一种用于放化疗减毒增效的药物组合物及其制备方法
专利名称：一种用于放化疗减毒增效的药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于放化疗减毒增效的药物及其制备方法，属于中药领域。
背景技术：
恶性肿瘤是我国常见病和多发病。目前所有的抗肿瘤药物几乎都属于细胞毒的范畴，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织也损伤严重，这种无法回避的毒副作用，限制了抗癌药物的应用和疗效的发挥。日前市场上常见用于放化疗减毒增效的药有核糖核酸、中成药有贞芪扶正颗粒、云芝多糖胶囊、精黄芝口服液(陕卫药准字(1993第001612号))等。这类中成药有的制剂工艺简单，有效成分不明确，有的作用靶点分散，从而影响疗效等。有资料表明，用于肿瘤的放疗、化疗中的升白效果明显、毒性小、且能增加血小板的药物很少，维血宁颗粒是同类药物中唯一的国家中药保护品种。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，如何依据中医药理论，研制在放化疗时使用具有减毒增效作用的药物组合物，同时通过优化制剂工艺、富集有效部位群，制备成疗效稳定、质量可控的中药制剂。
为解决上述问题，本发明提供下述技术方案。
一种有免疫调节作用的药物组合物，其特征在于它基本上由下列重量份的原料药制成黄芪、枸杞、灵芝为1-40份∶1-15份∶1-15份。其中原料药的较好的用量为黄芪、枸杞、灵芝重量比为1-30份∶1-12份∶1-12份。其中原料药更为理想的用量为黄芪、枸杞、灵芝重量比为30份∶12份∶12份。其中黄芪甘温，大补元气，为君。枸杞子甘平，滋补肝肾，灵芝甘平，补虚益肺，二药共为臣。诸药合用，共奏益气养阴、滋补肝肾之功。
上述药物组合物的制备方法，包括下列步骤a)取原料药黄芪、枸杞与灵芝，备用；b)将所述重量配比的黄芪，用70～90％乙醇提取1～4次，每次1～2.5小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上大孔树脂柱，用55～84％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入10～14倍量水，冷浸或煎煮提取2～4次，每次1～2小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量达70-85％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至相对密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量达70-80％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙与总多糖混合，得本发明药物的活性组分。该活性组分可与药学制剂上常规辅料混合，也可不加常规辅料，制成常规药物制剂。
本发明药物组合物较好的制备方法是b)将所述重量配比的黄芪，用75～85％乙醇提取2～3次，每次1.5～2.0小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上AB-8和/或D101型号大孔树脂柱，用60～80％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入11～13倍量水，煎煮3次，每次1.5小时，合并煎煮液，浓缩至80℃时相对密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量达75-80％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至80℃时相对密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量达75-80％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙与总多糖混合，加入药用辅料，常规制成口服制剂。
所述制备方法的较理想的技术特征在于b)将所述重量配比的黄芪，用80～82％乙醇提取3次，每次1.5小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上AB-8或D101型号大孔树脂柱，用65～70％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入12倍量水煎煮，煎煮液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达80％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙、总多糖与药学上常规辅料混合，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂或口服液。
上述制备方法中，其特征在于c)取水煎煮液，浓缩，醇沉，过滤得沉淀物后，取沉淀物加水溶解，过滤，用膜按常规操作进行超滤，先用30万截留分子量膜超滤去除大分子杂质，然后再用1000截留分子量膜超滤去除水分及部分小分子杂质，浓缩至相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀，得总多糖。
常用口服制剂辅料可选用，崩解剂如羟丙基淀粉、羟丙纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；填充剂如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精、微粉纤维素等；润湿剂和粘合剂如乙醇、预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素；润滑剂如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇4000和6000；润湿剂如十二烷基硫酸钠、吐温80。
本发明药物组合物，在制备提高免疫药物中的应用。
本发明药物组合物，在制备用于放化疗减毒增效的药物中的应用。
本发明药物组合物，在制备与放化疗合用的提高免疫、减毒增效药物中的应用。
在本发明药物组合物的原料药组方形成后，对有效部位的筛选是制备疗效准确、组分明确、质量可控的中药现代制剂的基础。
本发明药物组合物中的枸杞多糖和黄芪多糖都能于体外增强LAK活性。小鼠腹腔注射枸杞多糖5g/L(7d)可以显著增强NK细胞的杀伤功能，并能部分对抗环磷酰胺对小鼠NK细胞的抑制作用。灵芝的多糖类、三萜类、氨基酸多肽类、腺苷等化学成分，对免疫系统、神经系统、内分泌和代谢系统、心血管系统等具有调节作用，灵芝中的一种Gac-D三萜酸具有类似于紫杉醇的作用，可使癌细胞周期移行阻断在G2+M期，阻断癌细胞的疯长。深入的研究还显示灵芝多糖具有良好的免疫调节作用。而灵芝多糖类通过与三萜结合，可以具备免疫识别与细胞毒双重作用，能选择性地抑制肿瘤细胞，保证正常细胞不受损害，可以全面、主动调节机体免疫功能。与放化疗联用，本发明药物组合物即灵芝多糖、枸杞多糖和黄芪多糖与黄芪皂甙合用，具有显著协同减毒增效作用，具体表现在对环磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180有显著减毒增效作用，对60Co照射抑制小鼠肉瘤S180有明显的减毒增效作用，对正常小鼠经环磷酰胺化疗有明显的减毒作用，对60Co放疗所引起的毒副作用有明显的减毒功效作用，对荷瘤机体的细胞免疫及体液免疫功能均有明显增强作用，从而真正实现了“零毒化疗”。
一、有效部位筛选实验以药效学试验考察不同提取条件的差异及不同提取部位的药理活性。以正常小鼠化疗试验进行黄芪的不同提取部位的药理活性筛选，同时考察不同提取方法对枸杞多糖药效学的影响。结果表明黄芪中的皂甙为活性部位，而由黄芪提取出的氨基酸无明显药理活性；不同的提取温度对枸杞多糖的药理活性无明显影响。
动物昆明种小白鼠，♀♂各半，普通级，购于南京江宁青龙山动物繁殖场，合格证号SCXK(苏)2001-0014。饲养环境为普通级，合格证号SYXK(苏)2001-0008。
黄芪多糖(药液)含生药1g/ml，批号20010609。黄芪皂甙(药液)含生药1g/ml，批号20010426。黄芪氨基酸(药液)含生药1g/ml，批号20010429，江苏省中医药研究院中药制剂研究室提供，用时加适量蒸馏水配成适宜浓度的混悬液。
枸杞多糖I(药液)为冷提所得，含生药材1g/ml，批号20010425；枸杞多糖II(药液)为热提所得，含生药材1g/ml，批号20010411，江苏省中医药研究院中药制剂研究室提供，用时加适量蒸馏水配成适宜浓度的混悬液。
注射用环磷酰胺0.2g/支，鲁卫药准字(1996)第403501号，批号01010310，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，用时加适量无菌生理盐水配成所需浓度的药液。
黄芪不同提取部位的药理活性比较昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18～22克，随机分为5组即正常对照组、环磷酰胺化疗组、黄芪多糖组、皂甙组和氨基酸组。黄芪多糖、皂甙和氨基酸组均灌胃给予相当于生药材11.0g/kg的相应样品，正常对照及环磷酰胺化疗组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药10天。除正常对照组外，其余小鼠均于给药第8天开始，于灌胃给予水或药液的同时，每日腹腔注射环磷酰胺(Cy)40mg/kg，连续3天。于末次注射Cy后24小时，各组动物眼眶后静脉丛采血30μl，注入稀释液中，用法国产全自动动物血球计数仪测定外周血象。
结果表明正常小鼠经环磷酰胺化疗后，外周血液中白细胞数量显著下降，与环磷酰胺组比较，给予黄芪多糖及黄芪皂甙治疗的动物白细胞数量均有明显恢复(P＜0.05)，而给予黄芪氨基酸治疗的小鼠白细胞数量与环磷酰胺化疗组比较无显著性差异，这表明黄芪多糖及黄芪皂甙对化疗药引起的白细胞数量降低有显著的改善作用，而黄芪氨基酸则无明显的升白作用。
不同提取方法所得的枸杞多糖对正常小鼠Cy化疗后外周血象的影响实验表明，与环磷酰胺化疗组比较，给予枸杞多糖I和枸杞多糖II的小鼠白细胞数均明显升高(P＜0.05)，且两组动物的血红蛋白数均比化疗组有所增高(P＜0.01～0.001)，而这两组之间的外周血象则无明显差异，表明主要由枸杞多糖I和II组成的枸杞总多糖对化疗引起的白细胞数量减少均有显著的改善作用，证明枸杞多糖不同的提取温度对其药理活性无明显影响。
黄芪总皂甙和黄芪、枸杞与灵芝总多糖混合后，在放化疗情况下，对提高实验动物如小鼠的免疫功能、减毒增效具有显著作用。
二、本发明药物组合物的制备方法研究黄芪药材用乙醇回流提取可采用不同浓度乙醇冷浸或回流和/或索氏提取；沉淀时可静置，静置方法可用冷藏静置和/或常温静置；分离方法可采用离心分离，主要是去除杂质，和冷藏静置分离，主要是去除上浮油脂。树脂柱纯化分离时，事先可按常规将大孔树脂进行预处理。本发明制备方法中回收乙醇可采用常压回收和/或减压回收。干燥分离的沉淀时，可采用烘箱干燥、真空干燥、冷冻干燥和/或喷雾干燥。黄芪等水提取可用冷浸和/或煎煮。本发明制备方法中，凡涉及浓缩工艺时，可采用减压浓缩、常压浓缩和/或薄膜蒸发浓缩。
本发明方法中凡涉及沉淀或析出物与液体分离时，可采用离心分离、膜分离和/或常压或减压过滤。粉碎可采用单独粉碎和/或混合粉碎。制粒可采用湿法制粒和/或干法制粒。
对影响黄芪醇回流提取的主要因素乙醇浓度按四因素三水平L(3)进行正交试验。试验结果表明，影响黄芪总皂苷的主要因素为提取次数；影响黄芪甲苷的主要因素为乙醇的百分浓度，其次为提取次数，溶媒量和提取时间影响较小。综合三者，总提取物多者，即带进杂质亦较多，给下一步的纯化增加困难，根据综合分析的结果选择了发明药物组合物的制备方法。由于第一次醇回流时药材是干品，本身要吸收约2倍量的醇，因此第一次加醇量均在基础醇量上多加2倍。
提取液减压回收乙醇，离心或静置除去上浮油脂，AB-8树脂和/或D101和/或D605和/或D140和/或NKAII大孔树脂纯化，乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷。结果见表1。
本发明黄芪总皂苷提取物用AB-8和/或D101和/或D605和/或D140和/或NKAII大孔树脂分离纯化方法比传统的水醇法比较，本发明制得的样品中黄芪总皂苷含量较高，且总皂苷含量占总固体比例高，表明AB-8大孔树脂含量较大，表明用大孔树脂纯化法除去杂质的同时保留了有效成分的比例高。与传统工艺即水醇法比较，结果总皂苷的含量提高5倍，总皂苷占总固体物的比例由原来的2.3％提高至50％以上。结果见表2。
在总皂苷解吸过程中，用85～55％乙醇洗脱总皂甙含量较高，用75～60％乙醇洗脱更好，用65％乙醇洗脱最好，其总提取物中总皂苷含量为56.6％，高于其它浓度。结果见表2。
对影响黄芪、枸杞、灵芝三药多糖提取的因素加水量、药材浸泡时间、提取次数按四因素三水平L9(34)进行正交试验。按常规，将中药的水煎煮条件设计为中间水平，分别再取高低两个水平。试验表明，影响多糖提取的主要因素均为煎煮时间，且均以煎煮三次，每次1.5小时为佳。结果见表3。
