叶酸-聚二醇类化合物及其药物复合物的制作方法
专利名称：叶酸-聚二醇类化合物及其药物复合物的制作方法
技术领域：
本发明属化学药物领域，涉及叶酸-聚二醇类化合物及以该化合物与影像学核素或药物结合的复合物，特别涉及叶酸-聚乙二醇类化合物及其与影像学核素或抗肿瘤药物结合的复合物。本发明还涉及分别以叶酸-聚乙二醇类化合物、叶酸-聚乙二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物在制备抗肿瘤药物和肿瘤诊断药物中的应用，以及以上述物质为活性成分的药物组合物，及其它们在肿瘤靶向诊断和治疗中的应用，特别是在淋巴系统原发性或转移性肿瘤的靶向诊断和治疗中的应用。
随着多数肿瘤细胞表面FR表达数目或活性显著高于正常细胞的事实逐渐被揭示[Campbell et alCancer Res 1991，515329；Coney et alCancer Res 1991，516125；Weitman et alCancerRes 1992，523396]，以叶酸介导靶向肿瘤细胞的研究已有了迅速发展。
叶酸作为FR配体与放射性核素直接通过小分子间接连接而成的复合物，在肿瘤影像诊断方面的动物实验结果表明，肿瘤部位靶向效果显著[Low et alWO96/36367 Nov.21，1996和USA5688488Nov.18，1997；Wang S et alBioconjugate Chem 1996，7(1)56；Mathias CJ et alNucl Med Biol 1999，26(1)23；Wang S et alBioconjugate Chem 1997，8673；Mathias CJ et alJ Nucl Med1998，39(9)1579；Mathias CJ et alNucl Med Biol1998，25(6)585；Wang S et alBioconjugate Chem 1997，8(5)673；Iigan S et alCancer Biother Radiopharmaceuticals1998，13(6)427；Guo W et alJ Nucl Med 1999，40(9)1563]。
叶酸间接与脂质体表面结合生成的叶酸-聚乙二醇-脂质体细胞培养和动物实验结果表明，其靶向肿瘤细胞效果明显好于PEG-脂质体或普通脂质体[Lee et alJ Biol Chem 1994，269(5)3198；Wanget alProc Natl Acad Sci USA 1995，923318；Lee et alBiochimBiophys Acta 1995，1233134；Vogel et alJ Am Chem Soc1996，118(7)1581；Thompson et alWO97/31624 Sep.4，1997.RuiY et alJ A Chem Soc 1998，120(44)11213；Gabizon A et alBioconjugate Chem 1999，10(2)289；Shinoda T et alJ PharmSci 1998，87(12)1521；陆伟跃等上海医科大学学报2000，27(1)4]。
叶酸与高分子复合物也可通过FR将高分子完整地传释至细胞内的非溶酶体浆质中[Ying juan Lu et alAdv Drug Deliv Rev 2002，54675]。与叶酸复合的牛血清白蛋白、牛免疫球胆白、辣根过氧化酶、核糖核酸酶、豆丝氨酸酶抑制剂和抗DNA寡核苷酸均能明显导入KB细胞、HeLa细胞和XC细胞发挥其相应效果[Leamon et alProc NatlAcad Sci USA 1991，885572；Low et alWO90/12096Oct.18，1990]。结合叶酸的抗T细胞受体单克隆抗体或抗Fc受体单克隆抗体能将肿瘤细胞与T细胞或天然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞紧密地撮合在一起，达到有效溶解肿瘤细胞目的[David et alWO96/34630 Nov.7，1996]。而具有抑制蛋白合成功能的毒素[木鳖子皂甙(Momordin)—一种只有透过核糖体到达细胞浆才表现出细胞毒性的蛋白毒素；假单胞菌外毒素片段(LysPE38和CysPE35)]与叶酸复合后，其抑制肿瘤细胞生长能力极大增强[Leamon et alJBiol Chem 1992，26724966；1993，26824847]。一种本无抗肿瘤活性的用于血容量扩充剂的右旋糖苷与叶酸复合后，具有明显的抑制肿瘤组织生长作用(中国专利ZL00115752.3)。
一般认为，药物载体的粒径或等效直径介于9-100nm之间时，组织间隙注射后，具有良好的淋巴系统靶向性。至今为止，作为淋巴靶向药物载体研究的物质主要包括脂质体、纳米粒、胶束、多聚糖分子等，[Oussoren C et alAdv Drug deliv Rev 2001，50143；IllumL et alPharm Res 2001，18(5)640；Supersaxo A et alPharmRes 1991，8(10)1286；Vera DRJ Nucl Med 2001，42(6)951；陆伟跃等上海医科大学学报1996，23(suppl)3]，有报道，作为抗肿瘤药物载体靶向淋巴系统，[严忠勤等中国药物化学杂志1999，9(4)240]。
聚二醇化合物是一类具有-O(CH2)nO-或-(CH2)n’O(CH2)n’-重复结构的线性聚二醇类高分子化合物，其中n≥2或n’≥1。聚二醇化合物中最常见的是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，其分子组成为HOCH2CH2(OCH2CH2O)nCH2CH2OH或HOCH2(CH2OCH2)nCH2OHPEG既可溶解于水，又可溶解于绝大多数的有机溶剂，具有良好生物相容性和血液相容性，免疫原性低[Richter A W et alInt ArchAllergy Appl Immunol 1984，7436]，能被机体迅速排除而不产生任何毒副作用[Yamaoka T et alJ Pharm Sci 1994，83601]。
在制药工业中，PEG可用作药物辅料以提高药物的各种性能，如分散性、成膜性、润滑性、缓释性等[Zalipsky S et alAdv Drugdelivery Rev 1995，16157]。在新型生物材料的合成和改性中，PEG作为材料的一部分，能赋予材料新的特性和功能，如亲水性、柔性、抗凝血性、抗巨噬细胞吞噬性等[Green wald R B et alJ Org Chem1995，60333；Iphigenia L K et alInt J Pharm 2000，157103]。
在PEG的实际应用中，端基起着决定性的作用。PEG链末端不只限于羟基，其它反应活性更强的功能基团，如对甲苯磺酸酯[SuzakiT et alJ Polym Sci Polym Lett Ed 1979，17241]、氨基[GlassJD et alJ biopolym 1979，18383]、羧基[Fradet A et alPolymBull 1981，4205]、醛基[Ciuffarin E et alJ Org Chem1981，463064]等基团也可引入PEG链的两末端。这些功能基团的引入，扩大了PEG的应用范围。
PEG修饰包括，PEG与生物大分子类药物的物理结合和化学修饰，其可改变生物大分子的一些性质，如①增加药物的溶解度和稳定性；②减弱或消除免疫原性、抗原性和毒性；③改善药物的体内药动学行为，延长药物在体内的半衰期；④提高药物的治疗指数、扩大临床使用等。目前大部分研究主要集中在PEG与蛋白质的化学复合方面，如干扰素、超氧化物歧化酶、粒细胞集落刺激因子、牛血红蛋白、水蛭素、肿瘤坏死因子、胰岛素、白介素-2、尿酸酶腺苷脱胺酶、天冬酰胺酶等[Wang YS et alAdv Drug Deliv Rev 2002，54547；Bullick J et alAnal Biochem 1997，254(2)254；Malic F et alExp Hematol 1992，20(8)1028；Conover CD et alArtif CellsBlood Substit Immobil Biotechnol 1999，27(2)93；Fareed J etalThrombosis & Haemostasis 1991，65(6)1286；Tsutsumi Y etalBr J Cancer 1995，71(5)963；Hinds K et alBionconjug Chem2000，11(2)195；Schiavon O et alfarmaco 2000，55(4)264；Goodson RJ et alBiochem Biophysic Res Commun 1993，197(1)287；Inada Y et alTIBTECH 1995，1386；Jean-Francois J et alPiotechnol Appl Biochem 1996，23(Pt3)221]。
综上所述，肿瘤细胞膜表面FR是一条可通过叶酸将包括放射性核素、脂质体和高分子化合物等物质导入肿瘤细胞内的有效途径；PEG是一类具有广阔应用前景的高分子化合物，其在生物医学领域主要用作蛋白质、多肽、核酸、多糖等生物大分子的首选化学修饰剂。因此，叶酸的主动靶向性与PEG作为药物载体的优良性能结合，可能成为新的具有靶向作用的肿瘤诊断或治疗的药物载体。
本发明的另一目的是提供以上述化合物作为靶向载体与影像学核素或抗肿瘤药物结合的药物复合物。
本发明进一步目的是提供分别以叶酸-PEG类化合物、叶酸-PEG类化合物与影像学核素的复合物或与抗肿瘤药物的复合物为活性成分的药物组合物。
本发明还提供上述物质在制备肿瘤诊断药物和抗肿瘤药物中的用途和为临床提供肿瘤靶向诊断和治疗，特别是淋巴系统原发性或转移性肿瘤靶向诊断与治疗的物质基础。
本发明的实验结果表明，平均分子量仅为3,000的叶酸-PEG类化合物能够在组织间隙不透过毛细血管而导入淋巴系统，同时具有竞争叶酸受体的特征和肿瘤组织靶向性，其在进入淋巴系统后，与过度表达叶酸受体的肿瘤细胞结合，其所携带药物主动靶向肿瘤组织。
本发明特别涉及的叶酸-聚乙二醇类化合物包括，聚乙二醇末端一个羟基被氨基取代后再被叶酸衍生化，另一端羟基被甲氧基、氨基、醛基、羧基取代，或被羧甲基衍生化，或被氨基取代后再被叶酸、多羧基分子衍生化而生成的化合物；涉及的叶酸-聚乙二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物结合的复合物包括，一端被多羧基衍生化的叶酸-聚乙二醇化合物与放射性核素99mTc和111In或Gd磁共振核素螯合而生成的复合物，或一端取代有氨基、醛基、羧基和巯基，或衍生有多羧基或磺酸基的叶酸-聚乙二醇类化合物与甲氨蝶呤、阿霉素等蒽环类抗生素、丝裂霉素C、6-巯基嘌呤等抗肿瘤药物共价结合而成的复合物。
本发明采用如下技术方案实现本发明和达到上述发明目的。1.制备叶酸-聚二醇类化合物将叶酸或叶酸衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质与不同分子量、不同种类的聚二醇类化合物，特别是PEG类化合物，缩合生成下式的叶酸-聚二醇类化合物，X-Y其中X代表叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质；Y代表聚二醇及其衍生物。
