一种治疗出血性脑中风的药物及其制备方法
专利名称：一种治疗出血性脑中风的药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗出血性脑中风的药物，本发明还涉及该药物的制备方法。
背景技术：
出血性中风属于中医疾病的概念，又称“中风”、“卒中”，西医相应的病名为脑出血。脑出血是脑血管病中的一种。在世界上，脑血管病病死率居所有疾病的第三位，而脑出血占脑血管病的10％～30％，是脑血管疾病中主要的致死原因。
出血性中风乃一急危重症，发病率、致残率、死亡率均很高。据调查，出血性中风急性期病死率在18％～75％，其病后生存者60％～65％遗有不同程度的瘫痪、失语、痴呆等后遗症，且有40％左右的重残者。随着我国经济的发展，人口老龄化的出现，人群中高血压、肥胖、吸烟、饮酒、高血脂、糖尿病等危险因素水平上升，引起出血性中风的发病率及死亡率也与日剧增，上海市对91428人进行长达4年的疾病监测结果表明，出血性中风的死亡率为60.3％，男性发病率与死亡率均高于女性，且随年龄的增长，其死亡率呈上升趋势。随着人们生活水平的提高和世界范围的社会老龄化，其发病率有逐年增加的趋势。
出血性中风急性期发病急骤，症见多端，变化迅捷，及时救治对提高抢救成功率和病人的生存质量，具有重要意义，医学界一直将其列为重点研究的疾病之一。西医学治疗脑出血的方法分为手术治疗和内科综合治疗两大类，手术治疗主要用于出血量较大而有手术指征的患者，有一定的危险性。内科综合治疗除常规脱水剂减轻脑水肿、降压药物控制血压、防治感染、纠正酸碱平衡和电介质紊乱之外，加用神经细胞功能改善剂和钙通道阻滞剂，但疗效尚不能令人满意。近年来，中医学对出血性中风急性期的病因病机、治疗方法进行了多方面的研究，目前国内专家公认西医综合性治疗合并中医药疗法优于单纯的西医综合治疗。因此，研制抢救出血性中风急性期的新制剂，是当前急需解决的难题。
出血性中风病理机制主要在高血压、动脉硬化等基础上发生的急性颅内出血，出血后形成血肿压迫局部。而致神经功能受损同时，血肿在颅内形成占位性病变，导致颅内压更骤然升高脑组织局部出血，血肿形成所引起的脑水肿，脑组织受压、推移、软化、坏死等。目前出血性中风的西医内科治疗手段是脱水，降低颅内压、止血、抗感染及神经营养剂，但内科保守治疗病死率、致残率均较高，西药中尚无溶化血肿的特效药物。外科手术清除血肿、抽吸引流等为降低病死率和致残率起到了积极作用。但手术和麻醉本身可对机体产生负面影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出了采用凉血止血、活血化瘀、泻下通腑之药为主，辅以清热泻火、行血破瘀的一种治疗出血性脑中风的药物。
本发明另一个要解决的技术问题是提出了该治疗出血性脑中风的药物的制备方法。
本发明要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的，一种治疗出血性脑中风的药物，其特点是它是由以下重量配比的原料制成的大黄160～200栀子160～200牡丹皮100～150本发明药物的最佳重量(份)配比是大黄187.5 栀子187.5 牡丹皮125本发明所述的药物剂型为药剂学所述的任何剂型。其生产方法是取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，加入药用辅料，制成临床可接受的剂型。
本发明所述的药物剂型为注射剂。其生产方法是取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌封，灭菌，检查，包装，即得注射液；或取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加100～500g甘露醇，0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌装，经冻干工序制成冻干粉针剂。
