槲皮素衍生物及其医药用途的制作方法
专利名称：槲皮素衍生物及其医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及槲皮素衍生物，及其制备方法，含有它的药物组合物及它们作为预防或治疗与5HT1A有关疾病，尤其是预防或治疗抑郁或焦虑的用途。
属于棉花籽类的无毒棉花籽是无毒棉花成熟果实的种子，一般作为牲畜的饲料。无毒棉花籽是棉葵疼(Malvaceve)植物经过基因工程改造大一种新型农作物。到目前为止，尚未见到包括无毒棉花籽的棉花籽中槲皮素化学成分及其生物活性的报道。
本发明的目的，是寻找包括无毒棉花籽的棉花籽中具有生物活性的化学单体，并进而开发该化学单体的医药用途。
本发明者经过广泛深入的研究，现已从例如无毒棉花籽中提取出具有式I的槲皮素衍生物。结果发现，它可做为5HT1A受体的配基，并显示出良好的治疗和预防与5HT1A有关的疾病和症状，如抗胃溃疡、抗十二指肠溃疡、对心脏和血压的调节以及对中枢系统的疾病，如抗抑郁、抗焦虑等的活性。本发明基于以上发现得以完成。 式I的结构式本发明涉及式I槲皮素-3-O-α-D-芹菜糖-(1→2)-〔α-D-鼠李糖-(1→6)〕-β-D-葡萄糖甙，它可作为5HT1A受体的配基并且显示出良好的预防或治疗与5HT1A有关疾病，尤其预防或治疗抑郁或焦虑的活性。
本发明还涉及药物组合物，其包括式I化合物及药用载体。
本发明还涉及作为预防或治疗与5HT1A有关的疾病或症状，尤其是预防或治疗抑郁或焦虑的式I化合物本发明还涉及作为预防或治疗与5HT1A有关疾病或症状，尤其是预防或治疗抑郁和／或焦虑的含式I化合物的药物组合物。
根据本发明，本发明式I化合物或药物组合物可通过口服，非肠道或局部途径给药，给药剂型可以是例如片剂，胶囊，溶液，悬浮液，注射液、滴注液等。
根据本发明，本发明药物组合物可按本领域已知方法制备，例如将式I化合物与药用载体混合。
根据本发明，式I化合物槲皮素-3-O-α-D-芹菜糖-(1→2)-〔α-D-鼠李糖-(1→6)〕-β-D-葡萄糖甙是从例如无毒棉花籽中得到的。所用的有机体溶剂包括醇类如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；卤代烷类如二氯甲烷、三氯甲烷等；酯类如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯等；以及醚类如石油醚、乙醚。
下面的实施例及生物活性实验，是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。
实施例1式I槲皮素-3-O-α-D-芹菜糖-(1→2)-〔α-D-鼠李糖-(1→6)〕-β-D-葡萄糖甙的制备。
将无毒棉花籽1kg粉碎，然后过100目筛，筛过物用石油醚提取。每次用石油醚5升，提取3次。药渣用乙醇提取，每次用乙醇8升，提取3次，合并。减压蒸发至衡重。得到乙醇提取物260g乙醇提取物用水溶解，将其在在正丁醇／水中进行分析。得到正丁醇提取物10g，得到水提取物200g。将正丁醇取物上硅胶柱层析分离，展开剂是正丁醇∶醋酸∶水=7∶1∶2。得到式I化合物。
式I化合物为黄色粉末。10％EtOH-H2SO4呈红黑色(加热)，表明有糖存在。紫外254nm处有亮白色荧光，表明是黄酮类化合物。IR光谱(KBr)cm-13412(OH)，2925，1654(C=O)，1608，1361，1201，表明有羰基和羟基存在；UV光谱(MeOH)256．2(logε3．95)，354．6(logε2．83)，为典型的黄酮醇类紫外特征。FAB-MS(m／z 743[M+H]+)，确定其分子量是742。化合物I核磁数据见表一。
