白细胞介素－1受体拮抗剂治疗非典型性肺炎的用途的制作方法
专利名称：白细胞介素－1受体拮抗剂治疗非典型性肺炎的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组人白细胞介素1受体拮抗剂用于治疗非典型性肺炎(SARS)的新用途。更具体的，涉及将人白细胞介素1受体拮抗剂用于减轻重症非典型性肺炎病人的呼吸窘迫综合症症状，和降低非典型性肺炎的死亡率。
背景技术：
非典型性肺炎(SARS)是由新型冠状病毒引起的急性呼吸道疾病。于2002年10月开始出现于中国广东，目前已蔓延到全世界几十个国家和地区。非典型性肺炎(SARS)表现为急性呼吸窘迫综合证为主要特征的许多重症病例，世界卫生组织(WHO)统计SARS的死亡率可高达15％。
目前，有关重症“非典”病例诊断标准是符合下列标准的其中1条可诊断为非典型肺炎的重症病例(1)多叶病变或X线胸片48小时内病灶进展＞50％；(2)呼吸困难，呼吸频率＞30次/分；(3)低氧血症，吸氧3～5升/分条件下，SaO2＜93％或氧合指数＜300mmHg；(4)出现休克、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)或多器官功能障碍综合征(MODS)。
ARDS是指严重感染、创伤、休克等肺内外袭击后出现的以肺泡毛细血管损伤为主要表现的临床综合征，其临床特征是呼吸频速和窘迫，进行性低氧血症，X线呈现弥漫性肺泡浸润。
重症“非典”的主要症状事实上就是ARDS的主要表现。临床上重症“非典”的治疗措施包括抗病毒治疗、类固醇激素免疫抑制治疗、继发感染的治疗等。其中第二阶段使用大剂量类固醇激素控制呼吸窘迫症状以及急性肺损伤等措施，这些措施类似于或者等同于治疗ARDS的措施。
临床证明，及时使用类固醇激素是一种有效的治疗手段，保护毛细血管内皮细胞、防止白细胞、血小板聚集和粘附管壁形成微血栓；具抗炎和促使肺间质液吸收；缓解支气管痉挛；抑制后期肺纤维化作用。类固醇激素治疗的效果直接关系到病人呼吸道症状的改善，关系到“非典”病人的死亡率。
类固醇激素作为一个作用广泛的免疫抑制剂，长期使用会造成免疫力低下、引起严重感染等后果。此外，类固醇激素对部分病人无效，造成重症非典病人很高的死亡率。
因此，本领域迫切需要开发新的疗效好、副作用小的药物，用于减轻重症非典病人呼吸窘迫综合症症状，降低死亡率。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的疗效好、副作用小的用于减轻重症非典病人呼吸窘迫综合症症状的药物，及其在治疗重症非典病人方面的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，它含有药学上可接受的载体、白细胞介素-1受体拮抗剂以及类固醇激素。
在一优选例中，所述的白细胞介素-1受体拮抗剂是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
在另一优选例中，所述的白细胞介素-1受体拮抗剂的重量百分比是0.01～99.99％，按组合物总重量计。
在另一优选例中，所述组合物还含有类固醇激素，其重量百分比是0.01～90％，按组合物总重量计。
在另一优选例中，所述的白细胞介素1-受体拮抗剂包括天然存在的白细胞介素1-受体拮抗剂、重组人白细胞介素1-受体拮抗剂、和白细胞介素1-受体拮抗剂衍生物。
在本发明的第二方面，提供了一种白细胞介素1-受体拮抗剂的用途，它被用于制备治疗病原体引起的呼吸窘迫综合症。
在另一优选例中，所述的白细胞介素1-受体拮抗剂包括天然存在的白细胞介素1-受体拮抗剂、重组人白细胞介素1-受体拮抗剂、和白细胞介素1-受体拮抗剂衍生物。
在另一优选例中，所述的病原体包括细菌、病毒、支原体、或衣原体。
在另一优选例中，所说的病毒是冠状病毒和SARS病毒。
具体实施例方式
本发明人首次发现，SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)病毒感染患者血清中IL-1水平，在病程病理发展过程中，其临床IL-1水平与其恶性进展程度呈明显正相关。并且，本发明的发明人还发现使用白细胞介素1受体拮抗剂可有效干预SARS疾病进程。在此基础上完成了本发明。
虽然本发明的作用机理还不清楚，但是，据信可能与IL-1在SARS造成的急性肺损伤中起重要作用有关。因此，使用IL-1受体拮抗剂，可以有效地阻止或抵消IL-1起作用，从而减轻或消除IL-1所造成的急性肺损伤，从而缓解和消除急性呼吸窘迫综合症。因此，人白细胞介素1受体拮抗剂特别适合治疗重症非典型性肺炎。
此外，将人白细胞介素1受体拮抗剂与类固醇激素和/或抗病毒剂联用，更可起协同作用，从而显著提高治疗SARS等疾病的效果。
