源于hla相匹配的供体的激活的淋巴细胞的制作方法
专利名称：源于hla相匹配的供体的激活的淋巴细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞，使用所述激活的淋巴细胞的治疗方法，该淋巴细胞作为主要成分的制剂，生产该制剂的方法，以及用于制备该制剂的试剂盒。本发明的目的是更有效地治疗及预防肿瘤，例如癌症，以及感染性疾病。
背景技术：
近年来，淋巴细胞作为一种关键性的生物防御措施用于支持免疫系统，受到了广泛的关注。T淋巴细胞在细胞介导免疫中起着极其重要的作用。根据它们的单克隆抗体的反应性，对T淋巴细胞进行以下分类，例如，显示能与抗CD3抗体反应的T淋巴细胞(CD是指“分化簇”)被分类为CD3阳性细胞。到目前为止，已经对T淋巴细胞进行了重要的定量和定性研究，特别是关于所显示的抗原与其功能之间的关系。
另外，本发明的发明人之一，Sekine先生，曾在日本的未经审查的专利申请NO.H0380076中报道，通过使用固相抗CD3抗体(用淋巴细胞包被)和白介素-2能够使淋巴细胞增殖。增殖得到的自体淋巴细胞具有显著的抗肿瘤效果。另外，还有许多研究者也报道过，源于外周血等的淋巴细胞可以通过抗CD3抗体或白介素-2而得到增殖，所得到的自体淋巴细胞显示具有抗肿瘤的活性。
而且，供体白细胞输入(下文中简称为“DLT”)以及供体淋巴细胞输入(下文中简称为“DLI”)是两种较为成熟的治疗方法，当经过骨髓移植的病人中自血病复发时，通过上述两种方法引入大量的供体骨髓中的淋巴细胞。同时，近年来HLA相匹配母亲和孩子之间所显示的免疫耐受证实了微嵌合状态的存在。因此目前从事了大量的研究工作，其目的是利用微嵌机制迅速地在病人中诱导缓解状态，从而使器管移植更加安全。众所周知，当同胞之间产生微嵌合微嵌合时，同胞之间肾移植的成功率非常高。
然而，上述对T淋巴细胞以及诱导微嵌合状态的研究仍然处于实验阶段，目前还没有将上述研究用于实践的应用技术。此外，不能通过简单地对收集到的自体淋巴细胞进行增殖而始终确保其具有有效地抗肿瘤效果，特别是在癌症中。还必须强调，在实施DLT治疗中其相对比较困难。
根据每个白细胞所属的白细胞群，即HLAs(人类白细胞抗原)，将白细胞分为许多不同的“基因座”。在这些基因座中，DQ，DP，A，B，C以及DR基因座在器官移植中是必须经过仔细检查的关键因素。这些基因座每个都是由两个基因拷贝构成，其中一个来源于父亲，另一个来源于母亲(等位基因)。而且每个基因座都具有多态性。因此，从广义上来讲，输血，包括移植(例如外周血肝细胞移植)和DLT中，供体和病人中必须至少有四对HLA基因座相匹配，8个HLA分子之间的符合率是非常关键的因素。
在上述情况下，病人和供体的白细胞HLA完全相配几乎不可能的。实际上，只要主要的HLAs相匹配，则就可以采用骨髓移植或输血。然而，某个HLA不匹配将导致致死性的副作用，即病人在接受骨髓移植或DLT治疗后，发生的致死性的输血后移植物抗宿主疾病(下文简称“PT-GVHD”)另外，由于在进行器官移植或输血前表现出器官疾病和感染性疾病，即使有HLA相匹配的供体，许多病人仍然不能进行骨髓移植或输血。对于那些不选择进行骨髓移植的癌症患者，通过给予源于供体的淋巴细胞来尝试对其进行治疗，但是仍未证实上述尝试是非常有效的综上所述，当不选择进行骨髓移植时，自体(源自于病人的)淋巴细胞或源于供体的淋巴细胞的抗肿瘤效果并不令人满意，而且到目前为止，它们的抗病毒效果以及对自身免疫性疾病的效果还不清楚。另外还有一个问题是，如果不寄希望于淋巴细胞供体的话，淋巴细胞不可能被大量地制备。再者，必须与造血干细胞移植结合进行的DLI作为一种治疗选择有很大的限制，其原因是，如果病人不能进行造血干细胞移植的话，DLI就不能进行，同时，由于DLI必须结合干细胞移植进行，其需要高的HLA符合率，因此，找到HLA相匹配的供体的可能性就非常低。
发明内容
因此，本发明的发明人在研究具有高的抗肿瘤、抗病毒、抗自身免疫性疾病效果的源于供体的淋巴细胞及其制备方法方面作了大量的研究工作，从而完成了本发明。
本发明涉及源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞，制备所述激活的淋巴细胞的方法，以及通过给予所述激活的淋巴细胞，治疗HLA相匹配的患有肿瘤、病毒感染或自身免疫性疾病的病人，上述淋巴细胞作为主要成分的制剂，该制剂的生产方法，用于生产该制剂的试剂盒。所述淋巴细胞具有高的抗中瘤、抗病毒效果，同时其在治疗自身免疫性疾病方面证实非常有效。通过收集HLA相匹配的供体外周血中的细胞，或收集源于能够与病人发生微嵌合的HLA相匹配的供体外周血中的细胞，然后，例如，使用白介素-2，抗-CD3抗体或类似物刺激这些细胞并使它们增殖，从而得到上述淋巴细胞。
下文中将对本发明进行详细地描述。但是总的来说，本发明的特征在于，通过收集HLA相匹配的供体外周血中的细胞，或收集表现出微嵌合状态的HLA相匹配的供体外周血中的细胞，然后刺激并增殖这些细胞，从而制备出源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞。
所收集的细胞可以通过使用，例如白介素-2和抗-CD3抗体，对其进行多克隆的激活，从而刺激这些细胞并使它们增殖。此外，用适当的抗原等得到具有抗原特异性的T淋巴细胞等，然后用CD3抗体、CD26抗体和例如白介素2的细胞因子中的一种或者上述物质的组合得到具有抗原特异性的激活的淋巴细胞。另外，对所收集的源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞进行增殖和激活后，可以通过筛选而选择具有抗原特异性的激活的淋巴细胞，或通过使用一种合适的抗原诱导源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，从而得到抗原特异性的淋巴细胞。
或者，具有抗原特异性的激活的淋巴细胞可以通过筛选上述的激活的淋巴细胞而选择得到，或者，通过抗原刺激以增殖和激活淋巴细胞从而得到抗原特异性激活的淋巴细胞。在这种情况下，抗原特异性淋巴细胞可以源于CD8+细胞或CD4+细胞。除了提纯的抗原外，癌细胞或病毒的提取物，癌细胞本身或病毒本身或任何与癌细胞或病毒细胞具有交叉反应性的抗原物质均可以用于上述目的。
在本发明的一个具体方式中，源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞用于预防或治疗肿瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病。
此外，根据本发明，含有源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞的制剂用于预防或治疗肿瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病。
而且，本发明提供了一种治疗方法，该方法使用源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞或含有源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞的制剂，用于预防或治疗肿瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病。
本发明进一步提供了一种制备试剂盒，该试剂盒用于制备激活的淋巴细胞，或一种至少将源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞与白介素2相组合，从而激活淋巴细胞的制剂。另外，本发明提供一种制备试剂盒，该试剂盒用于制备激活的淋巴细胞，或一种至少将源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞与抗CD3抗体相组合，从而激活淋巴细胞的制剂。
本发明提供一种方法，用于生产预防和治疗肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的制剂，该方法包括从含有源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞的外周血中分离出单核细胞，在分离出的单核细胞中增殖并激活源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，提取增殖并激活的源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，并制备以所述淋巴细胞为主要成分的制剂。
具体实施例方式
以下将按步骤对本发明作出详细地解释(所收集的外周血类型)根据本发明，所收集的外周血必须是源于HLA相匹配的供体的外周血，较好是来源于显示具有微嵌合状态的HLA相匹配的供体。尽管所希望的是，所收集外周血与病人在HLA上完全相匹配以确保不发生GVHD所诱导的副作用，但是也可以收集与病人HLA部分相匹配的外周血。
例如，如果供体在4个A、B、C以及DR基因座中有1、2、3、或4个基因座与病人中的相应基因座一致，则可以使用源于该供体的外周血。此外，如果供体4个基因座上的8个HLA基因中至少有两个HLA基因与病人中相应的基因一致，则可以使用该供体的外周血。然而，最好是8个HLA基因中有4个基因相互一致。
另外，使用源于显示微嵌合状态的HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞也同样有效。尽管微嵌合状态在生物医药领域是熟知的概念，以下对其进行简单的解释，“微嵌合状态”(源于他人的细胞以约1/1000的比例存在于体内的状态)发生于坏孕时期，其间母亲与胎儿通过胎盘相互交换少量细胞。
实际上，在妊娠妇女当中一直能够检测到微嵌合状态的发生。另外，即使在分娩以后，很多母亲在一段时间内一直有微嵌合状态的发生。因此，其维持了对孩子的源于父亲的HLAs的免疫耐受。通过该现象，在母亲和孩子之间形成了免疫耐受三角。
因此，本发明的发明人通过研究确定，源于HLA相匹配的并具有微嵌合状态的同胞的激活的淋巴细胞在预防和治疗肿瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病方面是非常有效的。另外已经证实，即使外周血的HLA基因不相匹配，只要显示微嵌合状态，也可以使用这样的外周血，并且其安全性较高。
其意味着，只要有微嵌合状态，源于没有血源关系的陌生人的外周血，与源于父母、祖母、祖父、同胞、叔叔、阿姨、子女或孙子的外周血一样有效。应注意的是，对于遗传学上继承父母HLAs的孩子，其HLA组成上的每一半与父母中的一方相一致，因此，他的HLAs有25％的可能与他的同胞是相匹配的。而与没有任何血源关系的陌生人之间，其HLAs相配的几率为几百分之一至几万分之一，因此，在一般情况下，不能使用源于陌生人的淋巴细胞。然而，如果供体中达到微嵌合状态，则供体的淋巴细胞可以作为制剂的原料。
此外，最好选择与接受者的HLA组合具有排异倾向(work along a rejectivedirection)的供体。例如，当HLA组合具有排异倾向时，供体A基因座可以包括A2和A24血清，接收激活的淋巴细胞的病人的A基因座可以包括A2和A2血清。由于病人的淋巴细胞能够清除具有A24血清的供体的淋巴细胞，避免了严重的副作用，如GVHD。与A基因座一样，B、C和DR基因座同样能够产生具有排异倾向的HLA组合。
(收集淋巴细胞)本发明的源于供体的激活的淋巴细胞，可以用供体的外周血制备。从供体臂上的静脉中抽取血液简单易行，因此较好采用该方法。只要血液中含有淋巴细胞，对采集血液的位置没有特别的限制。此外，也可以采用脐带血中的淋巴细胞。只需要采集少量的外周血，其范围在0.001毫升至500毫升之间。在实际应用中，所采集的外周血量较好在大约10毫升至100毫升之间。
(对淋巴细胞的调节)可以在收集的外周血中加入肝素或柠檬酸防止凝血。本发明的源于供体的激活的淋巴细胞可以如此获得以所收集的外周血作为基础材料，从外周血中得到淋巴细胞，然后通过孵育增殖并激活淋巴细胞。另外，本发明的激活的淋巴细胞也可以通过提取法或类似的方法从供体的骨髓中制得。需要注意的是，在对本发明进行解释时，对所收集的淋巴细胞进行“孵育”中的术语“孵育”是指通过将少量的细胞组织样品放置于培养液中进行人工增殖(孵育)组织细胞，培养液中含有细胞生长所必需的营养素。术语“增殖”是指在体外通过上述的孵育而人为地使组织细胞在数量上得到增长。另外，术语“激活”是指施加的控制以激活某个静止的功能，通过在培养液中加入增殖剂或激活剂从而刺激细胞，尤其是，施加的控制使细胞具有抗肿瘤、抗病毒以及抗自身免疫性疾病的特性。
