含有阿卡宁类化合物作为活性成分的药物的制作方法
专利名称：含有阿卡宁类化合物作为活性成分的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有阿卡宁(Alkannin)类化合物或其盐的药物，尤其涉及含有阿卡宁类化合物或其盐作为活性成分用于预防和治疗人体的微生物感染(含SARA)、炎症、肿瘤、出血、血液病或免疫调节性疾病的药物。
背景技术：
阿卡宁类化合物是文献报道中已经公开的化合物(肖培根、贾晓光等主编《紫草》，中国中医药出版社2001年版P24-25)，其中阿卡宁类化合物具有如下通式结构 阿卡宁类化合物均不溶于水，而易溶于油、醇或醚类，其可由紫草科植物如紫草(Lithospermun erythrorhizon Sieb.et Zucc.)、新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst.)、内蒙紫草(Arnebiaguttata Bunge.)等中提取获得。已知紫草的混合提取物具有抗炎症等的作用，但是，在用药时，都是以混合提取物的形式使用，有关将从植物紫草的混合提取物中分离的阿卡宁类化合物和人工及生物合成阿卡宁类化合物以单独一种化合物或少数几种化合物的组合用于制药，特别是用于预防和治疗人体的微生物感染、炎症、肿瘤、出血、血液病或免疫调节性疾病等药物的制备中还未见报道。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种由从紫草提取物中分离出的单独一种化合物或少数几种化合物制备的用于预防和治疗人体的微生物感染、炎症、肿瘤、出血、血液病或免疫调节性疾病的药物。
本发明提供用于预防和治疗人体的微生物感染、炎症、肿瘤、出血、血液病或免疫调节性疾病的药物，该药物含有如下式(I)表示的阿卡宁类化合物或其盐类， 式中R为OH时为阿卡宁(Alkannin)；R为(CH3)2C＝CHC(O)O-时为β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(β，β-dimethylacrylalkannin)；R为CH3C(O)O-时为乙酰阿卡宁(acetylalkannin)；R为(CH3)2C＝C(CH3)CH2C(O)O-时为2，3-二甲基戊烯酰阿卡宁(teracrylalkannin)；R为(CH3)2COHCH2C(O)O-时为β-羟基异戊酰阿卡宁(β-hydroxyisovalerylalkannin)R为(CH3)2C[OC(O)CH3]CH2C(O)O-时为β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(β-acetoxyisovalerylalkannin)
上述化合物中的任意1-5种组合；其中优选含有阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁中的1-3种；更优选含有β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和/或乙酰阿卡宁；最优选含有乙酰阿卡宁。本发明的阿卡宁类化合物的盐包括碱金属、碱土金属和铵盐等。
本发明的药物作为原料药可以含有阿卡宁类化合物中的任意单独一种化合物，也可以含有其少数几种化合物的组合，其中各单独化合物的纯度为80％或80％以上，优选纯度为90％或90％以上。当含有其少数几种化合物的组合时，该少数几种化合物的组合物中的有效成分的含量为70％或70％以上。
根据需要，本发明的药物还可以含有其它药物作为活性成分。对于所述其它药物没有特别的限定，本领域的技术人员可以根据现有技术的知识，适当选择。
本发明的药物中含有的阿卡宁类化合物的含量范围在0.0001％-75％(重量百分比)，可以根据不同的制剂以及病症适当选择。当用于人体时，所述阿卡宁类化合物的日使用量可控制在10μg-20g之间，优选100μg-10g，更优选1mg-8克，最优选5克。可以根据患者的不同状况如年龄、体重、病情等适当选择。可以单次或分多次施用。本发明的药物可以以内服、外用、注射、吸入或透皮的方式给药。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物可用于预防和治疗人体的微生物感染，该微生物包括，致病性革兰氏阳性球菌如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等；致病性革兰氏阴性球菌如肺炎克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、嗜麦芽杆菌等；厌氧或微需氧致病菌如幽门螺旋杆菌等；深部和浅部真菌类如念珠菌、烟曲霉菌、隐球菌、皮肤癣菌、克柔念珠菌、尖端赛多孢霉菌等；各种支原体感染如解脲支原体、肺炎支原体等；病毒如乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、HIV病毒以及导致SARS病的病原微生物，如冠状病毒及其变异病毒等。