如本文所用，术语“白细胞介素1-受体拮抗剂”指能够与白细胞介素1受体结合，竞争性抑制白细胞介素1的物质。
可用于本发明的所述的白细胞介素1-受体拮抗剂没有特别限制，包括天然存在的白细胞介素1-受体拮抗剂、重组人白细胞介素1-受体拮抗剂、和白细胞介素1-受体拮抗剂衍生物。其中，白细胞介素1-受体拮抗剂衍生物包括利用氨基酸替代、缺失等手段得到的具有白细胞介素1-受体拮抗剂活性的衍生物。在本发明中，优选的是重组人白细胞介素1-受体拮抗剂。一种具体的拮抗剂是具有SEQ ID NO2所示序列的蛋白。
生产白细胞介素1受体拮抗剂的方法是已知的。例如，对于用基因工程方法表达的重组人白细胞介素1受体拮抗剂而言，可将人白细胞介素1受体拮抗剂基因插入到适合的载体，导入大肠杆菌菌株。在合适的条件下进行发酵，收获的菌体经裂解，纯化、复性，得到的具有天然人白细胞介素1受体拮抗剂活性的重组蛋白。
本发明的重组人白细胞介素1受体拮抗剂可以单独、或者结合任何医学上可接受的药用赋形剂或载体中给药。
本发明的药物组合物含有药学上可接受的载体、白细胞介素-1受体拮抗剂以及选自下组的物质类固醇激素和抗病毒剂。其中，白细胞介素-1受体拮抗剂的含量是0.01~99.99％，类固醇激素的含量是0.01~90％。
本发明的药物组合物的剂型没有特别限制，可以固体、半固体或液体的形式。此外，本发明的药物制剂可通过静脉、皮下以及其他适合的途径给药。
可用本发明的药物组合物和方法治疗对照是哺乳动物，尤其是人。
尽管重组人白细胞介素1受体拮抗剂的有效治疗剂量所治疗患者的年龄和病情，但在治疗疾病时常用的每日剂量为约0.0001-1000mg，优选0.01-500mg，更优选0.1-200mg，更优选50-100mg。给药次数可以是每天一次，或数次。
本发明提供一种治疗重症非典型性肺炎的方法。该方法包括给非典型性肺炎病人施用有效治疗剂量的人重组白细胞介素1受体拮抗剂，施用2-60天。通常，使用人重组白细胞介素1受体拮抗剂从病毒感染的第2周开始，连续施用人白细胞介素1受体拮抗剂14天。
在本发明中，治疗重症非典型性肺炎时，人白细胞介素1受体拮抗剂可以单独使用，也可以与类固醇激素以及的抗病毒药物如利巴韦林联合使用。
本发明的主要优点在于(1)单独使用IL-1Ra或者联合使用IL-1Ra和类固醇激素，可缓解对单独使用类固醇激素不敏感的病人的呼吸窘迫症状。
(2)使用IL-1Ra可减少类固醇激素的使用剂量，减轻类固醇激素可能的副作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1重组人白细胞介素1受体拮抗剂的表达和纯化IL-1Ra cDNA全长462bp(SEQ ID NO1)，编码153个氨基酸(SEQ ID NO2)，采用全基因合成方法合成。将该序列通过两端的NdeI和HindIII位点克隆于原核表达载体pET32a上(Novagen公司)，转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(Novagen公司)进行表达，目的蛋白IL-1Ra以可溶形式存于细胞质中，表达量达菌体总蛋白的30％以上。
采用Biostat C-20全自动发酵罐对IL-1Ra生产菌种进行高密度发酵，收集的菌体用裂解液重悬，使用GYB60-6S高压匀浆泵破菌，破菌液离心后经两步阳离子交换层析和一步阴离子交换层析，样品纯度达到96％以上，外源DNA、宿主菌蛋白残留符合生物制品要求。经纯化的蛋白质分子量为17.3kD，比活为1000mU/mg。
纯化的样品用超滤器对成品所需缓冲液透滤至两者pH、电导相同，浓缩、过滤即得rhIL-1Ra原液。将纯化的rhIL-1Ra原液与柠檬酸缓冲液配制成水性针剂成品(浓度为100mg/ml，50mg/ml和20mg/ml)。
实施例2内毒素诱导的急性呼吸窘迫综合症狗模型药效学研究将15只体重为10.0-15.0kg的狗通过静脉内给药50mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉。麻醉后，暴露并切开气管，然后进行套管插入术以便用30％O2和70％N2的混合气体进行人工换气(潮气量180ml/呼吸；呼吸频率15-20次呼吸/分钟)并测量导气管的压力。器械操作包括插入两侧中央静脉和主动脉的聚乙烯导管，以及在主肺线中插入7F导管。连续监测并记录主动脉压、心率、中央静脉压、肺压力。用热稀释技术一式两份地测量心输出量。分析从主动脉线获得的样品与各种肺功能有关的各指标，其中包括动脉血O2张力、血红蛋白饱和度和分流％等。当手术完成后，在研究开始前使动物安定(以确保动脉二氧化碳张力在的范围内，pH在的范围内)。使用加热垫以预防体温过低。在连续实验结束时，通过放血处死动物并用左肺测定两侧肺的湿重和干重比。