表1 水醇法与大孔树脂纯化法样品含量比较纯化方法总皂苷含量总提取物总提取中mg/g mg/g总皂苷含量(％)AB-873.3 10.569.8水醇法 14.7 63.02.3表2总皂苷乙醇解吸浓度比较乙醇浓度％总皂苷含量总提取物总提取中Mg/g mg/g 总皂苷含量(％)351.5029 6.18 24.3453.3896 7.09 47.8554.2278 8.90 47.5656.1688 10.09 56.6755.7850 11.18 51.7855.2486 10.09 52.0953.5428 9.27 38.1
表3 水提取正交试验总提取 多糖含量序列 A B CD 总多糖％物％ mg/g生药1 1 1 11 25.373.04 13.97042 1 2 22 33.369.24 50.57493 1 3 33 36.6411.34 64.05124 2 1 23 34.5210.05 58.60995 2 2 31 27.003.99 23.29836 2 3 12 33.989.43 50.06697 3 1 32 32.0010.28 57.53688 3 2 13 35.338.75 49.71309 3 3 21 27.737.22 39.7752总K195.37 91.89 94.6880.10提K295.50 95.69 95.6199.34取K395.06 98.35 95.64106.49物R×3 0.44 6.46 0.96 26.39总K123.62 23.37 21.2214.25多K223.47 21.98 26.5128.95糖K326.25 27.99 25.6130.14R×3 2.78 6.01 4.39 15.89多K1128.5965 130.1171 113.753 77.0439糖K2131.9751 125.5862 148.960 158.1786含K3147.0250 153.8933 144.883 172.3741量R×3 18.4285 28.3071 31.1360 95.3302三、发明组合物主要药效学研究资料1、对环磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180的减毒增效作用本发明药物组合物按10.0、5.0和2.5g生药/kg灌胃给药，对S180荷瘤小鼠经环磷酰胺化疗所引起的白细胞降低及骨髓有核细胞减少有明显的升高作用，对化疗所引起的脾脏及胸腺指数下降有显著的改善作用，与环磷酰胺合用能显著升高其抑瘤率，表明本品对环磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180有明显的减毒增效作用。
本发明组合物(干粉)含生药37.0g/g，制备方法见实施例1。
维血宁颗粒8g/袋，苏卫药准字(1993)第165801号，批号020712，常州药业股份有限公司健民制药厂生产，用时加适量蒸馏水配成适宜浓度的混悬液。(下同)注射用环磷酰胺(简称Cy，下同)0.2g/支，鲁卫药准字(1996)第403501号，批号02080421，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，用时加适量无菌生理盐水配成所需浓度的药液。(下同)
瘤株肉瘤S180实体型，移自江苏省肿瘤研究所，由江苏省中医药研究院药理室传代保种。(下同)实验详细方法参见中药新药药理学研究指南.治疗恶性肿瘤中药的药效学研究.卫生部药政局《中药新药研究指南》，1994104；叶应妩、王毓三等.全国临床检验操作规程.东南大学出版社.19914，64；万军梅、张永忠、吴巍等.抑瘤扶正丸提高化疗疗效的实验研究.中成药，2002，24(9)695～6972、对环磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180瘤重及抑瘤率的影响昆明种雄性小鼠60只，体重18-22克，分为6组即荷瘤对照组、环磷酰胺化疗组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药12天。并于给药的第4天，取腹部接种S180瘤株8天的荷瘤小鼠，无菌操作下抽取腹腔瘤液，以灭菌生理盐水稀释成1∶4浓度的瘤细胞液(镜检含瘤细胞数5×107/ml)，于所有小鼠右前肢腋部皮下接种0.2ml/鼠。除荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤后次日开始，于灌胃给予水或药液的同时，每日腹腔注射环磷酰胺15mg/kg，连续8天，于末次给药后24小时，小鼠脱颈椎处死，剥离肉瘤，电子天平称重。计算各组小鼠瘤重平均值及抑瘤率。结果见表1。 表4 本发明组合物对环磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180瘤重和抑瘤率的影响(x±SD，n＝10)剂量 Cy 瘤重抑瘤率组别(g/kg)(mg/kg×d)(g，X±SD) (％)荷瘤对照组 / / 1.910±0.402Cy组/ 15×8 1.086±0.305***43.12阳性药组4.8 15×8 0.810±0.258***Δ57.59高剂量组10.0 15×8 0.708±0.377***Δ62.93中剂量组5.0 15×8 0.735±0.366***Δ61.52低剂量组2.5 15×8 0.904±0.413***52.67注1.与荷瘤对照组比较(t-检验)，***P＜0.001；2.与Cy组比较(t-检验)，ΔP＜0.05；表4可见，S180荷瘤小鼠在Cy化疗同时灌胃给予本发明组合物，与荷瘤对照组比较，各给药组瘤重均有显著抑制作用(P＜0.001)，瘤重抑制率在52％至62％之间，且与单用Cy组比较，高、中剂量组瘤重明显减轻(P＜0.05)，表明本品对Cy抑制小鼠肉瘤S180有明显的增效作用。
3、对荷瘤小鼠Cy化疗后外周血象的影响昆明种雄性小鼠70只，体重18～22克，随机分为7组即正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺化疗组、阳性药组和给药高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常及荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药15天。并于给药的第4天，除正常对照组外，其余小鼠右前肢腋部皮下接种S180瘤细胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除正常及荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤后次日(即给药第5天)开始，于灌胃给予水或药液的同时，每日腹腔注射环磷酰胺(Cy)15mg/kg，连续8天。于末次注射Cy后第二、四、六天，各组动物眼眶后静脉丛采血30μl，注入稀释液中，用法国产全自动动物血球计数仪测定外周血象。结果见表5～8。
表5 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后外周血液中WBC的影响(x±SD，n＝10)Cy WBC(109/L)组别 剂量(g/kg)(mg/kg×d) 第一次 第二次 第三次正常对照组 / / 17.0±4.8 17.2±2.718.1±5.1荷瘤对照组 / / 16.9±5.5***16.0±4.5*18.1±4.7Cy组/ 15×8 7.3±3.1 12.2±2.618.3±5.1阳性药组4.8 15×8 11.9±3.5**15.9±4.3*19.8±5.5高剂量组10.0 15×8 12.2±3.9**17.1±3.4**19.7±6.8中剂量组5.0 15×8 11.3±4.5*15.7±3.9*18.4±3.9低剂量组2.5 15×8 13.2±4.3**15.1±3.4*20.8±4.5注与Cy化疗组比(t检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表6 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后外周血液中RBC的影响(x±SD，n＝10)Cy RBC(1012/L)组别 剂量(g/kg)(mg/kg×d)第一次 第二次 第三次正常对照组 // 13.23±1.53 12.72±2.2212.13±1.15荷瘤对照组 // 11.96±1.47 11.29±1.0111.98±1.07Cy组 /15×8 10.92±1.19 11.55±1.1011.04±1.35阳性药组 4.8 15×8 11.50±1.46 10.76±1.2810.13±1.74高剂量组 10.0 15×8 12.52±1.76*12.43±1.2011.93±1.66中剂量组 5.0 15×8 11.99±1.47 11.76±2.3411.11±0.86低剂量组 2.5 15×8 11.07±1.39 11.55±2.0411.90±1.60注与Cy化疗组比(t检验)，*P＜0.05。
表7 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后外周血液中HGB的影响(x±SD，n＝10)Cy HGB(g/L)组别 剂量(g/kg)(mg/kg×d)第一次 第二次 第三次正常对照组 / / 205.7±19.1Δ201.9±37.0Δ187.1±18.0
荷瘤对照组/ / 182.3±28.0170.4±15.5185.7±14.9Cy组 / 15×8169.6±21.9167.5±19.2171.4±21.2阳性药组4.815×8179.6±26.8161.1±18.6152.5±22.6高剂量组10.0 15×8193.7±24.9*192.9±21.9*179.1±25.0中剂量组5.015×8187.4±25.2176.6±32.1167.8±11.5低剂量组2.515×8172.4±22.2173.6±25.8183.4±26.8注1.与Cy化疗组比(t检验)，*P＜0.05。
2.与荷瘤组比(t检验)，ΔP＜0.05。
表8 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后外周血液中PLT的影响(x±SD，n＝10)剂量 Cy PLT(109/L)组别(g/kg) (mg/kg×d)第一次 第二次 第三次正常对照组// 707.6±132.1 793.2±111.0 643.3±79.7荷瘤对照组// 627.6±104.8 752.3±202.4 697.4±109.2Cy组 /15×8 649.5±160.5 709.9±96.0720.0±112.0阳性药组 4.8 15×8 691.2±123.4 778.5±106.9 787.2±192.7高剂量组 10.0 15×8 660.0±89.9771.1±166.7 768.1±82.1中剂量组 5.0 15×8 693.4±167.7 734.6±118.6 766.7±103.4低剂量组 2.5 15×8 771.7±198.1 748.5±122.2 798.9±68.9由表5～8可见，荷瘤小鼠经Cy化疗后，外周血液中WBC数量显著下降，并呈现出明显的时效关系，在末次注射Cy后24小时为最低点，以后逐淅恢复。与Cy组比较，给予本发明组合物治疗的各组动物的WBC数量在不同时间段均有明显恢复(P＜0.05～0.01)，且在化疗组WBC数量在最低点时作用更加显著，表明本品对化疗药引起的WBC数降低有显著的改善作用。而化疗组的RBC、HGB、PLT数则无明显变化，但本品高剂量组RBC及HGB比化疗组略有升高(P＜0.05)。
4、对荷瘤小鼠Cy化疗后骨髓有核细胞的影响昆明种雄性小鼠70只，体重18-22克，分为7组即正常组、荷瘤对照组、环磷酰胺化疗组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常及荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药12天。并于给药的第4天，除正常对照组外，其余小鼠右前肢腋部皮下接种S180瘤细胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤后次日开始，于灌胃给予水或药液的同时，每日腹腔注射环磷酰胺(Cy)15mg/kg，连续8天，于末次给药后24小时，小鼠脱颈椎处死，剥离左侧股骨，以3％醋酸10ml冲出骨髓细胞，按白细胞计数方法，计算1根骨内的骨髓有核细胞数量。结果见表9。表9 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后骨髓有核细胞数量的影响(x±SD，n＝10)
