球形氨基酸吸附剂及其制备方法
专利名称：球形氨基酸吸附剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医用吸附材料，特别是一种球形氨基酸吸附剂及其制备方法，应用于血液灌流治疗疑难疾病。将多种氨基酸分别以化学键连方式固定到球形天然高分子载体上，成为带有氨基酸配基的医用吸附剂，可用于血液灌流疗法治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、及内毒素血症和感染性休克等疾病。
肿瘤坏死因子α(TNFα)是内毒素休克致病机理中最重要的炎症介质，是内毒素血症和脓毒症中介导组织损伤的主要介质之一，感染死亡率较高。利用吸附剂从血液或血浆中选择性吸附清除TNFα，是近年来发展起来的新型治疗方法。Howard Levy等[ASAIOJ.1998，44659-665]应用活性炭和活性炭联合二氧化硅吸附剂血液净化系统共治疗8例病人，结果表明所有的病人均有症状的改善，血浆细胞因子水平在治疗过程中稳定或降低。多器官衰竭明显好转，2例病人存活时间超过28天，2例超过14天。龙海波等[中华肾脏病杂志1998，14(4)225-228；中国危重病急救医学1999，11(8)477-480]研究免疫吸附剂特异性清除循环TNFα对内毒素休克兔心脏损害的影响，结果表明经免疫吸附治疗后动物低血压状态明显改善，血浆TNFα水平迅速下降，延缓和显著减轻了肝肾功能损害及心肌、细胞膜和溶酶体损伤的发生，实验动物存活率明显提高。
血液灌流治疗是一种非药物疗法，这种疗法是基于病人血液通过含有能与血液中有害成分发生吸附作用的吸附柱过滤而达到治疗目的的。Jones，Frank R(EP 0 272 792A1，1987)对这种方法曾做过详细说明。治疗类风湿关节炎的血液灌流疗法始于二十世纪八十年代初期，日本学者Yamazaki等(Biomater Artif Cells Artif Organs1989；17(2)117-24)研制成功聚乙烯醇凝胶-色氨酸免疫吸附剂(IM-TR)和聚乙烯醇凝胶-苯丙氨酸免疫吸附剂(TM-PH)，并将IM-TR用于临床治疗类风湿关节炎，治疗后患者关节疼痛减轻，类风湿因子(RF)也有不同程度的降低，取得了较好的疗效。1990年，Kold用戊二醛溶液对IgG进行化学交联，合成IgG聚合体。体外吸附实验表明，该聚合体对RF的清除率高达94％。由于形成的聚合物过于细小，该吸附剂不适于临床应用。1997年，Ramlow报导了以琼脂糖凝胶为载体，化学键连蛋白A制备RA免疫吸附剂的研究及其临床应用。目前临床上使用较多的是将蛋白A共价键连到硅胶球上，制成RA免疫吸附剂，通过血浆灌流吸附清除类风湿因子。
美国的Terman DS等[Lancet，1979，2(8147)824-7]，首次使用活性炭为载体材料，采用火棉胶包膜固定DNA，得到的DNA免疫吸附剂用于血液灌流治疗一名重度SLE患者，使患者生命延长了31天。俞耀庭等[美国专利US 6,262,172 B1，中国专利CN1111430C]曾在临床上采用炭化树脂或纤维素为载体的DNA免疫吸附剂治疗或缓解系统性红斑狼疮病人的病情，取得了较好的疗效。Nagasawa采用葡聚糖凝胶共价键连DNA，制备得到化学键连的免疫吸附剂(Journal of Applied Biochemistry，1985，7296-302)。
文献中曾报道采用琼脂糖偶联蛋白A或聚乙烯醇偶联色氨酸作为吸附剂治疗重症肌无力患者，治疗后临床症状即有明显改善[J.Neuroimmunology，1989，22123-127；J.Neuro Neurosur.Psychia，1994，57578-581；Trans.Prac.，1999，39682-687]。
血液灌流的关键技术之一是吸附剂的制备，吸附剂的载体是吸附器件的重要原材料，配基则决定着吸附剂的性能。目前临床上普遍使用的血液灌流吸附剂是以硅胶为载体、以蛋白A为配基的合成树脂。作为配基的蛋白A，其价格较为昂贵，使得吸附剂的制作成本较高；同时这类吸附剂的血液相容性较差，在使用中必须首先将病人的血液进行血浆分离后才能进行吸附灌流的治疗。这就造成目前临床上血液灌流治疗费用较高，尽管其具有明确的疗效但却不能为大多数患者所接受。
本发明是以天然高分子为载体，粒度0.45-0.9mm，经环氧氯丙烷活化后固定有效量的氨基酸配基的树脂构成，其中，氨基酸含量为12.5-39.7μmol/ml树脂。
所述的天然高分子载体是球形纤维素、琼脂、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、阿拉伯胶、明胶或淀粉。
所述的载体是球形纤维素。
所述的配基为氨基酸、聚氨基酸、多肽或蛋白质；所述的氨基酸是精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、丝氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸或组氨酸；所述的聚氨基酸是聚赖氨酸；所述的多肽是2-14个氨基酸的肽；所述的蛋白质是IgG或热聚IgG。
所述的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸或赖氨酸。
球形氨基酸吸附剂的制备方法是经过下述步骤合成的1)制备纤维素载体的球形氨基酸吸附剂(1)精制棉或脱脂棉在室温下用10-20％氢氧化钠水溶液碱化1-2小时以后，除去碱液，于25-80℃条件下密封放置老化24-72h。
(2)在上述碱化棉中加入二硫化碳，25℃震荡反应5-10h得到橙色粘胶液，根据碱化棉花的重量用3-6％NaOH稀释上述粘胶液至6％-15％，室温下放置备用。
(3)以氯苯和油酸钾，或/和四氯化碳为分散介质，向其中加入粘胶液，升温至80-95℃，保温1-3h，倾出有机溶剂，洗涤合成的球形纤维素载体；收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。
(4)将载体置于0.5-5M NaOH溶液中，加入环氧氯丙烷，于25-60℃条件下反应1-4小时，得到活化后的球形纤维素载体，环氧基含量达61.7μmol/ml。
(5)氨基酸配基的偶联环氧氯丙烷活化的球形纤维素载体与氨基酸在pH大于8的介质中，于25-80℃条件下反应5-24小时。水洗后，加入两倍体积的1M乙醇胺溶液在室温下反应1-3h以封闭残留的环氧基，得到球形纤维素载体成品吸附剂，氨基酸含量达39.7μmol/ml。氨基酸吸附剂经过淋洗、灭菌、包装等处理后可直接用于临床。
2)制备琼脂、琼脂糖、明胶载体的球形氨基酸吸附剂(1)将琼脂、琼脂糖或明胶加入到水中，加热至60-90℃使之溶解，将此溶液转移至由甲苯、三氯甲烷和吐温80，或液体石蜡和司班80组成的分散相中，搅拌0.5小时以上至液滴分散均匀后，冷却至室温，倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。
