 459.9±128.2**P＜0.01 VS正常组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 VS模型组试验例4淫羊藿苷急性毒性试验1材料淫羊藿苷(含淫羊藿苷90％)按文献辛钟成，Euy Kyung Kim，田贞姬，等.淫羊藿苷对阴茎海绵体的松弛效应及其作用机制。科学通报，2001年，第6期中所述方法提取分离制备。
清洁级昆明系小鼠，18～22g，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106003号。饲料由中国药品生物制品鉴定检验所提供。按SOP要求检疫一周，剔除不合格动物。试验室与饲养室条件一致。室温18～25℃，湿度40～60％，过滤送风，光照12小时。自由摄食和饮水，每日更换饮水瓶一次。
2方法2.1剂量设计动物药效试验显示大鼠口服10mg/kg即有明显的抗骨质疏松的作用。淫羊藿苷能够配制的可供灌胃用的混悬液为100mg/ml，小鼠灌胃给药的最大允许体积为1ml/只，故设计给药剂量为小鼠5.0g/kg，每日给药1次。
2.2分组、给药取健康小鼠40只，雌雄各半。随机分为生理盐水组和淫羊藿苷组，每组20只。称重后，按5.0g/kg的剂量、1ml/20g的给药体积灌胃，对照组灌胃等体积生理盐水。给药后密切观察小鼠的毒性反应和死亡情况；4小时后，改为每天观察一次，连续14天。每周测量体重1次。
3结果灌胃给予淫羊藿苷后，小鼠活动未见异常。4小时内，未见耳朵、眼睑、四足等部位颜色的改变，尿液颜色未见明显异常。14天内，小鼠毛色光亮，饮食、活动以及体重都与对照组无显著差异(表1)。
表1小鼠口服5.0g/kg淫羊藿苷体重的变化(X±s)；动物体重(g)组别性别数量 试验前第7天 第14天淫羊藿 ♀ 10 18.58±0.65 25.45±1.07 28.2±1.53苷组♂ 10 18.86±0.52 29.15±0.81 34.57±1.80生理盐 ♀ 10 18.52±0.63 26.04±2.19 29.38±3.19水组♂ 10 18.59±0.82 29.27±1.77 34.87±1.9权利要求
1.淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于淫羊藿苷的使用剂量范围为10mg～1000mg。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于淫羊藿苷的使用剂量优选为100mg～500mg。
4.含有淫羊藿苷的用于治疗或预防骨质疏松的药物组合物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，该组合物可以通过口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、尿道、阴道或静脉途径给药。
6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于组合物可以以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液、糖浆、注射剂、霜剂、软膏、喷雾剂、口嚼剂或贴剂等形式存在。
全文摘要
本发明提供了淫羊藿苷在制备治疗或预防骨质疏松药物中的新用途，该用途的使用剂量为100－1000mg。本发明还提供了用于骨质疏松症的含淫羊藿苷的药物组合物，该组合物可以口服、经皮、舌下、皮下或静脉等多种途径给药。
文档编号A61K31/7048GK1539427SQ0312791
公开日2004年10月27日 申请日期2003年4月23日 优先权日2003年4月23日
发明者田京伟, 傅风华, 王振华, 徐本明, 刘珂 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司
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