组别 剂量(g/kg)Cy(mg/kg×d)骨髓有核细胞数(109/L)正常对照组/ / 24.32±3.75荷瘤对照组//23.70±4.65***Cy组 / 15×812.50±2.86阳性药组 4.8 15×816.60±3.66*高剂量组 10.0 15×817.84±3.05***中剂量组 5.0 15×816.78±3.33**低剂量组 2.5 15×815.29±2.84*注与Cy化疗组比(t-检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
由表9可见，与Cy化疗组比较，本发明组合物各组小鼠骨髓有核细胞数均明显升高(P＜0.05～0.001)，表明本品对化疗引起的骨髓有核细胞数量减少有显著增高作用。
5、对荷瘤小鼠Cy化疗后免疫器官重量的影响昆明种雄性小鼠70只，体重18-22克，实验方法同2.3。于末次给药后24小时，小鼠称重后脱颈椎处死，取脾脏及胸腺称重并计算脏器指数，结果见表10。
表10 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后免疫器官重量的影响(x±SD，n＝10)组别剂量(g/kg) Cy(mg/kg×d)脾脏指数(mg/g)胸腺指数(mg/g)正常对照组/ / 5.01±1.162.70±0.76荷瘤对照组/ / 5.81±0.74***2.64±0.88**Cy组 /15×83.27±0.651.58±0.44阳性药组 4.8 15×84.51±1.70*2.11±0.64*高剂量组 10.0 15×84.72±1.34**2.33±0.54**中剂量组 5.0 15×84.13±1.02*1.93±0.52低剂量组 2.5 15×83.97±1.131.67±0.67注与Cy化疗组比(t-检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表10可见，与Cy化疗组比较，本发明组合物高、中剂量组小鼠脾脏指数明显增加(P＜0.05～0.01)，高剂量组胸腺指数显著增高(P＜0.01)，表明本品对Cy化疗引起的胸腺及脾脏指数降低有明显的改善作用。实验结果表明，本发明组合物对环磷酰胺化疗所引起的S180荷瘤小鼠外周血白细胞数量减少有明显的改善作用，同时能明显升高骨髓有核细胞数量，并能增加荷瘤化疗小鼠的脾及胸腺指数；本品与环磷酰胺合用，能明显抑制肿瘤生长，对化疗药Cy的抑瘤作用有明显增强作用。以上结果表明本发明组合物与化疗药Cy合用，有明显的减毒增效作用。
6、对60Co照射抑制小鼠肉瘤S180的减毒增效作用本发明药物组合物按10.0、5.0和2.5g生药/kg灌胃给药，对S180荷瘤小鼠经60Co放疗所引起的白细胞降低及骨髓有核细胞减少有明显的升高作用，对放疗所引起的脾脏及胸腺指数下降有一定的改善作用，能显著升高放疗抑瘤率，表明本品对60Co放疗抑制小鼠肉瘤S180有明显的减毒增效作用。
本发明组合物(干粉)含生药37.0g/g，批号20020629，江苏省中医药研究院中药制剂研究室提供。其余同上。
实验方法与结果对60Co放疗抑制小鼠肉瘤S180瘤重及抑瘤率的影响昆明种雄性小鼠60只，体重18-22克，分为6组即荷瘤对照组、60Co放疗组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药12天。并于给药的第4天，取腹部接种S180瘤株8天的荷瘤小鼠，无菌操作下抽取腹腔瘤液，以灭菌生理盐水稀释成1∶4浓度的瘤细胞液(镜检含瘤细胞数5×107/ml)，于所有小鼠右前肢腋部皮下接种0.2ml/鼠。除荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤三日后，一次给予350Rad60Co照射。于末次给药后24小时，小鼠脱颈椎处死，剥离肉瘤，电子天平称重。计算各组小鼠瘤重平均值及抑瘤率。结果见表11。 表11 本发明组合物对60Co放疗抑制小鼠肉瘤S180瘤重和抑瘤率的影响(x±SD，n＝10)剂量60Co(Rad) 瘤重抑瘤率组别(g/kg) (g，X±SD) (％)荷瘤对照组 // 2.683±0.69560Co组 / 350 1.608±0.467***40.06阳性药组4.8 350 1.211±0.0.365***Δ54.85高剂量组10.0350 1.153±0.346***Δ57.02中剂量组5.0 350 1.179±0.319***Δ56.05低剂量组2.5 350 1.332±0.223***50.35注1.与荷瘤对照组比较(t-检验)，***P＜0.001；2.与60Co放疗组比较(t-检验)，ΔP＜0.05；表11可见，S180荷瘤小鼠在60Co放疗同时灌胃给予本发明组合物，与荷瘤对照组比较，各给药组瘤重均有显著抑制作用(P＜0.001)，瘤重抑制率在50％至57％之间，且与单用60Co放疗组比较，高、中剂量组瘤重明显减轻(P＜0.05)，表明本品对60Co放疗抑制小鼠肉瘤S180有明显的增效作用。
7、对荷瘤小鼠60Co放疗后外周血象的影响昆明种雄性小鼠70只，体重18-22克，随机分为7组即正常对照组、荷瘤对照组、60Co放疗组、阳性药组和给药高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常及荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药15天。并于给药的第4天，除正常对照组外，其余小鼠右前肢腋部皮下接种S180瘤细胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除正常及荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤3日后(即给药第7天)一次给予350Rad60Co照射。于60Co照射后第三、六、九天，各组动物眼眶后静脉丛采血30μ1，注入稀释液中，用法国产全自动动物血球计数仪测定外周血象。实验表明荷瘤小鼠经60Co放疗后，外周血液中WBC数量显著下降，且持续维持较低水平，而RBC、HGB及PLT数量在照射后第六日明显减少，至第九日，PLT仍维持较低水平。与60Co放疗组比较，本发明组合物高、中剂量组动物的WBC数量在第六日及第九日均有明显恢复(P＜0.05～0.01)，高剂量组HGB及PLT数量也明显升高(P＜0.05～0.01)，对RBC的降低有升高趋势，但无显著性差异。以上结果表明本品对化疗药引起的WBC数降低有显著的改善作用，并在一定程度上升高HGB和PLT。
8、对荷瘤小鼠60Co放疗后骨髓有核细胞的影响昆明种雄性小鼠70只，体重18-22克，分为7组即正常组、荷瘤对照组、60Co放疗组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常及荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药12天。并于给药的第4天，除正常对照组外，其余小鼠右前肢腋部皮下接种S180瘤细胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤3日后一次给予350Rad60Co照射。于末次给药后24小时，小鼠脱颈椎处死，剥离左侧股骨，以3％醋酸10ml冲出骨髓细胞，按白细胞计数方法，计算1根骨内的骨髓有核细胞数量。实验表明与60Co放疗组比较，本发明组合物对60Co放疗所引起的S180荷瘤小鼠外周血白细胞数量减少有明显的改善作用，在一定程度上升高由于放疗引起的HGB及PLT数量的下降，同时能明显升高骨髓有核细胞数量；本品与60Co照射合用，能明显抑制肿瘤生长，对放疗的抑瘤作用有明显增强作用。以上结果表明本发明组合物与放疗合用，有明显的减毒增效作用。
9、对正常小鼠化疗的减毒作用本发明药物组合物按10.0、5.0和2.5g生药/kg灌胃给药，对正常小鼠经环磷酰胺化疗所引起的白细胞降低及骨髓有核细胞数减少有明显的升高作用，对化疗所引起的脾脏及胸腺指数下降有显著的改善作用，表明本品对正常小鼠经环磷酰胺化疗有明显的减毒作用。
10、对荷瘤小鼠免疫功能的影响本发明药物组合物按10.0、5.0和2.5g生药/kg灌胃给药，可使S180荷瘤小鼠对PHA刺激的淋巴细胞转化反应增强，小鼠外周血中T淋巴细胞百分比明显升高，并且荷瘤机体血清溶血素水平显著提高。以上结果表明本品对荷瘤机体的细胞免疫及体液免疫功能均有明显增强作用。
本发明组合物(干粉)含生药37.0g/g，批号20020629，江苏省中医药研究院中药制剂研究室提供。
对PHA刺激淋巴细胞转化的影响(体内诱导法)，参见李仪奎等.中药药理实验方法学.上海上海科学技术出版社，1991164昆明种小鼠70只，雌雄各半，体重18-22克，分为7组即正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺模型组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。除正常对照组外，其余小鼠均于右前肢腋部皮下接种1∶4稀释的S180瘤细胞液0.2ml/鼠。接种肿瘤次日开始给药，给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常组、荷瘤对照组及模型组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药8天。并于给药的第1天起，每天肌肉注射PHA10mg/kg一次，连续三次；给药第6天除正常及荷瘤对照组外，其余各组动物均腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，第7天重复一次，末次给药后1小时，小鼠眼眶后静脉丛采血，推片，甲醇固定，姬氏染色，水洗，晾干，高倍镜下计数100个淋巴细胞中淋巴母细胞数，计算淋巴细胞转化率。结果见表12。
表12、本发明组合物对荷瘤小鼠淋巴细胞转化及T淋巴细胞酯酶染色率的影响(x±SD，n＝10)组别 剂量 Cy淋巴细胞转化率ANAE染色率(g/kg) (mg/kg×d)(％，X±SD) (％，X±SD)正常对照组// 43.6±5.6 59.3±7.1荷瘤对照组// 44.5±3.9***58.7±6.1***Cy组 / 40×2 15.0±4.832.2±5.8阳性药组 4.8 40×2 22.7±7.4*40.8±8.6*高剂量组 10.040×2 24.8±5.4***41.2±7.2**中剂量组 5.0 40×2 22.5±4.8**39.0±7.2*低剂量组 25 40×2 20.0±3.9*35.9±7.5注与Cy组比较(t-检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；表12可见，本发明组合物各剂量组动物对PHA刺激的转化反应增强，淋巴母细胞百分率与环磷酰胺组比较有显著提高(P＜0.05～0.001)，表明本品能提高荷瘤机体T淋巴细胞的应答功能，即提高细胞免疫功能。
11、对荷瘤小鼠T-淋巴细胞酯酶染色率的影响昆明种小鼠70只，雌雄各半，体重18-22克，分为7组即正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺模型组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。除正常对照组外，其余小鼠均于右前肢腋部皮下接种1∶4稀释的S180瘤细胞液0.2ml/鼠。接种肿瘤次日开始给药，给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常组、荷瘤对照组及模型组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药10天。第8天除正常及荷瘤对照组外，其余各组动物均腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，第9天重复一次，末次给药后1小时，小鼠眼眶后静脉丛采血，推片，酯酶染色，晾干，油镜下计数100个淋巴细胞，其中有棕红色颗粒的为T细胞，无棕红色颗粒的为B细胞。由表12结果可见，本发明组合物高、中剂量组外周血中T淋巴细胞百分比明显高于环磷酰胺组(P＜0.05～0.01)，说明本品对环磷酰胺所致的荷瘤机体免疫抑制有明显恢复作用，即对细胞免疫功能有促进作用。
12、对荷瘤小鼠溶血素抗体生成的影响(比色法)昆明种小鼠70只，雌雄各半，体重18-22克，分为7组即正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺模型组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。除正常对照组外，其余小鼠均于右前肢腋部皮下接种1∶4稀释的S180瘤细胞液0.2ml/鼠。接种肿瘤次日开始给药，给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常组、荷瘤对照组及模型组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药10天。于给药后第3天各组动物腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.2ml/只进行免疫，再于给药后第8天除正常及荷瘤对照组外，其余各组动物均腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，第9天重复一次，末次给药后1小时，小鼠眼眶后静脉丛采血，离心，取10μl血清用生理盐水稀释100倍，与5％鸡红细胞悬液0.5ml及10％补体0.5ml混合，37℃恒温水浴中保温30min后，0℃冰水浴中终止反应，离心，取上清液于分光光度计540nm处比色，测光密度值，另设不加血清的空白对照，取上清液作为比色时调零的基准。以OD值作为判定血清溶血素水平的指标。实验中本发明组合物能明显增加荷瘤小鼠血清溶血素水平(P＜0.05～0.001)，使环磷酰胺所致的血清溶血素含量下降有明显恢复，表明本品能提高荷瘤机体的体液免疫能力。以上实验结果表明，本发明组合物对S180荷瘤小鼠由环磷酰胺所引起的免疫抑制有明显的恢复作用，能显著升高T淋巴细胞酯酶染色率、增强PHA诱导的淋巴细胞转化反应，并能明显提高血清溶血素水平，表明本品对于荷瘤机体的细胞免疫及体液免疫均有显著增强作用。