(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。
3)制备葡聚糖或淀粉载体的球形氨基酸吸附剂(1)在葡聚糖或淀粉的水溶液中加入环氧氯丙烷，以液体石蜡和司班80为分散相，碱性条件下于25-40℃反应6-16小时。倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。
(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。
4)制备壳聚糖或阿拉伯胶载体的球形氨基酸吸附剂(1)在壳聚糖的酸性水溶液或阿拉伯胶的水溶液中加入甲醛或戊二醛，以液体石蜡和司班80为分散相，25-60℃反应2-24小时。倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。
(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。
所述的二硫化碳与棉花的体积/质量比是1-2∶3。
所述的分散介质与粘胶液的体积/质量比是3-5∶1。
所述的活化载体的环氧氯丙烷的加入量为0.5-5ml/g载体；所述的氨基酸加入量为0.001g-1g/g。
所述的天然高分子为载体的氨基酸吸附剂的应用，它可用于临床上血液灌流疗法治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、内毒素血症及感染性休克等疾病。
本发明以球形纤维素、琼脂、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、阿拉伯胶、明胶及淀粉等天然高分子为载体，经环氧氯丙烷活化后，固定氨基酸配基，得到可用于血液灌流的吸附剂。球形纤维素载体固定化苯丙氨酸吸附剂对类风湿因子的吸附量为116.1IU/ml，对重症肌无力患者血液中乙酰胆碱受体抗体的吸附率为16.6％；球形纤维素载体固定化色氨酸吸附剂对类风湿因子的吸附量为122.4IU/ml，对重症肌无力患者血液中乙酰胆碱受体抗体的吸附率为44.8％；球形纤维素载体固定化赖氨酸吸附剂对内毒素的吸附量为1.67EU/ml；球形琼脂载体固定化苯丙氨酸吸附剂对类风湿因子的吸附量为183.8IU/g；球形琼脂载体固定化苯丙氨酸吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为13.0％；球形琼脂载体固定化色氨酸吸附剂对类风湿因子的吸附量为155.0IU/g；球形琼脂载体固定化色氨酸吸附剂对重症肌无力患者血液中乙酰胆碱受体抗体的吸附率为34.5％。
本发明使用天然高分子材料作为吸附剂的载体，具有良好的生物相容性，在使用中无需进行血浆分离，可采用全血灌流方式，大大降低了治疗成本；而氨基酸作为一类廉价的配基不仅使吸附剂具有较好的吸附性能，同时在实际应用中不会产生因配基泄漏带来的危害，具有极高的安全性。本发明涉及的多种氨基酸吸附剂可以以同种天然高分子为载体，偶联不同的氨基酸，使得吸附剂的生产过程简单易行，生产成本低廉；不同的吸附剂对特定疾病的治疗又具备特异性的特点。可以获得更高的经济效益和社会效益。
本发明得到的固定化氨基酸生物医用吸附剂可直接用于全血灌流法治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、内毒素血症及感染性休克，通过清除患者体内有毒物质达到治疗目的。动物实验表明，此类吸附剂无毒副作用，无热源，是一种良好的医用血液净化吸附材料。吸附剂的制备简单，成本低廉，易于推广应用。
本发明突出的实质性特点和显著进步，可通过下述实施例予以证明，但它们不是对本发明作任何限制。
(a)纤维素载体的制备精制棉10g在室温下用19％氢氧化钠水溶液碱化棉花两小时以上，除去碱液后，于28℃密封放置老化三天。
加入6g CS2，于25℃震荡反应10h得到橙色粘胶液。加入6％NaOH使上述粘胶液的重量达到100g，备用。
以氯苯300ml和油酸钾1.2g为分散介质，向其中加入粘胶液，采用悬浮聚合法合成球形纤维素。升温至80℃，保温3h，之后，倾出有机溶剂，洗涤合成的载体。收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。产率大于80％。
(b)纤维素载体的活化将载体置于3M NaOH溶液中，加入环氧氯丙烷，于40℃条件下反应2小时，得到活化后的纤维素载体。环氧值采用酸碱滴定法测得，环氧值为54.7μmol/ml。
(c)氨基酸配基的固定化环氧氯丙烷活化的球形载体与氨基酸的碱性溶液在50℃条件下反应15h。之后，加入150ml乙醇胺溶液在室温下反应2h。采用茚三酮法测定氨基酸的固定量，苯丙氨酸的固定量为35.5μmol/ml。
(d)吸附剂对类风湿患者血清中类风湿因子的吸附在3ml带塞离心管中，加入0.5ml吸附剂和1.0ml类风湿患者血清，于恒温摇床中37℃振荡吸附2h。酶联免疫法分别测定吸附前后血清中类风湿因子的浓度(试剂盒为上海德波生物技术有限公司产品)，计算吸附量。
按照上述步骤合成的球形纤维素载体固定化苯丙氨酸吸附剂对类风湿因子的吸附量为116.1IU/ml。
实施例2.按照实施例1进行色胺酸的固定量为36.4μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为122.4IU/ml。
实施例3.按照实施例1进行亮胺酸的固定量为30.6μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为61.0IU/ml。
实施例4.按照实施例1进行谷胺酸的固定量为34.5μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为36.0IU/ml。
实施例5.按照实施例1进行丝胺酸的固定量为33.6μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为23.4IU/ml。
实施例6.按照实施例1进行酪胺酸的固定量为35.1μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为17.4IU/ml。
实施例7.按照实施例1进行赖胺酸的固定量为39.1μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为16.0IU/ml。
实施例8.按照实施例1进行精胺酸的固定量为39.7μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为10.4IU/ml。
实施例9.