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物对致病微生物敏感，但对人体有益的微生物如乳酸杆菌、双歧杆菌等不敏感。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物可用于预防和治疗人体的炎症。该炎症包括，例如，静脉炎、血管性紫癜、阴道炎、水肿等。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物还可用于预防和治疗人体的出血和血液病，例如烧伤烫伤、各种皮炎、败血症、血友病、原发性血小板增多症、白血病等。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物还可用于预防和治疗人体的肿瘤，特别是恶性肿瘤，例如腹水性肿瘤肝癌、L1210；实体瘤W256、S180、胃癌823、鳞癌109、Lewis肺癌等。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物可用于预防和治疗人体的免疫调节性疾病，即可通过促进T淋巴细胞的免疫应答等作用，促进机体非特异性免疫和特异性的细胞免疫作用。
因此，本发明的药物可用于人体的呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统、血液系统、循环系统以及皮肤和粘膜部位。
具体实施例方式
下面对本发明的含有阿卡宁类化合物的药物制剂的制备以及药效学试验进行详细的描述，但本发明的内容并不完全局限于此。
制备例1将新疆紫草2千克粉碎后，用石油醚提取至紫草残渣无色，回收溶剂得到80克暗红色浆状物。将所得的浆状物经硅胶H柱液相色谱分离制备，即用1％-20％乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱，分别得到前面所述6种阿卡宁类化合物的单体。即0.712克阿卡宁(得率0.89％)、29.024克β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(得率36.28％)、13.27克乙酰阿卡宁(得率16.59％)、6.032克2，3-二甲基戊烯酰阿卡宁(得率7.54％)、0.776克β-羟基异戊酰阿卡宁(得率0.97％)、0.792克β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(得率0.99％)。经高压液相色谱分析，纯度均在90％以上。
制备例2.
将新疆紫草2千克粉碎后，过20-40目筛，用CO2-超临界萃取，获得红色膏状物70克，通过高压液相制备色谱(德国Knauer K1001型)分离制备，制备柱硅胶H 10μm 50×300mm；即用1％-20％乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱，分别得到前面所述的6种阿卡宁类化合物的红色单体。即0.707克阿卡宁(得率1.01％)、30.877克β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(得率44.11％)、15.869克乙酰阿卡宁(得率22.67％)、6.034克2，3-二甲基戊烯酰阿卡宁(得率8.62％)、0.91克β-羟基异戊酰阿卡宁(得率1.30％)和0.77克β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(得率1.10％)，经高压液相色谱分析，纯度均在90％以上。
实施例1按照本领域技术人员公知的方法制备所述6种化合物中的单独一种或少数几种的组合的片剂，其中片剂中按照实际需要可制成含有10％-70％阿卡宁类化合物。
在无菌的操作条件下，取100克通过上述制备例1或制备例2获得的乙酰阿卡宁(acetylalkannin)、100克微晶纤维、30克硬脂酸镁、4克羟丙甲基纤维素。按照公知制片技术和装备制成0.5克的片剂。
实施例2取100克通过上述制备例1或制备例2获得的阿卡宁类化合物的组合物(阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁的混合比为1∶1∶2)，其它与实施例1相同，制备0.5克的片剂。