表一化合物I在400MHz中1H-NMR和13C-NMR数据 实施例2本发明式I化合物槲皮素-3-O-α-D-芹菜糖-(1→2)-〔α-D-鼠李糖-(1→6)〕-β-D-葡萄糖甙的抗抑郁实验。
1．对大鼠大脑皮层腺苷酸环化酶活性的影响
(1)方法雄性Wistar大鼠，体重200±20g，断头处死并分离大脑皮层，按文献方法4℃提取突触膜(参见Rasenick MM等人，Pro Natl Acad SciUSA，1980；77；4628)并用缓冲液悬浮，使蛋白浓度达3～5mg／ml。由于腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，AC)位于突触膜上，故需提前用药物与突触膜孵育，方法如下含相应待试药物浓度的总体积为100μl的反应液中各成分终浓度为15mmol．L-1HEPES，PH7．5，5mmol．L-1MgCl2，1mmol．L-1EGTA，1mmol．L-1DTT，60mmol．L-1NaCl，1mmol．L-1氨茶碱，0．5mg／ml磷酸肌酸，0．14mg／ml磷酸肌酸激酶，各反应管分别加入20μg的突触膜并立即置30℃水浴中反应10分钟，此反应20分钟内是线性的，然后立即将反应管置于沸水中煮3分钟，终止反应。利用cAMP试剂盒(购自中国原子科学研究院)测量各反应管中cAMP产生量，测定过程全部在冰浴中进行，反应总体积130μl，按试剂盒说明加入各种试剂，反应结束后，4000rpm离心7分钟，吸取上清120μl置测量杯中，加1．5ml无水乙醇，摇匀后再加闪烁液3．5ml，盖严、摇匀，过夜后在Wallac 1409液闪仪上测定样品cpm值，根据标准曲线及cpm值推算cAMP产生量。结果用ANOVA统计分析，组间比较Dunnett′s T检验，结果见表二及表三。
表二．丙咪嗪及丁螺环酮对AC的激活效应
表三．式I化合物AC激活效应的比较 X±SD vs对照组，*P＜0．0，5，**P＜0．01，***P＜0．001(2)讨论研究表明，抗抑郁剂对突触膜AC有急性激活效应，此效应可能是其作用机制的重要步骤，从表1看出，经典抗抑郁剂丙咪嗪及非典型抗抑郁剂丁螺环酮呈剂量依赖性地激活AC。式I化合物在13．5μM(0．01mg／ml)时就显著激活AC，达到23．27±4．95 pmol／mg蛋白／分钟，比丙咪嗪及丁螺环酮25μM时效应都强。式I化合物在404μM(0．3mg／ml)效应达68．34±10．45 pmol／mg蛋白／分钟，比相同剂量下丙咪嗪以及丁螺环酮强2～3倍。由此看出，式I化合物有抗抑郁作用，而且活性较强。
2．式I化合物对皮质酮损伤的PC-12细胞的保护作用(1)方法用含5％小牛血清及5％马血清的DMEM培养液将PC-12细胞稀释为每毫升悬液含2×105个细胞，然后接种于预先用多聚赖氨酸处理过的96孔板中，于37℃，5％CO2条件下培养2～3天，等细胞长满孔底后即可用于实验。吸去培养液，加入含相应药物浓度及10-4mol．L-1皮质酮的无血清DMEM，48小时后各孔加入5mg／ml MTT10μl并轻轻摇匀，4小时后，每孔加10％SDS100μl并摇匀，置37℃孵箱中过夜(8～12小时)，待深蓝结晶全部溶解后，轻轻摇匀，在酶标仪上测量各孔在570nm波长时的吸光度值(A)，用ANOVA统计分析，结果见表四。
表四．式I化合物对皮质酮损伤的PC-12细胞的保护作用 **P＜0．01，***P＜0．001(2)讨论由表4中数据可以看到，式I化合物在浓度4．04μM时A值升高百分率达208．3％，A值升高百分率越大，表明对皮质酮损伤的PC-12细胞的保护作用越强。因此，本发明式I化合物对皮质酮损伤的PC-12细胞有很强的保护作用。