(a)纤维素载体的制备精制棉10g在室温下用19％氢氧化钠水溶液碱化漂白的棉花两小时，除去碱液后于25℃密封放置老化三天。
加入5ml CS2，于28℃反应5h得到橙色粘胶液。加入6％NaOH使上述粘胶液的重量达到120g，搅拌均匀，28℃反应5h，放置备用。
以氯苯360ml、油酸钾0.7g和四氯化碳60ml为分散介质，向其中加入粘胶液，采用悬浮聚合法合成球形纤维素。升温至90℃，保温2h，倾出有机溶剂，洗涤合成的载体。收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。产率大于80％。
(b)纤维素载体的活化将10g载体置于1M NaOH溶液中，加入环氧氯丙烷10ml，于25℃条件下反应2小时，得到活化后的纤维素载体。
(c)氨基酸配基的固定化环氧氯丙烷活化的球形载体与氨基酸的碱性溶液在37℃条件下反应18h。之后，加入乙醇胺溶液20ml在室温下反应6h。
(d)吸附剂对重症肌无力病人血液中乙酰胆碱受体的吸附在3ml带塞离心管中，加入0.5g吸附剂和1.5ml重症肌无力病人血清，于恒温摇床中37℃振荡吸附2h。ELISA法测定吸附前后血清中重症肌无力抗体的浓度，计算吸附量。
按照上述步骤合成的球形纤维素载体固定化苯丙氨酸吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为16.6％。
实施例10.按照实施例9进行色胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为44.8％。
实施例11.按照实施例9进行酪胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为13.1％。
实施例12.按照实施例9进行半胱胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为19.5％。
实施例13.按照实施例9进行赖胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为15.4％。
实施例14.按照实施例9进行谷胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为14.4％。
实施例15.取30克优质精制棉，加入300ml 15％NaOH水溶液，室温下浸泡碱化2小时，除去碱液，室温下密闭放置老化2天。在装有碱化棉的锥形瓶中加入15ml CS2，于25℃反应5小时，得到深红色粘胶液。加入350ml 5％NaOH溶液稀释纤维素粘胶液。在2000ml三口瓶中，加入氯苯800g，四氯化碳200g，油酸钾2g。将300g粘胶液加入到三口瓶中，室温搅拌30分钟后升温至90℃，保温2.5小时。倾到出上层有机溶剂，依次用水、乙醇和水洗涤至无分散剂，标准筛筛选出粒度0.45-0.9mm的树脂备用，约250ml。
在25ml锥形瓶中加入1.0ml球状纤维素树脂，3.0ml 1.25mol/L NaOH溶液和1.0ml环氧氯丙烷，30℃反应2小时，用水洗涤至中性。活化的树脂环氧基含量在92.6μmol/ml。
在25ml锥形瓶中加入1.0ml环氧氯丙烷活化的树脂，3.0ml 10％L-Lys溶液，30℃反应10小时。水洗后，加入1.0mol/L乙醇胺溶液2.0ml，室温下反应2小时。再用水淋洗，制得成品吸附剂，Lys配基固定量在17.6μmol/ml。吸附剂对内毒素的吸附量为1.67EU/ml。患病动物经血液灌流治疗后血液生化指标改善的结果见表1。
表1.患病动物经血液灌流治疗血液生化指标改善
实施例16.采用实施例15的方法和步骤，L-Lys溶液浓度为1％，Lys固定量12.5μmol/ml。
实施例17.采用实施例15的方法和步骤，反应时间为5小时，Lys固定量14.6μmol/ml。
实施例18.采用实施例15的方法和步骤，pH6.85的L-Lys磷酸盐缓冲液，Lys固定量14.3μmol/ml。
实施例19.将50ml6％琼脂水溶液加热至90℃。将此溶液加入到由150ml甲苯，50ml三氯甲烷，1ml吐温80组成的分散相中，搅拌0.5小时。倾出上层有机溶剂，依次用水、乙醇和水洗涤至无分散剂，标准筛筛选出粒度0.45-0.9mm的树脂备用。
实施例20.将50ml 6％琼脂水溶液加热至90℃。将此溶液加入到由150ml液体石蜡和1.5ml司班80组成的分散相中，搅拌2小时。倾出上层有机溶剂，依次用水、乙醇和水洗涤至无分散剂，标准筛筛选出粒度0.45-0.9mm的树脂备用。
实施例21.按照实施例19所得的树脂1g，加入1ml环氧氯丙烷，2ml 1.25M NaOH溶液于30℃反应3小时。水洗至中性。所得载体的环氧基团含量为112.4mg/ml。
实施例22.按照实施例21的树脂1g，加入4ml 10g/L pH＝10.87的苯丙氨酸溶液，于70℃下反应5小时。所得吸附剂对类风湿关节炎抗体的吸附量达183.8IU/g。
实施例23.按照实施例22，采用色氨酸为配基的吸附剂对类风湿关节炎抗体的吸附量达155.0IU/g。
实施例24.按照实施例19所得的树脂1g，加入1ml环氧氯丙烷，2ml 1.0M NaOH溶液于25℃反应2小时。水洗至中性。再加入2ml pH＝9的1M乙醇胺溶液室温下振荡反应6小时。产物用水洗涤至中性。
实施例25.取实施例24的树脂1g，加入2ml pH＝9.2的苯丙氨酸饱和溶液，于37℃下反应18小时。所得吸附剂可使重症肌无力患者血清中的抗体水平下降13.0％。
实施例26.按照实施例25，采用色氨酸为配基的吸附剂可使重症肌无力患者血清中的抗体水平下降34.53％。
实施例27.按照实施例25进行酪胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为9.6％。
实施例28.按照实施例25进行半胱胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为11.0％。
实施例29.按照实施例25进行赖胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为11.8％。
实施例30.按照实施例25进行谷胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为17.6％。
实施例31.按照实施例19制备琼脂凝胶。取1ml湿态琼脂载体加入2ml 1.25M NaOH溶液和1ml的环氧氯丙烷，37℃反应2h，水洗至中性。再加入4ml 10g/L pH＝10.87的苯丙氨酸溶液，于70℃下反应5小时。所得吸附剂对1000u/ml的肿瘤坏死因子(TNFα)血浆进行静态吸附，夹心法ELISA检测吸附前后的TNFα浓度。其对TNFα的吸附率达41.2％。
