低聚寡糖在抗应激脑损伤中的用途的制作方法
专利名称：低聚寡糖在抗应激脑损伤中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及衍生自中药巴戟天的低聚寡糖在抗应激脑损伤中的用途。
中药巴戟天(mrinda officinalis How)具有补肾壮阳、强筋骨、抗风湿功效。中国专利申请No．94103414．3披露了一种活性成分为巴戟天的抗精神性疾病的药物。中国专利申请No．94103415．1披露了从巴戟天萃取得到的式(Ⅰ)低聚寡糖及其作为抗精神病药物，其中n=1-8。 但式Ⅰ低聚寡糖在抗应激脑损伤方面的活性还未见报道。
发明目的本发明的目的是寻找式Ⅰ低聚寡糖的新用途。
发明简述本发明人经研究现已出人意料发现，式Ⅰ的低聚寡糖具有优良的抗应激脑损伤作用。
因此，本发明第一方面涉及式Ⅰ低聚寡糖在制备用于治疗应激脑损伤药物中的用途。
本发明再一方面涉及的是治疗应激脑损伤的方法，其包括将上述定义的式Ⅰ低聚寡糖给予需治疗的应激脑损伤患者。
详细描述
本发明涉及式Ⅰ的低聚寡糖在制备用于治疗应激脑损伤药物 中的用途，其中n=1-8。
本发明还涉及治疗激脑损伤的方法，其包括将式Ⅰ低聚寡糖 给予需治疗的应激脑损伤患者，n=1-8。
根据本发明，本发明作用的式Ⅰ低聚寡糖是通过萃取植物巴戟天得到的。萃取中所用溶剂为有机溶剂，含水有机溶剂或水。有机溶剂为醇类如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇等，卤代烷类如二氯甲烷或三氯甲烷等，酯类如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯等，或醚类如石油醚或乙醚等。
根据本发明，式Ⅰ低聚寡糖在用于治疗应激脑损伤中可以单独或以组合物形式使用。给药方式可以是口服或非肠道途径。给药剂型可以是口服剂型如片剂或胶囊等，非肠道给药剂型如无菌注射剂、滴注液等。
根据本发明，优选的式Ⅰ低聚寡糖是n=4的式Ⅰ低聚寡糖。
本发明将通过下面的实施例及生物活性试验做进一步说明，但这并不意味着对本发明的任何限制。
实施例1n=4的式Ⅰ低聚寡糖的制备取巴戟天1KG粉碎过50目筛，筛过物用石油醚提取。每次用石油醚5升，提取三次。合并，减压蒸发干，得到石油醚提取物100g；药渣用乙醇提取。每次用乙醇8升，提三次，合并，减压蒸发干，得到乙醇提取物160g。提取物再用水溶解，过滤，滤过液在正丁醇和水中分配提取，得到可溶于正丁醇的提取物120g和水溶部分300g。将水溶部分100g用活性碳柱层析进行分离，展开剂是10％-70％的乙醇。得到式Ⅰ低聚寡糖混合物，重26g(纯度几乎100％)。取其部分进行高压液相色谱(柱Spherisorb C18(4．5×250mm)，检测RI Waters DifferentialRefractometer 410(US)，泵WatersTM600，洗脱5％甲醇水，流速1．0ml／分钟)，测得式Ⅰ低聚寡糖的保留时间为n 保留时间(分钟)12．3923．0533．4344．2754．5366．3477．4888．47同时得到呈白色固体的n=4的式Ⅰ低聚寡糖，即(2→1)果呋喃糖基蔗糖六聚体。
〔α〕D-18．2(C=1．0，H2O)。
IRλmaxcm-13411(br，S，OH)，2931，2895，1420(w)，1032(s)。
负离子FAB-MS m／z989[M-H]-。
元素分析实测值，C，39．28，H，6．89(C36H62O31·6H2O)，计算值，C，39．35，H，6．79。
1H-NMR(D2O)δ5．42(1H，d，J=3．9Hz，1-H)，4．27，4．20，4．21，4．22，4．17，4．08，4．06，4．03，3．52(1H，dd，J=10．5，3．9Hz；2-H)，3．45(1H，t，J=9．5Hz；4-H)。
生物活性实验实施例2、n=4的式Ⅰ低聚寡糖(今后简称化合物A)对慢性应激大鼠血中皮质酮及睾酮水平的调节1．方法与结果Wistar雄性大鼠，体重160±20g，随机分为4组，每组8只，应激对照组动物每日给予电击、强迫游泳、高速振荡、固定、禁食(水)等不良刺激，时程28天，使动物处于慢性应激状态。给药组则在应激后30分钟腹腔注射(ip)n=4的式Ⅰ低聚寡糖，正常组则不接受任何应激刺激，第15天断头取血并分离血清，利用皮质酮、睾酮试剂盒进行测定。结果用单因素方差分析进行统计并见表1。
表1
***P＜0．001，**P＜0．01，*P＜0．05 vs应激对照。
2．讨论慢性应激的关键特征之一就是血中皮质酮水平显著升高、睾酮水平降低。由表1可看到化合物A二个剂量组可以逆转这一结果，表示可以拮抗慢性应激。