实施例3按照本领域技术人员公知的方法制备所述6种阿卡宁类化合物的膏剂。其中膏剂中按照实际需要可制成含有0.0001％-10％阿卡宁类化合物。在无菌操作条件下，取0.5克上述制备例1或制备例2获得的阿卡宁类化合物(阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁、乙酰阿卡宁和β-羟基异戊酰阿卡宁的混合比为0.7∶1∶1∶2∶0.5)、80克凡士林、10克液体石蜡和10克无水羊毛脂，在研钵中研匀，分装制成产品，用于外用。也可以用此膏剂，按照本领域技术人员公知的方法制成贴片用于透皮吸收。
实施例4按照本领域技术人员公知的方法制备所述6种阿卡宁类化合物的注射液。在无菌操作条件下，取0.5克上述制备例1或制备例2获得的β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁、400毫升丙二醇、100毫升乙醇、20毫升吐温-80、苯甲醇15毫升，使混合物充分溶解，加水至1000毫升，混合均匀后，装瓶制成注射液产品。
下面描述含有阿卡宁类化合物的药物的药效试验结果。
(1)药物的配制分别称取5.0毫克的制备例1或制备例2中获得的阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁。将药物溶于1毫升DMSO中。用RPMI-1640培养基将其稀释50倍后，分装，并进一步稀释成浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625(μg/ml)。
(2)药物的敏感性试验将上述各浓度的药物分装到孔板中，并用制备好的菌浓度约为103-106的各菌株接种。
试验结果表明阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁对革兰氏阳性的金黄色球菌具有相当的敏感性，其敏感性范围(MIC)为0.391-12.5μg/ml；对常见的革兰氏阴性致病菌，肺炎克雷伯氏菌其敏感性MIC范围为0.391-6.25μg/ml，少数菌株为12.5-50μg/ml；粘质沙雷氏菌(大部分临床分离株)和嗜麦芽杆菌其多数菌株敏感性范围在0.391-3.125μg/ml。其中对嗜麦芽杆菌尤其有效，其敏感性范围为0.391-0.781μg/ml，而黄连素为8-32μg/ml，即，明显优于黄连素；对类杆菌尤其是脆弱类杆菌的MIC为0.391-6.25μg/ml；对幽门螺杆菌相当敏感，其MIC为0.391-0.781μg/ml。
另外，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的体外抗真菌试验的结果表明对念珠菌和隐球菌的MIC范围在2.08-33.3μg/ml之间，MIC90为33.3μg/ml，而氟康唑的MIC范围在0.125-64μg/ml之间，MIC90为69μg/ml；对皮肤癣菌的MIC范围在4.16-8.32μg/ml之间，MIC90为4.16μg/ml，而氟康唑对皮肤癣菌的大多数菌株的MIC范围在32-64μg/ml之间，MIC90为64μg/ml，两者差异明显。另外，令人惊喜的是，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对于氟康唑耐药的克柔念珠菌有较好的抑制效果，MIC为8.32-16.6μg/ml，并且对于氟康唑等绝大多数抗真菌药物均不敏感的尖端赛多孢霉的MIC在4.16-8.32μg/ml之间。此外乙酰阿卡宁对新型隐球菌的MIC为3.90625μg/ml，对红毛癣菌的MIC为0.90625-62.5μg/ml；β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对烟曲霉菌、隐球菌和红毛癣菌的MIC为3.0625-250μg/ml。因此，阿卡宁类化合物是一种广谱强效的抗真菌药。
另外，本发明的阿卡宁类化合物对人体有益的微生物如乳酸杆菌和双歧杆菌的MIC均在200μg/ml以上，因此，由上述数据可以看出本发明的含有阿卡宁类化合物的药物对致病微生物敏感，但对人体有益的微生物不敏感。
从紫草的混合提取物与1-3种所述阿卡宁类化合物的对比试验可以看出，本发明的含有1-3种所述阿卡宁类化合物的药物明显优于紫草的混合提取物其MIC(μg/ml)的结果如表1所示。
表1
注A为紫草的混合提取物；B为β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁；C为阿卡宁类化合物的混合物(阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁的混合比为1∶1∶2)阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁对肺炎支原体的抑菌效果试验的结果表明，其最小抑制肺炎支原体的浓度MIC分别为，3.751μg/ml、2μg/ml和7.819μg/ml，相当于纯注射用红霉素0.1925μg/ml的抑制效果。
用上述实施例3制备的阿卡宁类化合物的膏剂进行皮肤外用药对部分疾病的试验结果如下列表2所示。