上述叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质，其对动物或人体细胞无明显毒副作用，它们包括叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、四氢喋呤、蝶酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸、8-去氮叶酸等。其中，某位“去氮”是指叶酸中该位氮原子被碳原子取代。
上述聚二醇及其衍生物是聚二醇末端，特别是PEG末端一个羟基被氨基、羧基、甲氧基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被叶酸、二乙三胺五醋酸(DTPA)、乙二胺四醋酸(EDTA)和羧甲基右旋糖酐衍生化而生成的化合物。
(1)分子两端羟基被氨基取代的聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)与叶酸(F)在碳二亚胺脱水剂和碱性催化剂作用下，一端氨基或两端与F中的羧基缩合生成F-PEG-NH2或F-PEG-F。
(2)F-PEG-NH2与DTPA酸酐缩合反应生成F-PEG-DTPA。
(3)F-PEG-NH2与羧甲基右旋糖酐(CMDx)在碳二亚胺脱水剂和碱性催化剂作用下，另一端氨基与CMDx缩合生成F-PEG-CMDx。
(4)分子一端羟基被氨基取代的单甲氧基聚乙二醇(NH2-PEG-OCH3)与F在碳二亚胺脱水剂和碱性催化剂作用下，氨基与F缩合生成F-PEG-OCH3。2.制备叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物叶酸-聚二醇类化合物，特别是叶酸-聚乙二醇类化合物与不同影像学核素或抗肿瘤药物，在一定条件下反应生成相应叶酸-聚乙二醇衍生物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其通式如下X-Y-Z其中X代表叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质；Y代表聚二醇及其衍生物；Z为影像学核素或抗肿瘤药物。
上述叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质，其对动物或人体细胞无明显毒副作用，它们包括叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、四氢蝶呤、蝶酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸、8-去氮叶酸等。其中，某位“去氮”是指叶酸中该位氮原子被碳原子取代。
上述聚二醇及其衍生物是聚二醇末端，特别是PEG末端一个羟基被氨基、羧基、醛基和巯基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被二乙三胺五醋酸(DTPA)、乙二胺四醋酸(EDTA)和羧甲基右旋糖酐衍生化而生成的化合物。
上述影像学核素是指可被叶酸-聚二醇类化合物，特别是可被叶酸-聚乙二醇类化合物螯合的放射性核素和磁共振核素。
上述抗肿瘤药物是指具有可与叶酸-聚二醇类化合物，特别是具有可与叶酸-聚乙二醇类化合物一端氨基、巯基、醛基、羧基和磺酸基共价结合的带有羧基、氨基或巯基的抗肿瘤药物。
(1)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx先与还原剂氯化亚锡在酸性条件下制备成水针剂或冻干粉针剂，再与新鲜的Na99mTcO4生理盐水淋洗液混合，室温条件下反应生成F-PEG-DTPA-99mTc或F-PEG-CMDx-99mTc复合物。
(2)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx与GdCl3在酸性和室温条件下反应，生成F-PEG-DTPA-Gd或F-PEG-CMDx-Gd复合物。
(3)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx与丝裂霉素C(MMC)在水溶性碳二亚胺、pH5.0-5.5条件下，室温反应生成F-PEG-DTPA-MMC或F-PEG-CMDx-MMC复合物。
(4)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx与阿霉素(Dox)在碳二亚胺和碱性条件下，40℃反应生成F-PEG-DTPA-Dox或F-PEG-CMDx-Dox复合物。
(5)F-PEG-NH2与甲氨喋呤(MTX)在碳二亚胺和碱性条件下，40℃反应生成F-PEG-MTX复合物。3.叶酸-PEG类化合物对体外肿瘤细胞生长影响实验采用流式细胞仪检测一定浓度叶酸-PEG类化合物作用后的肿瘤细胞周期中各期DNA数量变化和凋亡百分率和叶酸-PEG类化合物对肿瘤细胞生长的影响。4.叶酸-PEG类化合物循叶酸受体途径导入肿瘤细胞的检测采用放射性配体结合分析法，测定叶酸-PEG类化合物竞争抑制125I-叶酸与肿瘤细胞膜表面叶酸受体结合程度，了解叶酸-PEG类化合物对肿瘤细胞膜表面叶酸受体的特异性亲和能力。
采用放射性同位素示踪法，检测不同时相肿瘤细胞内吞叶酸-PEG类化合物量的变化，证实叶酸-PEG类化合物循叶酸受体途径导入肿瘤细胞。5.叶酸-PEG类化合物在正常和模型动物体内的行为采用放射性同位素示踪法，检测不同时相内叶酸-PEG类化合物在正常小鼠、大鼠及荷瘤裸鼠的正常组织和肿瘤组织中的分布，了解其被动物正常组织摄取情况、药物动力学参数和对肿瘤组织的靶向性。6.叶酸-PEG类化合物对动物淋巴系统靶向性的检测采用放射性同位素示踪法，检测不同时相叶酸-PEG类化合物在正常大鼠的组织和淋巴结中的分布，结合SPECT仪对家兔全身动态显像观测，了解其对淋巴系统的靶向性及其排泄情况。
本发明叶酸-PEG类化合物及其与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物可采用药剂学上允许的赋形剂、粘合性、助悬剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、肠溶包衣材料、生物粘附材料、非水溶性骨架材料等辅料配伍，按照药学领域的常规或用特定的生产方法制备成相应药物组合物制剂。可采用叶酸-PEG类化合物与相关还原剂或pH调节剂以及相应的放射性核素或磁共振核素配伍，按药学领域的常规或用特定生产方法制备成相应药物组合物制剂。
所述药物组合物制剂包括肿瘤内、肿瘤旁、静脉或组织间隙注射用的叶酸-PEG类化合物及其影像学核素或抗肿瘤药物复合物的冻干粉针剂、水针剂、脂质体、纳米粒、胶束；口服用的叶酸-PEG类化合物及其抗肿瘤药物复合物的微球剂、肠溶胶囊等。
本发明所述的聚二醇类化合物，特别是聚乙二醇类化合物，其中PEG平均分子量范围为800-20,000。聚乙二醇类化合物与叶酸共价结合生成叶酸-PEG类化合物，选择PEG平均分子量为2000的叶酸-PEG类化合物作为模型药物进行如下试验。1.叶酸-PEG类化合物对肿瘤细胞周期的影响及凋亡的诱导作用流式细胞仪检测叶酸-PEG类化合物对人宫颈癌细胞HeLa229和人鼻咽癌细胞KB生长的影响程度，结果表明F-PEG-OCH3、F-PEG-DTPA、F-PEG-NH2、F-PEG-F诱导HeLa229细胞凋亡程度依次为43.14％、36.48％、14.37％和10.95％，诱导KB细胞凋亡程度依次为52.09％、32.76％、15.14％和3.81％。两株肿瘤细胞表现出类似的凋亡诱导效果，即F-PEG-OCH3最高，F-PEG-DTPA次之。2.叶酸-PEG-DTPA对肿瘤细胞表面叶酸受体竞争能力和内化程度F-PEG-DTPA与125I-F竞争HeLa229细胞表面叶酸受体的结果表明，F-LY2-DTPA具有与游离叶酸类似的竞争结合叶酸受体的特性。放射性同位素示踪的内化实验结果表明，KB细胞内化F-PEG-DTPA量随接触时间延长而逐渐增加，6h后KB细胞摄入量基本达到饱和。3.叶酸-PEG类化合物在正常和模型动物体内的行为特点正常动物体内组织分布和药动学的放射性同位素示踪结果表明大鼠体内2h时，F-PEG-DTPA主要分布于肾脏，总血浆清除半衰期为7.5min，其中t1/2(α)＝1.85min、t(1/2)β＝17.84min，血浆清除速度快；大鼠体内6h时，F-PEG-CMDx主要集中在肾脏和肺部，总血浆清除半衰期为37.44，其中t(1/2)α＝10.69、t(1/2)β＝107.8，血浆清除速度相对较慢。
荷瘤(SKOV3)裸鼠的肿瘤组织靶向性试验结果表明，F-PEG-DTPA和F-PEG-CMDx均表现出一定的肿瘤组织靶向性，且4h时均比游离叶酸靶向性好。荷瘤裸鼠尾静脉注射F-PEG-DTPA-99mTc后1、4和24h时，肿瘤与肌肉比分别为2.97、3.68和3.59倍；注射F-PEG-CMDx-99mTc后4和24h时，肿瘤与肌肉比分别为2.09和5.64倍；注射99mTc-F后4和24h时，肿瘤与肌肉比分别为1.45和3.62倍。4.叶酸-PEG-DTPA对动物淋巴系统靶向程度放射性同位素示踪的淋巴系统靶向试验结果表明大鼠和家兔趾间间隙注射F-PEG-DTPA-99mTc后，2h时大鼠淋巴结与血、肝、肾和肌肉比值分别为25.86、31.78、1.13和33.10，给药后家兔淋巴系统靶向显著而又迅速，进入血循环后，肝中摄取量少，肾脏为主要分布器官，并经其通过膀胱快速排泄，淋巴结影像逐渐淡化。提示F-PEG-DTPA具有良好的淋巴系统靶向性，且正常淋巴结无明显蓄积现象。
经上述实验结果证实，本发明有如下特点叶酸-PEG类化合物可循细胞膜上叶酸受体途径选择性地蓄积于过度表达叶酸受体的肿瘤细胞，具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用；叶酸-PEG-DTPA血浆清除速度快，但在组织间隙给药后，淋巴系统靶向性好，结合其肿瘤靶向性，可作为靶向载体分别与影像学核素和抗肿瘤药物结合成药物复合物，应用于淋巴系统原发性或转移性肿瘤靶向诊断和治疗。
在波长为366nm处测定0.5mmol/l的F-PEG-NH2氢氧化钠溶液的吸收度，A值为4.4630，由叶酸标准曲线可得，0.5mmol/l F-PEG-NH2中叶酸的摩尔浓度为0.4980mmol/l。