将所有接受静脉内给药0.5mg/kg脂多糖(LPS)和30ug/kg佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)的动物分成3组。在接受LPS和PMA的第一组的5只动物中(用作对照)，在整个过程中输注盐水。在第二组的5只动物中，在注射LPS/PMA后立即静脉内输注甲基强的松龙(MP)(30mg/kg)。在第3组中，在注射实施例1制备的IL-1受体拮抗剂针剂(100mg/ml)，剂量分别为9.6mg/kg/天、4.8mg/kg/天、和2.4mg/kg/d。
在给药后，每小时均测定各血液动力学参数，分析动脉、静脉血O2和CO2指标。实验后立即动物左侧下叶的肺样品，测定重量；然后在烘箱中于105℃干燥24小时后测定干组织重量。计算W/D比值，评价肺水肿程度。所有数据均用平均值±标准差来表示。用Student-t检验来评估各组之间的统计学意义。当p＜0.05时，认为在各组之间存在显著性差异。
结果表明，使用IL-1受体拮抗剂可显著降低肺的水肿程度。
实施例3病毒性ARDS模型取4-5周龄的雌性CBA/J小鼠，分为3组，每组20只。3组动物首先腹膜内注射0.008cc 20％氯胺酮(ketamine)和2％PromAce(乙酰丙嗪马来酸酯acepromazine maleate)对动物进行轻度麻醉，然后鼻腔内接种30ul含1×107pfu呼肠孤病毒(Reovirus)的0.9％的注射用无菌生理盐水，每侧鼻孔接种15ul。
于接种后第5天开始，第1组动物，皮下注射IL-1Ra 24mg/kg/d，每天1次，连续7天。第2组动物，静脉注射类固醇皮质激素30mg/kg/d，连续注射7天。第3组动物，皮下注射生理盐水2.5ml/kgml，作为对照。
于接种后5、7、9、10、12、14天，收集支气管肺泡罐洗液。使用插管用21号针头原位注射随后吸出0.5ml Hank’s平衡盐溶液，-70℃冻存。用Lowry法测定灌洗液总蛋白浓度，ELASA方法测定灌洗液血清白蛋白浓度。
于接种后5、7、9、10、12、14天，皮下注射0.2cc50mg/ml的戊巴比妥钠溶液处死动物，取动物肺脏，冻干并称重。按常规方法(Reddy GK，Clin.Biochem.29，225-229.1996)测定肺组织羟脯氨酸含量。
于接种后14天，计算动物存活率。
不同组之间数据使用t-检验统计学处理，当p＜0.05时，认为在各组之间存在显著性差异。
结果与对照组相比，施用IL-1受体拮抗剂组的血清白蛋白浓度显著降低，肺组织羟脯氨酸含量显著降低，同时动物存活率升高。
讨论虽然ARDS的机制迄今未完全阐明，但已经确认它是系统性炎症反应综合征的一部分。在实验和临床上应用血液透析除促炎因子对防止MODS的发生具有较好的效果，能显著提高患者生存率。以往的研究表明，Hybertson BM等人发现，炎症介质IL-1的过量表达在ARDS过程中发挥了重要作用(Ann N Y AcadSci.1998 Dec 15；832266-73)。此外，Siler TM等人发现，ARDS病人肺部巨嗜细胞分泌更多的IL-1(Lung Res.15881-894，1989)。Left JA发现，从气管灌注IL-1，会诱导肺损伤与肺渗漏(Am.J.Physiol.266L2-L8，1994)，这说明IL-1在肺损伤和ARDS中起作用。Ulich TR等人证明，使用可溶性IL-1受体、可溶性TNFα受体可以抑制急性炎症反应(Clin.Immunol.Immunopathol.72137-140，1995)。
本发明的研究首次证实了，使用IL-1受体拮抗剂，可以有效地阻止或抵消IL-1起作用，从而减轻或消除IL-1所造成的急性肺损伤，从而缓解和消除急性呼吸窘迫综合症。因此，人白细胞介素1受体拮抗剂特别适合治疗重症非典型性肺炎。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海复旦张江生物医药股份有限公司<120>白细胞介素-1受体拮抗剂治疗非典型性肺炎的用途<130>033161<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>462<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgcgaccct ctgggagaaa atccagcaag atgcaagcct tcagaatctg ggatgttaac 60cagaagacct tctatctgag gaacaaccaa ctagttgctg gatacttgca