四、本发明组合物急性毒性试验本发明组合物给小鼠灌胃给药未见明显的急性毒性反应，无法按常规方法测定半数致死量(LD50)。小鼠一次灌胃给药的最大给药量为740g生药/kg，此剂量相当于拟临床人用量的822倍，未见明显的毒性反应。
五、本发明组合物长期毒性试验连续灌胃给药3个月的长期毒性试验研究表明，用相当于生药材50.0、25.0和12.5g/kg剂量的本发明组合物给SD大鼠连续灌胃90天，其中大剂量约为临床人拟用剂量的55.6倍，未发现动物有活动减少、毛松乱、精神萎糜不振等现象，对大鼠的体重、脏器系数、血液生化检查等均未见明显的毒性反应。血液生化学检查显示大剂量组3个月的的ALP及6个月的AST明显升高，中、小剂量组未见有明显毒性，表明本品长期毒性试验的中剂量(25.0g生药/kg)以下为安全剂量，大剂量组对肝功能有一定损害，提请临床使用时注意对血液生化学指标的监测。
具体实施例方式
实施例1取黄芪3.0kg、枸杞1.2kg、灵芝1.2kg。
黄芪药材第一次用8倍量、第二次用6倍量80％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并回流液，过滤，回收乙醇，母液静置12小时，离心，离心液上已处理过AB-8大孔树脂纯化，70％乙醇洗脱，回收乙醇，干燥，得总皂苷30克。
黄芪药渣，枸杞、灵芝等处方药用12倍量水提取三次，每次1.5小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.2(80℃)，乙醇沉淀含醇量达80％，静置，过滤，沉淀物挥去乙醇至干，加蒸馏水溶解，离心，离心液浓缩至相对密度1.2(80℃)，再用乙醇沉淀，含醇量达75％，静置，过滤，挥去乙醇至干，得总多糖150克。
合并总皂甙与总多糖，粉碎，装入明胶硬胶囊。服法一天3次，一次2粒。
黄芪药材第一次用8倍量、第二次用6倍量80％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并回流液，过滤，回收乙醇，母液静置12小时，离心，离心液上已处理过AB-8大孔树脂纯化，70％乙醇洗脱，回收乙醇，干燥，得总皂苷30克。
黄芪药渣，枸杞、灵芝等处方药用12倍量水提取三次，每次1.5小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.2(80℃)，乙醇沉淀含醇量达80％，静置，过滤，沉淀物挥去乙醇至干，加蒸馏水溶解，离心，离心液浓缩至相对密度1.2(80℃)，再用乙醇沉淀，含醇量达75％，静置，过滤，挥去乙醇至干，得总多糖150克。
合并总皂甙与总多糖，粉碎，加赋形剂，压片。服法一天3次，一次3片。
实施例3取黄芪4.0kg、枸杞1.5kg、灵芝1.5kg。
将所述重量配比的黄芪，用90％乙醇提取4次，每次2.5小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上AB-8大孔树脂柱，用80％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙40克；将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入10倍量水，煎煮4次，每次2小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.3，加入乙醇使含醇量达70％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至相对密度1.1，加入乙醇使含醇量达70％，滤取沉淀物，干燥得总多糖196克；合并总皂甙与总多糖，粉碎，加入乙醇作粘合剂，加入淀粉作填充剂，常规压制成颗粒剂。服法一天3次，一次1袋。
实施例4取黄芪4.0kg、枸杞3.5kg、灵芝3.5kg。
将所述重量配比的黄芪，用70％乙醇提取2次，每次1小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上D101大孔树脂柱，用60％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙40克；将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入14倍量水，煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达85％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至相对密度1.3，加入乙醇使含醇量达70％，滤取沉淀物，干燥得总多糖276克；将黄芪总皂甙与总多糖混合，粉碎，加入常规辅料，制成散剂。服法一天3次，一次1袋。
实施例5取黄芪4.0kg、枸杞2.0kg、灵芝2.0kg将所述重量配比的黄芪，用75％乙醇提取3次，每次1小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上D101大孔树脂柱，用65％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙40克；将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入13倍量水煎煮，煎煮液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达80％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀物，干燥得总多糖210克；合并总皂甙与总多糖，粉碎，常规制粒，装胶囊。
实施例6取黄芪4.0kg、枸杞1.0kg、灵芝1.0kg将所述重量配比的黄芪，用75％乙醇提取3次，每次1小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上D101大孔树脂柱，用65％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙40克；将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入13倍量水煎煮，取水煎煮液，浓缩，醇沉，过滤得沉淀物后，取沉淀物加水溶解，过滤，用膜按常规操作进行超滤，先用30万截留分子量膜超滤去除大分子杂质，然后再用1000截留分子量膜超滤去除水分及部分小分子杂质，浓缩至相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀，得总多糖176克。合并总皂甙与总多糖，粉碎，装胶囊。
实施例7取黄芪3.0kg、枸杞1.2kg、灵芝1.2kg。
黄芪药材第一次用8倍量、第二次用6倍量80％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并回流液，过滤，回收乙醇，母液静置12小时，离心，离心液上已处理过AB-8大孔树脂纯化，70％乙醇洗脱，回收乙醇，干燥，得总皂苷30克。
黄芪药渣，枸杞、灵芝等处方药用12倍量水提取三次，每次1.5小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.2(80℃)，乙醇沉淀含醇量达80％，静置，过滤，沉淀物挥去乙醇至干，加蒸馏水溶解，离心，离心液浓缩至相对密度1.2(80℃)，再用乙醇沉淀，含醇量达75％，静置，过滤，挥去乙醇至干，得总多糖150克。合并总皂甙与总多糖，加蒸馏水溶解，过滤，制成每1ml含1.8g生药溶液，灌装于10ml管制口服液瓶中，灭菌。
权利要求
1.一种有免疫调节作用的药物组合物，其特征在于它基本上由下列重量份的原料药制成黄芪、枸杞、灵芝为1-40份∶1-15份∶1-15份。
2.权利要求1的药物组合物，其中原料药的用量为黄芪、枸杞、灵芝重量比为1-30份∶1-12份∶1-12份。
3.权利要求2的药物组合物，其中原料药的用量为黄芪、枸杞、灵芝重量比为30份∶12份∶12份。
4.权利要求1～3之一药物组合物的制备方法，包括下列步骤a)取原料药黄芪、枸杞与灵芝，备用；b)将所述重量配比的黄芪，用70～90％乙醇提取1～4次，每次1～2.5小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上大孔树脂柱，用55～84％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入10～14倍量水，冷浸或煎煮提取2～4次，每次1～2小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量达70-85％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至相对密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量达70-80％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙与总多糖混合，得本发明药物的活性组分。
5.权利要求4的制备方法，其特征在于b)将所述重量配比的黄芪，用75～85％乙醇提取2～3次，每次1.5～2.0小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上AB-8和/或D101型号大孔树脂柱，用60～80％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入11～13倍量水，煎煮3次，每次1.5小时，合并煎煮液，浓缩至80℃时相对密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量达75-80％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至80℃时相对密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量达75-80％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙与总多糖混合后，加入药用辅料，常规制成口服制剂。
6.权利要求5的制备方法，其特征在于b)将所述重量配比的黄芪，用80～82％乙醇提取3次，每次1.5小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上AB-8或D101型号大孔树脂柱，用65～70％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入12倍量水煎煮，煎煮液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达80％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙、总多糖与药学上常规辅料混合，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂或口服液。
7.权利要求6的制备方法，其特征在于c)取水煎煮液，浓缩，醇沉，过滤得沉淀物后，取沉淀物加水溶解，过滤，用膜按常规操作进行超滤，先用30万截留分子量膜超滤去除大分子杂质，然后再用1000截留分子量膜超滤去除水分及部分小分子杂质，浓缩至相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀，得总多糖。
8.权利要求1的药物组合物，在制备提高免疫药物中的应用。
9.权利要求1的药物组合物的制备方法，在制备用于放化疗减毒增效的药物中的应用。
10.权利要求1的药物组合物，在制备与放化疗合用的提高免疫、减毒增效药物中的应用。
全文摘要
一种与放化疗用协同作用的提高免疫、减毒增效的药物组合物，由黄芪、枸杞、灵芝按1－40份∶1－15份∶1－15份重量配比，通过优化制剂工艺，富集有效部位群，制成疗效显著且稳定、质量可控的中药口服制剂。
文档编号A61P37/02GK1480208SQ03132059
公开日2004年3月10日 申请日期2003年7月18日 优先权日2003年7月18日