表2
由上表可以看出，阿卡宁类化合物的皮肤外用药适合用于治疗绝大多数脓肿疮疥、疱疹，尤其是对烧伤和烫伤效果显著，愈后不留瘢痕。
阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁对移植肿瘤的动物试验结果如下列表3所示。
表3
由上表可以看出，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对肝癌、S180、Lewis肺癌有不同程度的疗效；乙酰阿卡宁对肝癌、S180、L1210、Lewis肺癌、W256有不同程度的疗效；阿卡宁只对肝癌有效。
阿卡宁类化合物对病毒的试验结果表明在鸭乙肝病毒感染鸭后的第7天口服β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁，100mg/kg一天2次，10天对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果显著(P＜0.05-0.01)，无毒性反应；50mg/kg组，有显著的抑制作用(P＜0.05)。
β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对乙肝病毒的体外试验表明，浓度为30μg/ml，对HBsAg的平均抑制率为96.2601％，对HBeAg的平均抑制率为91.6056％。
阿卡宁和β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁体外抗HIV-1逆转录酶和整合酶的试验结果如下表4所示。
表4
用丝裂霉素C所致小鼠免疫功能低下模型，研究阿卡宁类化合物的作用。结果显示每天腹腔注射6mg/kg的β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁，连续5天，小鼠脾细胞NK细胞细胞毒提高约20％(P＜0.001)，显示了可使小鼠腹腔内巨噬细胞伤害有所恢复，可以增加腹腔内巨噬细胞游走能力，增加T淋巴细胞的活性，并可促进T淋巴细胞的免疫应答作用，具有促进机体非特异性免疫和特异性的细胞免疫作用。
权利要求
1.一种用于预防和治疗人体微生物感染、炎症、肿瘤、出血、血液病或免疫调节性疾病的药物，该药物含有式(I)表示的阿卡宁类化合物或其盐类， 式中R为选自由OH、(CH3)2C＝CHC(O)O-、CH3C(O)O-、(CH3)2C＝C(CH3)CH2C(O)O-、(CH3)2COHCH2C(O)O-、(CH3)2C[OC(O)CH3]CH2C(O)O-所组成的组中的任意1-5种。
2.如权利要求1所述的药物，其中R为选自OH、(CH3)2C＝CHC(O)O-和CH3C(O)O-的1-3种。
3.如权利要求2所述的药物，其中R为(CH3)2C＝CHC(O)O-和/或CH3C(O)O-。
4.如权利要求3所述的药物，其中R为(CH3)2C＝CHC(O)O-。
5.如权利要求1所述的药物，其中所述药物含有的各化合物的纯度为80％或80％以上。
6.如权利要求1所述的药物，其中所述药物含有的各化合物的纯度为90％或90％以上。
7.如权利要求1所述的药物，其中当所述药物含有几种化合物的组合时，该组合物中的有效成分的含量为70％或70％以上
8.如权利要求1所述的药物，该药物还可含有其它药物活性成分。
9.如权利要求1所述的药物，当用于人体时，所述阿卡宁类化合物的日使用量可控制在10μg-10g之间。
10.如权利要求1所述的药物可以以内服、外用、注射、吸入或透皮的方式给药。
11.如权利要求1所述的药物，该药物用于治疗或预防人体的各系统的微生物感染，包括肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、幽门螺旋杆菌、念珠菌、隐球菌、皮肤癣菌、尖端赛多孢霉菌；各种支原体感染包括解脲支原体、肺炎支原体；或病毒感染包括乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、HIV病毒。
12.如权利要求1所述的药物，该药物用于治疗或预防人体的可能导致SARS病的病原微生物，如冠状病毒及其变异病毒、负黏液病毒、衣原体等。
13.如权利要求1所述的药物，该药物用于治疗或预防人体的腹水性肿瘤、肝癌、L1210、实体瘤、W256、肉瘤180、胃癌823、鳞癌109或Lewis肺癌。
全文摘要
本发明的目的在于提供含有阿卡宁类化合物或其盐的药物，该药物用于治疗或预防人体微生物感染疾病、炎症疾病、恶性肿瘤、出血和血液性疾病以及免疫调节性疾病。
文档编号A61P35/00GK1548036SQ0312874
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月8日 优先权日2003年5月8日