即F-PEG-NH2中氨基与叶酸摩尔比(0.4975/0.4980)近似为1。6.叶酸-PEG类化合物的检测将上述方法制备得到的叶酸-PEG类化合物，用HPLC法对其纯度进行定量分析，用紫外、红外、核磁共振对其结构进行鉴别，其结果分别如下HPLC法检测纯度结果将纯化后的F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3的HPLC检测图谱，采用面积归一法测得纯度分别为100％、99.18％、98.97％、97.67％和100％。紫外扫描图谱由紫外可见光谱扫描图谱显示，F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3在283和365nm波长处均有与叶酸相同的吸收峰。红外图谱将F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3红外图谱与叶酸比较，上述叶酸-PEG类化合物图谱中均有叶酸所含基团特征峰，如1693cm-1处的酰胺基特征峰，1600cm-1附近的羰基特征峰；同时也具有PEG所含基团的特征峰，如1100cm-1附近的脂肪醚特征峰。核磁共振图谱将F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3的HNMR图谱与叶酸、NH2-PEG-NH2、CH3O-PEG-NH2、DTPA、CMDx比较，均有与叶酸相似的位移峰δ8.67(s，1H，C7-H)、7.66(d，2H，Ar)、6.63(d，2H，Ar)、4.34(dd，C19-H)、2.0-2.4(m，2H，C21-H2)，还有与PEG相似的位移峰δ3.1-4.0(m，-OCH2CH2)；F-PEG-OCH3有与CH3O-PEG-NH2相似的位移峰δ3.36(s，-OCH3)；F-PEG-DTPA有与DTPA相似的位移峰δ3.29(t，C5，C7-2H)、3.42(t，C4，C8-2H)；F-PEG-CMDx有与CMDx在δ3.4-4.5处相似的位移多峰。实施例2 制备叶酸-PEG类化合物与99mTc的复合物1.制备叶酸-PEG-DTPA-99mTc取10mg F-PEG-DTPA加1ml pH 7.4的PBS(0.01mol/l)溶解后，加入10μl浓度为10μg/μl氯化亚锡的0.15N盐酸溶液后，再加入1-2ml新鲜Na99mTcO4溶液(1-5mCi)，混匀，室温下放置10min，即得F-PEG-DTPA-99mTc注射液。用Sephadex G-15柱，以pH 7.4的0.01MPBS为流动相洗脱，对其进行纯化，收集黄色区带洗脱液，以纸层析法检测其放射化学纯度(固定相为新华滤纸，展开剂为85％乙醇水溶液，展开后在γ计数器上测定各区段放射性计数，计算F-PEG-DTPA-99mTc放射性计数占总放射性计数的百分数)。F-PEG-DTPA-99mTc放射化学纯度＞95％。2.制备叶酸-PEG-CMDx-99mTc取10mg F-PEG-CMDx同上方法反应和纯化，得F-PEG-CMDx-99mTc注射液，其放射化学纯度＞95％。实施例3 制备叶酸-PEG类化合物与Gd的复合物取F-PEG-DTPA 100mg溶解于6ml注射用水，加1.5ml 50mmol/lGdCl3的0.1N HCl溶液，室温搅拌反应24h，反应液用Sephadex G-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，收集具有叶酸特征吸收波长段的流分，冷冻干燥，得黄色的F-PEG-DTPA-Gd固体184mg，再加注射用水4.2ml，按每瓶1ml分装后冻干。实施例4 制备叶酸-PEG类化合物与抗肿瘤药物的复合物1.制备叶酸-PEG-DTPA-丝裂霉素C取F-PEG-DTPA 83mg溶解于10ml注射用水，加丝裂霉素C(MMC)15mg溶解后，在搅拌下加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)83mg，维持pH 5.0-5.5之间室温搅拌反应24h。在4℃条件下，反应液对注射用水透析24h后，依次用DEAE Sepharose FF离子交换柱和Sephadex G-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，收集同时具有MMC和叶酸特征吸收波长段的流分，冷冻干燥，得黄中略带紫色的F-PEG-DTPA-MMC固体61mg。2.制备叶酸-PEG-DTPA-阿霉素取F-PEG-DTPA 83mg溶解于5ml DMSO，在搅拌下加DCC 18mg，在40℃条件下活化30min，加阿霉素(Dox)20mg和三乙胺10μl，搅拌反应24h，加20ml蒸馏水终止反应，室温下4000r/min离心，取上清液，依次用DEAE Sepharose FF离子交换柱和Sephadex G-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，收集同时具有Dox和叶酸特征吸收波长段的流分，冷冻干燥，得橙红色F-PEG-DTPA-Dox固体67mg。3.制备叶酸-PEG-DTPA-甲氨喋呤取甲氨喋呤(MTX)22mg溶解于5ml DMSO，在搅拌下加DCC20mg，在40℃条件下活化30min，F-PEG-NH260mg和吡啶10μl，搅拌反应24h，加20ml蒸馏水终止反应，室温下4000r/min离心，取上清液，依次用DEAE Sepharose FF离子交换柱和Sephadex G-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，收集同时具有MTX和叶酸特征吸收波长段的流分，冷冻干燥，得黄色F-PEG-MTX固体46mg。实施例5 叶酸-PEG类化合物对体外人癌细胞周期DNA和凋亡的影响用含10％小牛血清(BCS)的无叶酸RPMI1640培养液，在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO2、饱和湿度)连续HeLa229、KB细胞进行培养至足够量。将一定数量细胞分装后继续培养一天使之贴壁，分别加入F-PEG类化合物，使最终浓度为10μg/ml，连续培养72h两次。用0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化并分散HeLa229、KB细胞，制成单细胞悬液，离心，弃去上清液，重新悬浮于PBS中，调整细胞浓度至106cell/ml。将等体积的细胞悬液和碘化丙啶染色液混合，4℃放置20-30min，300目尼龙膜过滤后，用流式细胞仪在488nm激发波长处检测，考察F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-OCH3对HeLa229、KB细胞周期各期DNA量变化及其凋亡的影响。结果表明，F-PEG类化合物有明显的诱导肿瘤细胞凋亡作用，其诱导凋亡程度依次为F-LY2-OMe＞F-LY2-DTPA＞F-LY2-NH2＞LY2-F2(HeLa229细胞)；F-LY2-Ome＞F-LY2-DTPA＞LY2-F2＞F-LY2-NH2(KB细胞)。表1是叶酸(F)-PEG类叶酸化合物对Hela229及KB细胞的凋亡影响。表1DNA含量 凋亡率细胞类型 实验组G0-G1 G2-M S (％)KB 对照 91.82 6.41 1.77 1.02PEG-F2 64.77 6.12 29.10 15.14F-PEG-OCH370.20 28.13 1.67 52.09F-PEG-NH264.72 1.61 33.67 3.81F-PEG-DTPA 82.03 4.60 13.37 32.76对照 96.81 0.00 5.96 5.96HeLa229PEG-F2 59.42 0.41 40.16 10.95F-PEG-OCH388.99 0.06 10.95 43.14F-PEG-NH265.42 0.35 34.23 14.37F-PEG-DTPA 94.63 4.99 0.38 36.48实施例6 叶酸-PEG-DTPA与叶酸受体结合特性的评价1.叶酸-PEG-DTPA-99mTc对HeLa 229叶酸受体的竞争结合试验HeLa229细胞用含10％小牛血清(BCS)的无叶酸RPMI1640培养液，在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO2、饱和湿度)连续培养至足够量后，制备成约含2.2×105cells/ml的细胞悬液。将此细胞悬液中加入50μl125I-F与不同浓度F-PEG-DTPA或不同浓度叶酸，在pH 7.4的0.01mol/l磷酸盐缓冲液中，4℃反应20h后，4000r/min离心10min，弃去上清液，用γ计数器测量沉淀物(细胞结合物)放射性计数(CPM)。分别以细胞结合的放射性计数对叶酸、F-PEG-DTPA浓度作图，得HeLa229细胞结合125I-F的抑制曲线。结果表明，F-PEG-DTPA和F竞争抑制125I-F与肿瘤细胞表面叶酸受体结合的特征相似，但F-PEG-DTPA与125I-F竞争叶酸受体能力弱于F，两者抑制肿瘤细胞结合125I-F 50％时的浓度分别为11.2和1.58fmol2.KB细胞内化摄取叶酸-PEG-DTPA试验取对数生长期KB细胞，通过常规方法消化，制成单细胞悬液，将其接种于四块12孔板中，每孔2ml(每孔细胞数为6.25×104cells)。四天后将板中培养液更换成不含血清的无叶酸1640培养液，每孔2ml(洗涤，1ml×2次)。次日换培养液，每孔1ml不含血清的无叶酸1640培养液，后续处理按以下步骤操作。
非特异结合管(NBS)中先加F-PEG-DTPA溶液混匀，然后分别在非特异结合管、特异结合管和内化管中各加入100μlF-PEG-DTPA-99mTc，吸取不同时相孔内上清液。非特异结合管和特异结合管分别用pH 7.4的0.01M PBS洗涤(1ml×2次)后，0.25％胰蛋白酶消化5min，用力吹打贴壁细胞，吸出加入至测量管；内化管加pH 3的醋酸溶液，使结合在细胞表面叶酸受体的配体解离后，再按特异结合管处理方法操作。用γ计数器分别测定处理后的非特异结合管、特异结合管和内化管中放射性计数。结果提示，KB细胞内吞摄取F-PEG-DTPA量随接触时间延长而逐渐增加，6h后KB细胞摄入量基本达到饱和。实施例7 叶酸-PEG类化合物的动物体内行为试验1.叶酸-PEG-DTPA在正常大鼠体内血液动力学及其分布大鼠股静脉注射0.1ml浓度约为10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc，分别于注射后不同时相尾静脉取血50μl，在γ计数器上测定放射性计数(CPM)。应用MicroMath PKAnalyst Statistics Software按二室模型处理，药动学参数为t1/2(E)＝7.5min，t1/2(α)＝1.85min，t1/2(β)＝17.84min。结果表明，F-PEG-DTPA血液清除速度较快。
大鼠尾静脉注射0.1ml浓度约为10mg/ml的F-DTPA-PEG-99mTc，于2h后断头处死，取血、心、肝、脾、肾、肺、大肠、小肠、胃、肌肉，称量，在γ计数器上分别测定放射性计数(CPM)。计算每克组织的放射性计数占总注射量放射性计数的百分数(％ID/g)。结果提示，F-DTPA-PEG-99mTc在2h时主要分布在大鼠肾脏，而在肝脏等其它脏器中的量远小于肾。2.叶酸-PEG-CMDx在正常大鼠体内血液动力学及其分布大鼠6只，分为两组，每只股静脉分别注射0.1ml浓度约为5mg/ml的F-PEG-CMDx-99mTc或99mTc-CMDx，于注射后不同时相尾静脉各取血50μl，在γ计数器上测定放射性计数(CPM)。应用MicroMath PKAnalystStatistics Software按二室模型处理，F-PEG-CMDx和CMDx的药动学参数分别为t1/2(E)＝37.44min，t1/2(α)＝10.69min，t1/2(β)＝107.8min和t1/2(E)＝53.57min，t1/2(α)＝22.71min，t1/2(β)＝202.3min。结果提示，F-PEG化缩短了CMDx在血液中滞留时间，而F-PEG被CMDx衍生化则延长了F-PEG类化合物的血循环时间。注射6h后断头处死，取心、肺、肝、脾、肾，称量，在γ计数器上分别测定放射性计数(CPM)。计算每克组织的放射性计数占总注射量放射性计数的百分数(％ID/g)。结果表明，给药6h后，F-PEG-CMDx和CMDx均在肝中的分布较少，主要集中在肾和肺，但前者在组织中摄取量明显低于后者。表2是大鼠股静脉注射6h后F-PEG-CMDx-99m和99mTc-CMDx的组织分布。