aggaccaaat 120gtcaatttag aagaaaagat agatgtggta cccattgagc ctcatgctct gttcttggga 180atccatggag ggaagatgtg cctgtcctgt gtcaagtctg gtgatgagac cagactccag 240ctggaggcag ttaacatcac tgacctgagc gagaacagaa agcaggacaa gcgcttcgcc 300ttcatccgct cagacagtgg ccccaccacc agttttgagt ctgccgcctg ccccggttgg 360ttcctctgca cagcgatgga agctgaccag cccgtcagcc tcaccaatat gcctgacgaa 420ggcgtcatgg tcaccaaatt ctacttccag gaggacgagt ag 462<210>2<211>153<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile1 5 10 15Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val20 25 30
Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp35 40 45Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly50 55 60Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln65 70 75 80Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp85 90 95Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe100 105 110Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala115 120 125Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val130 135 140Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu145 150
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于，它含有药学上可接受的载体、白细胞介素-1受体拮抗剂以及类固醇激素。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的白细胞介素-1受体拮抗剂是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的白细胞介素-1受体拮抗剂的重量百分比是0.01～99.99％，按组合物总重量计。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还含有类固醇激素，其重量百分比是0.01～90％，按组合物总重量计。
5.白细胞介素1-受体拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备治疗病原体引起的呼吸窘迫综合症。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的白细胞介素1-受体拮抗剂包括天然存在的白细胞介素1-受体拮抗剂、重组人白细胞介素1-受体拮抗剂、和白细胞介素1-受体拮抗剂衍生物。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的病原体包括细菌、病毒、支原体、或衣原体。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所说的病毒是冠状病毒和SARS病毒。
全文摘要
本发明涉及重组人白细胞介素1受体拮抗剂用于治疗非典型性肺炎(SARS)的新用途。更具体的，涉及将人白细胞介素1受体拮抗剂用于减轻重症非典型性肺炎病人的呼吸窘迫综合症症状，和降低非典型性肺炎的死亡率。本发明还提供了用于治疗SARS的药物组合物。
文档编号A61P31/00GK1565620SQ0312913
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月9日 优先权日2003年6月9日
发明者刘彦君, 王罗春, 杨正茂, 曹峰, 王征, 杨彤, 吴芳 申请人:上海复旦张江生物医药股份有限公司