实施例3、化合物A对皮质酮损伤的PC12细胞的保护作用1．方法用含5％胎牛血清及5％马血清的DMEM培养液(含青霉素钠200kU·L-1，链霉素100mg·L-1，pH7．4)将细胞稀释为约2×108．L-1接种于预先用多聚赖氨酸(0．1g．L-1)处理过的96孔培养板，每孔100μL，放入CO2孵箱(美国Napco公司生产)37℃，5％CO2条件下培养3～4天，待细胞长满孔底后即可用于实验，参照文献(刘景根等，药学学报1998，33(3)165)方法，稍加改进，吸去细胞液，换上含有相应浓度药物及0．2mmol．L-1皮质酮(corticosterone，Cort)的无血清DMEM(对照组不含任何药品)，37℃5％CO2培养48小时，吸去培养液，用D-Hanks液洗2遍，每孔加入含0．5g．L-1MTT的无血清DMEM培养4小时后吸去培养液，每孔加入10％十二烷基硫酸钠100μL，待蓝色颗粒完全溶解(约12～16小时)，利用多孔扫描分光光度计(型号MCC／340)测定标本在570nm的吸光度(A)值，用于定量反映活细胞数并计算药物对皮质酮损伤的PC12细胞损伤的抑制率。表2
***P＜0．001 vs皮质酮损伤对照。
2．结果PC12细胞经0．2mmol．L-1皮质酮处理48小时后，对MTT摄取能力下降，A值显著低于正常对照组，表明细胞受到损伤或部分细胞已死亡，但当化合物A存在时，PC12细胞对MTT摄取能力明显增强，表明PC12细胞损伤明显减弱，活细胞明显增多，具有浓度依赖关系。此结果表明化合物A可以对抗应激导致的脑神经细胞的损伤。
权利要求
1．式Ⅰ低聚寡糖在制备用于治疗应激脑损伤药物中的用途， 其中n=1-8。
2．根据权利要求1的用途，其中所述药物可以片剂或胶囊形式使用。
3．根据权利要求1的用途，其中所述药物可以无菌注射剂或滴注液形式使用。
4．根据权利要求1的用途，其中式Ⅰ低聚寡糖为n=4的式Ⅰ低聚寡糖。
全文摘要
本发明涉及式Ⅰ低聚寡糖在制备用于治疗应激脑损伤药物中的用途。
文档编号A61K31/7004GK1289592SQ9912025
公开日2001年4月4日 申请日期1999年9月24日 优先权日1999年9月24日
发明者李云峰, 罗质璞, 赵毅民, 杨明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
技术领域：
本发明涉及衍生自中药巴戟天的低聚寡糖在抗应激脑损伤中的用途。
中药巴戟天(mrinda officinalis How)具有补肾壮阳、强筋骨、抗风湿功效。中国专利申请No．94103414．3披露了一种活性成分为巴戟天的抗精神性疾病的药物。中国专利申请No．94103415．1披露了从巴戟天萃取得到的式(Ⅰ)低聚寡糖及其作为抗精神病药物，其中n=1-8。 但式Ⅰ低聚寡糖在抗应激脑损伤方面的活性还未见报道。
发明目的本发明的目的是寻找式Ⅰ低聚寡糖的新用途。
发明简述本发明人经研究现已出人意料发现，式Ⅰ的低聚寡糖具有优良的抗应激脑损伤作用。
因此，本发明第一方面涉及式Ⅰ低聚寡糖在制备用于治疗应激脑损伤药物中的用途。
本发明再一方面涉及的是治疗应激脑损伤的方法，其包括将上述定义的式Ⅰ低聚寡糖给予需治疗的应激脑损伤患者。
详细描述
本发明涉及式Ⅰ的低聚寡糖在制备用于治疗应激脑损伤药物 中的用途，其中n=1-8。
本发明还涉及治疗激脑损伤的方法，其包括将式Ⅰ低聚寡糖 给予需治疗的应激脑损伤患者，n=1-8。
根据本发明，本发明作用的式Ⅰ低聚寡糖是通过萃取植物巴戟天得到的。萃取中所用溶剂为有机溶剂，含水有机溶剂或水。有机溶剂为醇类如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇等，卤代烷类如二氯甲烷或三氯甲烷等，酯类如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯等，或醚类如石油醚或乙醚等。
根据本发明，式Ⅰ低聚寡糖在用于治疗应激脑损伤中可以单独或以组合物形式使用。给药方式可以是口服或非肠道途径。给药剂型可以是口服剂型如片剂或胶囊等，非肠道给药剂型如无菌注射剂、滴注液等。
根据本发明，优选的式Ⅰ低聚寡糖是n=4的式Ⅰ低聚寡糖。
本发明将通过下面的实施例及生物活性试验做进一步说明，但这并不意味着对本发明的任何限制。