药学原理《内经素问·调经论》曰“血之与气，并走于上，则为大厥，厥则暴死，气复反则生，不反则死”，揭示了出血性中风血随气逆的病理基础。本病的病机主要在于瘀血和火热两种致病因子的共同参与，以致瘀热相搏，冲激上逆，损伤脑络，络破血溢，脑中蓄血，从而表明病证是“瘀热阻窍”型。其特点为离经之血瘀阻脑腑，使脑髓壅滞，闭阻窍络，元神内困，五脏失统，六腑气闭，肢体失相。一旦发病，来势凶险，风火相煽，气血逆乱，升降失调，导致“血之与气，并走于上”，冲脑损络，络破血溢即成“脑中蓄血”。发病过程中，风痰上扰、热迫血行是导致出血性中风的始动因素。离经之血即为瘀血，有学者对“离经之血——脑中蓄血为瘀血”的中医理论进行了实验研究，发现出血性中风有明显的血液流变学指标变化，从而认为其为出血性血瘀证或是血管性血瘀证，现代CT检查更证实颅内有高密度出血性改变灶。
张介宾曰“治风先治血，血行风自灭”，从中西医理论或临床研究均角度证实了这一观点，故出血性中风应从血论治。此外，出血性中风急性期常出现发热，部分患者虽无体温增高，但有明显的热证表现，如口苦、咽干、烦躁，甚至谵妄、夜不安、大便秘结等而呈阳明腑实之证象。“本发明注射液”之处方依据上述理论而立法，采用凉血止血、活血化瘀、泻下通腑之药为主，辅以清热泻火、行血破瘀之品，用于治疗出血性中风急性期的瘀热阻窍证。
药效学实验通过主要药效学实验验证本发明注射液与临床功能主治有关的作用。
药品及试剂本发明注射液(浓缩液)为棕红色液体，药液浓度2.0g/ml(按生药量计算)，成人日用量为40g/60kg(按生药量计算)，由江苏中康新药指纹图谱开发有限公司提供，批号20010818。临用前用无菌溶媒稀释至所需浓度；无菌溶媒，江苏中康新药指纹图谱开发有限公司提供，批号20010818；清开灵注射液，由山西太行药业有限公司生产，批号010606-10；氯化钠注射液，由南京小营制药厂生产，批号010208；戊巴比妥钠，使用前用灭菌注射用水配制成4％的水溶液；青霉素，由哈尔滨制药厂生产，批号980726；硫酸庆大霉素，由江苏宜兴前进制药厂生产，批号980109；2％碘酊，由江苏省常熟市卫生化工厂生产，批号990122；无水乙醇，AR，由南京化学试剂厂生产，批号970302；牛凝血酶(bovine thrombin)，2unit/μl，pH7.0，含50μmol的脆丝盐酸缓冲体系，批号EC3.4.21.5；伊文斯兰，由中国医药集团(上海)化学试剂公司生产，批号990501；生理盐水，由南京小营制药厂生产，批号001209；70％乙醇，由南京化学试剂厂生产的乙醇(AR，批号990302)配制而成；盐酸肾上腺素注射液(1mg/ml)，武汉诺佳药业集团股份有限公司，批号010601，临用前用生理盐水稀释成0.1mg/ml；乌来糖(氨基甲酸乙酯)中国医药(集团)上海化学试剂公司，化学纯，批号C，用蒸馏水配成25％的乌来糖溶液。
实验动物SD大鼠，由南京中医药大学实验动物中心提供。合格证苏(动)质98003。
纯种日本大耳白家兔，雄性，体重1.7～2.3kg，由南京中医药大学实验动物中心提供。苏动(质)98003。
仪器江湾I型C脑立体固定仪，上海第二军医大学器材处；754紫外可见分光光度计，上海第三分析仪器厂；DKZ-2型电热恒温振荡水槽，上海精宏实验设备有限公司；DF110型电子分析天平，常熟衡器公司；YXQ-280电热式压力蒸汽消毒器；752紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂；SB2200超声波清洗器，上海必能超声有限公司；10μl微量进样器，上海医用激光仪器厂；DHJ-9076A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；JA2003型电子秤，上海天平仪器厂；手术刀、止血钳、眼科镊、缝合针线、脱脂棉、纱布等。
实验条件给药前后，实验动物均分笼饲养，喂全价颗粒饲料或青稞饲料(南京市江浦县药检所实验动物饲料加工厂提供)，自由饮水，室温22～25℃，湿度50～70％。
统计方法本实验采用t检验、x2检验。
对大鼠实验性脑出血模型的影响(1)造模方法大鼠适应性喂养一周后开始造模。眼眶取血0.5ml/只，肝素抗凝；大鼠4mg/kg戊巴比妥钠按10ml/kg体重腹腔注射麻醉，剪去顶毛，固定于立体定位仪；常规局部消毒，切开头皮，以前囟为0点，向右旁开4mm，向后2mm，牙科钻钻孔，用微量注射器将自体抗凝血100μl缓慢注入尾壳核区，拔针，缝合头皮[1]。