(增殖和激活源于外周血的淋巴细胞)源于所收集的外周血的激活的淋巴细胞可以通过现有技术中的任一种淋巴细胞的孵育方法进行增殖。对于所采用的孵育方法没有特别的限制，例如日本的未审查专利申请NO.H3-80076中公开，使用白介素2或抗CD3抗体或两者的组合以孵育激活的淋巴细胞。较好地，在白介素2和抗CD3抗体同时存在的情况下对淋巴细胞进行孵育，从而达到更好的增殖效率。
除了上述利用白介素2和抗CD3抗体的对淋巴细胞进行多克隆增殖/激活之外，也可以通过以下方法得到具有抗原特异性的激活的淋巴细胞，如前所述，首先利用适当的抗原等产生抗原特异的T淋巴细胞等，然后使用CD3抗体，CD26抗体，各种促细胞分裂剂和细胞因子，例如白介素2之一或联合使用上述物质。
或者，抗原特异性的激活的淋巴细胞可以从实施方案中的激活的淋巴细胞进行筛选而得到，也可以通过使用合适的抗原而得到，也可以通过抗原刺激，然后增殖并激活淋巴细胞而得到。在这种情况下，抗原特异性淋巴细胞可以从CD8+细胞或CD4+细胞中得到。
除了精制抗原外，癌细胞或病毒的提取物，癌细胞本身或病毒本身，或任何与癌细胞或病毒细胞具有交叉反应性的抗原物质均可以用于上述目的。只要上述任一种物质具有增殖和激活淋巴细胞的功能都可以用于该过程中。此外，在该过程中使用的白介素2是一种可以在市场买到的商品，其必须是可以溶解的，能够在孵育培养液中达到1-2000U/ml的浓度。
白介素2可以溶于和用于任何广泛用于细胞孵育的培养液中，例如，水，生理盐水，杜伯科氏(Dulbecco’s)磷酸缓冲盐溶液，RPMI-1640，MDM，AIM-V。一旦白介素2溶于培养液中，该溶液必须冷冻保存，以确保白介素的活性不会降低。应当注意的是，对用于此目的的孵育培养液类型并没有特别的限制，只要该培养液适用于孵育淋巴细胞。例如可以使用源于生物体的培养液，例如，血清，或在平衡盐水中加入氨基酸、维生素、核酸碱基等而得到的合成培养基。较好的孵育培养液包括RPMI-1640、AIM-V、DMEM、IMDM。其中，特别优选RPMI-1640。
尽管使用含有正常人血清的孵育培养液能够更好地进行增殖，但是也可以使用在市场上可以购买到的培养液产品。此外，除了人类血清之外，还可以使用源于牛胚胎的血清。另外，可以使用不含血清的培养液。可以采用任何普遍应用的孵育方法进行孵育，例如，在CO2孵育箱中进行孵育。在这种情况下，CO2浓度较好维持在1-10％的范围内，更好地，在3-7％范围内，温度维持在30-40℃，更好地，在35-38℃。
尽管对孵育的天数没有特别的限制，但是其前提条件是，必须孵育足够长的时间以使源于抗CD3抗体的刺激信息能够传递给细胞。因此，孵育时间较好持续约2-20天，较理想地是，孵育淋巴细胞3-14天，而使刺激物信息稳定地传递给细胞，同时达到更好的孵育效率。更好地是，在孵育期间，对细胞进行显微镜观察，必要时对细胞数量进行检测，并在需要时补充培养液，从而达到更好的孵育效率。
应注意的是，在孵育开始后的1-2天之内，观察不到细胞数量发生明显地增长，在第3天左右首次观察到细胞的增殖，一旦细胞数量开始激增，培养液的颜色将从橙色变成黄色。此外，相对于补充前的培养液的量，应以约10％-500％的比率补充培养液。而且，培养液应每1-7天补充一次，更好地是，每3-5天补充一次，以防止培养液发生降解，并维持白介素2的活性水平。
而且，当在抗CD3抗体存在的环境下进行的孵育结束时，孵育过程可以在没有抗CD3抗体刺激的情况下继续进行。也就是说，可以使用固相中不含有抗CD3抗体的设备，例如，孵育瓶，滚瓶，孵育透气包继续进行孵育，直至给予淋巴细胞。
当按照如前所述对淋巴细胞进行继续孵育时，其孵育条件必须与抗CD3抗体影响下的初始孵育条件一致，除了第二次孵育不需要有抗CD3抗体的刺激。为了更加容易操作，具有更好的性能价格比以及更加安全，较好地是，调节人类血清的浓度，或必要时使用不含血清的培养液。
将含有白介素2的孵育培养液和脐带血或悬浮于其中的单核细胞放于孵育容器中时，孵育过程开始，其中孵育容器的固相中含有抗CD3抗体。在这种情况下，必要时在培养液中加入不同的细胞因子或促细胞分裂剂，进一步提高增殖和激活淋巴细胞的效率。应注意的是，尽管在动物或细胞中使用经提纯的CD3分子能够产生刺激淋巴细胞的抗CD3抗体，但是也可以使用市场上销售的、具有良好稳定性和性能价格比的OKT-3抗体(生产者Orthopharmaceutical)。
然而，只要能够促进淋巴细胞的增殖和激活，对于所使用的刺激淋巴细胞的抗体类型没有任何限制。例如抗CD20抗体可以取代抗CD3抗体。此外，为了得到更好的增殖淋巴细胞的效率，同时更加容易操作，较好使用固相抗CD3抗体。抗体可以用在由玻璃、聚亚胺酯、聚烯烃或聚苯乙烯构成的孵育容器的固相中。市售的、较易得到的、经消毒的由塑料等构成的细胞培养瓶可以用于此目的。在这种情况下，可以选择适宜大小的培养瓶。
另外，通过在容器中加入抗CD3抗体的稀释液，然后在4-37℃的温度下，使该容器静置2-24小时，可以将抗体导入固相中。较好的是，当将抗CD3抗体处理至固相中时，抗CD3抗体应该用生理缓冲液稀释至浓度为0.1-30μg/ml，例如，经消毒的Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液。当固相制成后，抗CD3抗体可贮存在冷藏室或冰箱中(4℃)直至使用。在这种情况下，在使用时取出液体，用生理缓冲液，例如Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液，在室温下进行冲洗从而得到供使用的抗CD3抗体。
所得到的源于供体外周血中的激活的淋巴细胞可以加工或制备成制剂，该制剂作为一种生物防御措施在预防/治疗肿瘤和感染性疾病中具有广泛的应用。此外，含有CD4+细胞和CD8+细胞的源于供体外周血中的激活的淋巴细胞具有更好的抗肿瘤效果。
此外，如果存在有发生GVHD等副作用的风险时，所得到的源于外周血的激活的淋巴细胞可以用抗CD4抗体等进行处理，从而得到治疗中所使用的、其主要成分为CD4+细胞的细胞群。另一方面，当副作用例如GVHD的风险很低时，或者需要更高的抗肿瘤效果时，可以在治疗中直接使用含有CD8+细胞的源于外周血的激活的淋巴细胞。在后一种情况中，激活的淋巴细胞可以作为一个细胞群用于治疗中，其中CD8+细胞的含量被调节到适当的水平上。
(源于外周血的激活的淋巴细胞为主要成分的制剂)从外周血获得的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞，其中的主要成分为增殖的外周血细胞，可以制备成制剂，例如将其悬浮于含有人白蛋白的生理盐水中从而制备成制剂，该制剂用作输液。所制成的制剂用于预防和治疗肿瘤以及感染性疾病。应注意的是，此处术语“制剂”是指以激活的淋巴细胞为主要成分的具有生物防御性功能的所有物质。该制剂可以为任何形态，只要其含有源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞，该淋巴细胞来自于供体的外周血。
例如，该制剂的形式可以为，源于外周血的HLA相匹配的激活的淋巴细胞悬浮于适当的溶液中。但较好的制剂形式为上述的将源于外周血的激活的淋巴细胞悬浮于含有人白蛋白的生理盐水中而制成，该制剂作为输液用。但是本发明并不仅仅局限于此。此外，可以通过在试管内直接增殖外周血来制备制剂，其中源于外周血的激活的淋巴细胞为其主要成分，或者，首先从外周血中分离出单核细胞，然后在试管内增殖分离出的单核细胞从而得到该制剂，其中源于外周血的激活的淋巴细胞为该制剂的主要成分。
而且，可以将不同的基因引入到包含在本发明制剂中的源于外周血的激活的淋巴细胞中，或者，删除或修饰原先存在于该激活的淋巴细胞中的任一基因。去除了其中的人类免疫缺陷病毒感染的辅助因子，该源于外周血的激活的淋巴细胞可以用于预防/治疗由病毒感染所引起的人类免疫缺陷疾病，或预防/治疗在免疫缺陷情况下所患有的感染性疾病，其中免疫缺陷状态是由人类免疫缺陷病毒所引起的。
以如上面所述从外周血中收集得到的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞为主要成分的制剂在临床上有广泛应用，可用于预防和治疗癌症患者、免疫缺陷患者、自身免疫性疾病患者、患有需要输入脐带血的疾病的患者，例如患有变态反应性疾病的患者，以及患有各种感染性疾病的患者。本发明中的制剂在预防肿瘤复发的同时，也能治疗肿瘤，其也可以用于治疗白血病和各种实体肿瘤。
而且，按照如上所述使用该制剂预防或治疗肿瘤，还可以提高病人的生活质量(QOL)。也就是说，例如，如果某种抗癌药引起慢性的肾脏或肝脏疾病，或者由于手术给该病人留下了永久性的疤痕，即使该病人所患的疾病本身得到了治愈，上述治疗的副作用或类似情况常常会降低病人的生活质量。然而，通过使用本发明中的制剂对病人进行治疗，病人的生活质量将得到显著地改善。
本发明中的以源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞为主要成分的制剂，对于治疗各种类型的癌症和肿瘤，免疫缺陷性疾病，各种类型的感染是非常有效的。上述疾病将在下文中详细描述。具体地说，在治疗肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胰腺癌、胆囊癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、白血病、肉瘤和脑瘤具有明显的疗效。同时对于治疗先天性和获得性免疫缺陷疾病方面也是非常有效的。
先天性免疫缺陷疾病包括严重的联合免疫缺陷症，Wiscott Aldrich综合征，腺苷脱氨酶缺陷，嘌呤核苷磷酸化酶缺陷，高IgM综合征，联合免疫缺陷症。本发明中的制剂可以治疗上述这些疾病之外的免疫缺陷疾病。此外，获得性免疫缺陷疾病的典型例子包括由于使用抗癌药、免疫抑制剂或类固醇所引起的继发性免疫缺陷，感染人类免疫缺陷病毒而导致的AIDS。本发明中的制剂可以用于治疗这些疾病之外的免疫缺陷疾病。
另外，可以用本发明中制剂进行治疗的自身免疫性疾病的典型例子包括，系统性红斑狼疮，慢性关节风湿病，干燥综合征，重症肌无力，恶性贫血，桥本氏病。同时还可以治疗上述以外的自身免疫性疾病。本发明中的制剂可以作为一种预防性或治疗性的措施用于治疗整体免疫能力较低的病人，也可以用来治疗那些对某种病毒或类似物没有免疫能力或者免疫能力较低的病人。可以用本发明中的制剂进行治疗的变态反应性疾病包括支气管哮喘、雪松花粉过敏、荨麻疹，同时本发明中的制剂还可以治疗其它的变态反应性疾病。本发明中的制剂还可以用于减轻各种变态反应性疾病的症状。
可以用本发明中的制剂进行治疗的感染性疾病包括病毒感染、微生物感染、真菌感染、原虫感染、衣原体感染、支原体感染。在上述疾病中，病毒感染包括巨细胞病毒感染，爱波斯坦—巴尔(Epstein-Barr)病毒感染。此外，本发明的制剂并不局限于对这几种病毒感染的治疗，其在预防和治疗其它各种病毒感染中具有广泛的应用，例如疱疹病毒，包括单纯疱疹病毒、水痘—带状疱疹病毒，包括人类白血病病毒和人类免疫缺陷病毒的各种逆转录病毒，腺病毒以及柯萨奇病毒。
可以用本发明中的制剂进行治疗的微生物感染包括绿脓杆菌引起的感染，耐新青霉素的金黄色葡萄球菌引起的感染。本发明中的制剂也可以用于治疗由对人类具有病原性的细菌所引起的感染性疾病。特别是，本发明中的制剂可以有效地预防和治疗由不明病原体所引起的感染性疾病，以及由不容易确定的病原体所引起的感染性疾病，或有效地预防和治疗由上述感染所导致的疾病。
之前所描述的微嵌合状态可以通过PCR(聚合酶链反应)分析很容易地检测出来。例如，当测量HLA-A基因座上A-24的微嵌合状态时，首光用HLA-A基因座引物放大反应，使用一个A-24引物进行嵌套式(mested)PCR反应，然后用适当的检测系统检测是否存在微嵌合状态，以便确定微嵌合状态的存在/缺乏。
(用于制备制剂的制备试剂盒，其中制剂的主要成分是源于外周血的激活的淋巴细胞)尽管本发明中源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞可以作为一种单独的试剂，其还可以与含有白介素2的培养液，含有固相抗CD3抗体的烧瓶一起，制备在同一个试剂盒中。在后面一种情况下，使用该试剂盒可以非常容易地制备出本发明中的制剂。
应注意的是，可以将适量的用于制备制剂的培养液事先倒入用固相抗CD3抗体包被的各个烧瓶中，然后将这些烧瓶放于冰箱中冷冻贮存。将激活的淋巴细胞以及至少两种如上所述的试剂制备于同一试剂盒中，在需要激活的淋巴细胞时，可以很容易地通过该试剂盒而制备出本发明中的制剂。由外周血或含有上述激活的淋巴细胞的制剂所制备而成的、可用于本发明所有用途的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞可以冷冻保存于冰箱中，这样就可以随时用于预防和治疗各种疾病。