实施例32.按照实施例31进行色胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为37.1％。
实施例33.按照实施例31进行亮胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为37.6％。
实施例34.按照实施例31进行谷胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为32.5％。
实施例35.按照实施例31进行谷胺胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为8.9％。
实施例36.按照实施例31进行组胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为24.2％。
实施例37.按照实施例31进行异亮胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为40.1％。
实施例38.按照实施例31进行半胱胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为41.9％。
实施例39.按照实施例19制备琼脂凝胶。取lml湿态琼脂载体加入2ml 1.25M NaOH溶液和1ml的环氧氯丙烷，37℃恒温振荡反应2h，水洗至中性。再加入10g/L的人IgG溶液，继续反应，IgG配基最大固定量达3524.48ug/ml gel。所得吸附剂对3000u/ml的肿瘤坏死因子(TNFα)血浆进行静态吸附，夹心法ELISA检测吸附前后的TNFα浓度。其对TNFα的最大吸附容量达3586.45u/ml。
权利要求
1.一种球形氨基酸吸附剂，其特征在于它是以天然高分子为载体，粒度0.45-0.9mm，经环氧氯丙烷活化后固定有效量的氨基酸配基的树脂构成，其中，氨基酸含量为12.5-39.7μmol/ml树脂。
2.按照权利要求1所述的球形氨基酸吸附剂，其特征在于所述的天然高分子载体是球形纤维素、琼脂、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、阿拉伯胶、明胶或淀粉。
3.按照权利要求2所述的球形氨基酸吸附剂，其特征在于所述的载体是球形纤维素。
4.按照权利要求1所述的球形氨基酸吸附剂，其特征在于所述的配基为氨基酸、聚氨基酸、多肽或蛋白质；所述的氨基酸是精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、丝氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸或组氨酸；所述的聚氨基酸是聚赖氨酸；所述的多肽是2-14个氨基酸的肽；所述的蛋白质是IgG或热聚IgG。
5.按照权利要求4所述的球形氨基酸吸附剂，其特征在于所述的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸或赖氨酸。
6.权利要求1所述的球形氨基酸吸附剂的制备方法，其特征在于它是经过下述步骤合成的1)制备纤维素载体的球形氨基酸吸附剂(1)精制棉或脱脂棉在室温下用10-20％氢氧化钠水溶液碱化1-2小时以上，除去碱液，于25-80℃条件下密封放置老化24-72h；(2)在上述碱化棉中加入棉花重量的1/3至2/3体积的二硫化碳，于25℃反应5-10h得到橙色粘胶液，根据碱化棉花的重量用3-6％NaOH稀释上述粘胶液至6％-15％；(3)以氯苯和油酸钾，或/和四氯化碳为分散相，向其中加入粘胶液，升温至80-95℃，保温1-3h，倾出有机溶剂，依次用水、乙醇和水洗涤至无分散剂，标准筛筛选出粒度0.45-0.9mm的树脂备用；(4)将载体置于0.5-5M NaOH溶液中，加入环氧氯丙烷，于25-60℃条件下反应1-4小时，得到活化后的球形纤维素载体；(5)氨基酸配基的的偶联环氧氯丙烷活化的球形载体与氨基酸在pH大于8的碱性溶液中，于25-80℃条件下反应5-24小时。水洗后，加入乙醇胺溶液在室温下反应1-6h以封闭未反应的环氧基团，得到球形纤维素载体成品吸附剂；2)制备琼脂、琼脂糖、明胶载体的球形氨基酸吸附剂(1)将琼脂、琼脂糖或明胶加入到水中，加热至60-90℃使之溶解，将此溶液转移至由甲苯、三氯甲烷和吐温80，或液体石蜡和司班80组成的分散相中，搅拌0.5小时以上至液滴分散均匀后，冷却至室温，倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。3)制备葡聚糖或淀粉载体的球形氨基酸吸附剂(1)在葡聚糖或淀粉的水溶液中加入环氧氯丙烷，以液体石蜡和司班80为分散相，碱性条件下于25-40℃反应6-16小时。倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。4)制备壳聚糖或阿拉伯胶载体的球形氨基酸吸附剂(1)在壳聚糖的酸性水溶液或阿拉伯胶的水溶液中加入甲醛或戊二醛，以液体石蜡和司班80为分散相，25-60℃反应2-24小时。倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。
7.按照权利要求6所述的球形氨基酸吸附剂的制备方法，其特征在于所述的二硫化碳与棉花的体积/质量比是1-2∶3。
8.按照权利要求6所述的球形氨基酸吸附剂的制备方法，其特征在于所述的分散介质与粘胶液的体积/质量比是3-5∶1。
9.按照权利要求6所述的球形氨基酸吸附剂的制备方法，其特征在于所述的活化载体的环氧氯丙烷的加入量为0.5-5ml/g载体；所述的氨基酸加入量为0.001g-1g/g。
10.权利要求1所述的天然高分子为载体的氨基酸吸附剂的应用特征在于，它可用于临床上血液灌流疗法治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、内毒素血症及感染性休克等疾病。
全文摘要
本发明涉及一种球形氨基酸吸附剂及其制备方法，它是以天然高分子为载体，粒度为0.45－0.9mm，经环氧氯丙烷活化后固定有效量的氨基酸配基的树脂构成，其中，氨基酸含量为12.5－39.7μmol/ml树脂。所述的配基为氨基酸、聚氨基酸、多肽或蛋白质；本发明可直接用于血液灌流法治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、内毒素血症和感染性休克，通过清除患者体内有毒物质达到治疗目的。动物实验表明，此类吸附剂无毒副作用，无热源，是一种良好的医用血液净化吸附材料。
文档编号A61M1/34GK1476908SQ0313040