发明者王飞欣 申请人:北京金本草中药科技发展有限公司
技术领域：
本发明涉及含有阿卡宁(Alkannin)类化合物或其盐的药物，尤其涉及含有阿卡宁类化合物或其盐作为活性成分用于预防和治疗人体的微生物感染(含SARA)、炎症、肿瘤、出血、血液病或免疫调节性疾病的药物。
背景技术：
阿卡宁类化合物是文献报道中已经公开的化合物(肖培根、贾晓光等主编《紫草》，中国中医药出版社2001年版P24-25)，其中阿卡宁类化合物具有如下通式结构 阿卡宁类化合物均不溶于水，而易溶于油、醇或醚类，其可由紫草科植物如紫草(Lithospermun erythrorhizon Sieb.et Zucc.)、新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst.)、内蒙紫草(Arnebiaguttata Bunge.)等中提取获得。已知紫草的混合提取物具有抗炎症等的作用，但是，在用药时，都是以混合提取物的形式使用，有关将从植物紫草的混合提取物中分离的阿卡宁类化合物和人工及生物合成阿卡宁类化合物以单独一种化合物或少数几种化合物的组合用于制药，特别是用于预防和治疗人体的微生物感染、炎症、肿瘤、出血、血液病或免疫调节性疾病等药物的制备中还未见报道。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种由从紫草提取物中分离出的单独一种化合物或少数几种化合物制备的用于预防和治疗人体的微生物感染、炎症、肿瘤、出血、血液病或免疫调节性疾病的药物。
本发明提供用于预防和治疗人体的微生物感染、炎症、肿瘤、出血、血液病或免疫调节性疾病的药物，该药物含有如下式(I)表示的阿卡宁类化合物或其盐类， 式中R为OH时为阿卡宁(Alkannin)；R为(CH3)2C＝CHC(O)O-时为β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(β，β-dimethylacrylalkannin)；R为CH3C(O)O-时为乙酰阿卡宁(acetylalkannin)；R为(CH3)2C＝C(CH3)CH2C(O)O-时为2，3-二甲基戊烯酰阿卡宁(teracrylalkannin)；R为(CH3)2COHCH2C(O)O-时为β-羟基异戊酰阿卡宁(β-hydroxyisovalerylalkannin)R为(CH3)2C[OC(O)CH3]CH2C(O)O-时为β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(β-acetoxyisovalerylalkannin)
上述化合物中的任意1-5种组合；其中优选含有阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁中的1-3种；更优选含有β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和/或乙酰阿卡宁；最优选含有乙酰阿卡宁。本发明的阿卡宁类化合物的盐包括碱金属、碱土金属和铵盐等。
本发明的药物作为原料药可以含有阿卡宁类化合物中的任意单独一种化合物，也可以含有其少数几种化合物的组合，其中各单独化合物的纯度为80％或80％以上，优选纯度为90％或90％以上。当含有其少数几种化合物的组合时，该少数几种化合物的组合物中的有效成分的含量为70％或70％以上。
根据需要，本发明的药物还可以含有其它药物作为活性成分。对于所述其它药物没有特别的限定，本领域的技术人员可以根据现有技术的知识，适当选择。
本发明的药物中含有的阿卡宁类化合物的含量范围在0.0001％-75％(重量百分比)，可以根据不同的制剂以及病症适当选择。当用于人体时，所述阿卡宁类化合物的日使用量可控制在10μg-20g之间，优选100μg-10g，更优选1mg-8克，最优选5克。可以根据患者的不同状况如年龄、体重、病情等适当选择。可以单次或分多次施用。本发明的药物可以以内服、外用、注射、吸入或透皮的方式给药。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物可用于预防和治疗人体的微生物感染，该微生物包括，致病性革兰氏阳性球菌如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等；致病性革兰氏阴性球菌如肺炎克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、嗜麦芽杆菌等；厌氧或微需氧致病菌如幽门螺旋杆菌等；深部和浅部真菌类如念珠菌、烟曲霉菌、隐球菌、皮肤癣菌、克柔念珠菌、尖端赛多孢霉菌等；各种支原体感染如解脲支原体、肺炎支原体等；病毒如乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、HIV病毒以及导致SARS病的病原微生物，如冠状病毒及其变异病毒等。