(剂量)尽管应根据具体病人的状态或具体治疗目标调整制剂的剂量，其中制剂的主要成分为从外周血制备成的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞，在正常情况下，该制剂的标准剂量为每公斤体重1×102-1×109个淋巴细胞。此外，为了进一步增强效果，剂量较好为每公斤体重1×103以上的淋巴细胞。但是，一旦剂量超过每公斤体重5×108个淋巴细胞，其效果就再也不能增加。因此，最佳的剂量范围为每公斤体重1×103-5×108个淋巴细胞。
(给药方式和方法)应以液体形式给予上述制剂，即，注射或滴注。更具体地说，较好地以注射液或滴注液的形式给予如上文所述制备而成的细胞，在该注射液或滴注液中，上述细胞分散于生理盐水中，其中生理盐水中含有浓度为0.01-5％的人血清白蛋白。应以静脉滴注、静脉注射、动脉注射或局部注射的方式给予该制剂。应根据给药方法、给药部位等对所给予的溶液量进行调整，但是在正常情况下，较好给予1-500ml的溶液，同时，确保溶液中含有前述需要量的淋巴细胞。此外，给药的频率为一天一次至一月一次，所述淋巴细胞应至少给予一次以上。
(实施例1)第一步，(采集血液和分离淋巴细胞)向注射器中添加肝素，从与急性淋巴细胞白血病患者HLA完全相匹配的供体的静脉中采集20ml外周血，然后在无菌条件下的清洁工作台上，从注射器上拔出针头，换上19G×11/2″的注射针头。事先向两个50ml离心管(制造商Iwaki玻璃有限公司，2341-050)中分别注入15ml洗液(RPMI 1640+6)(500ml，制造商Nikken生物医学研究中心，GM1106)。然后，用培养液稀释所收集到的血液从而将溶液量增加至三倍。缓慢地将所得到的全部混合液倒入上述两个离心管中，从而使两管中所倒入的混合液量恰好相等。
盖好离心管的盖子，翻转并振荡两到三次，用10ml的吸管吸取3mlLymphocepar 1(100ml，制造商免疫生物研究中心有限公司，23010)并分别注入6个15ml的离心管中。然后，为了不破坏每个离心管中所形成的液体表面，缓慢地将10ml已经用培养基稀释的血液注入每个离心管中，并分层位于Lymphocepar 1上面。离心管在离心温度为20℃，转速为1800rpm的条件下离心15分钟。
离心过程结束后，在无菌条件下，用吸出器缓慢地吸出每个离心管中的内容物，并使液面降至淋巴细胞层上面约1cm的地方，以防止将淋巴细胞吸出。然后，用5ml的移液管吸出淋巴细胞层，而不吸出血液凝结层，然后将吸出的淋巴细胞层收集到事先已经注入25ml洗液(RPMI 1640+6)的50ml离心管中。盖好盖子，反复倒置离心管，进行轻微的振荡和混合。再次将离心管放入离心机中，在温度为20℃，转速为1800rpm的条件下离心10分钟。
离心后，将上清液去除，使细胞沉淀物完全分散开来，并进行搅拌。测定完细胞数目之后，将细胞以0.5×106/ml的浓度悬浮于PBS中。细胞与DynabeadsCD4(进口商/销售商Veritas)以1∶4的细胞/珠比例相混合，并放入15ml体积的离心管中。混和物在4℃下孵育30分钟。将磁铁(进口商/销售商Veritas)置于离心管的外壁上，从而收集与Dynabeads CD4结合的CD4阳性细胞。没有与Dynabeads CD4结合的细胞在无菌条件下用吸出器吸出。
然后将与Dynabeads CD4结合的细胞放于振荡搅拌器中使其完全分散开来。通过反复地倒置，轻轻地将其与50ml的孵育培养液进行混合。所述孵育培养液制备如下将1ml浓度为3500U/ml的白介素-2(制造商Cetus)以及5ml人类血清加到44ml培养液中(RPMI 1640+7，制造商免疫生物研究中心有限公司)，制备细胞悬浮液。
将10μl细胞悬浮液放入试管(进口商/销售商Assist有限公司，72.690)中，然后将悬浮液与40μl Türk溶液相混合。取10μl混合液放入血球计上(制造商Elmer公司，9731)，在显微镜下观察细胞的数目。细胞的总数量为1.0×107～7.0×107。
第二步(制备用OKT3包被的烧瓶)将10ml用PBS(-)稀释的浓度为5μg/ml的OKT3溶液(进口商/销售商Jansen Kyowa有限公司，制造商OrthopharmaceutialOKT3注射液)加入到基底面积为225cm2的培养瓶中，并使瓶底部被溶液均匀覆盖。
第二天，用吸出器将烧瓶中的OKT3溶液吸出，然后将50ml PBS(-)注入烧瓶中。盖好盖子均匀摇晃烧瓶，然后打开盖子，将其中的液体倒出。然后，在无菌状态下，将50ml PBS(-)注入烧瓶中，盖好盖子均匀摇晃烧瓶，然后打开盖子，将其中的液体倒出。留在烧瓶内部以及盖子上的水分要用吸出器完全吸净，这样用OKT3包被的烧瓶就制备好了。
第三步(淋巴细胞的激活孵育)将50ml上述第一步(采集血液和分离淋巴细胞)中所制备的细胞悬浮液注入第二步(制备用OKT3包被的烧瓶)中所制备的用OKT3包被的烧瓶中，然后在37℃下孵育，环境中CO2气体的浓度为5％。三天后，向烧瓶中加入50ml的孵育培养液，并在37℃下孵育，环境中CO2气体的浓度为5％。四天后，向烧瓶中加入150ml的孵育培养液，并在37℃下孵育，环境中CO2气体的浓度为5％。最后一次补充培养液后，在37℃下孵育两天，环境中CO2气体的浓度为5％。最后，得到了2.0×108～7.0×108个激活的淋巴细胞。
第四步(淋巴细胞的增殖孵育)将上述第三步(淋巴细胞的激活孵育)中所制备的淋巴细胞转移至含750ml的LL-7(Nikken生物化学研究中心)培养液的透气性孵育包中，然后在CO2孵育箱(CDP-300A；Hirasawa有限公司)中孵育上述经转移的淋巴细胞，其中温度为37℃，CO2气体的浓度为5％。
四天后，用一无菌接合装置(制造商Terumo)将含有细胞的透气性孵育包(制造商Nipro culture bag A-1000)与另外一个包含新的培养液的透气性孵育包接合起来，并使两个透气性孵育包中的培养液均匀混合。然后，切断两个孵育包之间的连接，并对接合部位进行无菌性的密封。在37℃，CO2气体浓度为5％的条件下对细胞进行孵育。
第五步(制备供给药的制剂)三天后，将两个透气性孵育包中的含有细胞的培养液转移至250ml的离心管中。通过离心分离出细胞。接着，通过倾注法除去培养液，在细胞沉淀中加入生理盐水使细胞重新悬浮起来，并进行离心洗涤。随后，用含有人类白蛋白的生理盐水代替上述的生理盐水进行类似的洗涤，其中白蛋白的浓度为0.1％，这样就对细胞沉淀进行了调节。
接下来，向细胞沉淀中加入200ml含2％人类白蛋白的生理盐水，从而使细胞悬浮起来。然后用100μm的不锈钢网过滤该悬浮液。将得到的制剂转移至输血袋中以供施用。需要指出的是，转移至输血袋的细胞的数目为0.5～10×109。
第六步(制剂的冷冻保存)必须指出的是，必要时，上述第五步(制备供给药的制剂)中所制备的激活的淋巴细胞可以冷冻保存在冰箱中。下面对将制剂冷冻保存在冰箱中的具体实施方案进行解释。对上述第五步(制备供给药的制剂)中所制备的激活的淋巴细胞进行离心分离，通过倾注的方法将孵育培养液除去，从而得到细胞沉淀。然后向细胞沉淀中加入18ml细胞保存液(将5ml人类血清和5ml二甲亚砜(制造商Nakaraitesky，在此简称为DMSO)混合而制备得到)和40ml细胞培养液(RPMI 1640+7)。将细胞沉淀和保存液进行均匀地混合，然后向5个5ml的细胞保存管(5×107个细胞/管)中分别注入3ml混合物。然后将这些保存管放于超低温度的冰箱中，并在-80℃下保存。
另外，使用时冷冻的细胞必须解冻并使其溶解，首先将冷冻的细胞从冰箱中取出，然后用37℃的加热块(制造商Titek公司，TAL-IG)加热4分钟。在无菌条件下取出约3ml含有细胞的细胞保存液解冻，使其溶解，然后放入15ml的离心管中，加入10ml培养液使细胞悬浮于液体中，然后通过离心使细胞分离(速度1000rpm，温度20℃，时间5分钟)。随后，通过倾注法将上清液除去，采用如上1～4所述的方法对细胞进行孵育，采用上述第五步(制备供给药的制剂)所述的方法制备供给药的制剂。我们也可以通过用生理盐水冲洗经解冻和溶解的细胞，然后添加10ml含有5％人类血清的生理盐水使细胞悬浮于液体中，从而制备上述供使用的制剂。
第七步(制剂的给药)对于尚未进行造血干细胞移植的急性淋巴细胞白血病患者，通过静脉注射上述第五步(制备供给药的制剂)中所制备的制剂或者如上述第六步(制剂的冷冻存储)中的保存在冰箱中的制剂。对于显示对各种化疗药物具有耐药性的急性白血病患者，以及通过化疗并没有达到缓解状态的急性白血病患者，应给药30次。每次注射1.7×108～4.2×109个细胞，每隔几天至每隔12天给药一次(通常是每隔7天给药一次)。
第八步(效果的评价)当病人在输入源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞之前所进行的各种化疗被证实无效，而且白血病细胞数量增加的时侯，给予病人源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞之后，能观察到以下效果(1)白血病细胞没有明显的增加，相反观察到有减少的趋势(抗肿瘤效果)；(2)在治疗过程中病人没有发生严重的感染，可以观察到中性粒细胞增加(给药后以500/μl或更高的速率增加)(抗感染性疾病的效果)；以及(3)在治疗初期，病人的痛苦减少(提高了病人的生活质量以及抗自身免疫性疾病的效果)。
因此，可以证实，源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞对于肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病来说，是一种有效的预防和治疗手段，并且可以提高病人的生活质量。另外，用源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞进行治疗几乎没有观察到任何副作用，也没有观察到GVHD症状或者高烧等。
(实施例2)如实施例1制备激活的淋巴细胞，不同之处在于外周血取自显示与急性髓细胞性白血病患者具有微嵌合状态的血亲(与病人有2个HLA基因座相匹配)。如实施例1制备供给药的制剂，向尚没有进行造血干细胞移植的急性髓细胞白血病患者静脉注射该制剂，该制剂只给药一次。给药后三天，观察到病人外周血中的白血病细胞减少，七天以后，病人外周血中的白血病细胞完全消失。因此，可以证实，源于有微嵌合状态的供体的激活的淋巴细胞具有抗肿瘤效果。
(实施例3)如实施例1制备激活的淋巴细胞，不同之处在于外周血取自显示与肾癌患者有微嵌合状态的血亲(与病人有2个HLA基因座相匹配)。如实施例1制备供给药的制剂，向肾癌患者静脉注射该制剂，共给药三次，每月一次。第一次给药两个星期后，观察到肾癌部分减小，第三次给药两个星期后，肾癌完全消失。因此，可以证实，源于有微嵌合状态的供体的激活的淋巴细胞有抗肿瘤效果。
如上实施例所述，激活的淋巴细胞作为肿瘤、病毒感染和自身免疫性疾病的预防和治疗措施，是非常有效的。所述激活的淋巴细胞可以通过以下方法获得，收集并激活HLA相匹配的供体的淋巴细胞，然后用白介素-2和抗-CD3抗体等来刺激并增殖。此外也明确证实，源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞对于抗肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病是有效的，同时在提高病人的生活质量上也是有效的。源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞作为肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的预防和治疗措施，是非常有效的。
另外，源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞几乎没有任何不良的副作用，也没有观察到GVHD症状或者高烧等的发生。
另外，本发明不仅可以用于治疗诸如癌症等肿瘤以及各种感染性疾病，防止肿瘤的复发以及预防肿瘤和感染性疾病，也可以用于提高病人的生活质量，这是通过减轻恶病质以及改善病人的食欲而达到的。本发明的制剂可以作为一种预防性和治疗性措施，用于治疗白血病以及实体肿瘤。
特别是，将本发明与另外的治疗方法，例如化疗或放射疗法，相结合，或者是将本发明与其他的免疫疗法相结合，本发明的优点可以进一步增强。另外，本发明也可以改善接受造血干细胞移植前病人的身体状况。