公开日2004年2月25日 申请日期2003年7月15日 优先权日2003年7月15日
发明者俞耀庭, 王永健, 魏佼 申请人:南开大学
技术领域：
本发明涉及医用吸附材料，特别是一种球形氨基酸吸附剂及其制备方法，应用于血液灌流治疗疑难疾病。将多种氨基酸分别以化学键连方式固定到球形天然高分子载体上，成为带有氨基酸配基的医用吸附剂，可用于血液灌流疗法治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、及内毒素血症和感染性休克等疾病。
肿瘤坏死因子α(TNFα)是内毒素休克致病机理中最重要的炎症介质，是内毒素血症和脓毒症中介导组织损伤的主要介质之一，感染死亡率较高。利用吸附剂从血液或血浆中选择性吸附清除TNFα，是近年来发展起来的新型治疗方法。Howard Levy等[ASAIOJ.1998，44659-665]应用活性炭和活性炭联合二氧化硅吸附剂血液净化系统共治疗8例病人，结果表明所有的病人均有症状的改善，血浆细胞因子水平在治疗过程中稳定或降低。多器官衰竭明显好转，2例病人存活时间超过28天，2例超过14天。龙海波等[中华肾脏病杂志1998，14(4)225-228；中国危重病急救医学1999，11(8)477-480]研究免疫吸附剂特异性清除循环TNFα对内毒素休克兔心脏损害的影响，结果表明经免疫吸附治疗后动物低血压状态明显改善，血浆TNFα水平迅速下降，延缓和显著减轻了肝肾功能损害及心肌、细胞膜和溶酶体损伤的发生，实验动物存活率明显提高。
血液灌流治疗是一种非药物疗法，这种疗法是基于病人血液通过含有能与血液中有害成分发生吸附作用的吸附柱过滤而达到治疗目的的。Jones，Frank R(EP 0 272 792A1，1987)对这种方法曾做过详细说明。治疗类风湿关节炎的血液灌流疗法始于二十世纪八十年代初期，日本学者Yamazaki等(Biomater Artif Cells Artif Organs1989；17(2)117-24)研制成功聚乙烯醇凝胶-色氨酸免疫吸附剂(IM-TR)和聚乙烯醇凝胶-苯丙氨酸免疫吸附剂(TM-PH)，并将IM-TR用于临床治疗类风湿关节炎，治疗后患者关节疼痛减轻，类风湿因子(RF)也有不同程度的降低，取得了较好的疗效。1990年，Kold用戊二醛溶液对IgG进行化学交联，合成IgG聚合体。体外吸附实验表明，该聚合体对RF的清除率高达94％。由于形成的聚合物过于细小，该吸附剂不适于临床应用。1997年，Ramlow报导了以琼脂糖凝胶为载体，化学键连蛋白A制备RA免疫吸附剂的研究及其临床应用。目前临床上使用较多的是将蛋白A共价键连到硅胶球上，制成RA免疫吸附剂，通过血浆灌流吸附清除类风湿因子。
美国的Terman DS等[Lancet，1979，2(8147)824-7]，首次使用活性炭为载体材料，采用火棉胶包膜固定DNA，得到的DNA免疫吸附剂用于血液灌流治疗一名重度SLE患者，使患者生命延长了31天。俞耀庭等[美国专利US 6,262,172 B1，中国专利CN1111430C]曾在临床上采用炭化树脂或纤维素为载体的DNA免疫吸附剂治疗或缓解系统性红斑狼疮病人的病情，取得了较好的疗效。Nagasawa采用葡聚糖凝胶共价键连DNA，制备得到化学键连的免疫吸附剂(Journal of Applied Biochemistry，1985，7296-302)。
文献中曾报道采用琼脂糖偶联蛋白A或聚乙烯醇偶联色氨酸作为吸附剂治疗重症肌无力患者，治疗后临床症状即有明显改善[J.Neuroimmunology，1989，22123-127；J.Neuro Neurosur.Psychia，1994，57578-581；Trans.Prac.，1999，39682-687]。
血液灌流的关键技术之一是吸附剂的制备，吸附剂的载体是吸附器件的重要原材料，配基则决定着吸附剂的性能。目前临床上普遍使用的血液灌流吸附剂是以硅胶为载体、以蛋白A为配基的合成树脂。作为配基的蛋白A，其价格较为昂贵，使得吸附剂的制作成本较高；同时这类吸附剂的血液相容性较差，在使用中必须首先将病人的血液进行血浆分离后才能进行吸附灌流的治疗。这就造成目前临床上血液灌流治疗费用较高，尽管其具有明确的疗效但却不能为大多数患者所接受。
本发明是以天然高分子为载体，粒度0.45-0.9mm，经环氧氯丙烷活化后固定有效量的氨基酸配基的树脂构成，其中，氨基酸含量为12.5-39.7μmol/ml树脂。
所述的天然高分子载体是球形纤维素、琼脂、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、阿拉伯胶、明胶或淀粉。
所述的载体是球形纤维素。
所述的配基为氨基酸、聚氨基酸、多肽或蛋白质；所述的氨基酸是精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、丝氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸或组氨酸；所述的聚氨基酸是聚赖氨酸；所述的多肽是2-14个氨基酸的肽；所述的蛋白质是IgG或热聚IgG。
所述的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸或赖氨酸。
球形氨基酸吸附剂的制备方法是经过下述步骤合成的1)制备纤维素载体的球形氨基酸吸附剂(1)精制棉或脱脂棉在室温下用10-20％氢氧化钠水溶液碱化1-2小时以后，除去碱液，于25-80℃条件下密封放置老化24-72h。
(2)在上述碱化棉中加入二硫化碳，25℃震荡反应5-10h得到橙色粘胶液，根据碱化棉花的重量用3-6％NaOH稀释上述粘胶液至6％-15％，室温下放置备用。
(3)以氯苯和油酸钾，或/和四氯化碳为分散介质，向其中加入粘胶液，升温至80-95℃，保温1-3h，倾出有机溶剂，洗涤合成的球形纤维素载体；收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。
(4)将载体置于0.5-5M NaOH溶液中，加入环氧氯丙烷，于25-60℃条件下反应1-4小时，得到活化后的球形纤维素载体，环氧基含量达61.7μmol/ml。
(5)氨基酸配基的偶联环氧氯丙烷活化的球形纤维素载体与氨基酸在pH大于8的介质中，于25-80℃条件下反应5-24小时。水洗后，加入两倍体积的1M乙醇胺溶液在室温下反应1-3h以封闭残留的环氧基，得到球形纤维素载体成品吸附剂，氨基酸含量达39.7μmol/ml。氨基酸吸附剂经过淋洗、灭菌、包装等处理后可直接用于临床。
2)制备琼脂、琼脂糖、明胶载体的球形氨基酸吸附剂(1)将琼脂、琼脂糖或明胶加入到水中，加热至60-90℃使之溶解，将此溶液转移至由甲苯、三氯甲烷和吐温80，或液体石蜡和司班80组成的分散相中，搅拌0.5小时以上至液滴分散均匀后，冷却至室温，倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。