3．强迫游泳实验(1)方法按文献(Arch Int Pharmacodn Ther，1977，229(2)327)方法进行，小鼠ip给药物30分钟放入敞口玻璃缸内(高19cm、直径12cm)，缸内水深8cm，水温22～23℃，小鼠置水中6分钟，用Vidio运动解析仪观察小鼠后4分钟内的累计不动时间及活动性，统计方法同前，结果见表五。
表五．式I化合物对小鼠强迫游泳行为的影响
(2)讨论小鼠强迫游泳行为实验是经典的抑郁模型，动物置于水中先是挣扎，企图逃脱，最后进入绝望状态而静止不动，抗抑郁剂能明显缩短不动时间，表5看出，本发明式I化合物低剂量0．31mg／kg即可使不动时间缩短，因此，化合物式I抗抑郁活性较强。
4．5HT1A受体实验(1)方法按照表六的实验方法进行操作。
(2)讨化5HT1A受体实验表明，化合物式I与5HT1A有较强的结合率。其IC50在10-11mol左右。
表六．5HT1A受体实验
权利要求
1．式I化合物
2．含式I化合物及药用载体的药物组合物。
3．具有预防或治疗与5HT1A有关疾病或症状的式I化合物或含式I化合物的药物组合物。
4．根据权利要求3的化合物或药物组合物，其中所述与5HT1A有关疾病或症状是抑郁或焦虑。
全文摘要
本发明涉及槲皮素衍生物,及其制备方法,含有它的药物组合物及它们作为预防或治疗与5HT
文档编号A61K31/7042GK1288896SQ9912021
公开日2001年3月28日 申请日期1999年9月17日 优先权日1999年9月17日
发明者赵毅民, 杨明, 栾新慧, 罗质璞, 李云峰, 池木根 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
技术领域：
本发明涉及槲皮素衍生物，及其制备方法，含有它的药物组合物及它们作为预防或治疗与5HT1A有关疾病，尤其是预防或治疗抑郁或焦虑的用途。
属于棉花籽类的无毒棉花籽是无毒棉花成熟果实的种子，一般作为牲畜的饲料。无毒棉花籽是棉葵疼(Malvaceve)植物经过基因工程改造大一种新型农作物。到目前为止，尚未见到包括无毒棉花籽的棉花籽中槲皮素化学成分及其生物活性的报道。
本发明的目的，是寻找包括无毒棉花籽的棉花籽中具有生物活性的化学单体，并进而开发该化学单体的医药用途。
本发明者经过广泛深入的研究，现已从例如无毒棉花籽中提取出具有式I的槲皮素衍生物。结果发现，它可做为5HT1A受体的配基，并显示出良好的治疗和预防与5HT1A有关的疾病和症状，如抗胃溃疡、抗十二指肠溃疡、对心脏和血压的调节以及对中枢系统的疾病，如抗抑郁、抗焦虑等的活性。本发明基于以上发现得以完成。 式I的结构式本发明涉及式I槲皮素-3-O-α-D-芹菜糖-(1→2)-〔α-D-鼠李糖-(1→6)〕-β-D-葡萄糖甙，它可作为5HT1A受体的配基并且显示出良好的预防或治疗与5HT1A有关疾病，尤其预防或治疗抑郁或焦虑的活性。
本发明还涉及药物组合物，其包括式I化合物及药用载体。
本发明还涉及作为预防或治疗与5HT1A有关的疾病或症状，尤其是预防或治疗抑郁或焦虑的式I化合物本发明还涉及作为预防或治疗与5HT1A有关疾病或症状，尤其是预防或治疗抑郁和／或焦虑的含式I化合物的药物组合物。
根据本发明，本发明式I化合物或药物组合物可通过口服，非肠道或局部途径给药，给药剂型可以是例如片剂，胶囊，溶液，悬浮液，注射液、滴注液等。
根据本发明，本发明药物组合物可按本领域已知方法制备，例如将式I化合物与药用载体混合。