另外，通过以下途径可以大大地提高淋巴细胞激活的稳定性及其效率至少用白介素2和抗-CD3抗体中的一种来激活源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞；用适当的抗原等得到具有抗原特异性的T淋巴细胞等，然后用CD3抗体、CD26抗体或例如白介素2的细胞因子之一或者上述物质的组合得到抗原特异性的激活的淋巴细胞；或者，对用某一抗原刺激物从CD8阳性细胞或者CD4阳性细胞得到的抗原特异性淋巴细胞进行增殖并激活，从而得到具有抗原特异性的激活的淋巴细胞。然后，制备用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病以及自身免疫性疾病的包含激活的淋巴细胞的制剂，该制剂容易制备，并且方便给药。在该意义上，本发明对于再生医药领域的进一步发展具有很大的贡献。
以悬浮液的形式制备含有经增殖并激活的淋巴细胞的制剂，其中所述淋巴细胞悬浮于含有人类白蛋白的生理盐水中，则给药时，有效激活的淋巴细胞数目减少的程度就会降低。
另外，确保供给药的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞中含有具有排异倾向的HLAs，发生GVHD的风险会进一步降低。
使用从存在微嵌合状态的供体中所收集得到的淋巴细胞，可以得到更有效的用于预防和治疗肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的激活的淋巴细胞，同时，也会减少例如GVHD等副作用的发生。如果使用含有CD8和CD4阳性细胞的激活的淋巴细胞，这些优点会更加明显。
将源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞作为一种制备试剂盒进行销售，该试剂盒用于制备激活的淋巴细胞，至少由HLA相匹配的淋巴细胞以及用于激活淋巴细胞的白介素2组成；该制备试剂盒或者用于制备含有源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞的制剂，则即使在很偏远的地方，也能很容易地得到本发明中的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞。即使没有高深的知识以及丰富的经验，也可以增殖并激活源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，并用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病以及自身免疫性疾病。
生产用于预防和治疗肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的含有淋巴细胞的制剂的方法，包括以下步骤从含有源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞的外周血中分离出单核细胞；对分离出的单核细胞中的源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞进行激活并增殖，例如至少使用白介素2或者抗-CD3抗体中的一种进行激活并增殖；提取经激活并增殖的淋巴细胞；制备成以所述激活的淋巴细胞为主要成分的制剂。因此，可以有效地生产出含有源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞的制剂，同时，使防止有效淋巴细胞的活性以及数目的减低成为可能。
孵育增殖淋巴细胞的过程中，相对于3～14天的孵育周期中的孵育培养液的量，以10％～500％的比率补充培养液。为了防止培养液的降解和白介素2的活性降低，在3～14天的孵育期内，每隔3～5天培养液就必须补充一次培养液。而且，在通过孵育而激活并增殖淋巴细胞的同时，加入各种细胞因子或促细胞分裂素，将进一步增强激活的淋巴细胞的效果。
另外，已经证实，被激活并增殖的含有CD4阳性细胞和CD8阳性细胞的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞比仅含有CD4阳性细胞的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞甚至更加有效。
权利要求
1.一种用于预防和治疗肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述淋巴细胞通过激活源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞来获得。
2.如权利要求1所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞用白介素2来激活。
3.如权利要求1所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞用抗-CD3抗体来激活。
4.如权利要求1、2或3所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞为抗原特异性激活的淋巴细胞，它是通过先利用适当的抗原诱导抗原特异性的淋巴细胞，然后用CD3抗体、CD26抗体和白介素2之一或者CD3抗体、CD26抗体和白介素2的组合而获得。
5.如权利要求1至4之一所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于通过以下方式制备和使用所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，首先激活并增殖所收集的源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，然后通过筛选而选择抗原特异性的激活的淋巴细胞，或者用适当的抗原来诱导抗原特异性激活的淋巴细胞。
6.如权利要求1至4之一所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞通过制备已经被抗原刺激激活并增殖的抗原特异性淋巴细胞而得到。
7.如权利要求4至6之一所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述抗原为精制抗原，癌细胞或者病毒的提取物，癌细胞或者病毒，或者与癌细胞或病毒具有交叉反应的抗原物质。
8.如权利要求1至7之一所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞含有具有排异倾向的HLAs。
9.如权利要求1至7之一所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞从具有微嵌合状态的供体中收集。
10.如权利要求1至9之一所述的预防和治疗淋巴细胞，其特征在于所述淋巴细胞的正确剂量是每公斤体重1×103～5×108个细胞。
11.一种用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂，其特征在于获得源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞。
12.如权利要求11所述的预防性和治疗性制剂，其特征在于通过将已经被激活和增殖的淋巴细胞悬浮于含有人类白蛋白的输注生理盐水中而制备得到所述制剂。
13.如权利要求n或12所述的预防性和治疗性制剂，其特征在于所述淋巴细胞的正确剂量是每公斤体重1×103～5×108个细胞。
14.一种制备制剂的试剂盒，其特征在于至少由源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞以及用于激活所述淋巴细胞的白介素2的组合组成。
15.一种制备制剂的试剂盒，其特征在于至少由源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞以及用于激活所述淋巴细胞的抗-CD3抗体的组合组成。
16.一种用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于包括以下步骤从含有源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞的外周血中分离出单核细胞；激活并增殖存在于所分离出的单核细胞中的所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞；将已经被激活和增殖的所述淋巴细胞提取出来，并制备成以所述淋巴细胞为主要成分的制剂。
17.如权利要求16所述的用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于使用孵育培养液在3～14天的持续孵育周期内增殖所述淋巴细胞，其中所述培养液组合了白介素2或抗-CD3抗体或者同时组合了这两种物质。
18.如权利要求16或17所述的用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于在通过孵育而增殖所述淋巴细胞时，为了避免所述孵育培养液降解以及白介素2活性水平的降低，相对于3～14天的孵育周期中孵育培养液的量，以10％～500％的比例补充培养液。
19.如权利要求18所述的用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于在3～14天的孵育期中，每隔3～5天补充一次所述培养液。
20.如权利要求16至19之一所述的用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于在通过孵育而激活和增殖所述淋巴细胞时，向培养液中添加各种细胞因子或促细胞分裂剂。
21.如权利要求16所述的用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于已经被激活和增殖的所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞中包括CD4阳性细胞和CD8阳性细胞。
22.一种用于预防和治疗患有肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的患者的预防和治疗方法，其特征在于给予所述患者如权利要求1所述的淋巴细胞。
23.如权利要求22所述的预防和治疗方法，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞用白介素2激活。
24.如权利要求22所述的预防和治疗方法，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞用抗-CD3抗体激活。
25.如权利要求22、23或24所述的预防和治疗方法，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞为抗原特异性激活的淋巴细胞，它是通过先利用适当的抗原诱导抗原特异性的淋巴细胞，然后用CD3抗体、CD26抗体和白介素2之一或者CD3抗体、CD26抗体和白介素2的组合而获得。
26.如权利要求22至25之一所述的预防和治疗方法，其特征在于通过以下方式制备和使用所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，首先激活并增殖所收集的源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，然后通过筛选而选择抗原特异性的激活的淋巴细胞，或者用适当的抗原来诱导抗原特异性激活的淋巴细胞。
27.如权利要求22至26之一所述的预防和治疗方法，其特征在于所述淋巴细胞的正确剂量是每公斤体重1×103～5×108个细胞。
全文摘要
根据本发明，对患有肿瘤、病毒感染以及自身免疫性疾病的患者具有很高疗效的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞可以通过以下方法制备得到收集源于HLA相匹配的供体外周血中的细胞，或者收集源于HLA相匹配的、并具有微嵌合状态的供体的外周血中的细胞；然后，用例如白介素2、抗CD3抗体等物质激活并增殖所收集到的细胞。由此制得的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞可以用于预防和治疗HLA相匹配的患有肿瘤、病毒感染以及自身免疫性疾病的患者。
文档编号A61K47/02GK1481901SQ0313123
公开日2004年3月17日 申请日期2003年4月8日 优先权日2002年4月8日