(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。
3)制备葡聚糖或淀粉载体的球形氨基酸吸附剂(1)在葡聚糖或淀粉的水溶液中加入环氧氯丙烷，以液体石蜡和司班80为分散相，碱性条件下于25-40℃反应6-16小时。倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。
(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。
4)制备壳聚糖或阿拉伯胶载体的球形氨基酸吸附剂(1)在壳聚糖的酸性水溶液或阿拉伯胶的水溶液中加入甲醛或戊二醛，以液体石蜡和司班80为分散相，25-60℃反应2-24小时。倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。
(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。
所述的二硫化碳与棉花的体积/质量比是1-2∶3。
所述的分散介质与粘胶液的体积/质量比是3-5∶1。
所述的活化载体的环氧氯丙烷的加入量为0.5-5ml/g载体；所述的氨基酸加入量为0.001g-1g/g。
所述的天然高分子为载体的氨基酸吸附剂的应用，它可用于临床上血液灌流疗法治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、内毒素血症及感染性休克等疾病。
本发明以球形纤维素、琼脂、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、阿拉伯胶、明胶及淀粉等天然高分子为载体，经环氧氯丙烷活化后，固定氨基酸配基，得到可用于血液灌流的吸附剂。球形纤维素载体固定化苯丙氨酸吸附剂对类风湿因子的吸附量为116.1IU/ml，对重症肌无力患者血液中乙酰胆碱受体抗体的吸附率为16.6％；球形纤维素载体固定化色氨酸吸附剂对类风湿因子的吸附量为122.4IU/ml，对重症肌无力患者血液中乙酰胆碱受体抗体的吸附率为44.8％；球形纤维素载体固定化赖氨酸吸附剂对内毒素的吸附量为1.67EU/ml；球形琼脂载体固定化苯丙氨酸吸附剂对类风湿因子的吸附量为183.8IU/g；球形琼脂载体固定化苯丙氨酸吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为13.0％；球形琼脂载体固定化色氨酸吸附剂对类风湿因子的吸附量为155.0IU/g；球形琼脂载体固定化色氨酸吸附剂对重症肌无力患者血液中乙酰胆碱受体抗体的吸附率为34.5％。
本发明使用天然高分子材料作为吸附剂的载体，具有良好的生物相容性，在使用中无需进行血浆分离，可采用全血灌流方式，大大降低了治疗成本；而氨基酸作为一类廉价的配基不仅使吸附剂具有较好的吸附性能，同时在实际应用中不会产生因配基泄漏带来的危害，具有极高的安全性。本发明涉及的多种氨基酸吸附剂可以以同种天然高分子为载体，偶联不同的氨基酸，使得吸附剂的生产过程简单易行，生产成本低廉；不同的吸附剂对特定疾病的治疗又具备特异性的特点。可以获得更高的经济效益和社会效益。
本发明得到的固定化氨基酸生物医用吸附剂可直接用于全血灌流法治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、内毒素血症及感染性休克，通过清除患者体内有毒物质达到治疗目的。动物实验表明，此类吸附剂无毒副作用，无热源，是一种良好的医用血液净化吸附材料。吸附剂的制备简单，成本低廉，易于推广应用。
本发明突出的实质性特点和显著进步，可通过下述实施例予以证明，但它们不是对本发明作任何限制。
(a)纤维素载体的制备精制棉10g在室温下用19％氢氧化钠水溶液碱化棉花两小时以上，除去碱液后，于28℃密封放置老化三天。
加入6g CS2，于25℃震荡反应10h得到橙色粘胶液。加入6％NaOH使上述粘胶液的重量达到100g，备用。
以氯苯300ml和油酸钾1.2g为分散介质，向其中加入粘胶液，采用悬浮聚合法合成球形纤维素。升温至80℃，保温3h，之后，倾出有机溶剂，洗涤合成的载体。收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。产率大于80％。
(b)纤维素载体的活化将载体置于3M NaOH溶液中，加入环氧氯丙烷，于40℃条件下反应2小时，得到活化后的纤维素载体。环氧值采用酸碱滴定法测得，环氧值为54.7μmol/ml。
(c)氨基酸配基的固定化环氧氯丙烷活化的球形载体与氨基酸的碱性溶液在50℃条件下反应15h。之后，加入150ml乙醇胺溶液在室温下反应2h。采用茚三酮法测定氨基酸的固定量，苯丙氨酸的固定量为35.5μmol/ml。
(d)吸附剂对类风湿患者血清中类风湿因子的吸附在3ml带塞离心管中，加入0.5ml吸附剂和1.0ml类风湿患者血清，于恒温摇床中37℃振荡吸附2h。酶联免疫法分别测定吸附前后血清中类风湿因子的浓度(试剂盒为上海德波生物技术有限公司产品)，计算吸附量。
按照上述步骤合成的球形纤维素载体固定化苯丙氨酸吸附剂对类风湿因子的吸附量为116.1IU/ml。
实施例2.按照实施例1进行色胺酸的固定量为36.4μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为122.4IU/ml。
实施例3.按照实施例1进行亮胺酸的固定量为30.6μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为61.0IU/ml。
实施例4.按照实施例1进行谷胺酸的固定量为34.5μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为36.0IU/ml。
实施例5.按照实施例1进行丝胺酸的固定量为33.6μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为23.4IU/ml。
实施例6.按照实施例1进行酪胺酸的固定量为35.1μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为17.4IU/ml。
实施例7.按照实施例1进行赖胺酸的固定量为39.1μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为16.0IU/ml。
实施例8.按照实施例1进行精胺酸的固定量为39.7μmol/ml。对类风湿因子的吸附量为10.4IU/ml。
实施例9.