(2)分组给药将造模成功的大鼠随机分为6组，即①模型组，给予生理盐水10ml/kg体重；②高剂量组(本发明I组)，给予本发明注射液生药8g/kg体重；③中剂量组(本发明II组)，给予本发明注射液4g/kg体重；④低剂量组(本发明III组)，给予本发明注射液2g生药/kg体重；⑤阳性对照组，给予清开灵注射液3.5ml/kg；⑥假手术组(手术方法相同，但不注入自体抗凝血)，给予生理盐水10ml/kg体重。各组均腹腔注射给药，给药体积均为10ml/kg体重连续给药5d。
(3)观测指标及方法①动物一般情况及死亡数统计观察动物造模后精神状态、毛色、活动能力、体重和死亡数。按下式计算大鼠体重增长率大鼠体重增长率＝(造模后第4天体重-造模前体重)/造模前体重×100％②动物神经功能缺损分级动物神经功能缺损分级方案参照Bederson[2]及爱丁堡与斯堪的那维亚研究组[3]方案修订0级正常；I级一侧肢体轻度无力，略有跛行，可以直线行进或有偏行(行进打偏半径超过1m)；II级一测肢体明显无力，头部轻度向另侧歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半径在0.5～0.75m左右；III级一侧偏瘫，站立比较困难，不能行走，但可以正卧位，有显著的歪头、口角歪斜；IV级一侧偏瘫，不能正卧，呈侧卧甚至仰卧，歪头及身体扭曲明显，或不能自主进食，神志迷蒙，或抽搐频繁(10min内2次以上)；V级昏迷或死亡。
③脑组织含水量测定脱颈椎处死大鼠，断头，剪开头皮，以止血钳小心剥离颅骨和硬脑膜，取脑于滤纸上，吸干残血，去除小脑和嗅球，以手术刀片从正中线分左右大脑，分别称重，计算左右脑重量差。再将左右半脑分别置于事先已干燥至恒重的小玻璃瓶内，于烤箱内70□下烘干至恒重，分别称左右半脑干重，计算左半脑含水量。
脑干重＝恒重后的带瓶脑重-称量瓶重左脑组织含水率＝(左脑湿重-左脑干重)/左脑湿重×100％④脑指数计算脑指数＝全脑湿重(左半脑湿重+右半脑湿重)/体重×100⑥脑组织病理形态学的光镜观察标本福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，HE染色，光镜观察。
(4)实验结果①动物一般状况及死亡数统计造模后，各组大鼠均出现不同程度的精神萎靡、行动迟缓或障碍等表现。各组大鼠在造模后均有不同程度的死亡，各给药组动物死亡率低于模型组，但给药组动物死亡率与模型组相比，无显著性差异(p＞0.05)。见表1。
表1本发明注射液对实验性脑出血大鼠死亡率的影响大鼠死亡率(％)分组动物数 剂量(g/kg)术后1d 术后2d 术后3d 术后4d假手术组20-0(0/20)0(0/20) (0/20) (0/20)模型组 25-20(5/25) 36(9/25) 36(9/25) 45.45(9/25)清开灵组253.5ml/kg 8(2/25)36(9/25) 36(9/25) 35(9/25)本发明I组 25812(3/25) 28.00(7/25) 32(8/25) 40(8/25)本发明II组 25412(3/25) 32(8/25) 32(8/25) 35(8/25)本发明III组 2528(2/25)32(8/25) 36(9/25) 35(9/25)②对大鼠体重的影响造模前各组动物体重无显著性差异，造模后第4d，模型组大鼠体重增长率低于正常组，两者相比，有显著性差异(p＜0.01)。各给药组动物体重增长率均大于模型组，其中本发明注射液中剂量组动物体重增长率与模型组两者相比，有显著性差异(p＜0.05)。见表2。
表2本发明注射液对实验性脑出血大鼠体重的影响(X+S)剂量 造模前体重 造模后的体重 体重增长率分组动物数(g/kg) (g) (g) (％)假手术组20 - 299±22.3303±27.11 1.17±2.21模型组 16 - 302.33±23.15292.83±27.26-3.18±4.7□□清开灵组16 3.5ml/kg 287.75±26.57285.42±30.15-0.89±2.97本发明I组 17 8 290±13.64 284.67±14.38-1.83±2.24本发明II组 17 4 289.62±17.22290.69±21.760.24±2.9*本发明III组 16 2 300.83±27.85295.08±32.89-2.04±3.21注与假手术组比较，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05。