根据本发明，式I化合物槲皮素-3-O-α-D-芹菜糖-(1→2)-〔α-D-鼠李糖-(1→6)〕-β-D-葡萄糖甙是从例如无毒棉花籽中得到的。所用的有机体溶剂包括醇类如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；卤代烷类如二氯甲烷、三氯甲烷等；酯类如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯等；以及醚类如石油醚、乙醚。
下面的实施例及生物活性实验，是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。
实施例1式I槲皮素-3-O-α-D-芹菜糖-(1→2)-〔α-D-鼠李糖-(1→6)〕-β-D-葡萄糖甙的制备。
将无毒棉花籽1kg粉碎，然后过100目筛，筛过物用石油醚提取。每次用石油醚5升，提取3次。药渣用乙醇提取，每次用乙醇8升，提取3次，合并。减压蒸发至衡重。得到乙醇提取物260g乙醇提取物用水溶解，将其在在正丁醇／水中进行分析。得到正丁醇提取物10g，得到水提取物200g。将正丁醇取物上硅胶柱层析分离，展开剂是正丁醇∶醋酸∶水=7∶1∶2。得到式I化合物。
式I化合物为黄色粉末。10％EtOH-H2SO4呈红黑色(加热)，表明有糖存在。紫外254nm处有亮白色荧光，表明是黄酮类化合物。IR光谱(KBr)cm-13412(OH)，2925，1654(C=O)，1608，1361，1201，表明有羰基和羟基存在；UV光谱(MeOH)256．2(logε3．95)，354．6(logε2．83)，为典型的黄酮醇类紫外特征。FAB-MS(m／z 743[M+H]+)，确定其分子量是742。化合物I核磁数据见表一。
表一化合物I在400MHz中1H-NMR和13C-NMR数据 实施例2本发明式I化合物槲皮素-3-O-α-D-芹菜糖-(1→2)-〔α-D-鼠李糖-(1→6)〕-β-D-葡萄糖甙的抗抑郁实验。
1．对大鼠大脑皮层腺苷酸环化酶活性的影响
(1)方法雄性Wistar大鼠，体重200±20g，断头处死并分离大脑皮层，按文献方法4℃提取突触膜(参见Rasenick MM等人，Pro Natl Acad SciUSA，1980；77；4628)并用缓冲液悬浮，使蛋白浓度达3～5mg／ml。由于腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，AC)位于突触膜上，故需提前用药物与突触膜孵育，方法如下含相应待试药物浓度的总体积为100μl的反应液中各成分终浓度为15mmol．L-1HEPES，PH7．5，5mmol．L-1MgCl2，1mmol．L-1EGTA，1mmol．L-1DTT，60mmol．L-1NaCl，1mmol．L-1氨茶碱，0．5mg／ml磷酸肌酸，0．14mg／ml磷酸肌酸激酶，各反应管分别加入20μg的突触膜并立即置30℃水浴中反应10分钟，此反应20分钟内是线性的，然后立即将反应管置于沸水中煮3分钟，终止反应。利用cAMP试剂盒(购自中国原子科学研究院)测量各反应管中cAMP产生量，测定过程全部在冰浴中进行，反应总体积130μl，按试剂盒说明加入各种试剂，反应结束后，4000rpm离心7分钟，吸取上清120μl置测量杯中，加1．5ml无水乙醇，摇匀后再加闪烁液3．5ml，盖严、摇匀，过夜后在Wallac 1409液闪仪上测定样品cpm值，根据标准曲线及cpm值推算cAMP产生量。结果用ANOVA统计分析，组间比较Dunnett′s T检验，结果见表二及表三。
表二．丙咪嗪及丁螺环酮对AC的激活效应