技术领域：
本发明涉及重组人白细胞介素1受体拮抗剂用于治疗非典型性肺炎(SARS)的新用途。更具体的，涉及将人白细胞介素1受体拮抗剂用于减轻重症非典型性肺炎病人的呼吸窘迫综合症症状，和降低非典型性肺炎的死亡率。
背景技术：
非典型性肺炎(SARS)是由新型冠状病毒引起的急性呼吸道疾病。于2002年10月开始出现于中国广东，目前已蔓延到全世界几十个国家和地区。非典型性肺炎(SARS)表现为急性呼吸窘迫综合证为主要特征的许多重症病例，世界卫生组织(WHO)统计SARS的死亡率可高达15％。
目前，有关重症“非典”病例诊断标准是符合下列标准的其中1条可诊断为非典型肺炎的重症病例(1)多叶病变或X线胸片48小时内病灶进展＞50％；(2)呼吸困难，呼吸频率＞30次/分；(3)低氧血症，吸氧3～5升/分条件下，SaO2＜93％或氧合指数＜300mmHg；(4)出现休克、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)或多器官功能障碍综合征(MODS)。
ARDS是指严重感染、创伤、休克等肺内外袭击后出现的以肺泡毛细血管损伤为主要表现的临床综合征，其临床特征是呼吸频速和窘迫，进行性低氧血症，X线呈现弥漫性肺泡浸润。
重症“非典”的主要症状事实上就是ARDS的主要表现。临床上重症“非典”的治疗措施包括抗病毒治疗、类固醇激素免疫抑制治疗、继发感染的治疗等。其中第二阶段使用大剂量类固醇激素控制呼吸窘迫症状以及急性肺损伤等措施，这些措施类似于或者等同于治疗ARDS的措施。
临床证明，及时使用类固醇激素是一种有效的治疗手段，保护毛细血管内皮细胞、防止白细胞、血小板聚集和粘附管壁形成微血栓；具抗炎和促使肺间质液吸收；缓解支气管痉挛；抑制后期肺纤维化作用。类固醇激素治疗的效果直接关系到病人呼吸道症状的改善，关系到“非典”病人的死亡率。
类固醇激素作为一个作用广泛的免疫抑制剂，长期使用会造成免疫力低下、引起严重感染等后果。此外，类固醇激素对部分病人无效，造成重症非典病人很高的死亡率。
因此，本领域迫切需要开发新的疗效好、副作用小的药物，用于减轻重症非典病人呼吸窘迫综合症症状，降低死亡率。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的疗效好、副作用小的用于减轻重症非典病人呼吸窘迫综合症症状的药物，及其在治疗重症非典病人方面的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，它含有药学上可接受的载体、白细胞介素-1受体拮抗剂以及类固醇激素。
在一优选例中，所述的白细胞介素-1受体拮抗剂是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
在另一优选例中，所述的白细胞介素-1受体拮抗剂的重量百分比是0.01～99.99％，按组合物总重量计。
在另一优选例中，所述组合物还含有类固醇激素，其重量百分比是0.01～90％，按组合物总重量计。
在另一优选例中，所述的白细胞介素1-受体拮抗剂包括天然存在的白细胞介素1-受体拮抗剂、重组人白细胞介素1-受体拮抗剂、和白细胞介素1-受体拮抗剂衍生物。
在本发明的第二方面，提供了一种白细胞介素1-受体拮抗剂的用途，它被用于制备治疗病原体引起的呼吸窘迫综合症。
在另一优选例中，所述的白细胞介素1-受体拮抗剂包括天然存在的白细胞介素1-受体拮抗剂、重组人白细胞介素1-受体拮抗剂、和白细胞介素1-受体拮抗剂衍生物。
在另一优选例中，所述的病原体包括细菌、病毒、支原体、或衣原体。
在另一优选例中，所说的病毒是冠状病毒和SARS病毒。
具体实施例方式
本发明人首次发现，SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)病毒感染患者血清中IL-1水平，在病程病理发展过程中，其临床IL-1水平与其恶性进展程度呈明显正相关。并且，本发明的发明人还发现使用白细胞介素1受体拮抗剂可有效干预SARS疾病进程。在此基础上完成了本发明。
虽然本发明的作用机理还不清楚，但是，据信可能与IL-1在SARS造成的急性肺损伤中起重要作用有关。因此，使用IL-1受体拮抗剂，可以有效地阻止或抵消IL-1起作用，从而减轻或消除IL-1所造成的急性肺损伤，从而缓解和消除急性呼吸窘迫综合症。因此，人白细胞介素1受体拮抗剂特别适合治疗重症非典型性肺炎。
此外，将人白细胞介素1受体拮抗剂与类固醇激素和/或抗病毒剂联用，更可起协同作用，从而显著提高治疗SARS等疾病的效果。
如本文所用，术语“白细胞介素1-受体拮抗剂”指能够与白细胞介素1受体结合，竞争性抑制白细胞介素1的物质。