实施例1n=4的式Ⅰ低聚寡糖的制备取巴戟天1KG粉碎过50目筛，筛过物用石油醚提取。每次用石油醚5升，提取三次。合并，减压蒸发干，得到石油醚提取物100g；药渣用乙醇提取。每次用乙醇8升，提三次，合并，减压蒸发干，得到乙醇提取物160g。提取物再用水溶解，过滤，滤过液在正丁醇和水中分配提取，得到可溶于正丁醇的提取物120g和水溶部分300g。将水溶部分100g用活性碳柱层析进行分离，展开剂是10％-70％的乙醇。得到式Ⅰ低聚寡糖混合物，重26g(纯度几乎100％)。取其部分进行高压液相色谱(柱Spherisorb C18(4．5×250mm)，检测RI Waters DifferentialRefractometer 410(US)，泵WatersTM600，洗脱5％甲醇水，流速1．0ml／分钟)，测得式Ⅰ低聚寡糖的保留时间为n 保留时间(分钟)12．3923．0533．4344．2754．5366．3477．4888．47同时得到呈白色固体的n=4的式Ⅰ低聚寡糖，即(2→1)果呋喃糖基蔗糖六聚体。
〔α〕D-18．2(C=1．0，H2O)。
IRλmaxcm-13411(br，S，OH)，2931，2895，1420(w)，1032(s)。
负离子FAB-MS m／z989[M-H]-。
元素分析实测值，C，39．28，H，6．89(C36H62O31·6H2O)，计算值，C，39．35，H，6．79。
1H-NMR(D2O)δ5．42(1H，d，J=3．9Hz，1-H)，4．27，4．20，4．21，4．22，4．17，4．08，4．06，4．03，3．52(1H，dd，J=10．5，3．9Hz；2-H)，3．45(1H，t，J=9．5Hz；4-H)。
生物活性实验实施例2、n=4的式Ⅰ低聚寡糖(今后简称化合物A)对慢性应激大鼠血中皮质酮及睾酮水平的调节1．方法与结果Wistar雄性大鼠，体重160±20g，随机分为4组，每组8只，应激对照组动物每日给予电击、强迫游泳、高速振荡、固定、禁食(水)等不良刺激，时程28天，使动物处于慢性应激状态。给药组则在应激后30分钟腹腔注射(ip)n=4的式Ⅰ低聚寡糖，正常组则不接受任何应激刺激，第15天断头取血并分离血清，利用皮质酮、睾酮试剂盒进行测定。结果用单因素方差分析进行统计并见表1。
表1
***P＜0．001，**P＜0．01，*P＜0．05 vs应激对照。
2．讨论慢性应激的关键特征之一就是血中皮质酮水平显著升高、睾酮水平降低。由表1可看到化合物A二个剂量组可以逆转这一结果，表示可以拮抗慢性应激。
实施例3、化合物A对皮质酮损伤的PC12细胞的保护作用1．方法用含5％胎牛血清及5％马血清的DMEM培养液(含青霉素钠200kU·L-1，链霉素100mg·L-1，pH7．4)将细胞稀释为约2×108．L-1接种于预先用多聚赖氨酸(0．1g．L-1)处理过的96孔培养板，每孔100μL，放入CO2孵箱(美国Napco公司生产)37℃，5％CO2条件下培养3～4天，待细胞长满孔底后即可用于实验，参照文献(刘景根等，药学学报1998，33(3)165)方法，稍加改进，吸去细胞液，换上含有相应浓度药物及0．2mmol．L-1皮质酮(corticosterone，Cort)的无血清DMEM(对照组不含任何药品)，37℃5％CO2培养48小时，吸去培养液，用D-Hanks液洗2遍，每孔加入含0．5g．L-1MTT的无血清DMEM培养4小时后吸去培养液，每孔加入10％十二烷基硫酸钠100μL，待蓝色颗粒完全溶解(约12～16小时)，利用多孔扫描分光光度计(型号MCC／340)测定标本在570nm的吸光度(A)值，用于定量反映活细胞数并计算药物对皮质酮损伤的PC12细胞损伤的抑制率。表2
***P＜0．001 vs皮质酮损伤对照。
2．结果PC12细胞经0．2mmol．L-1皮质酮处理48小时后，对MTT摄取能力下降，A值显著低于正常对照组，表明细胞受到损伤或部分细胞已死亡，但当化合物A存在时，PC12细胞对MTT摄取能力明显增强，表明PC12细胞损伤明显减弱，活细胞明显增多，具有浓度依赖关系。此结果表明化合物A可以对抗应激导致的脑神经细胞的损伤。
权利要求
1．式Ⅰ低聚寡糖在制备用于治疗应激脑损伤药物中的用途， 其中n=1-8。
2．根据权利要求1的用途，其中所述药物可以片剂或胶囊形式使用。
3．根据权利要求1的用途，其中所述药物可以无菌注射剂或滴注液形式使用。
4．根据权利要求1的用途，其中式Ⅰ低聚寡糖为n=4的式Ⅰ低聚寡糖。
全文摘要
本发明涉及式Ⅰ低聚寡糖在制备用于治疗应激脑损伤药物中的用途。
文档编号A61K31/7004GK1289592SQ9912025
公开日2001年4月4日 申请日期1999年9月24日 优先权日1999年9月24日
发明者李云峰, 罗质璞, 赵毅民, 杨明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
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