发明者段金廒, 贾晓斌, 彭蕴茹 申请人:江苏省中医药研究院
技术领域：
本发明涉及一种用于放化疗减毒增效的药物及其制备方法，属于中药领域。
背景技术：
恶性肿瘤是我国常见病和多发病。目前所有的抗肿瘤药物几乎都属于细胞毒的范畴，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织也损伤严重，这种无法回避的毒副作用，限制了抗癌药物的应用和疗效的发挥。日前市场上常见用于放化疗减毒增效的药有核糖核酸、中成药有贞芪扶正颗粒、云芝多糖胶囊、精黄芝口服液(陕卫药准字(1993第001612号))等。这类中成药有的制剂工艺简单，有效成分不明确，有的作用靶点分散，从而影响疗效等。有资料表明，用于肿瘤的放疗、化疗中的升白效果明显、毒性小、且能增加血小板的药物很少，维血宁颗粒是同类药物中唯一的国家中药保护品种。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，如何依据中医药理论，研制在放化疗时使用具有减毒增效作用的药物组合物，同时通过优化制剂工艺、富集有效部位群，制备成疗效稳定、质量可控的中药制剂。
为解决上述问题，本发明提供下述技术方案。
一种有免疫调节作用的药物组合物，其特征在于它基本上由下列重量份的原料药制成黄芪、枸杞、灵芝为1-40份∶1-15份∶1-15份。其中原料药的较好的用量为黄芪、枸杞、灵芝重量比为1-30份∶1-12份∶1-12份。其中原料药更为理想的用量为黄芪、枸杞、灵芝重量比为30份∶12份∶12份。其中黄芪甘温，大补元气，为君。枸杞子甘平，滋补肝肾，灵芝甘平，补虚益肺，二药共为臣。诸药合用，共奏益气养阴、滋补肝肾之功。
上述药物组合物的制备方法，包括下列步骤a)取原料药黄芪、枸杞与灵芝，备用；b)将所述重量配比的黄芪，用70～90％乙醇提取1～4次，每次1～2.5小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上大孔树脂柱，用55～84％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入10～14倍量水，冷浸或煎煮提取2～4次，每次1～2小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量达70-85％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至相对密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量达70-80％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙与总多糖混合，得本发明药物的活性组分。该活性组分可与药学制剂上常规辅料混合，也可不加常规辅料，制成常规药物制剂。
本发明药物组合物较好的制备方法是b)将所述重量配比的黄芪，用75～85％乙醇提取2～3次，每次1.5～2.0小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上AB-8和/或D101型号大孔树脂柱，用60～80％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入11～13倍量水，煎煮3次，每次1.5小时，合并煎煮液，浓缩至80℃时相对密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量达75-80％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至80℃时相对密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量达75-80％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙与总多糖混合，加入药用辅料，常规制成口服制剂。
所述制备方法的较理想的技术特征在于b)将所述重量配比的黄芪，用80～82％乙醇提取3次，每次1.5小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上AB-8或D101型号大孔树脂柱，用65～70％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入12倍量水煎煮，煎煮液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达80％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙、总多糖与药学上常规辅料混合，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂或口服液。
上述制备方法中，其特征在于c)取水煎煮液，浓缩，醇沉，过滤得沉淀物后，取沉淀物加水溶解，过滤，用膜按常规操作进行超滤，先用30万截留分子量膜超滤去除大分子杂质，然后再用1000截留分子量膜超滤去除水分及部分小分子杂质，浓缩至相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀，得总多糖。
常用口服制剂辅料可选用，崩解剂如羟丙基淀粉、羟丙纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；填充剂如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精、微粉纤维素等；润湿剂和粘合剂如乙醇、预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素；润滑剂如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇4000和6000；润湿剂如十二烷基硫酸钠、吐温80。
本发明药物组合物，在制备提高免疫药物中的应用。
本发明药物组合物，在制备用于放化疗减毒增效的药物中的应用。
本发明药物组合物，在制备与放化疗合用的提高免疫、减毒增效药物中的应用。
在本发明药物组合物的原料药组方形成后，对有效部位的筛选是制备疗效准确、组分明确、质量可控的中药现代制剂的基础。
本发明药物组合物中的枸杞多糖和黄芪多糖都能于体外增强LAK活性。小鼠腹腔注射枸杞多糖5g/L(7d)可以显著增强NK细胞的杀伤功能，并能部分对抗环磷酰胺对小鼠NK细胞的抑制作用。灵芝的多糖类、三萜类、氨基酸多肽类、腺苷等化学成分，对免疫系统、神经系统、内分泌和代谢系统、心血管系统等具有调节作用，灵芝中的一种Gac-D三萜酸具有类似于紫杉醇的作用，可使癌细胞周期移行阻断在G2+M期，阻断癌细胞的疯长。深入的研究还显示灵芝多糖具有良好的免疫调节作用。而灵芝多糖类通过与三萜结合，可以具备免疫识别与细胞毒双重作用，能选择性地抑制肿瘤细胞，保证正常细胞不受损害，可以全面、主动调节机体免疫功能。与放化疗联用，本发明药物组合物即灵芝多糖、枸杞多糖和黄芪多糖与黄芪皂甙合用，具有显著协同减毒增效作用，具体表现在对环磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180有显著减毒增效作用，对60Co照射抑制小鼠肉瘤S180有明显的减毒增效作用，对正常小鼠经环磷酰胺化疗有明显的减毒作用，对60Co放疗所引起的毒副作用有明显的减毒功效作用，对荷瘤机体的细胞免疫及体液免疫功能均有明显增强作用，从而真正实现了“零毒化疗”。
一、有效部位筛选实验以药效学试验考察不同提取条件的差异及不同提取部位的药理活性。以正常小鼠化疗试验进行黄芪的不同提取部位的药理活性筛选，同时考察不同提取方法对枸杞多糖药效学的影响。结果表明黄芪中的皂甙为活性部位，而由黄芪提取出的氨基酸无明显药理活性；不同的提取温度对枸杞多糖的药理活性无明显影响。
动物昆明种小白鼠，♀♂各半，普通级，购于南京江宁青龙山动物繁殖场，合格证号SCXK(苏)2001-0014。饲养环境为普通级，合格证号SYXK(苏)2001-0008。
黄芪多糖(药液)含生药1g/ml，批号20010609。黄芪皂甙(药液)含生药1g/ml，批号20010426。黄芪氨基酸(药液)含生药1g/ml，批号20010429，江苏省中医药研究院中药制剂研究室提供，用时加适量蒸馏水配成适宜浓度的混悬液。
枸杞多糖I(药液)为冷提所得，含生药材1g/ml，批号20010425；枸杞多糖II(药液)为热提所得，含生药材1g/ml，批号20010411，江苏省中医药研究院中药制剂研究室提供，用时加适量蒸馏水配成适宜浓度的混悬液。
注射用环磷酰胺0.2g/支，鲁卫药准字(1996)第403501号，批号01010310，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，用时加适量无菌生理盐水配成所需浓度的药液。
黄芪不同提取部位的药理活性比较昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18～22克，随机分为5组即正常对照组、环磷酰胺化疗组、黄芪多糖组、皂甙组和氨基酸组。黄芪多糖、皂甙和氨基酸组均灌胃给予相当于生药材11.0g/kg的相应样品，正常对照及环磷酰胺化疗组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药10天。除正常对照组外，其余小鼠均于给药第8天开始，于灌胃给予水或药液的同时，每日腹腔注射环磷酰胺(Cy)40mg/kg，连续3天。于末次注射Cy后24小时，各组动物眼眶后静脉丛采血30μl，注入稀释液中，用法国产全自动动物血球计数仪测定外周血象。
结果表明正常小鼠经环磷酰胺化疗后，外周血液中白细胞数量显著下降，与环磷酰胺组比较，给予黄芪多糖及黄芪皂甙治疗的动物白细胞数量均有明显恢复(P＜0.05)，而给予黄芪氨基酸治疗的小鼠白细胞数量与环磷酰胺化疗组比较无显著性差异，这表明黄芪多糖及黄芪皂甙对化疗药引起的白细胞数量降低有显著的改善作用，而黄芪氨基酸则无明显的升白作用。
不同提取方法所得的枸杞多糖对正常小鼠Cy化疗后外周血象的影响实验表明，与环磷酰胺化疗组比较，给予枸杞多糖I和枸杞多糖II的小鼠白细胞数均明显升高(P＜0.05)，且两组动物的血红蛋白数均比化疗组有所增高(P＜0.01～0.001)，而这两组之间的外周血象则无明显差异，表明主要由枸杞多糖I和II组成的枸杞总多糖对化疗引起的白细胞数量减少均有显著的改善作用，证明枸杞多糖不同的提取温度对其药理活性无明显影响。
黄芪总皂甙和黄芪、枸杞与灵芝总多糖混合后，在放化疗情况下，对提高实验动物如小鼠的免疫功能、减毒增效具有显著作用。
二、本发明药物组合物的制备方法研究黄芪药材用乙醇回流提取可采用不同浓度乙醇冷浸或回流和/或索氏提取；沉淀时可静置，静置方法可用冷藏静置和/或常温静置；分离方法可采用离心分离，主要是去除杂质，和冷藏静置分离，主要是去除上浮油脂。树脂柱纯化分离时，事先可按常规将大孔树脂进行预处理。本发明制备方法中回收乙醇可采用常压回收和/或减压回收。干燥分离的沉淀时，可采用烘箱干燥、真空干燥、冷冻干燥和/或喷雾干燥。黄芪等水提取可用冷浸和/或煎煮。本发明制备方法中，凡涉及浓缩工艺时，可采用减压浓缩、常压浓缩和/或薄膜蒸发浓缩。
本发明方法中凡涉及沉淀或析出物与液体分离时，可采用离心分离、膜分离和/或常压或减压过滤。粉碎可采用单独粉碎和/或混合粉碎。制粒可采用湿法制粒和/或干法制粒。
对影响黄芪醇回流提取的主要因素乙醇浓度按四因素三水平L(3)进行正交试验。试验结果表明，影响黄芪总皂苷的主要因素为提取次数；影响黄芪甲苷的主要因素为乙醇的百分浓度，其次为提取次数，溶媒量和提取时间影响较小。综合三者，总提取物多者，即带进杂质亦较多，给下一步的纯化增加困难，根据综合分析的结果选择了发明药物组合物的制备方法。由于第一次醇回流时药材是干品，本身要吸收约2倍量的醇，因此第一次加醇量均在基础醇量上多加2倍。
提取液减压回收乙醇，离心或静置除去上浮油脂，AB-8树脂和/或D101和/或D605和/或D140和/或NKAII大孔树脂纯化，乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，干燥，得黄芪总皂苷。结果见表1。
本发明黄芪总皂苷提取物用AB-8和/或D101和/或D605和/或D140和/或NKAII大孔树脂分离纯化方法比传统的水醇法比较，本发明制得的样品中黄芪总皂苷含量较高，且总皂苷含量占总固体比例高，表明AB-8大孔树脂含量较大，表明用大孔树脂纯化法除去杂质的同时保留了有效成分的比例高。与传统工艺即水醇法比较，结果总皂苷的含量提高5倍，总皂苷占总固体物的比例由原来的2.3％提高至50％以上。结果见表2。
在总皂苷解吸过程中，用85～55％乙醇洗脱总皂甙含量较高，用75～60％乙醇洗脱更好，用65％乙醇洗脱最好，其总提取物中总皂苷含量为56.6％，高于其它浓度。结果见表2。
对影响黄芪、枸杞、灵芝三药多糖提取的因素加水量、药材浸泡时间、提取次数按四因素三水平L9(34)进行正交试验。按常规，将中药的水煎煮条件设计为中间水平，分别再取高低两个水平。试验表明，影响多糖提取的主要因素均为煎煮时间，且均以煎煮三次，每次1.5小时为佳。结果见表3。