可用于本发明的所述的白细胞介素1-受体拮抗剂没有特别限制，包括天然存在的白细胞介素1-受体拮抗剂、重组人白细胞介素1-受体拮抗剂、和白细胞介素1-受体拮抗剂衍生物。其中，白细胞介素1-受体拮抗剂衍生物包括利用氨基酸替代、缺失等手段得到的具有白细胞介素1-受体拮抗剂活性的衍生物。在本发明中，优选的是重组人白细胞介素1-受体拮抗剂。一种具体的拮抗剂是具有SEQ ID NO2所示序列的蛋白。
生产白细胞介素1受体拮抗剂的方法是已知的。例如，对于用基因工程方法表达的重组人白细胞介素1受体拮抗剂而言，可将人白细胞介素1受体拮抗剂基因插入到适合的载体，导入大肠杆菌菌株。在合适的条件下进行发酵，收获的菌体经裂解，纯化、复性，得到的具有天然人白细胞介素1受体拮抗剂活性的重组蛋白。
本发明的重组人白细胞介素1受体拮抗剂可以单独、或者结合任何医学上可接受的药用赋形剂或载体中给药。
本发明的药物组合物含有药学上可接受的载体、白细胞介素-1受体拮抗剂以及选自下组的物质类固醇激素和抗病毒剂。其中，白细胞介素-1受体拮抗剂的含量是0.01~99.99％，类固醇激素的含量是0.01~90％。
本发明的药物组合物的剂型没有特别限制，可以固体、半固体或液体的形式。此外，本发明的药物制剂可通过静脉、皮下以及其他适合的途径给药。
可用本发明的药物组合物和方法治疗对照是哺乳动物，尤其是人。
尽管重组人白细胞介素1受体拮抗剂的有效治疗剂量所治疗患者的年龄和病情，但在治疗疾病时常用的每日剂量为约0.0001-1000mg，优选0.01-500mg，更优选0.1-200mg，更优选50-100mg。给药次数可以是每天一次，或数次。
本发明提供一种治疗重症非典型性肺炎的方法。该方法包括给非典型性肺炎病人施用有效治疗剂量的人重组白细胞介素1受体拮抗剂，施用2-60天。通常，使用人重组白细胞介素1受体拮抗剂从病毒感染的第2周开始，连续施用人白细胞介素1受体拮抗剂14天。
在本发明中，治疗重症非典型性肺炎时，人白细胞介素1受体拮抗剂可以单独使用，也可以与类固醇激素以及的抗病毒药物如利巴韦林联合使用。
本发明的主要优点在于(1)单独使用IL-1Ra或者联合使用IL-1Ra和类固醇激素，可缓解对单独使用类固醇激素不敏感的病人的呼吸窘迫症状。
(2)使用IL-1Ra可减少类固醇激素的使用剂量，减轻类固醇激素可能的副作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1重组人白细胞介素1受体拮抗剂的表达和纯化IL-1Ra cDNA全长462bp(SEQ ID NO1)，编码153个氨基酸(SEQ ID NO2)，采用全基因合成方法合成。将该序列通过两端的NdeI和HindIII位点克隆于原核表达载体pET32a上(Novagen公司)，转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(Novagen公司)进行表达，目的蛋白IL-1Ra以可溶形式存于细胞质中，表达量达菌体总蛋白的30％以上。
采用Biostat C-20全自动发酵罐对IL-1Ra生产菌种进行高密度发酵，收集的菌体用裂解液重悬，使用GYB60-6S高压匀浆泵破菌，破菌液离心后经两步阳离子交换层析和一步阴离子交换层析，样品纯度达到96％以上，外源DNA、宿主菌蛋白残留符合生物制品要求。经纯化的蛋白质分子量为17.3kD，比活为1000mU/mg。
纯化的样品用超滤器对成品所需缓冲液透滤至两者pH、电导相同，浓缩、过滤即得rhIL-1Ra原液。将纯化的rhIL-1Ra原液与柠檬酸缓冲液配制成水性针剂成品(浓度为100mg/ml，50mg/ml和20mg/ml)。
实施例2内毒素诱导的急性呼吸窘迫综合症狗模型药效学研究将15只体重为10.0-15.0kg的狗通过静脉内给药50mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉。麻醉后，暴露并切开气管，然后进行套管插入术以便用30％O2和70％N2的混合气体进行人工换气(潮气量180ml/呼吸；呼吸频率15-20次呼吸/分钟)并测量导气管的压力。器械操作包括插入两侧中央静脉和主动脉的聚乙烯导管，以及在主肺线中插入7F导管。连续监测并记录主动脉压、心率、中央静脉压、肺压力。用热稀释技术一式两份地测量心输出量。分析从主动脉线获得的样品与各种肺功能有关的各指标，其中包括动脉血O2张力、血红蛋白饱和度和分流％等。当手术完成后，在研究开始前使动物安定(以确保动脉二氧化碳张力在的范围内，pH在的范围内)。使用加热垫以预防体温过低。在连续实验结束时，通过放血处死动物并用左肺测定两侧肺的湿重和干重比。