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物对致病微生物敏感，但对人体有益的微生物如乳酸杆菌、双歧杆菌等不敏感。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物可用于预防和治疗人体的炎症。该炎症包括，例如，静脉炎、血管性紫癜、阴道炎、水肿等。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物还可用于预防和治疗人体的出血和血液病，例如烧伤烫伤、各种皮炎、败血症、血友病、原发性血小板增多症、白血病等。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物还可用于预防和治疗人体的肿瘤，特别是恶性肿瘤，例如腹水性肿瘤肝癌、L1210；实体瘤W256、S180、胃癌823、鳞癌109、Lewis肺癌等。
本发明的含有阿卡宁类化合物的药物可用于预防和治疗人体的免疫调节性疾病，即可通过促进T淋巴细胞的免疫应答等作用，促进机体非特异性免疫和特异性的细胞免疫作用。
因此，本发明的药物可用于人体的呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统、血液系统、循环系统以及皮肤和粘膜部位。
具体实施例方式
下面对本发明的含有阿卡宁类化合物的药物制剂的制备以及药效学试验进行详细的描述，但本发明的内容并不完全局限于此。
制备例1将新疆紫草2千克粉碎后，用石油醚提取至紫草残渣无色，回收溶剂得到80克暗红色浆状物。将所得的浆状物经硅胶H柱液相色谱分离制备，即用1％-20％乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱，分别得到前面所述6种阿卡宁类化合物的单体。即0.712克阿卡宁(得率0.89％)、29.024克β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(得率36.28％)、13.27克乙酰阿卡宁(得率16.59％)、6.032克2，3-二甲基戊烯酰阿卡宁(得率7.54％)、0.776克β-羟基异戊酰阿卡宁(得率0.97％)、0.792克β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(得率0.99％)。经高压液相色谱分析，纯度均在90％以上。
制备例2.
将新疆紫草2千克粉碎后，过20-40目筛，用CO2-超临界萃取，获得红色膏状物70克，通过高压液相制备色谱(德国Knauer K1001型)分离制备，制备柱硅胶H 10μm 50×300mm；即用1％-20％乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱，分别得到前面所述的6种阿卡宁类化合物的红色单体。即0.707克阿卡宁(得率1.01％)、30.877克β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁(得率44.11％)、15.869克乙酰阿卡宁(得率22.67％)、6.034克2，3-二甲基戊烯酰阿卡宁(得率8.62％)、0.91克β-羟基异戊酰阿卡宁(得率1.30％)和0.77克β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁(得率1.10％)，经高压液相色谱分析，纯度均在90％以上。
实施例1按照本领域技术人员公知的方法制备所述6种化合物中的单独一种或少数几种的组合的片剂，其中片剂中按照实际需要可制成含有10％-70％阿卡宁类化合物。
在无菌的操作条件下，取100克通过上述制备例1或制备例2获得的乙酰阿卡宁(acetylalkannin)、100克微晶纤维、30克硬脂酸镁、4克羟丙甲基纤维素。按照公知制片技术和装备制成0.5克的片剂。
实施例2取100克通过上述制备例1或制备例2获得的阿卡宁类化合物的组合物(阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁的混合比为1∶1∶2)，其它与实施例1相同，制备0.5克的片剂。
实施例3按照本领域技术人员公知的方法制备所述6种阿卡宁类化合物的膏剂。其中膏剂中按照实际需要可制成含有0.0001％-10％阿卡宁类化合物。在无菌操作条件下，取0.5克上述制备例1或制备例2获得的阿卡宁类化合物(阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁、乙酰阿卡宁和β-羟基异戊酰阿卡宁的混合比为0.7∶1∶1∶2∶0.5)、80克凡士林、10克液体石蜡和10克无水羊毛脂，在研钵中研匀，分装制成产品，用于外用。也可以用此膏剂，按照本领域技术人员公知的方法制成贴片用于透皮吸收。