表1 水醇法与大孔树脂纯化法样品含量比较纯化方法总皂苷含量总提取物总提取中mg/g mg/g总皂苷含量(％)AB-873.3 10.569.8水醇法 14.7 63.02.3表2总皂苷乙醇解吸浓度比较乙醇浓度％总皂苷含量总提取物总提取中Mg/g mg/g 总皂苷含量(％)351.5029 6.18 24.3453.3896 7.09 47.8554.2278 8.90 47.5656.1688 10.09 56.6755.7850 11.18 51.7855.2486 10.09 52.0953.5428 9.27 38.1
表3 水提取正交试验总提取 多糖含量序列 A B CD 总多糖％物％ mg/g生药1 1 1 11 25.373.04 13.97042 1 2 22 33.369.24 50.57493 1 3 33 36.6411.34 64.05124 2 1 23 34.5210.05 58.60995 2 2 31 27.003.99 23.29836 2 3 12 33.989.43 50.06697 3 1 32 32.0010.28 57.53688 3 2 13 35.338.75 49.71309 3 3 21 27.737.22 39.7752总K195.37 91.89 94.6880.10提K295.50 95.69 95.6199.34取K395.06 98.35 95.64106.49物R×3 0.44 6.46 0.96 26.39总K123.62 23.37 21.2214.25多K223.47 21.98 26.5128.95糖K326.25 27.99 25.6130.14R×3 2.78 6.01 4.39 15.89多K1128.5965 130.1171 113.753 77.0439糖K2131.9751 125.5862 148.960 158.1786含K3147.0250 153.8933 144.883 172.3741量R×3 18.4285 28.3071 31.1360 95.3302三、发明组合物主要药效学研究资料1、对环磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180的减毒增效作用本发明药物组合物按10.0、5.0和2.5g生药/kg灌胃给药，对S180荷瘤小鼠经环磷酰胺化疗所引起的白细胞降低及骨髓有核细胞减少有明显的升高作用，对化疗所引起的脾脏及胸腺指数下降有显著的改善作用，与环磷酰胺合用能显著升高其抑瘤率，表明本品对环磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180有明显的减毒增效作用。
本发明组合物(干粉)含生药37.0g/g，制备方法见实施例1。
维血宁颗粒8g/袋，苏卫药准字(1993)第165801号，批号020712，常州药业股份有限公司健民制药厂生产，用时加适量蒸馏水配成适宜浓度的混悬液。(下同)注射用环磷酰胺(简称Cy，下同)0.2g/支，鲁卫药准字(1996)第403501号，批号02080421，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，用时加适量无菌生理盐水配成所需浓度的药液。(下同)
瘤株肉瘤S180实体型，移自江苏省肿瘤研究所，由江苏省中医药研究院药理室传代保种。(下同)实验详细方法参见中药新药药理学研究指南.治疗恶性肿瘤中药的药效学研究.卫生部药政局《中药新药研究指南》，1994104；叶应妩、王毓三等.全国临床检验操作规程.东南大学出版社.19914，64；万军梅、张永忠、吴巍等.抑瘤扶正丸提高化疗疗效的实验研究.中成药，2002，24(9)695～6972、对环磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180瘤重及抑瘤率的影响昆明种雄性小鼠60只，体重18-22克，分为6组即荷瘤对照组、环磷酰胺化疗组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药12天。并于给药的第4天，取腹部接种S180瘤株8天的荷瘤小鼠，无菌操作下抽取腹腔瘤液，以灭菌生理盐水稀释成1∶4浓度的瘤细胞液(镜检含瘤细胞数5×107/ml)，于所有小鼠右前肢腋部皮下接种0.2ml/鼠。除荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤后次日开始，于灌胃给予水或药液的同时，每日腹腔注射环磷酰胺15mg/kg，连续8天，于末次给药后24小时，小鼠脱颈椎处死，剥离肉瘤，电子天平称重。计算各组小鼠瘤重平均值及抑瘤率。结果见表1。 表4 本发明组合物对环磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180瘤重和抑瘤率的影响(x±SD，n＝10)剂量 Cy 瘤重抑瘤率组别(g/kg)(mg/kg×d)(g，X±SD) (％)荷瘤对照组 / / 1.910±0.402Cy组/ 15×8 1.086±0.305***43.12阳性药组4.8 15×8 0.810±0.258***Δ57.59高剂量组10.0 15×8 0.708±0.377***Δ62.93中剂量组5.0 15×8 0.735±0.366***Δ61.52低剂量组2.5 15×8 0.904±0.413***52.67注1.与荷瘤对照组比较(t-检验)，***P＜0.001；2.与Cy组比较(t-检验)，ΔP＜0.05；表4可见，S180荷瘤小鼠在Cy化疗同时灌胃给予本发明组合物，与荷瘤对照组比较，各给药组瘤重均有显著抑制作用(P＜0.001)，瘤重抑制率在52％至62％之间，且与单用Cy组比较，高、中剂量组瘤重明显减轻(P＜0.05)，表明本品对Cy抑制小鼠肉瘤S180有明显的增效作用。
3、对荷瘤小鼠Cy化疗后外周血象的影响昆明种雄性小鼠70只，体重18～22克，随机分为7组即正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺化疗组、阳性药组和给药高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常及荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药15天。并于给药的第4天，除正常对照组外，其余小鼠右前肢腋部皮下接种S180瘤细胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除正常及荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤后次日(即给药第5天)开始，于灌胃给予水或药液的同时，每日腹腔注射环磷酰胺(Cy)15mg/kg，连续8天。于末次注射Cy后第二、四、六天，各组动物眼眶后静脉丛采血30μl，注入稀释液中，用法国产全自动动物血球计数仪测定外周血象。结果见表5～8。
表5 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后外周血液中WBC的影响(x±SD，n＝10)Cy WBC(109/L)组别 剂量(g/kg)(mg/kg×d) 第一次 第二次 第三次正常对照组 / / 17.0±4.8 17.2±2.718.1±5.1荷瘤对照组 / / 16.9±5.5***16.0±4.5*18.1±4.7Cy组/ 15×8 7.3±3.1 12.2±2.618.3±5.1阳性药组4.8 15×8 11.9±3.5**15.9±4.3*19.8±5.5高剂量组10.0 15×8 12.2±3.9**17.1±3.4**19.7±6.8中剂量组5.0 15×8 11.3±4.5*15.7±3.9*18.4±3.9低剂量组2.5 15×8 13.2±4.3**15.1±3.4*20.8±4.5注与Cy化疗组比(t检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表6 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后外周血液中RBC的影响(x±SD，n＝10)Cy RBC(1012/L)组别 剂量(g/kg)(mg/kg×d)第一次 第二次 第三次正常对照组 // 13.23±1.53 12.72±2.2212.13±1.15荷瘤对照组 // 11.96±1.47 11.29±1.0111.98±1.07Cy组 /15×8 10.92±1.19 11.55±1.1011.04±1.35阳性药组 4.8 15×8 11.50±1.46 10.76±1.2810.13±1.74高剂量组 10.0 15×8 12.52±1.76*12.43±1.2011.93±1.66中剂量组 5.0 15×8 11.99±1.47 11.76±2.3411.11±0.86低剂量组 2.5 15×8 11.07±1.39 11.55±2.0411.90±1.60注与Cy化疗组比(t检验)，*P＜0.05。
表7 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后外周血液中HGB的影响(x±SD，n＝10)Cy HGB(g/L)组别 剂量(g/kg)(mg/kg×d)第一次 第二次 第三次正常对照组 / / 205.7±19.1Δ201.9±37.0Δ187.1±18.0
荷瘤对照组/ / 182.3±28.0170.4±15.5185.7±14.9Cy组 / 15×8169.6±21.9167.5±19.2171.4±21.2阳性药组4.815×8179.6±26.8161.1±18.6152.5±22.6高剂量组10.0 15×8193.7±24.9*192.9±21.9*179.1±25.0中剂量组5.015×8187.4±25.2176.6±32.1167.8±11.5低剂量组2.515×8172.4±22.2173.6±25.8183.4±26.8注1.与Cy化疗组比(t检验)，*P＜0.05。
2.与荷瘤组比(t检验)，ΔP＜0.05。
表8 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后外周血液中PLT的影响(x±SD，n＝10)剂量 Cy PLT(109/L)组别(g/kg) (mg/kg×d)第一次 第二次 第三次正常对照组// 707.6±132.1 793.2±111.0 643.3±79.7荷瘤对照组// 627.6±104.8 752.3±202.4 697.4±109.2Cy组 /15×8 649.5±160.5 709.9±96.0720.0±112.0阳性药组 4.8 15×8 691.2±123.4 778.5±106.9 787.2±192.7高剂量组 10.0 15×8 660.0±89.9771.1±166.7 768.1±82.1中剂量组 5.0 15×8 693.4±167.7 734.6±118.6 766.7±103.4低剂量组 2.5 15×8 771.7±198.1 748.5±122.2 798.9±68.9由表5～8可见，荷瘤小鼠经Cy化疗后，外周血液中WBC数量显著下降，并呈现出明显的时效关系，在末次注射Cy后24小时为最低点，以后逐淅恢复。与Cy组比较，给予本发明组合物治疗的各组动物的WBC数量在不同时间段均有明显恢复(P＜0.05～0.01)，且在化疗组WBC数量在最低点时作用更加显著，表明本品对化疗药引起的WBC数降低有显著的改善作用。而化疗组的RBC、HGB、PLT数则无明显变化，但本品高剂量组RBC及HGB比化疗组略有升高(P＜0.05)。
4、对荷瘤小鼠Cy化疗后骨髓有核细胞的影响昆明种雄性小鼠70只，体重18-22克，分为7组即正常组、荷瘤对照组、环磷酰胺化疗组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常及荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药12天。并于给药的第4天，除正常对照组外，其余小鼠右前肢腋部皮下接种S180瘤细胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤后次日开始，于灌胃给予水或药液的同时，每日腹腔注射环磷酰胺(Cy)15mg/kg，连续8天，于末次给药后24小时，小鼠脱颈椎处死，剥离左侧股骨，以3％醋酸10ml冲出骨髓细胞，按白细胞计数方法，计算1根骨内的骨髓有核细胞数量。结果见表9。表9 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后骨髓有核细胞数量的影响(x±SD，n＝10)
组别 剂量(g/kg)Cy(mg/kg×d)骨髓有核细胞数(109/L)正常对照组/ / 24.32±3.75荷瘤对照组//23.70±4.65***Cy组 / 15×812.50±2.86阳性药组 4.8 15×816.60±3.66*高剂量组 10.0 15×817.84±3.05***中剂量组 5.0 15×816.78±3.33**低剂量组 2.5 15×815.29±2.84*注与Cy化疗组比(t-检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