(a)纤维素载体的制备精制棉10g在室温下用19％氢氧化钠水溶液碱化漂白的棉花两小时，除去碱液后于25℃密封放置老化三天。
加入5ml CS2，于28℃反应5h得到橙色粘胶液。加入6％NaOH使上述粘胶液的重量达到120g，搅拌均匀，28℃反应5h，放置备用。
以氯苯360ml、油酸钾0.7g和四氯化碳60ml为分散介质，向其中加入粘胶液，采用悬浮聚合法合成球形纤维素。升温至90℃，保温2h，倾出有机溶剂，洗涤合成的载体。收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。产率大于80％。
(b)纤维素载体的活化将10g载体置于1M NaOH溶液中，加入环氧氯丙烷10ml，于25℃条件下反应2小时，得到活化后的纤维素载体。
(c)氨基酸配基的固定化环氧氯丙烷活化的球形载体与氨基酸的碱性溶液在37℃条件下反应18h。之后，加入乙醇胺溶液20ml在室温下反应6h。
(d)吸附剂对重症肌无力病人血液中乙酰胆碱受体的吸附在3ml带塞离心管中，加入0.5g吸附剂和1.5ml重症肌无力病人血清，于恒温摇床中37℃振荡吸附2h。ELISA法测定吸附前后血清中重症肌无力抗体的浓度，计算吸附量。
按照上述步骤合成的球形纤维素载体固定化苯丙氨酸吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为16.6％。
实施例10.按照实施例9进行色胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为44.8％。
实施例11.按照实施例9进行酪胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为13.1％。
实施例12.按照实施例9进行半胱胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为19.5％。
实施例13.按照实施例9进行赖胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为15.4％。
实施例14.按照实施例9进行谷胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为14.4％。
实施例15.取30克优质精制棉，加入300ml 15％NaOH水溶液，室温下浸泡碱化2小时，除去碱液，室温下密闭放置老化2天。在装有碱化棉的锥形瓶中加入15ml CS2，于25℃反应5小时，得到深红色粘胶液。加入350ml 5％NaOH溶液稀释纤维素粘胶液。在2000ml三口瓶中，加入氯苯800g，四氯化碳200g，油酸钾2g。将300g粘胶液加入到三口瓶中，室温搅拌30分钟后升温至90℃，保温2.5小时。倾到出上层有机溶剂，依次用水、乙醇和水洗涤至无分散剂，标准筛筛选出粒度0.45-0.9mm的树脂备用，约250ml。
在25ml锥形瓶中加入1.0ml球状纤维素树脂，3.0ml 1.25mol/L NaOH溶液和1.0ml环氧氯丙烷，30℃反应2小时，用水洗涤至中性。活化的树脂环氧基含量在92.6μmol/ml。
在25ml锥形瓶中加入1.0ml环氧氯丙烷活化的树脂，3.0ml 10％L-Lys溶液，30℃反应10小时。水洗后，加入1.0mol/L乙醇胺溶液2.0ml，室温下反应2小时。再用水淋洗，制得成品吸附剂，Lys配基固定量在17.6μmol/ml。吸附剂对内毒素的吸附量为1.67EU/ml。患病动物经血液灌流治疗后血液生化指标改善的结果见表1。
表1.患病动物经血液灌流治疗血液生化指标改善
实施例16.采用实施例15的方法和步骤，L-Lys溶液浓度为1％，Lys固定量12.5μmol/ml。
实施例17.采用实施例15的方法和步骤，反应时间为5小时，Lys固定量14.6μmol/ml。
实施例18.采用实施例15的方法和步骤，pH6.85的L-Lys磷酸盐缓冲液，Lys固定量14.3μmol/ml。
实施例19.将50ml6％琼脂水溶液加热至90℃。将此溶液加入到由150ml甲苯，50ml三氯甲烷，1ml吐温80组成的分散相中，搅拌0.5小时。倾出上层有机溶剂，依次用水、乙醇和水洗涤至无分散剂，标准筛筛选出粒度0.45-0.9mm的树脂备用。
实施例20.将50ml 6％琼脂水溶液加热至90℃。将此溶液加入到由150ml液体石蜡和1.5ml司班80组成的分散相中，搅拌2小时。倾出上层有机溶剂，依次用水、乙醇和水洗涤至无分散剂，标准筛筛选出粒度0.45-0.9mm的树脂备用。
实施例21.按照实施例19所得的树脂1g，加入1ml环氧氯丙烷，2ml 1.25M NaOH溶液于30℃反应3小时。水洗至中性。所得载体的环氧基团含量为112.4mg/ml。
实施例22.按照实施例21的树脂1g，加入4ml 10g/L pH＝10.87的苯丙氨酸溶液，于70℃下反应5小时。所得吸附剂对类风湿关节炎抗体的吸附量达183.8IU/g。
实施例23.按照实施例22，采用色氨酸为配基的吸附剂对类风湿关节炎抗体的吸附量达155.0IU/g。
实施例24.按照实施例19所得的树脂1g，加入1ml环氧氯丙烷，2ml 1.0M NaOH溶液于25℃反应2小时。水洗至中性。再加入2ml pH＝9的1M乙醇胺溶液室温下振荡反应6小时。产物用水洗涤至中性。
实施例25.取实施例24的树脂1g，加入2ml pH＝9.2的苯丙氨酸饱和溶液，于37℃下反应18小时。所得吸附剂可使重症肌无力患者血清中的抗体水平下降13.0％。
实施例26.按照实施例25，采用色氨酸为配基的吸附剂可使重症肌无力患者血清中的抗体水平下降34.53％。
实施例27.按照实施例25进行酪胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为9.6％。
实施例28.按照实施例25进行半胱胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为11.0％。
实施例29.按照实施例25进行赖胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为11.8％。
实施例30.按照实施例25进行谷胺酸的固定化。所得吸附剂对重症肌无力抗体的吸附率为17.6％。
实施例31.按照实施例19制备琼脂凝胶。取1ml湿态琼脂载体加入2ml 1.25M NaOH溶液和1ml的环氧氯丙烷，37℃反应2h，水洗至中性。再加入4ml 10g/L pH＝10.87的苯丙氨酸溶液，于70℃下反应5小时。所得吸附剂对1000u/ml的肿瘤坏死因子(TNFα)血浆进行静态吸附，夹心法ELISA检测吸附前后的TNFα浓度。其对TNFα的吸附率达41.2％。
实施例32.按照实施例31进行色胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为37.1％。