表2％ID/g组 织F-PEG-CMDx-99mTc99mTc-CMDx心0.31±0.040.30±0.06肝0.46±0.040.75±0.05肺2.55±0.184.22±0.78脾0.58±0.282.16±0.19肾9.88±6.2412.49±5.723.叶酸-PEG-DTPA在荷瘤动物体内组织分布荷瘤(SKOV3)裸鼠10只，用低叶酸饲料喂养三天后，分成三组，除F-PEG-DTPA-99mTc组设1个时相外，F-PEG-CMDx-99mTc、99mTc-F均为2个时相。尾静脉分别注射0.1ml浓度10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc、F-PEG-CMDx-99mTc、99mTc-F后，F-PEG-DTPA-99mTc组于4h、后二组分别于4和24h处死，取血、心、肝、脾、肾、肺、大肠、小肠、胃、肌肉、肿瘤，称量，在γ计数器上分别测定放射性计数(CPM)。计算每克组织放射性计数占总注射量放射性计数的百分数(％ID/g)。
另取(SKOV3)荷瘤裸鼠14只，用低叶酸饲料喂养三天后，分成3个时相组(4、5、5只)，尾静脉分别注射0.1ml浓度为7mg/ml的叶酸-PEG-DTPA-99mTc99mTc-DTPA-LY2-F后，于1、4、24h分别断头处死，后续操作同上。计算每克组织放射性计数占总注射量放射性计数的百分数(％ID/g)。
结果表明，静脉注射1、4和24h后，F-PEG-DTPA在肿瘤组织中分布量比肌肉分别高2.97、3.68和3.59倍；静脉注射4和24h后，F-PEG-CMDx在肿瘤组织中分布量比肌肉分别高2.09和5.64倍；静脉注射4和24h后，叶酸在肿瘤组织中分布量比肌肉分别高1.45和3.62。提示F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx具有一定的肿瘤组织靶向性，且在给药后的4h内均比游离叶酸靶向性好。实施例8 F-PEG-DTPA淋巴系统靶向性试验1.F-PEG-DTPA对大鼠淋巴结靶向试验大鼠两后肢趾间间隙各注射一点，每点60μl浓度约为10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc，于注射后2h断头处死，取血、心、肝、脾、肾、肺、大肠、小肠、胃、肌肉、国淋巴结，称量，在γ计数器上分别测定放射性计数(CPM)。计算每克组织放射性计数占总注射量放射性计数的百分数(％ID/g)。结果表明，F-PEG-DTPA在淋巴结中的量远高于血、心、脾、肺、肝、大肠、小肠、胃，与肾脏中的量相当，提示F-PEG-DTPA具有较好的淋巴靶向性。2.F-PEG-DTPA对家兔淋巴系统靶向试验家兔两后肢趾间间隙各注射一点，每点0.1ml浓度为10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc，分别于注射后5、15和120min在SPECT仪下进行全身显像观察并摄片记录。动态图象结果表明，F-PEG-DTPA在组织间隙靶向淋巴系统迅速而显著，整个下肢淋巴系统导入在5min内完成，除肾脏和膀胱外，2h内其它脏器或组织均未见明显蓄积，但包括淋巴结在内的淋巴系统摄取F-PEG-DTPA量随时间延长而显著递减。此外，家兔膀胱中蓄积量随时间增加，肾脏中蓄积量随时间减少，提示肾脏可能仅是F-PEG-DTPA排泄途径。
权利要求
1.一种叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于其具有以下通式，X-Y其中X为叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质；Y为具有-O(CH2)nO-或-(CH2)n’O(CH2)n’-重复结构的聚二醇及其衍生物，其中n≥2或n’≥1。
2.按权利要求1所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质是叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、四氢蝶呤、喋酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸和8-去氮叶酸。
3.按权利要求1所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物的聚二醇类化合物是聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量为800-20,000。
4.按权利要求3所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸-聚乙二醇衍生物的聚乙二醇末端一个羟基被氨基取代后再被叶酸衍生化，另一端羟基被甲氧基、氨基、羧基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被叶酸、二乙三胺五醋酸、乙二胺四醋酸和羧甲基右旋糖酐衍生化。
5.按权利要求4所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸-聚乙二醇衍生物的聚乙二醇末端一个羟基被氨基取代后再被叶酸衍生化，另一端羟基被甲氧基取代，或被羧甲基衍生化，或被氨基取代后再被叶酸、二乙三胺五醋酸或羧甲基右旋糖酐衍生化。
6.按权利要求5所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸-聚乙二醇衍生物的聚乙二醇平均分子量为2,000-20,000。
7.按权利要求6所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸-聚乙二醇衍生物中的聚乙二醇平均分子量为2,000。
8.叶酸-聚二醇类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种用于抗肿瘤的药物组合物，其特征在于由权利要求5的叶酸-聚二醇类化合物与药用辅料混合制成，其制剂为小针剂、冻干粉针剂、微球剂、纳米粒和肠溶胶囊剂。
10.按权利要求9所述的用于抗肿瘤的药物组合物，其特征在于所述药物辅料是药剂学上允许的赋形剂、粘合剂、助悬剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、肠溶包衣材料、生物粘附材料和非水溶性骨架材料。
11.一种叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于具有以下通式X-Y-Z其中X为叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质；Y为具有-O(CH2)nO-或-(CH2)n’O(CH2)n’-重复结构的聚二醇及其衍生物，其中n≥2或n’≥1；Z为影像学核素或抗肿瘤药物。
12.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质与权利要求2相同。
13.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物中聚二醇类化合物是聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量为800-20,000。
14.按权利要求13所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物是聚乙二醇末端一个羟基被氨基取代后再被叶酸衍生化，另一端羟基被氨基、醛基、羧基和巯基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被二乙三胺五醋酸、乙二胺四醋酸和羧甲基右旋糖酐衍生化。
15.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素的复合物，其特征在于所述影像学核素是可被叶酸-聚二醇类化合物螯合的放射性核素和磁共振核素。
16.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述抗肿瘤药物是具有可与叶酸-聚二醇类化合物一端氨基、巯基、醛基、羧基和磺酸基共价结合的带有羧基、氨基、巯基的抗肿瘤药物。
17.按权利要求13所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物中的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量为2,000-10,000。
18.按权利要求17所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物中的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量为2,000。
19.按权利要求14所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物，其中聚乙二醇末端一个羟基被氨基取代后再被叶酸衍生化，另一端羟基被氨基取代，或被羧甲基衍生化，或被氨基取代后再被二乙三胺五醋酸或羧甲基右旋糖酐衍生化。
20.按权利要求15所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素的复合物，其特征在于所述放射性核素是99mTc和111In，所述磁共振核素是Gd。
21.按权利要求16所述的叶酸-聚二醇类化合物与抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述抗肿瘤药物是甲氨喋呤、阿霉素等蒽环类抗生素和丝裂霉素。
22.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素的复合物在制备肿瘤诊断药物中的用途。
23.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素的复合物在制备淋巴系统原发性或转移性肿瘤诊断药物中的用途。
24.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与抗肿瘤药物的复合物在制备肿瘤靶向治疗药物中的用途。
25.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与抗肿瘤药物的复合物在制备淋巴系统原发性或转移性肿瘤治疗药物中的用途。
26.一种用于肿瘤靶向治疗的药物组合物，其特征在于由权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与抗肿瘤药物的复合物和药用辅料混合制成，其制剂为小针剂、冻干粉针剂、微球剂、纳米粒和肠溶胶囊剂。
27.按权利要求26所述的用于肿瘤靶向治疗的药物组合物，其特征在于所述药物辅料是药剂学上允许的赋形剂、粘合剂、助悬剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、肠溶包衣材料、生物粘附材料和非水溶性骨架材料。
全文摘要
本发明属化学药物领域，涉及叶酸－聚二醇类特别是叶酸－聚乙二醇类化合物及以该化合物与影像学核素或抗肿瘤药物结合的复合物，及其在肿瘤靶向诊断和治疗中的应用。本发明的实验结果表明，小分子量的叶酸－PEG类化合物能在组织间隙不透过毛细血管而导入淋巴系统，并具有竞争叶酸受体的特征和肿瘤组织靶向性。本发明叶酸－聚二醇类化合物及以该化合物与影像学核素或抗肿瘤药物结合的复合物可制备肿瘤诊断药物和抗肿瘤药物，为临床提供肿瘤靶向诊断和治疗，特别是淋巴系统原发性或转移性肿瘤靶向诊断与治疗的物质基础。
文档编号A61K49/00GK1472235SQ0312956