发明者黒岩保幸, 森尾友宏, 清水则夫, 关根晖彬, 夫, 宏, 岩保幸, 彬 申请人:淋巴细胞技术株式会社
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞，使用所述激活的淋巴细胞的治疗方法，该淋巴细胞作为主要成分的制剂，生产该制剂的方法，以及用于制备该制剂的试剂盒。本发明的目的是更有效地治疗及预防肿瘤，例如癌症，以及感染性疾病。
背景技术：
近年来，淋巴细胞作为一种关键性的生物防御措施用于支持免疫系统，受到了广泛的关注。T淋巴细胞在细胞介导免疫中起着极其重要的作用。根据它们的单克隆抗体的反应性，对T淋巴细胞进行以下分类，例如，显示能与抗CD3抗体反应的T淋巴细胞(CD是指“分化簇”)被分类为CD3阳性细胞。到目前为止，已经对T淋巴细胞进行了重要的定量和定性研究，特别是关于所显示的抗原与其功能之间的关系。
另外，本发明的发明人之一，Sekine先生，曾在日本的未经审查的专利申请NO.H0380076中报道，通过使用固相抗CD3抗体(用淋巴细胞包被)和白介素-2能够使淋巴细胞增殖。增殖得到的自体淋巴细胞具有显著的抗肿瘤效果。另外，还有许多研究者也报道过，源于外周血等的淋巴细胞可以通过抗CD3抗体或白介素-2而得到增殖，所得到的自体淋巴细胞显示具有抗肿瘤的活性。
而且，供体白细胞输入(下文中简称为“DLT”)以及供体淋巴细胞输入(下文中简称为“DLI”)是两种较为成熟的治疗方法，当经过骨髓移植的病人中自血病复发时，通过上述两种方法引入大量的供体骨髓中的淋巴细胞。同时，近年来HLA相匹配母亲和孩子之间所显示的免疫耐受证实了微嵌合状态的存在。因此目前从事了大量的研究工作，其目的是利用微嵌机制迅速地在病人中诱导缓解状态，从而使器管移植更加安全。众所周知，当同胞之间产生微嵌合微嵌合时，同胞之间肾移植的成功率非常高。
然而，上述对T淋巴细胞以及诱导微嵌合状态的研究仍然处于实验阶段，目前还没有将上述研究用于实践的应用技术。此外，不能通过简单地对收集到的自体淋巴细胞进行增殖而始终确保其具有有效地抗肿瘤效果，特别是在癌症中。还必须强调，在实施DLT治疗中其相对比较困难。
根据每个白细胞所属的白细胞群，即HLAs(人类白细胞抗原)，将白细胞分为许多不同的“基因座”。在这些基因座中，DQ，DP，A，B，C以及DR基因座在器官移植中是必须经过仔细检查的关键因素。这些基因座每个都是由两个基因拷贝构成，其中一个来源于父亲，另一个来源于母亲(等位基因)。而且每个基因座都具有多态性。因此，从广义上来讲，输血，包括移植(例如外周血肝细胞移植)和DLT中，供体和病人中必须至少有四对HLA基因座相匹配，8个HLA分子之间的符合率是非常关键的因素。
在上述情况下，病人和供体的白细胞HLA完全相配几乎不可能的。实际上，只要主要的HLAs相匹配，则就可以采用骨髓移植或输血。然而，某个HLA不匹配将导致致死性的副作用，即病人在接受骨髓移植或DLT治疗后，发生的致死性的输血后移植物抗宿主疾病(下文简称“PT-GVHD”)另外，由于在进行器官移植或输血前表现出器官疾病和感染性疾病，即使有HLA相匹配的供体，许多病人仍然不能进行骨髓移植或输血。对于那些不选择进行骨髓移植的癌症患者，通过给予源于供体的淋巴细胞来尝试对其进行治疗，但是仍未证实上述尝试是非常有效的综上所述，当不选择进行骨髓移植时，自体(源自于病人的)淋巴细胞或源于供体的淋巴细胞的抗肿瘤效果并不令人满意，而且到目前为止，它们的抗病毒效果以及对自身免疫性疾病的效果还不清楚。另外还有一个问题是，如果不寄希望于淋巴细胞供体的话，淋巴细胞不可能被大量地制备。再者，必须与造血干细胞移植结合进行的DLI作为一种治疗选择有很大的限制，其原因是，如果病人不能进行造血干细胞移植的话，DLI就不能进行，同时，由于DLI必须结合干细胞移植进行，其需要高的HLA符合率，因此，找到HLA相匹配的供体的可能性就非常低。
发明内容
因此，本发明的发明人在研究具有高的抗肿瘤、抗病毒、抗自身免疫性疾病效果的源于供体的淋巴细胞及其制备方法方面作了大量的研究工作，从而完成了本发明。
本发明涉及源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞，制备所述激活的淋巴细胞的方法，以及通过给予所述激活的淋巴细胞，治疗HLA相匹配的患有肿瘤、病毒感染或自身免疫性疾病的病人，上述淋巴细胞作为主要成分的制剂，该制剂的生产方法，用于生产该制剂的试剂盒。所述淋巴细胞具有高的抗中瘤、抗病毒效果，同时其在治疗自身免疫性疾病方面证实非常有效。通过收集HLA相匹配的供体外周血中的细胞，或收集源于能够与病人发生微嵌合的HLA相匹配的供体外周血中的细胞，然后，例如，使用白介素-2，抗-CD3抗体或类似物刺激这些细胞并使它们增殖，从而得到上述淋巴细胞。
下文中将对本发明进行详细地描述。但是总的来说，本发明的特征在于，通过收集HLA相匹配的供体外周血中的细胞，或收集表现出微嵌合状态的HLA相匹配的供体外周血中的细胞，然后刺激并增殖这些细胞，从而制备出源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞。
所收集的细胞可以通过使用，例如白介素-2和抗-CD3抗体，对其进行多克隆的激活，从而刺激这些细胞并使它们增殖。此外，用适当的抗原等得到具有抗原特异性的T淋巴细胞等，然后用CD3抗体、CD26抗体和例如白介素2的细胞因子中的一种或者上述物质的组合得到具有抗原特异性的激活的淋巴细胞。另外，对所收集的源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞进行增殖和激活后，可以通过筛选而选择具有抗原特异性的激活的淋巴细胞，或通过使用一种合适的抗原诱导源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，从而得到抗原特异性的淋巴细胞。
或者，具有抗原特异性的激活的淋巴细胞可以通过筛选上述的激活的淋巴细胞而选择得到，或者，通过抗原刺激以增殖和激活淋巴细胞从而得到抗原特异性激活的淋巴细胞。在这种情况下，抗原特异性淋巴细胞可以源于CD8+细胞或CD4+细胞。除了提纯的抗原外，癌细胞或病毒的提取物，癌细胞本身或病毒本身或任何与癌细胞或病毒细胞具有交叉反应性的抗原物质均可以用于上述目的。
在本发明的一个具体方式中，源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞用于预防或治疗肿瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病。
此外，根据本发明，含有源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞的制剂用于预防或治疗肿瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病。
而且，本发明提供了一种治疗方法，该方法使用源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞或含有源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞的制剂，用于预防或治疗肿瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病。
本发明进一步提供了一种制备试剂盒，该试剂盒用于制备激活的淋巴细胞，或一种至少将源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞与白介素2相组合，从而激活淋巴细胞的制剂。另外，本发明提供一种制备试剂盒，该试剂盒用于制备激活的淋巴细胞，或一种至少将源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞与抗CD3抗体相组合，从而激活淋巴细胞的制剂。
本发明提供一种方法，用于生产预防和治疗肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的制剂，该方法包括从含有源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞的外周血中分离出单核细胞，在分离出的单核细胞中增殖并激活源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，提取增殖并激活的源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，并制备以所述淋巴细胞为主要成分的制剂。
具体实施例方式
以下将按步骤对本发明作出详细地解释(所收集的外周血类型)根据本发明，所收集的外周血必须是源于HLA相匹配的供体的外周血，较好是来源于显示具有微嵌合状态的HLA相匹配的供体。尽管所希望的是，所收集外周血与病人在HLA上完全相匹配以确保不发生GVHD所诱导的副作用，但是也可以收集与病人HLA部分相匹配的外周血。
例如，如果供体在4个A、B、C以及DR基因座中有1、2、3、或4个基因座与病人中的相应基因座一致，则可以使用源于该供体的外周血。此外，如果供体4个基因座上的8个HLA基因中至少有两个HLA基因与病人中相应的基因一致，则可以使用该供体的外周血。然而，最好是8个HLA基因中有4个基因相互一致。
另外，使用源于显示微嵌合状态的HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞也同样有效。尽管微嵌合状态在生物医药领域是熟知的概念，以下对其进行简单的解释，“微嵌合状态”(源于他人的细胞以约1/1000的比例存在于体内的状态)发生于坏孕时期，其间母亲与胎儿通过胎盘相互交换少量细胞。
实际上，在妊娠妇女当中一直能够检测到微嵌合状态的发生。另外，即使在分娩以后，很多母亲在一段时间内一直有微嵌合状态的发生。因此，其维持了对孩子的源于父亲的HLAs的免疫耐受。通过该现象，在母亲和孩子之间形成了免疫耐受三角。
因此，本发明的发明人通过研究确定，源于HLA相匹配的并具有微嵌合状态的同胞的激活的淋巴细胞在预防和治疗肿瘤，感染性疾病以及自身免疫性疾病方面是非常有效的。另外已经证实，即使外周血的HLA基因不相匹配，只要显示微嵌合状态，也可以使用这样的外周血，并且其安全性较高。
其意味着，只要有微嵌合状态，源于没有血源关系的陌生人的外周血，与源于父母、祖母、祖父、同胞、叔叔、阿姨、子女或孙子的外周血一样有效。应注意的是，对于遗传学上继承父母HLAs的孩子，其HLA组成上的每一半与父母中的一方相一致，因此，他的HLAs有25％的可能与他的同胞是相匹配的。而与没有任何血源关系的陌生人之间，其HLAs相配的几率为几百分之一至几万分之一，因此，在一般情况下，不能使用源于陌生人的淋巴细胞。然而，如果供体中达到微嵌合状态，则供体的淋巴细胞可以作为制剂的原料。
此外，最好选择与接受者的HLA组合具有排异倾向(work along a rejectivedirection)的供体。例如，当HLA组合具有排异倾向时，供体A基因座可以包括A2和A24血清，接收激活的淋巴细胞的病人的A基因座可以包括A2和A2血清。由于病人的淋巴细胞能够清除具有A24血清的供体的淋巴细胞，避免了严重的副作用，如GVHD。与A基因座一样，B、C和DR基因座同样能够产生具有排异倾向的HLA组合。
(收集淋巴细胞)本发明的源于供体的激活的淋巴细胞，可以用供体的外周血制备。从供体臂上的静脉中抽取血液简单易行，因此较好采用该方法。只要血液中含有淋巴细胞，对采集血液的位置没有特别的限制。此外，也可以采用脐带血中的淋巴细胞。只需要采集少量的外周血，其范围在0.001毫升至500毫升之间。在实际应用中，所采集的外周血量较好在大约10毫升至100毫升之间。
(对淋巴细胞的调节)可以在收集的外周血中加入肝素或柠檬酸防止凝血。本发明的源于供体的激活的淋巴细胞可以如此获得以所收集的外周血作为基础材料，从外周血中得到淋巴细胞，然后通过孵育增殖并激活淋巴细胞。另外，本发明的激活的淋巴细胞也可以通过提取法或类似的方法从供体的骨髓中制得。需要注意的是，在对本发明进行解释时，对所收集的淋巴细胞进行“孵育”中的术语“孵育”是指通过将少量的细胞组织样品放置于培养液中进行人工增殖(孵育)组织细胞，培养液中含有细胞生长所必需的营养素。术语“增殖”是指在体外通过上述的孵育而人为地使组织细胞在数量上得到增长。另外，术语“激活”是指施加的控制以激活某个静止的功能，通过在培养液中加入增殖剂或激活剂从而刺激细胞，尤其是，施加的控制使细胞具有抗肿瘤、抗病毒以及抗自身免疫性疾病的特性。