实施例4按照本领域技术人员公知的方法制备所述6种阿卡宁类化合物的注射液。在无菌操作条件下，取0.5克上述制备例1或制备例2获得的β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁、400毫升丙二醇、100毫升乙醇、20毫升吐温-80、苯甲醇15毫升，使混合物充分溶解，加水至1000毫升，混合均匀后，装瓶制成注射液产品。
下面描述含有阿卡宁类化合物的药物的药效试验结果。
(1)药物的配制分别称取5.0毫克的制备例1或制备例2中获得的阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁。将药物溶于1毫升DMSO中。用RPMI-1640培养基将其稀释50倍后，分装，并进一步稀释成浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625(μg/ml)。
(2)药物的敏感性试验将上述各浓度的药物分装到孔板中，并用制备好的菌浓度约为103-106的各菌株接种。
试验结果表明阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁对革兰氏阳性的金黄色球菌具有相当的敏感性，其敏感性范围(MIC)为0.391-12.5μg/ml；对常见的革兰氏阴性致病菌，肺炎克雷伯氏菌其敏感性MIC范围为0.391-6.25μg/ml，少数菌株为12.5-50μg/ml；粘质沙雷氏菌(大部分临床分离株)和嗜麦芽杆菌其多数菌株敏感性范围在0.391-3.125μg/ml。其中对嗜麦芽杆菌尤其有效，其敏感性范围为0.391-0.781μg/ml，而黄连素为8-32μg/ml，即，明显优于黄连素；对类杆菌尤其是脆弱类杆菌的MIC为0.391-6.25μg/ml；对幽门螺杆菌相当敏感，其MIC为0.391-0.781μg/ml。
另外，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的体外抗真菌试验的结果表明对念珠菌和隐球菌的MIC范围在2.08-33.3μg/ml之间，MIC90为33.3μg/ml，而氟康唑的MIC范围在0.125-64μg/ml之间，MIC90为69μg/ml；对皮肤癣菌的MIC范围在4.16-8.32μg/ml之间，MIC90为4.16μg/ml，而氟康唑对皮肤癣菌的大多数菌株的MIC范围在32-64μg/ml之间，MIC90为64μg/ml，两者差异明显。另外，令人惊喜的是，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对于氟康唑耐药的克柔念珠菌有较好的抑制效果，MIC为8.32-16.6μg/ml，并且对于氟康唑等绝大多数抗真菌药物均不敏感的尖端赛多孢霉的MIC在4.16-8.32μg/ml之间。此外乙酰阿卡宁对新型隐球菌的MIC为3.90625μg/ml，对红毛癣菌的MIC为0.90625-62.5μg/ml；β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对烟曲霉菌、隐球菌和红毛癣菌的MIC为3.0625-250μg/ml。因此，阿卡宁类化合物是一种广谱强效的抗真菌药。
另外，本发明的阿卡宁类化合物对人体有益的微生物如乳酸杆菌和双歧杆菌的MIC均在200μg/ml以上，因此，由上述数据可以看出本发明的含有阿卡宁类化合物的药物对致病微生物敏感，但对人体有益的微生物不敏感。
从紫草的混合提取物与1-3种所述阿卡宁类化合物的对比试验可以看出，本发明的含有1-3种所述阿卡宁类化合物的药物明显优于紫草的混合提取物其MIC(μg/ml)的结果如表1所示。
表1
注A为紫草的混合提取物；B为β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁；C为阿卡宁类化合物的混合物(阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁的混合比为1∶1∶2)阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁对肺炎支原体的抑菌效果试验的结果表明，其最小抑制肺炎支原体的浓度MIC分别为，3.751μg/ml、2μg/ml和7.819μg/ml，相当于纯注射用红霉素0.1925μg/ml的抑制效果。
用上述实施例3制备的阿卡宁类化合物的膏剂进行皮肤外用药对部分疾病的试验结果如下列表2所示。
表2
由上表可以看出，阿卡宁类化合物的皮肤外用药适合用于治疗绝大多数脓肿疮疥、疱疹，尤其是对烧伤和烫伤效果显著，愈后不留瘢痕。