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月26日 优先权日2003年6月26日
发明者陆伟跃, 徐雯, 韩慧兰, 刘敏, 谢操, 潘俊, 钟高仁, 陈绍亮, 姚明 申请人:上海复康医药科技发展有限公司, 复旦大学
技术领域：
本发明属化学药物领域，涉及叶酸-聚二醇类化合物及以该化合物与影像学核素或药物结合的复合物，特别涉及叶酸-聚乙二醇类化合物及其与影像学核素或抗肿瘤药物结合的复合物。本发明还涉及分别以叶酸-聚乙二醇类化合物、叶酸-聚乙二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物在制备抗肿瘤药物和肿瘤诊断药物中的应用，以及以上述物质为活性成分的药物组合物，及其它们在肿瘤靶向诊断和治疗中的应用，特别是在淋巴系统原发性或转移性肿瘤的靶向诊断和治疗中的应用。
随着多数肿瘤细胞表面FR表达数目或活性显著高于正常细胞的事实逐渐被揭示[Campbell et alCancer Res 1991，515329；Coney et alCancer Res 1991，516125；Weitman et alCancerRes 1992，523396]，以叶酸介导靶向肿瘤细胞的研究已有了迅速发展。
叶酸作为FR配体与放射性核素直接通过小分子间接连接而成的复合物，在肿瘤影像诊断方面的动物实验结果表明，肿瘤部位靶向效果显著[Low et alWO96/36367 Nov.21，1996和USA5688488Nov.18，1997；Wang S et alBioconjugate Chem 1996，7(1)56；Mathias CJ et alNucl Med Biol 1999，26(1)23；Wang S et alBioconjugate Chem 1997，8673；Mathias CJ et alJ Nucl Med1998，39(9)1579；Mathias CJ et alNucl Med Biol1998，25(6)585；Wang S et alBioconjugate Chem 1997，8(5)673；Iigan S et alCancer Biother Radiopharmaceuticals1998，13(6)427；Guo W et alJ Nucl Med 1999，40(9)1563]。
叶酸间接与脂质体表面结合生成的叶酸-聚乙二醇-脂质体细胞培养和动物实验结果表明，其靶向肿瘤细胞效果明显好于PEG-脂质体或普通脂质体[Lee et alJ Biol Chem 1994，269(5)3198；Wanget alProc Natl Acad Sci USA 1995，923318；Lee et alBiochimBiophys Acta 1995，1233134；Vogel et alJ Am Chem Soc1996，118(7)1581；Thompson et alWO97/31624 Sep.4，1997.RuiY et alJ A Chem Soc 1998，120(44)11213；Gabizon A et alBioconjugate Chem 1999，10(2)289；Shinoda T et alJ PharmSci 1998，87(12)1521；陆伟跃等上海医科大学学报2000，27(1)4]。
叶酸与高分子复合物也可通过FR将高分子完整地传释至细胞内的非溶酶体浆质中[Ying juan Lu et alAdv Drug Deliv Rev 2002，54675]。与叶酸复合的牛血清白蛋白、牛免疫球胆白、辣根过氧化酶、核糖核酸酶、豆丝氨酸酶抑制剂和抗DNA寡核苷酸均能明显导入KB细胞、HeLa细胞和XC细胞发挥其相应效果[Leamon et alProc NatlAcad Sci USA 1991，885572；Low et alWO90/12096Oct.18，1990]。结合叶酸的抗T细胞受体单克隆抗体或抗Fc受体单克隆抗体能将肿瘤细胞与T细胞或天然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞紧密地撮合在一起，达到有效溶解肿瘤细胞目的[David et alWO96/34630 Nov.7，1996]。而具有抑制蛋白合成功能的毒素[木鳖子皂甙(Momordin)—一种只有透过核糖体到达细胞浆才表现出细胞毒性的蛋白毒素；假单胞菌外毒素片段(LysPE38和CysPE35)]与叶酸复合后，其抑制肿瘤细胞生长能力极大增强[Leamon et alJBiol Chem 1992，26724966；1993，26824847]。一种本无抗肿瘤活性的用于血容量扩充剂的右旋糖苷与叶酸复合后，具有明显的抑制肿瘤组织生长作用(中国专利ZL00115752.3)。
一般认为，药物载体的粒径或等效直径介于9-100nm之间时，组织间隙注射后，具有良好的淋巴系统靶向性。至今为止，作为淋巴靶向药物载体研究的物质主要包括脂质体、纳米粒、胶束、多聚糖分子等，[Oussoren C et alAdv Drug deliv Rev 2001，50143；IllumL et alPharm Res 2001，18(5)640；Supersaxo A et alPharmRes 1991，8(10)1286；Vera DRJ Nucl Med 2001，42(6)951；陆伟跃等上海医科大学学报1996，23(suppl)3]，有报道，作为抗肿瘤药物载体靶向淋巴系统，[严忠勤等中国药物化学杂志1999，9(4)240]。
聚二醇化合物是一类具有-O(CH2)nO-或-(CH2)n’O(CH2)n’-重复结构的线性聚二醇类高分子化合物，其中n≥2或n’≥1。聚二醇化合物中最常见的是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，其分子组成为HOCH2CH2(OCH2CH2O)nCH2CH2OH或HOCH2(CH2OCH2)nCH2OHPEG既可溶解于水，又可溶解于绝大多数的有机溶剂，具有良好生物相容性和血液相容性，免疫原性低[Richter A W et alInt ArchAllergy Appl Immunol 1984，7436]，能被机体迅速排除而不产生任何毒副作用[Yamaoka T et alJ Pharm Sci 1994，83601]。
在制药工业中，PEG可用作药物辅料以提高药物的各种性能，如分散性、成膜性、润滑性、缓释性等[Zalipsky S et alAdv Drugdelivery Rev 1995，16157]。在新型生物材料的合成和改性中，PEG作为材料的一部分，能赋予材料新的特性和功能，如亲水性、柔性、抗凝血性、抗巨噬细胞吞噬性等[Green wald R B et alJ Org Chem1995，60333；Iphigenia L K et alInt J Pharm 2000，157103]。
在PEG的实际应用中，端基起着决定性的作用。PEG链末端不只限于羟基，其它反应活性更强的功能基团，如对甲苯磺酸酯[SuzakiT et alJ Polym Sci Polym Lett Ed 1979，17241]、氨基[GlassJD et alJ biopolym 1979，18383]、羧基[Fradet A et alPolymBull 1981，4205]、醛基[Ciuffarin E et alJ Org Chem1981，463064]等基团也可引入PEG链的两末端。这些功能基团的引入，扩大了PEG的应用范围。
PEG修饰包括，PEG与生物大分子类药物的物理结合和化学修饰，其可改变生物大分子的一些性质，如①增加药物的溶解度和稳定性；②减弱或消除免疫原性、抗原性和毒性；③改善药物的体内药动学行为，延长药物在体内的半衰期；④提高药物的治疗指数、扩大临床使用等。目前大部分研究主要集中在PEG与蛋白质的化学复合方面，如干扰素、超氧化物歧化酶、粒细胞集落刺激因子、牛血红蛋白、水蛭素、肿瘤坏死因子、胰岛素、白介素-2、尿酸酶腺苷脱胺酶、天冬酰胺酶等[Wang YS et alAdv Drug Deliv Rev 2002，54547；Bullick J et alAnal Biochem 1997，254(2)254；Malic F et alExp Hematol 1992，20(8)1028；Conover CD et alArtif CellsBlood Substit Immobil Biotechnol 1999，27(2)93；Fareed J etalThrombosis & Haemostasis 1991，65(6)1286；Tsutsumi Y etalBr J Cancer 1995，71(5)963；Hinds K et alBionconjug Chem2000，11(2)195；Schiavon O et alfarmaco 2000，55(4)264；Goodson RJ et alBiochem Biophysic Res Commun 1993，197(1)287；Inada Y et alTIBTECH 1995，1386；Jean-Francois J et alPiotechnol Appl Biochem 1996，23(Pt3)221]。
综上所述，肿瘤细胞膜表面FR是一条可通过叶酸将包括放射性核素、脂质体和高分子化合物等物质导入肿瘤细胞内的有效途径；PEG是一类具有广阔应用前景的高分子化合物，其在生物医学领域主要用作蛋白质、多肽、核酸、多糖等生物大分子的首选化学修饰剂。因此，叶酸的主动靶向性与PEG作为药物载体的优良性能结合，可能成为新的具有靶向作用的肿瘤诊断或治疗的药物载体。
本发明的另一目的是提供以上述化合物作为靶向载体与影像学核素或抗肿瘤药物结合的药物复合物。
本发明进一步目的是提供分别以叶酸-PEG类化合物、叶酸-PEG类化合物与影像学核素的复合物或与抗肿瘤药物的复合物为活性成分的药物组合物。
本发明还提供上述物质在制备肿瘤诊断药物和抗肿瘤药物中的用途和为临床提供肿瘤靶向诊断和治疗，特别是淋巴系统原发性或转移性肿瘤靶向诊断与治疗的物质基础。
本发明的实验结果表明，平均分子量仅为3,000的叶酸-PEG类化合物能够在组织间隙不透过毛细血管而导入淋巴系统，同时具有竞争叶酸受体的特征和肿瘤组织靶向性，其在进入淋巴系统后，与过度表达叶酸受体的肿瘤细胞结合，其所携带药物主动靶向肿瘤组织。
本发明特别涉及的叶酸-聚乙二醇类化合物包括，聚乙二醇末端一个羟基被氨基取代后再被叶酸衍生化，另一端羟基被甲氧基、氨基、醛基、羧基取代，或被羧甲基衍生化，或被氨基取代后再被叶酸、多羧基分子衍生化而生成的化合物；涉及的叶酸-聚乙二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物结合的复合物包括，一端被多羧基衍生化的叶酸-聚乙二醇化合物与放射性核素99mTc和111In或Gd磁共振核素螯合而生成的复合物，或一端取代有氨基、醛基、羧基和巯基，或衍生有多羧基或磺酸基的叶酸-聚乙二醇类化合物与甲氨蝶呤、阿霉素等蒽环类抗生素、丝裂霉素C、6-巯基嘌呤等抗肿瘤药物共价结合而成的复合物。
本发明采用如下技术方案实现本发明和达到上述发明目的。1.制备叶酸-聚二醇类化合物将叶酸或叶酸衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质与不同分子量、不同种类的聚二醇类化合物，特别是PEG类化合物，缩合生成下式的叶酸-聚二醇类化合物，X-Y其中X代表叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质；Y代表聚二醇及其衍生物。