由表9可见，与Cy化疗组比较，本发明组合物各组小鼠骨髓有核细胞数均明显升高(P＜0.05～0.001)，表明本品对化疗引起的骨髓有核细胞数量减少有显著增高作用。
5、对荷瘤小鼠Cy化疗后免疫器官重量的影响昆明种雄性小鼠70只，体重18-22克，实验方法同2.3。于末次给药后24小时，小鼠称重后脱颈椎处死，取脾脏及胸腺称重并计算脏器指数，结果见表10。
表10 本发明组合物对荷瘤小鼠Cy化疗后免疫器官重量的影响(x±SD，n＝10)组别剂量(g/kg) Cy(mg/kg×d)脾脏指数(mg/g)胸腺指数(mg/g)正常对照组/ / 5.01±1.162.70±0.76荷瘤对照组/ / 5.81±0.74***2.64±0.88**Cy组 /15×83.27±0.651.58±0.44阳性药组 4.8 15×84.51±1.70*2.11±0.64*高剂量组 10.0 15×84.72±1.34**2.33±0.54**中剂量组 5.0 15×84.13±1.02*1.93±0.52低剂量组 2.5 15×83.97±1.131.67±0.67注与Cy化疗组比(t-检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表10可见，与Cy化疗组比较，本发明组合物高、中剂量组小鼠脾脏指数明显增加(P＜0.05～0.01)，高剂量组胸腺指数显著增高(P＜0.01)，表明本品对Cy化疗引起的胸腺及脾脏指数降低有明显的改善作用。实验结果表明，本发明组合物对环磷酰胺化疗所引起的S180荷瘤小鼠外周血白细胞数量减少有明显的改善作用，同时能明显升高骨髓有核细胞数量，并能增加荷瘤化疗小鼠的脾及胸腺指数；本品与环磷酰胺合用，能明显抑制肿瘤生长，对化疗药Cy的抑瘤作用有明显增强作用。以上结果表明本发明组合物与化疗药Cy合用，有明显的减毒增效作用。
6、对60Co照射抑制小鼠肉瘤S180的减毒增效作用本发明药物组合物按10.0、5.0和2.5g生药/kg灌胃给药，对S180荷瘤小鼠经60Co放疗所引起的白细胞降低及骨髓有核细胞减少有明显的升高作用，对放疗所引起的脾脏及胸腺指数下降有一定的改善作用，能显著升高放疗抑瘤率，表明本品对60Co放疗抑制小鼠肉瘤S180有明显的减毒增效作用。
本发明组合物(干粉)含生药37.0g/g，批号20020629，江苏省中医药研究院中药制剂研究室提供。其余同上。
实验方法与结果对60Co放疗抑制小鼠肉瘤S180瘤重及抑瘤率的影响昆明种雄性小鼠60只，体重18-22克，分为6组即荷瘤对照组、60Co放疗组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药12天。并于给药的第4天，取腹部接种S180瘤株8天的荷瘤小鼠，无菌操作下抽取腹腔瘤液，以灭菌生理盐水稀释成1∶4浓度的瘤细胞液(镜检含瘤细胞数5×107/ml)，于所有小鼠右前肢腋部皮下接种0.2ml/鼠。除荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤三日后，一次给予350Rad60Co照射。于末次给药后24小时，小鼠脱颈椎处死，剥离肉瘤，电子天平称重。计算各组小鼠瘤重平均值及抑瘤率。结果见表11。 表11 本发明组合物对60Co放疗抑制小鼠肉瘤S180瘤重和抑瘤率的影响(x±SD，n＝10)剂量60Co(Rad) 瘤重抑瘤率组别(g/kg) (g，X±SD) (％)荷瘤对照组 // 2.683±0.69560Co组 / 350 1.608±0.467***40.06阳性药组4.8 350 1.211±0.0.365***Δ54.85高剂量组10.0350 1.153±0.346***Δ57.02中剂量组5.0 350 1.179±0.319***Δ56.05低剂量组2.5 350 1.332±0.223***50.35注1.与荷瘤对照组比较(t-检验)，***P＜0.001；2.与60Co放疗组比较(t-检验)，ΔP＜0.05；表11可见，S180荷瘤小鼠在60Co放疗同时灌胃给予本发明组合物，与荷瘤对照组比较，各给药组瘤重均有显著抑制作用(P＜0.001)，瘤重抑制率在50％至57％之间，且与单用60Co放疗组比较，高、中剂量组瘤重明显减轻(P＜0.05)，表明本品对60Co放疗抑制小鼠肉瘤S180有明显的增效作用。
7、对荷瘤小鼠60Co放疗后外周血象的影响昆明种雄性小鼠70只，体重18-22克，随机分为7组即正常对照组、荷瘤对照组、60Co放疗组、阳性药组和给药高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常及荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药15天。并于给药的第4天，除正常对照组外，其余小鼠右前肢腋部皮下接种S180瘤细胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除正常及荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤3日后(即给药第7天)一次给予350Rad60Co照射。于60Co照射后第三、六、九天，各组动物眼眶后静脉丛采血30μ1，注入稀释液中，用法国产全自动动物血球计数仪测定外周血象。实验表明荷瘤小鼠经60Co放疗后，外周血液中WBC数量显著下降，且持续维持较低水平，而RBC、HGB及PLT数量在照射后第六日明显减少，至第九日，PLT仍维持较低水平。与60Co放疗组比较，本发明组合物高、中剂量组动物的WBC数量在第六日及第九日均有明显恢复(P＜0.05～0.01)，高剂量组HGB及PLT数量也明显升高(P＜0.05～0.01)，对RBC的降低有升高趋势，但无显著性差异。以上结果表明本品对化疗药引起的WBC数降低有显著的改善作用，并在一定程度上升高HGB和PLT。
8、对荷瘤小鼠60Co放疗后骨髓有核细胞的影响昆明种雄性小鼠70只，体重18-22克，分为7组即正常组、荷瘤对照组、60Co放疗组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常及荷瘤对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药12天。并于给药的第4天，除正常对照组外，其余小鼠右前肢腋部皮下接种S180瘤细胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除荷瘤对照组外，其余小鼠均于接种肿瘤3日后一次给予350Rad60Co照射。于末次给药后24小时，小鼠脱颈椎处死，剥离左侧股骨，以3％醋酸10ml冲出骨髓细胞，按白细胞计数方法，计算1根骨内的骨髓有核细胞数量。实验表明与60Co放疗组比较，本发明组合物对60Co放疗所引起的S180荷瘤小鼠外周血白细胞数量减少有明显的改善作用，在一定程度上升高由于放疗引起的HGB及PLT数量的下降，同时能明显升高骨髓有核细胞数量；本品与60Co照射合用，能明显抑制肿瘤生长，对放疗的抑瘤作用有明显增强作用。以上结果表明本发明组合物与放疗合用，有明显的减毒增效作用。
9、对正常小鼠化疗的减毒作用本发明药物组合物按10.0、5.0和2.5g生药/kg灌胃给药，对正常小鼠经环磷酰胺化疗所引起的白细胞降低及骨髓有核细胞数减少有明显的升高作用，对化疗所引起的脾脏及胸腺指数下降有显著的改善作用，表明本品对正常小鼠经环磷酰胺化疗有明显的减毒作用。
10、对荷瘤小鼠免疫功能的影响本发明药物组合物按10.0、5.0和2.5g生药/kg灌胃给药，可使S180荷瘤小鼠对PHA刺激的淋巴细胞转化反应增强，小鼠外周血中T淋巴细胞百分比明显升高，并且荷瘤机体血清溶血素水平显著提高。以上结果表明本品对荷瘤机体的细胞免疫及体液免疫功能均有明显增强作用。
本发明组合物(干粉)含生药37.0g/g，批号20020629，江苏省中医药研究院中药制剂研究室提供。
对PHA刺激淋巴细胞转化的影响(体内诱导法)，参见李仪奎等.中药药理实验方法学.上海上海科学技术出版社，1991164昆明种小鼠70只，雌雄各半，体重18-22克，分为7组即正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺模型组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。除正常对照组外，其余小鼠均于右前肢腋部皮下接种1∶4稀释的S180瘤细胞液0.2ml/鼠。接种肿瘤次日开始给药，给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常组、荷瘤对照组及模型组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药8天。并于给药的第1天起，每天肌肉注射PHA10mg/kg一次，连续三次；给药第6天除正常及荷瘤对照组外，其余各组动物均腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，第7天重复一次，末次给药后1小时，小鼠眼眶后静脉丛采血，推片，甲醇固定，姬氏染色，水洗，晾干，高倍镜下计数100个淋巴细胞中淋巴母细胞数，计算淋巴细胞转化率。结果见表12。
表12、本发明组合物对荷瘤小鼠淋巴细胞转化及T淋巴细胞酯酶染色率的影响(x±SD，n＝10)组别 剂量 Cy淋巴细胞转化率ANAE染色率(g/kg) (mg/kg×d)(％，X±SD) (％，X±SD)正常对照组// 43.6±5.6 59.3±7.1荷瘤对照组// 44.5±3.9***58.7±6.1***Cy组 / 40×2 15.0±4.832.2±5.8阳性药组 4.8 40×2 22.7±7.4*40.8±8.6*高剂量组 10.040×2 24.8±5.4***41.2±7.2**中剂量组 5.0 40×2 22.5±4.8**39.0±7.2*低剂量组 25 40×2 20.0±3.9*35.9±7.5注与Cy组比较(t-检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；表12可见，本发明组合物各剂量组动物对PHA刺激的转化反应增强，淋巴母细胞百分率与环磷酰胺组比较有显著提高(P＜0.05～0.001)，表明本品能提高荷瘤机体T淋巴细胞的应答功能，即提高细胞免疫功能。
11、对荷瘤小鼠T-淋巴细胞酯酶染色率的影响昆明种小鼠70只，雌雄各半，体重18-22克，分为7组即正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺模型组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。除正常对照组外，其余小鼠均于右前肢腋部皮下接种1∶4稀释的S180瘤细胞液0.2ml/鼠。接种肿瘤次日开始给药，给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常组、荷瘤对照组及模型组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药10天。第8天除正常及荷瘤对照组外，其余各组动物均腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，第9天重复一次，末次给药后1小时，小鼠眼眶后静脉丛采血，推片，酯酶染色，晾干，油镜下计数100个淋巴细胞，其中有棕红色颗粒的为T细胞，无棕红色颗粒的为B细胞。由表12结果可见，本发明组合物高、中剂量组外周血中T淋巴细胞百分比明显高于环磷酰胺组(P＜0.05～0.01)，说明本品对环磷酰胺所致的荷瘤机体免疫抑制有明显恢复作用，即对细胞免疫功能有促进作用。
12、对荷瘤小鼠溶血素抗体生成的影响(比色法)昆明种小鼠70只，雌雄各半，体重18-22克，分为7组即正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺模型组、维血宁颗粒组和本发明组合物高、中、低剂量组。除正常对照组外，其余小鼠均于右前肢腋部皮下接种1∶4稀释的S180瘤细胞液0.2ml/鼠。接种肿瘤次日开始给药，给药组分别灌胃给予本发明组合物混悬液10.0、5.0和2.5g生药/kg，阳性药组灌胃给予维血宁颗粒4.8g/kg，正常组、荷瘤对照组及模型组灌胃给予同体积的蒸馏水，小鼠均灌胃给药10天。于给药后第3天各组动物腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.2ml/只进行免疫，再于给药后第8天除正常及荷瘤对照组外，其余各组动物均腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，第9天重复一次，末次给药后1小时，小鼠眼眶后静脉丛采血，离心，取10μl血清用生理盐水稀释100倍，与5％鸡红细胞悬液0.5ml及10％补体0.5ml混合，37℃恒温水浴中保温30min后，0℃冰水浴中终止反应，离心，取上清液于分光光度计540nm处比色，测光密度值，另设不加血清的空白对照，取上清液作为比色时调零的基准。以OD值作为判定血清溶血素水平的指标。实验中本发明组合物能明显增加荷瘤小鼠血清溶血素水平(P＜0.05～0.001)，使环磷酰胺所致的血清溶血素含量下降有明显恢复，表明本品能提高荷瘤机体的体液免疫能力。以上实验结果表明，本发明组合物对S180荷瘤小鼠由环磷酰胺所引起的免疫抑制有明显的恢复作用，能显著升高T淋巴细胞酯酶染色率、增强PHA诱导的淋巴细胞转化反应，并能明显提高血清溶血素水平，表明本品对于荷瘤机体的细胞免疫及体液免疫均有显著增强作用。