(增殖和激活源于外周血的淋巴细胞)源于所收集的外周血的激活的淋巴细胞可以通过现有技术中的任一种淋巴细胞的孵育方法进行增殖。对于所采用的孵育方法没有特别的限制，例如日本的未审查专利申请NO.H3-80076中公开，使用白介素2或抗CD3抗体或两者的组合以孵育激活的淋巴细胞。较好地，在白介素2和抗CD3抗体同时存在的情况下对淋巴细胞进行孵育，从而达到更好的增殖效率。
除了上述利用白介素2和抗CD3抗体的对淋巴细胞进行多克隆增殖/激活之外，也可以通过以下方法得到具有抗原特异性的激活的淋巴细胞，如前所述，首先利用适当的抗原等产生抗原特异的T淋巴细胞等，然后使用CD3抗体，CD26抗体，各种促细胞分裂剂和细胞因子，例如白介素2之一或联合使用上述物质。
或者，抗原特异性的激活的淋巴细胞可以从实施方案中的激活的淋巴细胞进行筛选而得到，也可以通过使用合适的抗原而得到，也可以通过抗原刺激，然后增殖并激活淋巴细胞而得到。在这种情况下，抗原特异性淋巴细胞可以从CD8+细胞或CD4+细胞中得到。
除了精制抗原外，癌细胞或病毒的提取物，癌细胞本身或病毒本身，或任何与癌细胞或病毒细胞具有交叉反应性的抗原物质均可以用于上述目的。只要上述任一种物质具有增殖和激活淋巴细胞的功能都可以用于该过程中。此外，在该过程中使用的白介素2是一种可以在市场买到的商品，其必须是可以溶解的，能够在孵育培养液中达到1-2000U/ml的浓度。
白介素2可以溶于和用于任何广泛用于细胞孵育的培养液中，例如，水，生理盐水，杜伯科氏(Dulbecco’s)磷酸缓冲盐溶液，RPMI-1640，MDM，AIM-V。一旦白介素2溶于培养液中，该溶液必须冷冻保存，以确保白介素的活性不会降低。应当注意的是，对用于此目的的孵育培养液类型并没有特别的限制，只要该培养液适用于孵育淋巴细胞。例如可以使用源于生物体的培养液，例如，血清，或在平衡盐水中加入氨基酸、维生素、核酸碱基等而得到的合成培养基。较好的孵育培养液包括RPMI-1640、AIM-V、DMEM、IMDM。其中，特别优选RPMI-1640。
尽管使用含有正常人血清的孵育培养液能够更好地进行增殖，但是也可以使用在市场上可以购买到的培养液产品。此外，除了人类血清之外，还可以使用源于牛胚胎的血清。另外，可以使用不含血清的培养液。可以采用任何普遍应用的孵育方法进行孵育，例如，在CO2孵育箱中进行孵育。在这种情况下，CO2浓度较好维持在1-10％的范围内，更好地，在3-7％范围内，温度维持在30-40℃，更好地，在35-38℃。
尽管对孵育的天数没有特别的限制，但是其前提条件是，必须孵育足够长的时间以使源于抗CD3抗体的刺激信息能够传递给细胞。因此，孵育时间较好持续约2-20天，较理想地是，孵育淋巴细胞3-14天，而使刺激物信息稳定地传递给细胞，同时达到更好的孵育效率。更好地是，在孵育期间，对细胞进行显微镜观察，必要时对细胞数量进行检测，并在需要时补充培养液，从而达到更好的孵育效率。
应注意的是，在孵育开始后的1-2天之内，观察不到细胞数量发生明显地增长，在第3天左右首次观察到细胞的增殖，一旦细胞数量开始激增，培养液的颜色将从橙色变成黄色。此外，相对于补充前的培养液的量，应以约10％-500％的比率补充培养液。而且，培养液应每1-7天补充一次，更好地是，每3-5天补充一次，以防止培养液发生降解，并维持白介素2的活性水平。
而且，当在抗CD3抗体存在的环境下进行的孵育结束时，孵育过程可以在没有抗CD3抗体刺激的情况下继续进行。也就是说，可以使用固相中不含有抗CD3抗体的设备，例如，孵育瓶，滚瓶，孵育透气包继续进行孵育，直至给予淋巴细胞。
当按照如前所述对淋巴细胞进行继续孵育时，其孵育条件必须与抗CD3抗体影响下的初始孵育条件一致，除了第二次孵育不需要有抗CD3抗体的刺激。为了更加容易操作，具有更好的性能价格比以及更加安全，较好地是，调节人类血清的浓度，或必要时使用不含血清的培养液。
将含有白介素2的孵育培养液和脐带血或悬浮于其中的单核细胞放于孵育容器中时，孵育过程开始，其中孵育容器的固相中含有抗CD3抗体。在这种情况下，必要时在培养液中加入不同的细胞因子或促细胞分裂剂，进一步提高增殖和激活淋巴细胞的效率。应注意的是，尽管在动物或细胞中使用经提纯的CD3分子能够产生刺激淋巴细胞的抗CD3抗体，但是也可以使用市场上销售的、具有良好稳定性和性能价格比的OKT-3抗体(生产者Orthopharmaceutical)。
然而，只要能够促进淋巴细胞的增殖和激活，对于所使用的刺激淋巴细胞的抗体类型没有任何限制。例如抗CD20抗体可以取代抗CD3抗体。此外，为了得到更好的增殖淋巴细胞的效率，同时更加容易操作，较好使用固相抗CD3抗体。抗体可以用在由玻璃、聚亚胺酯、聚烯烃或聚苯乙烯构成的孵育容器的固相中。市售的、较易得到的、经消毒的由塑料等构成的细胞培养瓶可以用于此目的。在这种情况下，可以选择适宜大小的培养瓶。
另外，通过在容器中加入抗CD3抗体的稀释液，然后在4-37℃的温度下，使该容器静置2-24小时，可以将抗体导入固相中。较好的是，当将抗CD3抗体处理至固相中时，抗CD3抗体应该用生理缓冲液稀释至浓度为0.1-30μg/ml，例如，经消毒的Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液。当固相制成后，抗CD3抗体可贮存在冷藏室或冰箱中(4℃)直至使用。在这种情况下，在使用时取出液体，用生理缓冲液，例如Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液，在室温下进行冲洗从而得到供使用的抗CD3抗体。
所得到的源于供体外周血中的激活的淋巴细胞可以加工或制备成制剂，该制剂作为一种生物防御措施在预防/治疗肿瘤和感染性疾病中具有广泛的应用。此外，含有CD4+细胞和CD8+细胞的源于供体外周血中的激活的淋巴细胞具有更好的抗肿瘤效果。
此外，如果存在有发生GVHD等副作用的风险时，所得到的源于外周血的激活的淋巴细胞可以用抗CD4抗体等进行处理，从而得到治疗中所使用的、其主要成分为CD4+细胞的细胞群。另一方面，当副作用例如GVHD的风险很低时，或者需要更高的抗肿瘤效果时，可以在治疗中直接使用含有CD8+细胞的源于外周血的激活的淋巴细胞。在后一种情况中，激活的淋巴细胞可以作为一个细胞群用于治疗中，其中CD8+细胞的含量被调节到适当的水平上。
(源于外周血的激活的淋巴细胞为主要成分的制剂)从外周血获得的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞，其中的主要成分为增殖的外周血细胞，可以制备成制剂，例如将其悬浮于含有人白蛋白的生理盐水中从而制备成制剂，该制剂用作输液。所制成的制剂用于预防和治疗肿瘤以及感染性疾病。应注意的是，此处术语“制剂”是指以激活的淋巴细胞为主要成分的具有生物防御性功能的所有物质。该制剂可以为任何形态，只要其含有源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞，该淋巴细胞来自于供体的外周血。
例如，该制剂的形式可以为，源于外周血的HLA相匹配的激活的淋巴细胞悬浮于适当的溶液中。但较好的制剂形式为上述的将源于外周血的激活的淋巴细胞悬浮于含有人白蛋白的生理盐水中而制成，该制剂作为输液用。但是本发明并不仅仅局限于此。此外，可以通过在试管内直接增殖外周血来制备制剂，其中源于外周血的激活的淋巴细胞为其主要成分，或者，首先从外周血中分离出单核细胞，然后在试管内增殖分离出的单核细胞从而得到该制剂，其中源于外周血的激活的淋巴细胞为该制剂的主要成分。
而且，可以将不同的基因引入到包含在本发明制剂中的源于外周血的激活的淋巴细胞中，或者，删除或修饰原先存在于该激活的淋巴细胞中的任一基因。去除了其中的人类免疫缺陷病毒感染的辅助因子，该源于外周血的激活的淋巴细胞可以用于预防/治疗由病毒感染所引起的人类免疫缺陷疾病，或预防/治疗在免疫缺陷情况下所患有的感染性疾病，其中免疫缺陷状态是由人类免疫缺陷病毒所引起的。
以如上面所述从外周血中收集得到的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞为主要成分的制剂在临床上有广泛应用，可用于预防和治疗癌症患者、免疫缺陷患者、自身免疫性疾病患者、患有需要输入脐带血的疾病的患者，例如患有变态反应性疾病的患者，以及患有各种感染性疾病的患者。本发明中的制剂在预防肿瘤复发的同时，也能治疗肿瘤，其也可以用于治疗白血病和各种实体肿瘤。
而且，按照如上所述使用该制剂预防或治疗肿瘤，还可以提高病人的生活质量(QOL)。也就是说，例如，如果某种抗癌药引起慢性的肾脏或肝脏疾病，或者由于手术给该病人留下了永久性的疤痕，即使该病人所患的疾病本身得到了治愈，上述治疗的副作用或类似情况常常会降低病人的生活质量。然而，通过使用本发明中的制剂对病人进行治疗，病人的生活质量将得到显著地改善。
本发明中的以源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞为主要成分的制剂，对于治疗各种类型的癌症和肿瘤，免疫缺陷性疾病，各种类型的感染是非常有效的。上述疾病将在下文中详细描述。具体地说，在治疗肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胰腺癌、胆囊癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、白血病、肉瘤和脑瘤具有明显的疗效。同时对于治疗先天性和获得性免疫缺陷疾病方面也是非常有效的。
先天性免疫缺陷疾病包括严重的联合免疫缺陷症，Wiscott Aldrich综合征，腺苷脱氨酶缺陷，嘌呤核苷磷酸化酶缺陷，高IgM综合征，联合免疫缺陷症。本发明中的制剂可以治疗上述这些疾病之外的免疫缺陷疾病。此外，获得性免疫缺陷疾病的典型例子包括由于使用抗癌药、免疫抑制剂或类固醇所引起的继发性免疫缺陷，感染人类免疫缺陷病毒而导致的AIDS。本发明中的制剂可以用于治疗这些疾病之外的免疫缺陷疾病。
另外，可以用本发明中制剂进行治疗的自身免疫性疾病的典型例子包括，系统性红斑狼疮，慢性关节风湿病，干燥综合征，重症肌无力，恶性贫血，桥本氏病。同时还可以治疗上述以外的自身免疫性疾病。本发明中的制剂可以作为一种预防性或治疗性的措施用于治疗整体免疫能力较低的病人，也可以用来治疗那些对某种病毒或类似物没有免疫能力或者免疫能力较低的病人。可以用本发明中的制剂进行治疗的变态反应性疾病包括支气管哮喘、雪松花粉过敏、荨麻疹，同时本发明中的制剂还可以治疗其它的变态反应性疾病。本发明中的制剂还可以用于减轻各种变态反应性疾病的症状。
可以用本发明中的制剂进行治疗的感染性疾病包括病毒感染、微生物感染、真菌感染、原虫感染、衣原体感染、支原体感染。在上述疾病中，病毒感染包括巨细胞病毒感染，爱波斯坦—巴尔(Epstein-Barr)病毒感染。此外，本发明的制剂并不局限于对这几种病毒感染的治疗，其在预防和治疗其它各种病毒感染中具有广泛的应用，例如疱疹病毒，包括单纯疱疹病毒、水痘—带状疱疹病毒，包括人类白血病病毒和人类免疫缺陷病毒的各种逆转录病毒，腺病毒以及柯萨奇病毒。
可以用本发明中的制剂进行治疗的微生物感染包括绿脓杆菌引起的感染，耐新青霉素的金黄色葡萄球菌引起的感染。本发明中的制剂也可以用于治疗由对人类具有病原性的细菌所引起的感染性疾病。特别是，本发明中的制剂可以有效地预防和治疗由不明病原体所引起的感染性疾病，以及由不容易确定的病原体所引起的感染性疾病，或有效地预防和治疗由上述感染所导致的疾病。
之前所描述的微嵌合状态可以通过PCR(聚合酶链反应)分析很容易地检测出来。例如，当测量HLA-A基因座上A-24的微嵌合状态时，首光用HLA-A基因座引物放大反应，使用一个A-24引物进行嵌套式(mested)PCR反应，然后用适当的检测系统检测是否存在微嵌合状态，以便确定微嵌合状态的存在/缺乏。
(用于制备制剂的制备试剂盒，其中制剂的主要成分是源于外周血的激活的淋巴细胞)尽管本发明中源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞可以作为一种单独的试剂，其还可以与含有白介素2的培养液，含有固相抗CD3抗体的烧瓶一起，制备在同一个试剂盒中。在后面一种情况下，使用该试剂盒可以非常容易地制备出本发明中的制剂。
应注意的是，可以将适量的用于制备制剂的培养液事先倒入用固相抗CD3抗体包被的各个烧瓶中，然后将这些烧瓶放于冰箱中冷冻贮存。将激活的淋巴细胞以及至少两种如上所述的试剂制备于同一试剂盒中，在需要激活的淋巴细胞时，可以很容易地通过该试剂盒而制备出本发明中的制剂。由外周血或含有上述激活的淋巴细胞的制剂所制备而成的、可用于本发明所有用途的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞可以冷冻保存于冰箱中，这样就可以随时用于预防和治疗各种疾病。