上述叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质，其对动物或人体细胞无明显毒副作用，它们包括叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、四氢喋呤、蝶酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸、8-去氮叶酸等。其中，某位“去氮”是指叶酸中该位氮原子被碳原子取代。
上述聚二醇及其衍生物是聚二醇末端，特别是PEG末端一个羟基被氨基、羧基、甲氧基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被叶酸、二乙三胺五醋酸(DTPA)、乙二胺四醋酸(EDTA)和羧甲基右旋糖酐衍生化而生成的化合物。
(1)分子两端羟基被氨基取代的聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)与叶酸(F)在碳二亚胺脱水剂和碱性催化剂作用下，一端氨基或两端与F中的羧基缩合生成F-PEG-NH2或F-PEG-F。
(2)F-PEG-NH2与DTPA酸酐缩合反应生成F-PEG-DTPA。
(3)F-PEG-NH2与羧甲基右旋糖酐(CMDx)在碳二亚胺脱水剂和碱性催化剂作用下，另一端氨基与CMDx缩合生成F-PEG-CMDx。
(4)分子一端羟基被氨基取代的单甲氧基聚乙二醇(NH2-PEG-OCH3)与F在碳二亚胺脱水剂和碱性催化剂作用下，氨基与F缩合生成F-PEG-OCH3。2.制备叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物叶酸-聚二醇类化合物，特别是叶酸-聚乙二醇类化合物与不同影像学核素或抗肿瘤药物，在一定条件下反应生成相应叶酸-聚乙二醇衍生物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其通式如下X-Y-Z其中X代表叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质；Y代表聚二醇及其衍生物；Z为影像学核素或抗肿瘤药物。
上述叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质，其对动物或人体细胞无明显毒副作用，它们包括叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、四氢蝶呤、蝶酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸、8-去氮叶酸等。其中，某位“去氮”是指叶酸中该位氮原子被碳原子取代。
上述聚二醇及其衍生物是聚二醇末端，特别是PEG末端一个羟基被氨基、羧基、醛基和巯基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被二乙三胺五醋酸(DTPA)、乙二胺四醋酸(EDTA)和羧甲基右旋糖酐衍生化而生成的化合物。
上述影像学核素是指可被叶酸-聚二醇类化合物，特别是可被叶酸-聚乙二醇类化合物螯合的放射性核素和磁共振核素。
上述抗肿瘤药物是指具有可与叶酸-聚二醇类化合物，特别是具有可与叶酸-聚乙二醇类化合物一端氨基、巯基、醛基、羧基和磺酸基共价结合的带有羧基、氨基或巯基的抗肿瘤药物。
(1)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx先与还原剂氯化亚锡在酸性条件下制备成水针剂或冻干粉针剂，再与新鲜的Na99mTcO4生理盐水淋洗液混合，室温条件下反应生成F-PEG-DTPA-99mTc或F-PEG-CMDx-99mTc复合物。
(2)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx与GdCl3在酸性和室温条件下反应，生成F-PEG-DTPA-Gd或F-PEG-CMDx-Gd复合物。
(3)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx与丝裂霉素C(MMC)在水溶性碳二亚胺、pH5.0-5.5条件下，室温反应生成F-PEG-DTPA-MMC或F-PEG-CMDx-MMC复合物。
(4)F-PEG-DTPA或F-PEG-CMDx与阿霉素(Dox)在碳二亚胺和碱性条件下，40℃反应生成F-PEG-DTPA-Dox或F-PEG-CMDx-Dox复合物。
(5)F-PEG-NH2与甲氨喋呤(MTX)在碳二亚胺和碱性条件下，40℃反应生成F-PEG-MTX复合物。3.叶酸-PEG类化合物对体外肿瘤细胞生长影响实验采用流式细胞仪检测一定浓度叶酸-PEG类化合物作用后的肿瘤细胞周期中各期DNA数量变化和凋亡百分率和叶酸-PEG类化合物对肿瘤细胞生长的影响。4.叶酸-PEG类化合物循叶酸受体途径导入肿瘤细胞的检测采用放射性配体结合分析法，测定叶酸-PEG类化合物竞争抑制125I-叶酸与肿瘤细胞膜表面叶酸受体结合程度，了解叶酸-PEG类化合物对肿瘤细胞膜表面叶酸受体的特异性亲和能力。
采用放射性同位素示踪法，检测不同时相肿瘤细胞内吞叶酸-PEG类化合物量的变化，证实叶酸-PEG类化合物循叶酸受体途径导入肿瘤细胞。5.叶酸-PEG类化合物在正常和模型动物体内的行为采用放射性同位素示踪法，检测不同时相内叶酸-PEG类化合物在正常小鼠、大鼠及荷瘤裸鼠的正常组织和肿瘤组织中的分布，了解其被动物正常组织摄取情况、药物动力学参数和对肿瘤组织的靶向性。6.叶酸-PEG类化合物对动物淋巴系统靶向性的检测采用放射性同位素示踪法，检测不同时相叶酸-PEG类化合物在正常大鼠的组织和淋巴结中的分布，结合SPECT仪对家兔全身动态显像观测，了解其对淋巴系统的靶向性及其排泄情况。
本发明叶酸-PEG类化合物及其与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物可采用药剂学上允许的赋形剂、粘合性、助悬剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、肠溶包衣材料、生物粘附材料、非水溶性骨架材料等辅料配伍，按照药学领域的常规或用特定的生产方法制备成相应药物组合物制剂。可采用叶酸-PEG类化合物与相关还原剂或pH调节剂以及相应的放射性核素或磁共振核素配伍，按药学领域的常规或用特定生产方法制备成相应药物组合物制剂。
所述药物组合物制剂包括肿瘤内、肿瘤旁、静脉或组织间隙注射用的叶酸-PEG类化合物及其影像学核素或抗肿瘤药物复合物的冻干粉针剂、水针剂、脂质体、纳米粒、胶束；口服用的叶酸-PEG类化合物及其抗肿瘤药物复合物的微球剂、肠溶胶囊等。
本发明所述的聚二醇类化合物，特别是聚乙二醇类化合物，其中PEG平均分子量范围为800-20,000。聚乙二醇类化合物与叶酸共价结合生成叶酸-PEG类化合物，选择PEG平均分子量为2000的叶酸-PEG类化合物作为模型药物进行如下试验。1.叶酸-PEG类化合物对肿瘤细胞周期的影响及凋亡的诱导作用流式细胞仪检测叶酸-PEG类化合物对人宫颈癌细胞HeLa229和人鼻咽癌细胞KB生长的影响程度，结果表明F-PEG-OCH3、F-PEG-DTPA、F-PEG-NH2、F-PEG-F诱导HeLa229细胞凋亡程度依次为43.14％、36.48％、14.37％和10.95％，诱导KB细胞凋亡程度依次为52.09％、32.76％、15.14％和3.81％。两株肿瘤细胞表现出类似的凋亡诱导效果，即F-PEG-OCH3最高，F-PEG-DTPA次之。2.叶酸-PEG-DTPA对肿瘤细胞表面叶酸受体竞争能力和内化程度F-PEG-DTPA与125I-F竞争HeLa229细胞表面叶酸受体的结果表明，F-LY2-DTPA具有与游离叶酸类似的竞争结合叶酸受体的特性。放射性同位素示踪的内化实验结果表明，KB细胞内化F-PEG-DTPA量随接触时间延长而逐渐增加，6h后KB细胞摄入量基本达到饱和。3.叶酸-PEG类化合物在正常和模型动物体内的行为特点正常动物体内组织分布和药动学的放射性同位素示踪结果表明大鼠体内2h时，F-PEG-DTPA主要分布于肾脏，总血浆清除半衰期为7.5min，其中t1/2(α)＝1.85min、t(1/2)β＝17.84min，血浆清除速度快；大鼠体内6h时，F-PEG-CMDx主要集中在肾脏和肺部，总血浆清除半衰期为37.44，其中t(1/2)α＝10.69、t(1/2)β＝107.8，血浆清除速度相对较慢。
荷瘤(SKOV3)裸鼠的肿瘤组织靶向性试验结果表明，F-PEG-DTPA和F-PEG-CMDx均表现出一定的肿瘤组织靶向性，且4h时均比游离叶酸靶向性好。荷瘤裸鼠尾静脉注射F-PEG-DTPA-99mTc后1、4和24h时，肿瘤与肌肉比分别为2.97、3.68和3.59倍；注射F-PEG-CMDx-99mTc后4和24h时，肿瘤与肌肉比分别为2.09和5.64倍；注射99mTc-F后4和24h时，肿瘤与肌肉比分别为1.45和3.62倍。4.叶酸-PEG-DTPA对动物淋巴系统靶向程度放射性同位素示踪的淋巴系统靶向试验结果表明大鼠和家兔趾间间隙注射F-PEG-DTPA-99mTc后，2h时大鼠淋巴结与血、肝、肾和肌肉比值分别为25.86、31.78、1.13和33.10，给药后家兔淋巴系统靶向显著而又迅速，进入血循环后，肝中摄取量少，肾脏为主要分布器官，并经其通过膀胱快速排泄，淋巴结影像逐渐淡化。提示F-PEG-DTPA具有良好的淋巴系统靶向性，且正常淋巴结无明显蓄积现象。
经上述实验结果证实，本发明有如下特点叶酸-PEG类化合物可循细胞膜上叶酸受体途径选择性地蓄积于过度表达叶酸受体的肿瘤细胞，具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用；叶酸-PEG-DTPA血浆清除速度快，但在组织间隙给药后，淋巴系统靶向性好，结合其肿瘤靶向性，可作为靶向载体分别与影像学核素和抗肿瘤药物结合成药物复合物，应用于淋巴系统原发性或转移性肿瘤靶向诊断和治疗。
在波长为366nm处测定0.5mmol/l的F-PEG-NH2氢氧化钠溶液的吸收度，A值为4.4630，由叶酸标准曲线可得，0.5mmol/l F-PEG-NH2中叶酸的摩尔浓度为0.4980mmol/l。