表三．式I化合物AC激活效应的比较 X±SD vs对照组，*P＜0．0，5，**P＜0．01，***P＜0．001(2)讨论研究表明，抗抑郁剂对突触膜AC有急性激活效应，此效应可能是其作用机制的重要步骤，从表1看出，经典抗抑郁剂丙咪嗪及非典型抗抑郁剂丁螺环酮呈剂量依赖性地激活AC。式I化合物在13．5μM(0．01mg／ml)时就显著激活AC，达到23．27±4．95 pmol／mg蛋白／分钟，比丙咪嗪及丁螺环酮25μM时效应都强。式I化合物在404μM(0．3mg／ml)效应达68．34±10．45 pmol／mg蛋白／分钟，比相同剂量下丙咪嗪以及丁螺环酮强2～3倍。由此看出，式I化合物有抗抑郁作用，而且活性较强。
2．式I化合物对皮质酮损伤的PC-12细胞的保护作用(1)方法用含5％小牛血清及5％马血清的DMEM培养液将PC-12细胞稀释为每毫升悬液含2×105个细胞，然后接种于预先用多聚赖氨酸处理过的96孔板中，于37℃，5％CO2条件下培养2～3天，等细胞长满孔底后即可用于实验。吸去培养液，加入含相应药物浓度及10-4mol．L-1皮质酮的无血清DMEM，48小时后各孔加入5mg／ml MTT10μl并轻轻摇匀，4小时后，每孔加10％SDS100μl并摇匀，置37℃孵箱中过夜(8～12小时)，待深蓝结晶全部溶解后，轻轻摇匀，在酶标仪上测量各孔在570nm波长时的吸光度值(A)，用ANOVA统计分析，结果见表四。
表四．式I化合物对皮质酮损伤的PC-12细胞的保护作用 **P＜0．01，***P＜0．001(2)讨论由表4中数据可以看到，式I化合物在浓度4．04μM时A值升高百分率达208．3％，A值升高百分率越大，表明对皮质酮损伤的PC-12细胞的保护作用越强。因此，本发明式I化合物对皮质酮损伤的PC-12细胞有很强的保护作用。
3．强迫游泳实验(1)方法按文献(Arch Int Pharmacodn Ther，1977，229(2)327)方法进行，小鼠ip给药物30分钟放入敞口玻璃缸内(高19cm、直径12cm)，缸内水深8cm，水温22～23℃，小鼠置水中6分钟，用Vidio运动解析仪观察小鼠后4分钟内的累计不动时间及活动性，统计方法同前，结果见表五。
表五．式I化合物对小鼠强迫游泳行为的影响
(2)讨论小鼠强迫游泳行为实验是经典的抑郁模型，动物置于水中先是挣扎，企图逃脱，最后进入绝望状态而静止不动，抗抑郁剂能明显缩短不动时间，表5看出，本发明式I化合物低剂量0．31mg／kg即可使不动时间缩短，因此，化合物式I抗抑郁活性较强。
4．5HT1A受体实验(1)方法按照表六的实验方法进行操作。
(2)讨化5HT1A受体实验表明，化合物式I与5HT1A有较强的结合率。其IC50在10-11mol左右。
表六．5HT1A受体实验
权利要求
1．式I化合物
2．含式I化合物及药用载体的药物组合物。
3．具有预防或治疗与5HT1A有关疾病或症状的式I化合物或含式I化合物的药物组合物。
4．根据权利要求3的化合物或药物组合物，其中所述与5HT1A有关疾病或症状是抑郁或焦虑。
全文摘要
本发明涉及槲皮素衍生物,及其制备方法,含有它的药物组合物及它们作为预防或治疗与5HT
文档编号A61K31/7042GK1288896SQ9912021
公开日2001年3月28日 申请日期1999年9月17日 优先权日1999年9月17日
发明者赵毅民, 杨明, 栾新慧, 罗质璞, 李云峰, 池木根 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
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