将所有接受静脉内给药0.5mg/kg脂多糖(LPS)和30ug/kg佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)的动物分成3组。在接受LPS和PMA的第一组的5只动物中(用作对照)，在整个过程中输注盐水。在第二组的5只动物中，在注射LPS/PMA后立即静脉内输注甲基强的松龙(MP)(30mg/kg)。在第3组中，在注射实施例1制备的IL-1受体拮抗剂针剂(100mg/ml)，剂量分别为9.6mg/kg/天、4.8mg/kg/天、和2.4mg/kg/d。
在给药后，每小时均测定各血液动力学参数，分析动脉、静脉血O2和CO2指标。实验后立即动物左侧下叶的肺样品，测定重量；然后在烘箱中于105℃干燥24小时后测定干组织重量。计算W/D比值，评价肺水肿程度。所有数据均用平均值±标准差来表示。用Student-t检验来评估各组之间的统计学意义。当p＜0.05时，认为在各组之间存在显著性差异。
结果表明，使用IL-1受体拮抗剂可显著降低肺的水肿程度。
实施例3病毒性ARDS模型取4-5周龄的雌性CBA/J小鼠，分为3组，每组20只。3组动物首先腹膜内注射0.008cc 20％氯胺酮(ketamine)和2％PromAce(乙酰丙嗪马来酸酯acepromazine maleate)对动物进行轻度麻醉，然后鼻腔内接种30ul含1×107pfu呼肠孤病毒(Reovirus)的0.9％的注射用无菌生理盐水，每侧鼻孔接种15ul。
于接种后第5天开始，第1组动物，皮下注射IL-1Ra 24mg/kg/d，每天1次，连续7天。第2组动物，静脉注射类固醇皮质激素30mg/kg/d，连续注射7天。第3组动物，皮下注射生理盐水2.5ml/kgml，作为对照。
于接种后5、7、9、10、12、14天，收集支气管肺泡罐洗液。使用插管用21号针头原位注射随后吸出0.5ml Hank’s平衡盐溶液，-70℃冻存。用Lowry法测定灌洗液总蛋白浓度，ELASA方法测定灌洗液血清白蛋白浓度。
于接种后5、7、9、10、12、14天，皮下注射0.2cc50mg/ml的戊巴比妥钠溶液处死动物，取动物肺脏，冻干并称重。按常规方法(Reddy GK，Clin.Biochem.29，225-229.1996)测定肺组织羟脯氨酸含量。
于接种后14天，计算动物存活率。
不同组之间数据使用t-检验统计学处理，当p＜0.05时，认为在各组之间存在显著性差异。
结果与对照组相比，施用IL-1受体拮抗剂组的血清白蛋白浓度显著降低，肺组织羟脯氨酸含量显著降低，同时动物存活率升高。
讨论虽然ARDS的机制迄今未完全阐明，但已经确认它是系统性炎症反应综合征的一部分。在实验和临床上应用血液透析除促炎因子对防止MODS的发生具有较好的效果，能显著提高患者生存率。以往的研究表明，Hybertson BM等人发现，炎症介质IL-1的过量表达在ARDS过程中发挥了重要作用(Ann N Y AcadSci.1998 Dec 15；832266-73)。此外，Siler TM等人发现，ARDS病人肺部巨嗜细胞分泌更多的IL-1(Lung Res.15881-894，1989)。Left JA发现，从气管灌注IL-1，会诱导肺损伤与肺渗漏(Am.J.Physiol.266L2-L8，1994)，这说明IL-1在肺损伤和ARDS中起作用。Ulich TR等人证明，使用可溶性IL-1受体、可溶性TNFα受体可以抑制急性炎症反应(Clin.Immunol.Immunopathol.72137-140，1995)。
本发明的研究首次证实了，使用IL-1受体拮抗剂，可以有效地阻止或抵消IL-1起作用，从而减轻或消除IL-1所造成的急性肺损伤，从而缓解和消除急性呼吸窘迫综合症。因此，人白细胞介素1受体拮抗剂特别适合治疗重症非典型性肺炎。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海复旦张江生物医药股份有限公司<120>白细胞介素-1受体拮抗剂治疗非典型性肺炎的用途<130>033161<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>462<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgcgaccct ctgggagaaa atccagcaag atgcaagcct tcagaatctg ggatgttaac 60cagaagacct tctatctgag gaacaaccaa ctagttgctg gatacttgca aggaccaaat 120gtcaatttag aagaaaagat agatgtggta cccattgagc ctcatgctct