即F-PEG-NH2中氨基与叶酸摩尔比(0.4975/0.4980)近似为1。6.叶酸-PEG类化合物的检测将上述方法制备得到的叶酸-PEG类化合物，用HPLC法对其纯度进行定量分析，用紫外、红外、核磁共振对其结构进行鉴别，其结果分别如下HPLC法检测纯度结果将纯化后的F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3的HPLC检测图谱，采用面积归一法测得纯度分别为100％、99.18％、98.97％、97.67％和100％。紫外扫描图谱由紫外可见光谱扫描图谱显示，F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3在283和365nm波长处均有与叶酸相同的吸收峰。红外图谱将F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3红外图谱与叶酸比较，上述叶酸-PEG类化合物图谱中均有叶酸所含基团特征峰，如1693cm-1处的酰胺基特征峰，1600cm-1附近的羰基特征峰；同时也具有PEG所含基团的特征峰，如1100cm-1附近的脂肪醚特征峰。核磁共振图谱将F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx、F-PEG-OCH3的HNMR图谱与叶酸、NH2-PEG-NH2、CH3O-PEG-NH2、DTPA、CMDx比较，均有与叶酸相似的位移峰δ8.67(s，1H，C7-H)、7.66(d，2H，Ar)、6.63(d，2H，Ar)、4.34(dd，C19-H)、2.0-2.4(m，2H，C21-H2)，还有与PEG相似的位移峰δ3.1-4.0(m，-OCH2CH2)；F-PEG-OCH3有与CH3O-PEG-NH2相似的位移峰δ3.36(s，-OCH3)；F-PEG-DTPA有与DTPA相似的位移峰δ3.29(t，C5，C7-2H)、3.42(t，C4，C8-2H)；F-PEG-CMDx有与CMDx在δ3.4-4.5处相似的位移多峰。实施例2 制备叶酸-PEG类化合物与99mTc的复合物1.制备叶酸-PEG-DTPA-99mTc取10mg F-PEG-DTPA加1ml pH 7.4的PBS(0.01mol/l)溶解后，加入10μl浓度为10μg/μl氯化亚锡的0.15N盐酸溶液后，再加入1-2ml新鲜Na99mTcO4溶液(1-5mCi)，混匀，室温下放置10min，即得F-PEG-DTPA-99mTc注射液。用Sephadex G-15柱，以pH 7.4的0.01MPBS为流动相洗脱，对其进行纯化，收集黄色区带洗脱液，以纸层析法检测其放射化学纯度(固定相为新华滤纸，展开剂为85％乙醇水溶液，展开后在γ计数器上测定各区段放射性计数，计算F-PEG-DTPA-99mTc放射性计数占总放射性计数的百分数)。F-PEG-DTPA-99mTc放射化学纯度＞95％。2.制备叶酸-PEG-CMDx-99mTc取10mg F-PEG-CMDx同上方法反应和纯化，得F-PEG-CMDx-99mTc注射液，其放射化学纯度＞95％。实施例3 制备叶酸-PEG类化合物与Gd的复合物取F-PEG-DTPA 100mg溶解于6ml注射用水，加1.5ml 50mmol/lGdCl3的0.1N HCl溶液，室温搅拌反应24h，反应液用Sephadex G-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，收集具有叶酸特征吸收波长段的流分，冷冻干燥，得黄色的F-PEG-DTPA-Gd固体184mg，再加注射用水4.2ml，按每瓶1ml分装后冻干。实施例4 制备叶酸-PEG类化合物与抗肿瘤药物的复合物1.制备叶酸-PEG-DTPA-丝裂霉素C取F-PEG-DTPA 83mg溶解于10ml注射用水，加丝裂霉素C(MMC)15mg溶解后，在搅拌下加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)83mg，维持pH 5.0-5.5之间室温搅拌反应24h。在4℃条件下，反应液对注射用水透析24h后，依次用DEAE Sepharose FF离子交换柱和Sephadex G-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，收集同时具有MMC和叶酸特征吸收波长段的流分，冷冻干燥，得黄中略带紫色的F-PEG-DTPA-MMC固体61mg。2.制备叶酸-PEG-DTPA-阿霉素取F-PEG-DTPA 83mg溶解于5ml DMSO，在搅拌下加DCC 18mg，在40℃条件下活化30min，加阿霉素(Dox)20mg和三乙胺10μl，搅拌反应24h，加20ml蒸馏水终止反应，室温下4000r/min离心，取上清液，依次用DEAE Sepharose FF离子交换柱和Sephadex G-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，收集同时具有Dox和叶酸特征吸收波长段的流分，冷冻干燥，得橙红色F-PEG-DTPA-Dox固体67mg。3.制备叶酸-PEG-DTPA-甲氨喋呤取甲氨喋呤(MTX)22mg溶解于5ml DMSO，在搅拌下加DCC20mg，在40℃条件下活化30min，F-PEG-NH260mg和吡啶10μl，搅拌反应24h，加20ml蒸馏水终止反应，室温下4000r/min离心，取上清液，依次用DEAE Sepharose FF离子交换柱和Sephadex G-15柱结合AKTA explorer快速纯化系统进行分离纯化，收集同时具有MTX和叶酸特征吸收波长段的流分，冷冻干燥，得黄色F-PEG-MTX固体46mg。实施例5 叶酸-PEG类化合物对体外人癌细胞周期DNA和凋亡的影响用含10％小牛血清(BCS)的无叶酸RPMI1640培养液，在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO2、饱和湿度)连续HeLa229、KB细胞进行培养至足够量。将一定数量细胞分装后继续培养一天使之贴壁，分别加入F-PEG类化合物，使最终浓度为10μg/ml，连续培养72h两次。用0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化并分散HeLa229、KB细胞，制成单细胞悬液，离心，弃去上清液，重新悬浮于PBS中，调整细胞浓度至106cell/ml。将等体积的细胞悬液和碘化丙啶染色液混合，4℃放置20-30min，300目尼龙膜过滤后，用流式细胞仪在488nm激发波长处检测，考察F-PEG-NH2、F-PEG-F、F-PEG-DTPA、F-PEG-OCH3对HeLa229、KB细胞周期各期DNA量变化及其凋亡的影响。结果表明，F-PEG类化合物有明显的诱导肿瘤细胞凋亡作用，其诱导凋亡程度依次为F-LY2-OMe＞F-LY2-DTPA＞F-LY2-NH2＞LY2-F2(HeLa229细胞)；F-LY2-Ome＞F-LY2-DTPA＞LY2-F2＞F-LY2-NH2(KB细胞)。表1是叶酸(F)-PEG类叶酸化合物对Hela229及KB细胞的凋亡影响。表1DNA含量 凋亡率细胞类型 实验组G0-G1 G2-M S (％)KB 对照 91.82 6.41 1.77 1.02PEG-F2 64.77 6.12 29.10 15.14F-PEG-OCH370.20 28.13 1.67 52.09F-PEG-NH264.72 1.61 33.67 3.81F-PEG-DTPA 82.03 4.60 13.37 32.76对照 96.81 0.00 5.96 5.96HeLa229PEG-F2 59.42 0.41 40.16 10.95F-PEG-OCH388.99 0.06 10.95 43.14F-PEG-NH265.42 0.35 34.23 14.37F-PEG-DTPA 94.63 4.99 0.38 36.48实施例6 叶酸-PEG-DTPA与叶酸受体结合特性的评价1.叶酸-PEG-DTPA-99mTc对HeLa 229叶酸受体的竞争结合试验HeLa229细胞用含10％小牛血清(BCS)的无叶酸RPMI1640培养液，在二氧化碳培养箱内(37℃、5％CO2、饱和湿度)连续培养至足够量后，制备成约含2.2×105cells/ml的细胞悬液。将此细胞悬液中加入50μl125I-F与不同浓度F-PEG-DTPA或不同浓度叶酸，在pH 7.4的0.01mol/l磷酸盐缓冲液中，4℃反应20h后，4000r/min离心10min，弃去上清液，用γ计数器测量沉淀物(细胞结合物)放射性计数(CPM)。分别以细胞结合的放射性计数对叶酸、F-PEG-DTPA浓度作图，得HeLa229细胞结合125I-F的抑制曲线。结果表明，F-PEG-DTPA和F竞争抑制125I-F与肿瘤细胞表面叶酸受体结合的特征相似，但F-PEG-DTPA与125I-F竞争叶酸受体能力弱于F，两者抑制肿瘤细胞结合125I-F 50％时的浓度分别为11.2和1.58fmol2.KB细胞内化摄取叶酸-PEG-DTPA试验取对数生长期KB细胞，通过常规方法消化，制成单细胞悬液，将其接种于四块12孔板中，每孔2ml(每孔细胞数为6.25×104cells)。四天后将板中培养液更换成不含血清的无叶酸1640培养液，每孔2ml(洗涤，1ml×2次)。次日换培养液，每孔1ml不含血清的无叶酸1640培养液，后续处理按以下步骤操作。
非特异结合管(NBS)中先加F-PEG-DTPA溶液混匀，然后分别在非特异结合管、特异结合管和内化管中各加入100μlF-PEG-DTPA-99mTc，吸取不同时相孔内上清液。非特异结合管和特异结合管分别用pH 7.4的0.01M PBS洗涤(1ml×2次)后，0.25％胰蛋白酶消化5min，用力吹打贴壁细胞，吸出加入至测量管；内化管加pH 3的醋酸溶液，使结合在细胞表面叶酸受体的配体解离后，再按特异结合管处理方法操作。用γ计数器分别测定处理后的非特异结合管、特异结合管和内化管中放射性计数。结果提示，KB细胞内吞摄取F-PEG-DTPA量随接触时间延长而逐渐增加，6h后KB细胞摄入量基本达到饱和。实施例7 叶酸-PEG类化合物的动物体内行为试验1.叶酸-PEG-DTPA在正常大鼠体内血液动力学及其分布大鼠股静脉注射0.1ml浓度约为10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc，分别于注射后不同时相尾静脉取血50μl，在γ计数器上测定放射性计数(CPM)。应用MicroMath PKAnalyst Statistics Software按二室模型处理，药动学参数为t1/2(E)＝7.5min，t1/2(α)＝1.85min，t1/2(β)＝17.84min。结果表明，F-PEG-DTPA血液清除速度较快。
大鼠尾静脉注射0.1ml浓度约为10mg/ml的F-DTPA-PEG-99mTc，于2h后断头处死，取血、心、肝、脾、肾、肺、大肠、小肠、胃、肌肉，称量，在γ计数器上分别测定放射性计数(CPM)。计算每克组织的放射性计数占总注射量放射性计数的百分数(％ID/g)。结果提示，F-DTPA-PEG-99mTc在2h时主要分布在大鼠肾脏，而在肝脏等其它脏器中的量远小于肾。2.叶酸-PEG-CMDx在正常大鼠体内血液动力学及其分布大鼠6只，分为两组，每只股静脉分别注射0.1ml浓度约为5mg/ml的F-PEG-CMDx-99mTc或99mTc-CMDx，于注射后不同时相尾静脉各取血50μl，在γ计数器上测定放射性计数(CPM)。应用MicroMath PKAnalystStatistics Software按二室模型处理，F-PEG-CMDx和CMDx的药动学参数分别为t1/2(E)＝37.44min，t1/2(α)＝10.69min，t1/2(β)＝107.8min和t1/2(E)＝53.57min，t1/2(α)＝22.71min，t1/2(β)＝202.3min。结果提示，F-PEG化缩短了CMDx在血液中滞留时间，而F-PEG被CMDx衍生化则延长了F-PEG类化合物的血循环时间。注射6h后断头处死，取心、肺、肝、脾、肾，称量，在γ计数器上分别测定放射性计数(CPM)。计算每克组织的放射性计数占总注射量放射性计数的百分数(％ID/g)。结果表明，给药6h后，F-PEG-CMDx和CMDx均在肝中的分布较少，主要集中在肾和肺，但前者在组织中摄取量明显低于后者。表2是大鼠股静脉注射6h后F-PEG-CMDx-99m和99mTc-CMDx的组织分布。