(剂量)尽管应根据具体病人的状态或具体治疗目标调整制剂的剂量，其中制剂的主要成分为从外周血制备成的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞，在正常情况下，该制剂的标准剂量为每公斤体重1×102-1×109个淋巴细胞。此外，为了进一步增强效果，剂量较好为每公斤体重1×103以上的淋巴细胞。但是，一旦剂量超过每公斤体重5×108个淋巴细胞，其效果就再也不能增加。因此，最佳的剂量范围为每公斤体重1×103-5×108个淋巴细胞。
(给药方式和方法)应以液体形式给予上述制剂，即，注射或滴注。更具体地说，较好地以注射液或滴注液的形式给予如上文所述制备而成的细胞，在该注射液或滴注液中，上述细胞分散于生理盐水中，其中生理盐水中含有浓度为0.01-5％的人血清白蛋白。应以静脉滴注、静脉注射、动脉注射或局部注射的方式给予该制剂。应根据给药方法、给药部位等对所给予的溶液量进行调整，但是在正常情况下，较好给予1-500ml的溶液，同时，确保溶液中含有前述需要量的淋巴细胞。此外，给药的频率为一天一次至一月一次，所述淋巴细胞应至少给予一次以上。
(实施例1)第一步，(采集血液和分离淋巴细胞)向注射器中添加肝素，从与急性淋巴细胞白血病患者HLA完全相匹配的供体的静脉中采集20ml外周血，然后在无菌条件下的清洁工作台上，从注射器上拔出针头，换上19G×11/2″的注射针头。事先向两个50ml离心管(制造商Iwaki玻璃有限公司，2341-050)中分别注入15ml洗液(RPMI 1640+6)(500ml，制造商Nikken生物医学研究中心，GM1106)。然后，用培养液稀释所收集到的血液从而将溶液量增加至三倍。缓慢地将所得到的全部混合液倒入上述两个离心管中，从而使两管中所倒入的混合液量恰好相等。
盖好离心管的盖子，翻转并振荡两到三次，用10ml的吸管吸取3mlLymphocepar 1(100ml，制造商免疫生物研究中心有限公司，23010)并分别注入6个15ml的离心管中。然后，为了不破坏每个离心管中所形成的液体表面，缓慢地将10ml已经用培养基稀释的血液注入每个离心管中，并分层位于Lymphocepar 1上面。离心管在离心温度为20℃，转速为1800rpm的条件下离心15分钟。
离心过程结束后，在无菌条件下，用吸出器缓慢地吸出每个离心管中的内容物，并使液面降至淋巴细胞层上面约1cm的地方，以防止将淋巴细胞吸出。然后，用5ml的移液管吸出淋巴细胞层，而不吸出血液凝结层，然后将吸出的淋巴细胞层收集到事先已经注入25ml洗液(RPMI 1640+6)的50ml离心管中。盖好盖子，反复倒置离心管，进行轻微的振荡和混合。再次将离心管放入离心机中，在温度为20℃，转速为1800rpm的条件下离心10分钟。
离心后，将上清液去除，使细胞沉淀物完全分散开来，并进行搅拌。测定完细胞数目之后，将细胞以0.5×106/ml的浓度悬浮于PBS中。细胞与DynabeadsCD4(进口商/销售商Veritas)以1∶4的细胞/珠比例相混合，并放入15ml体积的离心管中。混和物在4℃下孵育30分钟。将磁铁(进口商/销售商Veritas)置于离心管的外壁上，从而收集与Dynabeads CD4结合的CD4阳性细胞。没有与Dynabeads CD4结合的细胞在无菌条件下用吸出器吸出。
然后将与Dynabeads CD4结合的细胞放于振荡搅拌器中使其完全分散开来。通过反复地倒置，轻轻地将其与50ml的孵育培养液进行混合。所述孵育培养液制备如下将1ml浓度为3500U/ml的白介素-2(制造商Cetus)以及5ml人类血清加到44ml培养液中(RPMI 1640+7，制造商免疫生物研究中心有限公司)，制备细胞悬浮液。
将10μl细胞悬浮液放入试管(进口商/销售商Assist有限公司，72.690)中，然后将悬浮液与40μl Türk溶液相混合。取10μl混合液放入血球计上(制造商Elmer公司，9731)，在显微镜下观察细胞的数目。细胞的总数量为1.0×107～7.0×107。
第二步(制备用OKT3包被的烧瓶)将10ml用PBS(-)稀释的浓度为5μg/ml的OKT3溶液(进口商/销售商Jansen Kyowa有限公司，制造商OrthopharmaceutialOKT3注射液)加入到基底面积为225cm2的培养瓶中，并使瓶底部被溶液均匀覆盖。
第二天，用吸出器将烧瓶中的OKT3溶液吸出，然后将50ml PBS(-)注入烧瓶中。盖好盖子均匀摇晃烧瓶，然后打开盖子，将其中的液体倒出。然后，在无菌状态下，将50ml PBS(-)注入烧瓶中，盖好盖子均匀摇晃烧瓶，然后打开盖子，将其中的液体倒出。留在烧瓶内部以及盖子上的水分要用吸出器完全吸净，这样用OKT3包被的烧瓶就制备好了。
第三步(淋巴细胞的激活孵育)将50ml上述第一步(采集血液和分离淋巴细胞)中所制备的细胞悬浮液注入第二步(制备用OKT3包被的烧瓶)中所制备的用OKT3包被的烧瓶中，然后在37℃下孵育，环境中CO2气体的浓度为5％。三天后，向烧瓶中加入50ml的孵育培养液，并在37℃下孵育，环境中CO2气体的浓度为5％。四天后，向烧瓶中加入150ml的孵育培养液，并在37℃下孵育，环境中CO2气体的浓度为5％。最后一次补充培养液后，在37℃下孵育两天，环境中CO2气体的浓度为5％。最后，得到了2.0×108～7.0×108个激活的淋巴细胞。
第四步(淋巴细胞的增殖孵育)将上述第三步(淋巴细胞的激活孵育)中所制备的淋巴细胞转移至含750ml的LL-7(Nikken生物化学研究中心)培养液的透气性孵育包中，然后在CO2孵育箱(CDP-300A；Hirasawa有限公司)中孵育上述经转移的淋巴细胞，其中温度为37℃，CO2气体的浓度为5％。
四天后，用一无菌接合装置(制造商Terumo)将含有细胞的透气性孵育包(制造商Nipro culture bag A-1000)与另外一个包含新的培养液的透气性孵育包接合起来，并使两个透气性孵育包中的培养液均匀混合。然后，切断两个孵育包之间的连接，并对接合部位进行无菌性的密封。在37℃，CO2气体浓度为5％的条件下对细胞进行孵育。
第五步(制备供给药的制剂)三天后，将两个透气性孵育包中的含有细胞的培养液转移至250ml的离心管中。通过离心分离出细胞。接着，通过倾注法除去培养液，在细胞沉淀中加入生理盐水使细胞重新悬浮起来，并进行离心洗涤。随后，用含有人类白蛋白的生理盐水代替上述的生理盐水进行类似的洗涤，其中白蛋白的浓度为0.1％，这样就对细胞沉淀进行了调节。
接下来，向细胞沉淀中加入200ml含2％人类白蛋白的生理盐水，从而使细胞悬浮起来。然后用100μm的不锈钢网过滤该悬浮液。将得到的制剂转移至输血袋中以供施用。需要指出的是，转移至输血袋的细胞的数目为0.5～10×109。
第六步(制剂的冷冻保存)必须指出的是，必要时，上述第五步(制备供给药的制剂)中所制备的激活的淋巴细胞可以冷冻保存在冰箱中。下面对将制剂冷冻保存在冰箱中的具体实施方案进行解释。对上述第五步(制备供给药的制剂)中所制备的激活的淋巴细胞进行离心分离，通过倾注的方法将孵育培养液除去，从而得到细胞沉淀。然后向细胞沉淀中加入18ml细胞保存液(将5ml人类血清和5ml二甲亚砜(制造商Nakaraitesky，在此简称为DMSO)混合而制备得到)和40ml细胞培养液(RPMI 1640+7)。将细胞沉淀和保存液进行均匀地混合，然后向5个5ml的细胞保存管(5×107个细胞/管)中分别注入3ml混合物。然后将这些保存管放于超低温度的冰箱中，并在-80℃下保存。
另外，使用时冷冻的细胞必须解冻并使其溶解，首先将冷冻的细胞从冰箱中取出，然后用37℃的加热块(制造商Titek公司，TAL-IG)加热4分钟。在无菌条件下取出约3ml含有细胞的细胞保存液解冻，使其溶解，然后放入15ml的离心管中，加入10ml培养液使细胞悬浮于液体中，然后通过离心使细胞分离(速度1000rpm，温度20℃，时间5分钟)。随后，通过倾注法将上清液除去，采用如上1～4所述的方法对细胞进行孵育，采用上述第五步(制备供给药的制剂)所述的方法制备供给药的制剂。我们也可以通过用生理盐水冲洗经解冻和溶解的细胞，然后添加10ml含有5％人类血清的生理盐水使细胞悬浮于液体中，从而制备上述供使用的制剂。
第七步(制剂的给药)对于尚未进行造血干细胞移植的急性淋巴细胞白血病患者，通过静脉注射上述第五步(制备供给药的制剂)中所制备的制剂或者如上述第六步(制剂的冷冻存储)中的保存在冰箱中的制剂。对于显示对各种化疗药物具有耐药性的急性白血病患者，以及通过化疗并没有达到缓解状态的急性白血病患者，应给药30次。每次注射1.7×108～4.2×109个细胞，每隔几天至每隔12天给药一次(通常是每隔7天给药一次)。
第八步(效果的评价)当病人在输入源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞之前所进行的各种化疗被证实无效，而且白血病细胞数量增加的时侯，给予病人源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞之后，能观察到以下效果(1)白血病细胞没有明显的增加，相反观察到有减少的趋势(抗肿瘤效果)；(2)在治疗过程中病人没有发生严重的感染，可以观察到中性粒细胞增加(给药后以500/μl或更高的速率增加)(抗感染性疾病的效果)；以及(3)在治疗初期，病人的痛苦减少(提高了病人的生活质量以及抗自身免疫性疾病的效果)。
因此，可以证实，源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞对于肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病来说，是一种有效的预防和治疗手段，并且可以提高病人的生活质量。另外，用源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞进行治疗几乎没有观察到任何副作用，也没有观察到GVHD症状或者高烧等。
(实施例2)如实施例1制备激活的淋巴细胞，不同之处在于外周血取自显示与急性髓细胞性白血病患者具有微嵌合状态的血亲(与病人有2个HLA基因座相匹配)。如实施例1制备供给药的制剂，向尚没有进行造血干细胞移植的急性髓细胞白血病患者静脉注射该制剂，该制剂只给药一次。给药后三天，观察到病人外周血中的白血病细胞减少，七天以后，病人外周血中的白血病细胞完全消失。因此，可以证实，源于有微嵌合状态的供体的激活的淋巴细胞具有抗肿瘤效果。
(实施例3)如实施例1制备激活的淋巴细胞，不同之处在于外周血取自显示与肾癌患者有微嵌合状态的血亲(与病人有2个HLA基因座相匹配)。如实施例1制备供给药的制剂，向肾癌患者静脉注射该制剂，共给药三次，每月一次。第一次给药两个星期后，观察到肾癌部分减小，第三次给药两个星期后，肾癌完全消失。因此，可以证实，源于有微嵌合状态的供体的激活的淋巴细胞有抗肿瘤效果。
如上实施例所述，激活的淋巴细胞作为肿瘤、病毒感染和自身免疫性疾病的预防和治疗措施，是非常有效的。所述激活的淋巴细胞可以通过以下方法获得，收集并激活HLA相匹配的供体的淋巴细胞，然后用白介素-2和抗-CD3抗体等来刺激并增殖。此外也明确证实，源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞对于抗肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病是有效的，同时在提高病人的生活质量上也是有效的。源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞作为肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的预防和治疗措施，是非常有效的。
另外，源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞几乎没有任何不良的副作用，也没有观察到GVHD症状或者高烧等的发生。
另外，本发明不仅可以用于治疗诸如癌症等肿瘤以及各种感染性疾病，防止肿瘤的复发以及预防肿瘤和感染性疾病，也可以用于提高病人的生活质量，这是通过减轻恶病质以及改善病人的食欲而达到的。本发明的制剂可以作为一种预防性和治疗性措施，用于治疗白血病以及实体肿瘤。
特别是，将本发明与另外的治疗方法，例如化疗或放射疗法，相结合，或者是将本发明与其他的免疫疗法相结合，本发明的优点可以进一步增强。另外，本发明也可以改善接受造血干细胞移植前病人的身体状况。