gttcttggga 180atccatggag ggaagatgtg cctgtcctgt gtcaagtctg gtgatgagac cagactccag 240ctggaggcag ttaacatcac tgacctgagc gagaacagaa agcaggacaa gcgcttcgcc 300ttcatccgct cagacagtgg ccccaccacc agttttgagt ctgccgcctg ccccggttgg 360ttcctctgca cagcgatgga agctgaccag cccgtcagcc tcaccaatat gcctgacgaa 420ggcgtcatgg tcaccaaatt ctacttccag gaggacgagt ag 462<210>2<211>153<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile1 5 10 15Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val20 25 30
Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp35 40 45Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly50 55 60Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln65 70 75 80Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp85 90 95Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe100 105 110Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala115 120 125Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val130 135 140Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu145 150
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于，它含有药学上可接受的载体、白细胞介素-1受体拮抗剂以及类固醇激素。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的白细胞介素-1受体拮抗剂是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的白细胞介素-1受体拮抗剂的重量百分比是0.01～99.99％，按组合物总重量计。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还含有类固醇激素，其重量百分比是0.01～90％，按组合物总重量计。
5.白细胞介素1-受体拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备治疗病原体引起的呼吸窘迫综合症。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的白细胞介素1-受体拮抗剂包括天然存在的白细胞介素1-受体拮抗剂、重组人白细胞介素1-受体拮抗剂、和白细胞介素1-受体拮抗剂衍生物。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的病原体包括细菌、病毒、支原体、或衣原体。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所说的病毒是冠状病毒和SARS病毒。
全文摘要
本发明涉及重组人白细胞介素1受体拮抗剂用于治疗非典型性肺炎(SARS)的新用途。更具体的，涉及将人白细胞介素1受体拮抗剂用于减轻重症非典型性肺炎病人的呼吸窘迫综合症症状，和降低非典型性肺炎的死亡率。本发明还提供了用于治疗SARS的药物组合物。
文档编号A61P31/00GK1565620SQ0312913
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月9日 优先权日2003年6月9日
发明者刘彦君, 王罗春, 杨正茂, 曹峰, 王征, 杨彤, 吴芳 申请人:上海复旦张江生物医药股份有限公司
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