表2％ID/g组 织F-PEG-CMDx-99mTc99mTc-CMDx心0.31±0.040.30±0.06肝0.46±0.040.75±0.05肺2.55±0.184.22±0.78脾0.58±0.282.16±0.19肾9.88±6.2412.49±5.723.叶酸-PEG-DTPA在荷瘤动物体内组织分布荷瘤(SKOV3)裸鼠10只，用低叶酸饲料喂养三天后，分成三组，除F-PEG-DTPA-99mTc组设1个时相外，F-PEG-CMDx-99mTc、99mTc-F均为2个时相。尾静脉分别注射0.1ml浓度10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc、F-PEG-CMDx-99mTc、99mTc-F后，F-PEG-DTPA-99mTc组于4h、后二组分别于4和24h处死，取血、心、肝、脾、肾、肺、大肠、小肠、胃、肌肉、肿瘤，称量，在γ计数器上分别测定放射性计数(CPM)。计算每克组织放射性计数占总注射量放射性计数的百分数(％ID/g)。
另取(SKOV3)荷瘤裸鼠14只，用低叶酸饲料喂养三天后，分成3个时相组(4、5、5只)，尾静脉分别注射0.1ml浓度为7mg/ml的叶酸-PEG-DTPA-99mTc99mTc-DTPA-LY2-F后，于1、4、24h分别断头处死，后续操作同上。计算每克组织放射性计数占总注射量放射性计数的百分数(％ID/g)。
结果表明，静脉注射1、4和24h后，F-PEG-DTPA在肿瘤组织中分布量比肌肉分别高2.97、3.68和3.59倍；静脉注射4和24h后，F-PEG-CMDx在肿瘤组织中分布量比肌肉分别高2.09和5.64倍；静脉注射4和24h后，叶酸在肿瘤组织中分布量比肌肉分别高1.45和3.62。提示F-PEG-DTPA、F-PEG-CMDx具有一定的肿瘤组织靶向性，且在给药后的4h内均比游离叶酸靶向性好。实施例8 F-PEG-DTPA淋巴系统靶向性试验1.F-PEG-DTPA对大鼠淋巴结靶向试验大鼠两后肢趾间间隙各注射一点，每点60μl浓度约为10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc，于注射后2h断头处死，取血、心、肝、脾、肾、肺、大肠、小肠、胃、肌肉、国淋巴结，称量，在γ计数器上分别测定放射性计数(CPM)。计算每克组织放射性计数占总注射量放射性计数的百分数(％ID/g)。结果表明，F-PEG-DTPA在淋巴结中的量远高于血、心、脾、肺、肝、大肠、小肠、胃，与肾脏中的量相当，提示F-PEG-DTPA具有较好的淋巴靶向性。2.F-PEG-DTPA对家兔淋巴系统靶向试验家兔两后肢趾间间隙各注射一点，每点0.1ml浓度为10mg/ml的F-PEG-DTPA-99mTc，分别于注射后5、15和120min在SPECT仪下进行全身显像观察并摄片记录。动态图象结果表明，F-PEG-DTPA在组织间隙靶向淋巴系统迅速而显著，整个下肢淋巴系统导入在5min内完成，除肾脏和膀胱外，2h内其它脏器或组织均未见明显蓄积，但包括淋巴结在内的淋巴系统摄取F-PEG-DTPA量随时间延长而显著递减。此外，家兔膀胱中蓄积量随时间增加，肾脏中蓄积量随时间减少，提示肾脏可能仅是F-PEG-DTPA排泄途径。
权利要求
1.一种叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于其具有以下通式，X-Y其中X为叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质；Y为具有-O(CH2)nO-或-(CH2)n’O(CH2)n’-重复结构的聚二醇及其衍生物，其中n≥2或n’≥1。
2.按权利要求1所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质是叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、四氢蝶呤、喋酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸和8-去氮叶酸。
3.按权利要求1所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物的聚二醇类化合物是聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量为800-20,000。
4.按权利要求3所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸-聚乙二醇衍生物的聚乙二醇末端一个羟基被氨基取代后再被叶酸衍生化，另一端羟基被甲氧基、氨基、羧基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被叶酸、二乙三胺五醋酸、乙二胺四醋酸和羧甲基右旋糖酐衍生化。
5.按权利要求4所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸-聚乙二醇衍生物的聚乙二醇末端一个羟基被氨基取代后再被叶酸衍生化，另一端羟基被甲氧基取代，或被羧甲基衍生化，或被氨基取代后再被叶酸、二乙三胺五醋酸或羧甲基右旋糖酐衍生化。
6.按权利要求5所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸-聚乙二醇衍生物的聚乙二醇平均分子量为2,000-20,000。
7.按权利要求6所述的叶酸-聚二醇类化合物，其特征在于所述的叶酸-聚乙二醇衍生物中的聚乙二醇平均分子量为2,000。
8.叶酸-聚二醇类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种用于抗肿瘤的药物组合物，其特征在于由权利要求5的叶酸-聚二醇类化合物与药用辅料混合制成，其制剂为小针剂、冻干粉针剂、微球剂、纳米粒和肠溶胶囊剂。
10.按权利要求9所述的用于抗肿瘤的药物组合物，其特征在于所述药物辅料是药剂学上允许的赋形剂、粘合剂、助悬剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、肠溶包衣材料、生物粘附材料和非水溶性骨架材料。
11.一种叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于具有以下通式X-Y-Z其中X为叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质；Y为具有-O(CH2)nO-或-(CH2)n’O(CH2)n’-重复结构的聚二醇及其衍生物，其中n≥2或n’≥1；Z为影像学核素或抗肿瘤药物。
12.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质与权利要求2相同。
13.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物中聚二醇类化合物是聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量为800-20,000。
14.按权利要求13所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物是聚乙二醇末端一个羟基被氨基取代后再被叶酸衍生化，另一端羟基被氨基、醛基、羧基和巯基取代，或被羧甲基和磺酸基衍生化，或被氨基取代后再被二乙三胺五醋酸、乙二胺四醋酸和羧甲基右旋糖酐衍生化。
15.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素的复合物，其特征在于所述影像学核素是可被叶酸-聚二醇类化合物螯合的放射性核素和磁共振核素。
16.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述抗肿瘤药物是具有可与叶酸-聚二醇类化合物一端氨基、巯基、醛基、羧基和磺酸基共价结合的带有羧基、氨基、巯基的抗肿瘤药物。
17.按权利要求13所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物中的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量为2,000-10,000。
18.按权利要求17所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物中的聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇平均分子量为2,000。
19.按权利要求14所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素或抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述的叶酸-聚二醇类化合物，其中聚乙二醇末端一个羟基被氨基取代后再被叶酸衍生化，另一端羟基被氨基取代，或被羧甲基衍生化，或被氨基取代后再被二乙三胺五醋酸或羧甲基右旋糖酐衍生化。
20.按权利要求15所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素的复合物，其特征在于所述放射性核素是99mTc和111In，所述磁共振核素是Gd。
21.按权利要求16所述的叶酸-聚二醇类化合物与抗肿瘤药物的复合物，其特征在于所述抗肿瘤药物是甲氨喋呤、阿霉素等蒽环类抗生素和丝裂霉素。
22.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素的复合物在制备肿瘤诊断药物中的用途。
23.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与影像学核素的复合物在制备淋巴系统原发性或转移性肿瘤诊断药物中的用途。
24.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与抗肿瘤药物的复合物在制备肿瘤靶向治疗药物中的用途。
25.按权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与抗肿瘤药物的复合物在制备淋巴系统原发性或转移性肿瘤治疗药物中的用途。
26.一种用于肿瘤靶向治疗的药物组合物，其特征在于由权利要求11所述的叶酸-聚二醇类化合物与抗肿瘤药物的复合物和药用辅料混合制成，其制剂为小针剂、冻干粉针剂、微球剂、纳米粒和肠溶胶囊剂。
27.按权利要求26所述的用于肿瘤靶向治疗的药物组合物，其特征在于所述药物辅料是药剂学上允许的赋形剂、粘合剂、助悬剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、肠溶包衣材料、生物粘附材料和非水溶性骨架材料。
全文摘要
本发明属化学药物领域，涉及叶酸－聚二醇类特别是叶酸－聚乙二醇类化合物及以该化合物与影像学核素或抗肿瘤药物结合的复合物，及其在肿瘤靶向诊断和治疗中的应用。本发明的实验结果表明，小分子量的叶酸－PEG类化合物能在组织间隙不透过毛细血管而导入淋巴系统，并具有竞争叶酸受体的特征和肿瘤组织靶向性。本发明叶酸－聚二醇类化合物及以该化合物与影像学核素或抗肿瘤药物结合的复合物可制备肿瘤诊断药物和抗肿瘤药物，为临床提供肿瘤靶向诊断和治疗，特别是淋巴系统原发性或转移性肿瘤靶向诊断与治疗的物质基础。
文档编号A61K49/00GK1472235SQ0312956
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月26日 优先权日2003年6月26日
发明者陆伟跃, 徐雯, 韩慧兰, 刘敏, 谢操, 潘俊, 钟高仁, 陈绍亮, 姚明 申请人:上海复康医药科技发展有限公司, 复旦大学
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