另外，通过以下途径可以大大地提高淋巴细胞激活的稳定性及其效率至少用白介素2和抗-CD3抗体中的一种来激活源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞；用适当的抗原等得到具有抗原特异性的T淋巴细胞等，然后用CD3抗体、CD26抗体或例如白介素2的细胞因子之一或者上述物质的组合得到抗原特异性的激活的淋巴细胞；或者，对用某一抗原刺激物从CD8阳性细胞或者CD4阳性细胞得到的抗原特异性淋巴细胞进行增殖并激活，从而得到具有抗原特异性的激活的淋巴细胞。然后，制备用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病以及自身免疫性疾病的包含激活的淋巴细胞的制剂，该制剂容易制备，并且方便给药。在该意义上，本发明对于再生医药领域的进一步发展具有很大的贡献。
以悬浮液的形式制备含有经增殖并激活的淋巴细胞的制剂，其中所述淋巴细胞悬浮于含有人类白蛋白的生理盐水中，则给药时，有效激活的淋巴细胞数目减少的程度就会降低。
另外，确保供给药的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞中含有具有排异倾向的HLAs，发生GVHD的风险会进一步降低。
使用从存在微嵌合状态的供体中所收集得到的淋巴细胞，可以得到更有效的用于预防和治疗肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的激活的淋巴细胞，同时，也会减少例如GVHD等副作用的发生。如果使用含有CD8和CD4阳性细胞的激活的淋巴细胞，这些优点会更加明显。
将源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞作为一种制备试剂盒进行销售，该试剂盒用于制备激活的淋巴细胞，至少由HLA相匹配的淋巴细胞以及用于激活淋巴细胞的白介素2组成；该制备试剂盒或者用于制备含有源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞的制剂，则即使在很偏远的地方，也能很容易地得到本发明中的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞。即使没有高深的知识以及丰富的经验，也可以增殖并激活源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，并用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病以及自身免疫性疾病。
生产用于预防和治疗肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的含有淋巴细胞的制剂的方法，包括以下步骤从含有源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞的外周血中分离出单核细胞；对分离出的单核细胞中的源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞进行激活并增殖，例如至少使用白介素2或者抗-CD3抗体中的一种进行激活并增殖；提取经激活并增殖的淋巴细胞；制备成以所述激活的淋巴细胞为主要成分的制剂。因此，可以有效地生产出含有源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞的制剂，同时，使防止有效淋巴细胞的活性以及数目的减低成为可能。
孵育增殖淋巴细胞的过程中，相对于3～14天的孵育周期中的孵育培养液的量，以10％～500％的比率补充培养液。为了防止培养液的降解和白介素2的活性降低，在3～14天的孵育期内，每隔3～5天培养液就必须补充一次培养液。而且，在通过孵育而激活并增殖淋巴细胞的同时，加入各种细胞因子或促细胞分裂素，将进一步增强激活的淋巴细胞的效果。
另外，已经证实，被激活并增殖的含有CD4阳性细胞和CD8阳性细胞的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞比仅含有CD4阳性细胞的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞甚至更加有效。
权利要求
1.一种用于预防和治疗肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述淋巴细胞通过激活源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞来获得。
2.如权利要求1所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞用白介素2来激活。
3.如权利要求1所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞用抗-CD3抗体来激活。
4.如权利要求1、2或3所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞为抗原特异性激活的淋巴细胞，它是通过先利用适当的抗原诱导抗原特异性的淋巴细胞，然后用CD3抗体、CD26抗体和白介素2之一或者CD3抗体、CD26抗体和白介素2的组合而获得。
5.如权利要求1至4之一所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于通过以下方式制备和使用所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，首先激活并增殖所收集的源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，然后通过筛选而选择抗原特异性的激活的淋巴细胞，或者用适当的抗原来诱导抗原特异性激活的淋巴细胞。
6.如权利要求1至4之一所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞通过制备已经被抗原刺激激活并增殖的抗原特异性淋巴细胞而得到。
7.如权利要求4至6之一所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述抗原为精制抗原，癌细胞或者病毒的提取物，癌细胞或者病毒，或者与癌细胞或病毒具有交叉反应的抗原物质。
8.如权利要求1至7之一所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞含有具有排异倾向的HLAs。
9.如权利要求1至7之一所述的预防性和治疗性淋巴细胞，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞从具有微嵌合状态的供体中收集。
10.如权利要求1至9之一所述的预防和治疗淋巴细胞，其特征在于所述淋巴细胞的正确剂量是每公斤体重1×103～5×108个细胞。
11.一种用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂，其特征在于获得源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞。
12.如权利要求11所述的预防性和治疗性制剂，其特征在于通过将已经被激活和增殖的淋巴细胞悬浮于含有人类白蛋白的输注生理盐水中而制备得到所述制剂。
13.如权利要求n或12所述的预防性和治疗性制剂，其特征在于所述淋巴细胞的正确剂量是每公斤体重1×103～5×108个细胞。
14.一种制备制剂的试剂盒，其特征在于至少由源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞以及用于激活所述淋巴细胞的白介素2的组合组成。
15.一种制备制剂的试剂盒，其特征在于至少由源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞以及用于激活所述淋巴细胞的抗-CD3抗体的组合组成。
16.一种用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于包括以下步骤从含有源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞的外周血中分离出单核细胞；激活并增殖存在于所分离出的单核细胞中的所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞；将已经被激活和增殖的所述淋巴细胞提取出来，并制备成以所述淋巴细胞为主要成分的制剂。
17.如权利要求16所述的用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于使用孵育培养液在3～14天的持续孵育周期内增殖所述淋巴细胞，其中所述培养液组合了白介素2或抗-CD3抗体或者同时组合了这两种物质。
18.如权利要求16或17所述的用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于在通过孵育而增殖所述淋巴细胞时，为了避免所述孵育培养液降解以及白介素2活性水平的降低，相对于3～14天的孵育周期中孵育培养液的量，以10％～500％的比例补充培养液。
19.如权利要求18所述的用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于在3～14天的孵育期中，每隔3～5天补充一次所述培养液。
20.如权利要求16至19之一所述的用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于在通过孵育而激活和增殖所述淋巴细胞时，向培养液中添加各种细胞因子或促细胞分裂剂。
21.如权利要求16所述的用于预防和治疗肿瘤、各种感染性疾病和自身免疫性疾病的预防性和治疗性制剂的生产方法，其特征在于已经被激活和增殖的所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞中包括CD4阳性细胞和CD8阳性细胞。
22.一种用于预防和治疗患有肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的患者的预防和治疗方法，其特征在于给予所述患者如权利要求1所述的淋巴细胞。
23.如权利要求22所述的预防和治疗方法，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞用白介素2激活。
24.如权利要求22所述的预防和治疗方法，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞用抗-CD3抗体激活。
25.如权利要求22、23或24所述的预防和治疗方法，其特征在于所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞为抗原特异性激活的淋巴细胞，它是通过先利用适当的抗原诱导抗原特异性的淋巴细胞，然后用CD3抗体、CD26抗体和白介素2之一或者CD3抗体、CD26抗体和白介素2的组合而获得。
26.如权利要求22至25之一所述的预防和治疗方法，其特征在于通过以下方式制备和使用所述源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，首先激活并增殖所收集的源于HLA相匹配的供体的淋巴细胞，然后通过筛选而选择抗原特异性的激活的淋巴细胞，或者用适当的抗原来诱导抗原特异性激活的淋巴细胞。
27.如权利要求22至26之一所述的预防和治疗方法，其特征在于所述淋巴细胞的正确剂量是每公斤体重1×103～5×108个细胞。
全文摘要
根据本发明，对患有肿瘤、病毒感染以及自身免疫性疾病的患者具有很高疗效的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞可以通过以下方法制备得到收集源于HLA相匹配的供体外周血中的细胞，或者收集源于HLA相匹配的、并具有微嵌合状态的供体的外周血中的细胞；然后，用例如白介素2、抗CD3抗体等物质激活并增殖所收集到的细胞。由此制得的源于HLA相匹配的供体的激活的淋巴细胞可以用于预防和治疗HLA相匹配的患有肿瘤、病毒感染以及自身免疫性疾病的患者。
文档编号A61K47/02GK1481901SQ0313123
公开日2004年3月17日 申请日期2003年4月8日 优先权日2002年4月8日
发明者黒岩保幸, 森尾友宏, 清水则夫, 关根晖彬, 夫, 宏, 岩保幸, 彬 申请人:淋巴细胞技术株式会社
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