阿卡宁、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁和乙酰阿卡宁对移植肿瘤的动物试验结果如下列表3所示。
表3
由上表可以看出，β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对肝癌、S180、Lewis肺癌有不同程度的疗效；乙酰阿卡宁对肝癌、S180、L1210、Lewis肺癌、W256有不同程度的疗效；阿卡宁只对肝癌有效。
阿卡宁类化合物对病毒的试验结果表明在鸭乙肝病毒感染鸭后的第7天口服β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁，100mg/kg一天2次，10天对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果显著(P＜0.05-0.01)，无毒性反应；50mg/kg组，有显著的抑制作用(P＜0.05)。
β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对乙肝病毒的体外试验表明，浓度为30μg/ml，对HBsAg的平均抑制率为96.2601％，对HBeAg的平均抑制率为91.6056％。
阿卡宁和β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁体外抗HIV-1逆转录酶和整合酶的试验结果如下表4所示。
表4
用丝裂霉素C所致小鼠免疫功能低下模型，研究阿卡宁类化合物的作用。结果显示每天腹腔注射6mg/kg的β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁，连续5天，小鼠脾细胞NK细胞细胞毒提高约20％(P＜0.001)，显示了可使小鼠腹腔内巨噬细胞伤害有所恢复，可以增加腹腔内巨噬细胞游走能力，增加T淋巴细胞的活性，并可促进T淋巴细胞的免疫应答作用，具有促进机体非特异性免疫和特异性的细胞免疫作用。
权利要求
1.一种用于预防和治疗人体微生物感染、炎症、肿瘤、出血、血液病或免疫调节性疾病的药物，该药物含有式(I)表示的阿卡宁类化合物或其盐类， 式中R为选自由OH、(CH3)2C＝CHC(O)O-、CH3C(O)O-、(CH3)2C＝C(CH3)CH2C(O)O-、(CH3)2COHCH2C(O)O-、(CH3)2C[OC(O)CH3]CH2C(O)O-所组成的组中的任意1-5种。
2.如权利要求1所述的药物，其中R为选自OH、(CH3)2C＝CHC(O)O-和CH3C(O)O-的1-3种。
3.如权利要求2所述的药物，其中R为(CH3)2C＝CHC(O)O-和/或CH3C(O)O-。
4.如权利要求3所述的药物，其中R为(CH3)2C＝CHC(O)O-。
5.如权利要求1所述的药物，其中所述药物含有的各化合物的纯度为80％或80％以上。
6.如权利要求1所述的药物，其中所述药物含有的各化合物的纯度为90％或90％以上。
7.如权利要求1所述的药物，其中当所述药物含有几种化合物的组合时，该组合物中的有效成分的含量为70％或70％以上
8.如权利要求1所述的药物，该药物还可含有其它药物活性成分。
9.如权利要求1所述的药物，当用于人体时，所述阿卡宁类化合物的日使用量可控制在10μg-10g之间。
10.如权利要求1所述的药物可以以内服、外用、注射、吸入或透皮的方式给药。
11.如权利要求1所述的药物，该药物用于治疗或预防人体的各系统的微生物感染，包括肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、幽门螺旋杆菌、念珠菌、隐球菌、皮肤癣菌、尖端赛多孢霉菌；各种支原体感染包括解脲支原体、肺炎支原体；或病毒感染包括乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、HIV病毒。
12.如权利要求1所述的药物，该药物用于治疗或预防人体的可能导致SARS病的病原微生物，如冠状病毒及其变异病毒、负黏液病毒、衣原体等。
13.如权利要求1所述的药物，该药物用于治疗或预防人体的腹水性肿瘤、肝癌、L1210、实体瘤、W256、肉瘤180、胃癌823、鳞癌109或Lewis肺癌。
全文摘要
本发明的目的在于提供含有阿卡宁类化合物或其盐的药物，该药物用于治疗或预防人体微生物感染疾病、炎症疾病、恶性肿瘤、出血和血液性疾病以及免疫调节性疾病。
文档编号A61P35/00GK1548036SQ0312874
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月8日 优先权日2003年5月8日
发明者王飞欣 申请人:北京金本草中药科技发展有限公司
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