四、本发明组合物急性毒性试验本发明组合物给小鼠灌胃给药未见明显的急性毒性反应，无法按常规方法测定半数致死量(LD50)。小鼠一次灌胃给药的最大给药量为740g生药/kg，此剂量相当于拟临床人用量的822倍，未见明显的毒性反应。
五、本发明组合物长期毒性试验连续灌胃给药3个月的长期毒性试验研究表明，用相当于生药材50.0、25.0和12.5g/kg剂量的本发明组合物给SD大鼠连续灌胃90天，其中大剂量约为临床人拟用剂量的55.6倍，未发现动物有活动减少、毛松乱、精神萎糜不振等现象，对大鼠的体重、脏器系数、血液生化检查等均未见明显的毒性反应。血液生化学检查显示大剂量组3个月的的ALP及6个月的AST明显升高，中、小剂量组未见有明显毒性，表明本品长期毒性试验的中剂量(25.0g生药/kg)以下为安全剂量，大剂量组对肝功能有一定损害，提请临床使用时注意对血液生化学指标的监测。
具体实施例方式
实施例1取黄芪3.0kg、枸杞1.2kg、灵芝1.2kg。
黄芪药材第一次用8倍量、第二次用6倍量80％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并回流液，过滤，回收乙醇，母液静置12小时，离心，离心液上已处理过AB-8大孔树脂纯化，70％乙醇洗脱，回收乙醇，干燥，得总皂苷30克。
黄芪药渣，枸杞、灵芝等处方药用12倍量水提取三次，每次1.5小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.2(80℃)，乙醇沉淀含醇量达80％，静置，过滤，沉淀物挥去乙醇至干，加蒸馏水溶解，离心，离心液浓缩至相对密度1.2(80℃)，再用乙醇沉淀，含醇量达75％，静置，过滤，挥去乙醇至干，得总多糖150克。
合并总皂甙与总多糖，粉碎，装入明胶硬胶囊。服法一天3次，一次2粒。
黄芪药材第一次用8倍量、第二次用6倍量80％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并回流液，过滤，回收乙醇，母液静置12小时，离心，离心液上已处理过AB-8大孔树脂纯化，70％乙醇洗脱，回收乙醇，干燥，得总皂苷30克。
黄芪药渣，枸杞、灵芝等处方药用12倍量水提取三次，每次1.5小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.2(80℃)，乙醇沉淀含醇量达80％，静置，过滤，沉淀物挥去乙醇至干，加蒸馏水溶解，离心，离心液浓缩至相对密度1.2(80℃)，再用乙醇沉淀，含醇量达75％，静置，过滤，挥去乙醇至干，得总多糖150克。
合并总皂甙与总多糖，粉碎，加赋形剂，压片。服法一天3次，一次3片。
实施例3取黄芪4.0kg、枸杞1.5kg、灵芝1.5kg。
将所述重量配比的黄芪，用90％乙醇提取4次，每次2.5小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上AB-8大孔树脂柱，用80％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙40克；将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入10倍量水，煎煮4次，每次2小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.3，加入乙醇使含醇量达70％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至相对密度1.1，加入乙醇使含醇量达70％，滤取沉淀物，干燥得总多糖196克；合并总皂甙与总多糖，粉碎，加入乙醇作粘合剂，加入淀粉作填充剂，常规压制成颗粒剂。服法一天3次，一次1袋。
实施例4取黄芪4.0kg、枸杞3.5kg、灵芝3.5kg。
将所述重量配比的黄芪，用70％乙醇提取2次，每次1小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上D101大孔树脂柱，用60％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙40克；将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入14倍量水，煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达85％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至相对密度1.3，加入乙醇使含醇量达70％，滤取沉淀物，干燥得总多糖276克；将黄芪总皂甙与总多糖混合，粉碎，加入常规辅料，制成散剂。服法一天3次，一次1袋。
实施例5取黄芪4.0kg、枸杞2.0kg、灵芝2.0kg将所述重量配比的黄芪，用75％乙醇提取3次，每次1小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上D101大孔树脂柱，用65％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙40克；将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入13倍量水煎煮，煎煮液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达80％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀物，干燥得总多糖210克；合并总皂甙与总多糖，粉碎，常规制粒，装胶囊。
实施例6取黄芪4.0kg、枸杞1.0kg、灵芝1.0kg将所述重量配比的黄芪，用75％乙醇提取3次，每次1小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上D101大孔树脂柱，用65％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙40克；将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入13倍量水煎煮，取水煎煮液，浓缩，醇沉，过滤得沉淀物后，取沉淀物加水溶解，过滤，用膜按常规操作进行超滤，先用30万截留分子量膜超滤去除大分子杂质，然后再用1000截留分子量膜超滤去除水分及部分小分子杂质，浓缩至相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀，得总多糖176克。合并总皂甙与总多糖，粉碎，装胶囊。
实施例7取黄芪3.0kg、枸杞1.2kg、灵芝1.2kg。
黄芪药材第一次用8倍量、第二次用6倍量80％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并回流液，过滤，回收乙醇，母液静置12小时，离心，离心液上已处理过AB-8大孔树脂纯化，70％乙醇洗脱，回收乙醇，干燥，得总皂苷30克。
黄芪药渣，枸杞、灵芝等处方药用12倍量水提取三次，每次1.5小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.2(80℃)，乙醇沉淀含醇量达80％，静置，过滤，沉淀物挥去乙醇至干，加蒸馏水溶解，离心，离心液浓缩至相对密度1.2(80℃)，再用乙醇沉淀，含醇量达75％，静置，过滤，挥去乙醇至干，得总多糖150克。合并总皂甙与总多糖，加蒸馏水溶解，过滤，制成每1ml含1.8g生药溶液，灌装于10ml管制口服液瓶中，灭菌。
权利要求
1.一种有免疫调节作用的药物组合物，其特征在于它基本上由下列重量份的原料药制成黄芪、枸杞、灵芝为1-40份∶1-15份∶1-15份。
2.权利要求1的药物组合物，其中原料药的用量为黄芪、枸杞、灵芝重量比为1-30份∶1-12份∶1-12份。
3.权利要求2的药物组合物，其中原料药的用量为黄芪、枸杞、灵芝重量比为30份∶12份∶12份。
4.权利要求1～3之一药物组合物的制备方法，包括下列步骤a)取原料药黄芪、枸杞与灵芝，备用；b)将所述重量配比的黄芪，用70～90％乙醇提取1～4次，每次1～2.5小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上大孔树脂柱，用55～84％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入10～14倍量水，冷浸或煎煮提取2～4次，每次1～2小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量达70-85％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至相对密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量达70-80％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙与总多糖混合，得本发明药物的活性组分。
5.权利要求4的制备方法，其特征在于b)将所述重量配比的黄芪，用75～85％乙醇提取2～3次，每次1.5～2.0小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上AB-8和/或D101型号大孔树脂柱，用60～80％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入11～13倍量水，煎煮3次，每次1.5小时，合并煎煮液，浓缩至80℃时相对密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量达75-80％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至80℃时相对密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量达75-80％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙与总多糖混合后，加入药用辅料，常规制成口服制剂。
6.权利要求5的制备方法，其特征在于b)将所述重量配比的黄芪，用80～82％乙醇提取3次，每次1.5小时，合并乙醇提取液，回收乙醇，将去除沉淀后的液体上AB-8或D101型号大孔树脂柱，用65～70％乙醇洗脱，得黄芪总皂甙；c)将所述重量配比的枸杞、灵芝与上述乙醇提取过黄芪残渣合并，加入12倍量水煎煮，煎煮液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达80％，过滤得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，将水液浓缩至80℃时相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀物，干燥得总多糖；d)将黄芪总皂甙、总多糖与药学上常规辅料混合，制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂或口服液。
7.权利要求6的制备方法，其特征在于c)取水煎煮液，浓缩，醇沉，过滤得沉淀物后，取沉淀物加水溶解，过滤，用膜按常规操作进行超滤，先用30万截留分子量膜超滤去除大分子杂质，然后再用1000截留分子量膜超滤去除水分及部分小分子杂质，浓缩至相对密度1.2，加入乙醇使含醇量达75％，滤取沉淀，得总多糖。
8.权利要求1的药物组合物，在制备提高免疫药物中的应用。
9.权利要求1的药物组合物的制备方法，在制备用于放化疗减毒增效的药物中的应用。
10.权利要求1的药物组合物，在制备与放化疗合用的提高免疫、减毒增效药物中的应用。
全文摘要
一种与放化疗用协同作用的提高免疫、减毒增效的药物组合物，由黄芪、枸杞、灵芝按1－40份∶1－15份∶1－15份重量配比，通过优化制剂工艺，富集有效部位群，制成疗效显著且稳定、质量可控的中药口服制剂。
文档编号A61P37/02GK1480208SQ03132059
公开日2004年3月10日 申请日期2003年7月18日 优先权日2003年7月18日
发明者段金廒, 贾晓斌, 彭蕴茹 申请人:江苏省中医药研究院
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