实施例33.按照实施例31进行亮胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为37.6％。
实施例34.按照实施例31进行谷胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为32.5％。
实施例35.按照实施例31进行谷胺胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为8.9％。
实施例36.按照实施例31进行组胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为24.2％。
实施例37.按照实施例31进行异亮胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为40.1％。
实施例38.按照实施例31进行半胱胺酸的固定化。吸附剂对肿瘤坏死因子的吸附率为41.9％。
实施例39.按照实施例19制备琼脂凝胶。取lml湿态琼脂载体加入2ml 1.25M NaOH溶液和1ml的环氧氯丙烷，37℃恒温振荡反应2h，水洗至中性。再加入10g/L的人IgG溶液，继续反应，IgG配基最大固定量达3524.48ug/ml gel。所得吸附剂对3000u/ml的肿瘤坏死因子(TNFα)血浆进行静态吸附，夹心法ELISA检测吸附前后的TNFα浓度。其对TNFα的最大吸附容量达3586.45u/ml。
权利要求
1.一种球形氨基酸吸附剂，其特征在于它是以天然高分子为载体，粒度0.45-0.9mm，经环氧氯丙烷活化后固定有效量的氨基酸配基的树脂构成，其中，氨基酸含量为12.5-39.7μmol/ml树脂。
2.按照权利要求1所述的球形氨基酸吸附剂，其特征在于所述的天然高分子载体是球形纤维素、琼脂、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、阿拉伯胶、明胶或淀粉。
3.按照权利要求2所述的球形氨基酸吸附剂，其特征在于所述的载体是球形纤维素。
4.按照权利要求1所述的球形氨基酸吸附剂，其特征在于所述的配基为氨基酸、聚氨基酸、多肽或蛋白质；所述的氨基酸是精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、丝氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸或组氨酸；所述的聚氨基酸是聚赖氨酸；所述的多肽是2-14个氨基酸的肽；所述的蛋白质是IgG或热聚IgG。
5.按照权利要求4所述的球形氨基酸吸附剂，其特征在于所述的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸或赖氨酸。
6.权利要求1所述的球形氨基酸吸附剂的制备方法，其特征在于它是经过下述步骤合成的1)制备纤维素载体的球形氨基酸吸附剂(1)精制棉或脱脂棉在室温下用10-20％氢氧化钠水溶液碱化1-2小时以上，除去碱液，于25-80℃条件下密封放置老化24-72h；(2)在上述碱化棉中加入棉花重量的1/3至2/3体积的二硫化碳，于25℃反应5-10h得到橙色粘胶液，根据碱化棉花的重量用3-6％NaOH稀释上述粘胶液至6％-15％；(3)以氯苯和油酸钾，或/和四氯化碳为分散相，向其中加入粘胶液，升温至80-95℃，保温1-3h，倾出有机溶剂，依次用水、乙醇和水洗涤至无分散剂，标准筛筛选出粒度0.45-0.9mm的树脂备用；(4)将载体置于0.5-5M NaOH溶液中，加入环氧氯丙烷，于25-60℃条件下反应1-4小时，得到活化后的球形纤维素载体；(5)氨基酸配基的的偶联环氧氯丙烷活化的球形载体与氨基酸在pH大于8的碱性溶液中，于25-80℃条件下反应5-24小时。水洗后，加入乙醇胺溶液在室温下反应1-6h以封闭未反应的环氧基团，得到球形纤维素载体成品吸附剂；2)制备琼脂、琼脂糖、明胶载体的球形氨基酸吸附剂(1)将琼脂、琼脂糖或明胶加入到水中，加热至60-90℃使之溶解，将此溶液转移至由甲苯、三氯甲烷和吐温80，或液体石蜡和司班80组成的分散相中，搅拌0.5小时以上至液滴分散均匀后，冷却至室温，倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。3)制备葡聚糖或淀粉载体的球形氨基酸吸附剂(1)在葡聚糖或淀粉的水溶液中加入环氧氯丙烷，以液体石蜡和司班80为分散相，碱性条件下于25-40℃反应6-16小时。倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。4)制备壳聚糖或阿拉伯胶载体的球形氨基酸吸附剂(1)在壳聚糖的酸性水溶液或阿拉伯胶的水溶液中加入甲醛或戊二醛，以液体石蜡和司班80为分散相，25-60℃反应2-24小时。倾出有机溶剂，洗涤合成的树脂，收集粒度在0.45-0.9mm范围内的组份，置于水中4℃保存备用。(2)采用步骤1)中的(4)和(5)，得到上述载体的球形氨基酸吸附剂。
7.按照权利要求6所述的球形氨基酸吸附剂的制备方法，其特征在于所述的二硫化碳与棉花的体积/质量比是1-2∶3。
8.按照权利要求6所述的球形氨基酸吸附剂的制备方法，其特征在于所述的分散介质与粘胶液的体积/质量比是3-5∶1。
9.按照权利要求6所述的球形氨基酸吸附剂的制备方法，其特征在于所述的活化载体的环氧氯丙烷的加入量为0.5-5ml/g载体；所述的氨基酸加入量为0.001g-1g/g。
10.权利要求1所述的天然高分子为载体的氨基酸吸附剂的应用特征在于，它可用于临床上血液灌流疗法治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、内毒素血症及感染性休克等疾病。
全文摘要
本发明涉及一种球形氨基酸吸附剂及其制备方法，它是以天然高分子为载体，粒度为0.45－0.9mm，经环氧氯丙烷活化后固定有效量的氨基酸配基的树脂构成，其中，氨基酸含量为12.5－39.7μmol/ml树脂。所述的配基为氨基酸、聚氨基酸、多肽或蛋白质；本发明可直接用于血液灌流法治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、内毒素血症和感染性休克，通过清除患者体内有毒物质达到治疗目的。动物实验表明，此类吸附剂无毒副作用，无热源，是一种良好的医用血液净化吸附材料。
文档编号A61M1/34GK1476908SQ0313040
公开日2004年2月25日 申请日期2003年7月15日 优先权日2003年7月15日
发明者俞耀庭, 王永健, 魏佼 申请人:南开大学
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