③神经功能缺损评分大鼠经脑内注射自身抗凝血后，均出现较为明显的行为体征异常。造模后第1d，模型组与4个给药组比较，大鼠神经功能缺损分级无显著性差异(p＞0.05)，造模第2d后，各给药组动物行为体征评分均低于模型组，本发明注射液高、中剂量组行为体征评分与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。清开灵组在造模第3d后，行为体征评分与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。造模后第4d，模型组动物行为体征评分与自身第1d比较，无显著性差，表明动物自身恢复不显著；本发明注射液中剂量组动物行为体征评分造模后第4d与第1d比较，有显著性差异。提示本发明注射液对实验性脑出血大鼠的行为体征异常有一定的改善作用。见表3。
表3本发明注射液对实验性脑出血大鼠神经功能的影响(X+S)
注与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；同组第4d与第1d组比较，#p＜0.05。
④对脑指数和脑组织含水量的影响大鼠经脑内注射自身抗凝血后，左右半脑重量差、脑指数和左脑组织含水率均增大，与假手术组相比，有显著性差异(p＜0.01)，表明动物脑内注射自身抗凝血后已造成了脑水肿。各给药组动物左右半脑重量差和脑指数均小于模型组，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，本发明注射液中剂量组动物的左脑组织含水率与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。提示本发明注射液有减轻实验性脑出血大鼠脑水肿作用。见表4。
表4本发明对实验性脑出血大鼠左右半脑重量差、脑指数和脑组织含水量影响的比较(X+S)左右半脑重量动物脑指数左脑组织含水量组别差数 (g/100g体重) (％)(g)假手术组 11 0.015±0.004 0.429±0.024 77.62±1.87模型组 9 0.087±0.042□□0.471±0.039□□82.01±2.63□清开灵组 8 0.038±0.006**0.437±0.07*79.21±2.61本发明I组 8 0.036±0.013**0.435±0.028*78.74±2.47本发明II组 8 0.035±0**0.431±0.049*78.92±2.76*本发明III组9 0.037±0.015*0.435±0.075*81.35±3.73注与假手术组比较，□p＜0.05，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
⑤对造模大鼠血清内皮素的影响大鼠经脑内注射自身抗凝血造成实验性出血性中风模型后，模型组动物血清内皮素含量升高，但与假手术组相比，无显著性差异(p＞0.05)。本发明注射液高、中剂量给药组动物血清内皮素含量均低于模型组，但与模型组相比，无显著性差异(p＞0.05)。提示本发明注射液对造模动物血清内皮素的升高有一定的抑制作用。见表5。
表5本发明注射液对实验性脑出血大鼠血清内皮素的影响(X+S)动物数剂量组别 ET(只)(g/kg)假手术组 11 - 85.91±60.59模型组 9- 181.16±84清开灵组 83.5ml/kg 129.93±80.05本发明I组 88 109.88±95.09本发明II组 84 109.59±74.33本发明III组92 157.33±116.91⑥脑组织病理形态学的光镜观察各组大鼠光镜观察结果如下(表6)
表6本发明对实验性脑出血大鼠脑组织病理形态学的影响动物数 脑白质部分 脑组织胶质细胞肿胀或见胞浆中性白细 无明显组别 剂量(g/kg)(只)区域疏松坏死 呈泡沫状的格子细胞 胞集聚病变假手术组 99模型组 7 -322清开灵组 8 3.5ml/kg 2 2 1 4本发明I组 9 84 5本发明II组 9 44 1 4本发明III组7 23 4 0由表6可见a.假手术组假手术组9例，神经细胞未见胞体肿胀，胞核固缩、坏死等病理改变。未见软化灶形成。胶质细胞无增生，间质血管无扩张充血、出血、水肿、炎细胞浸润等；b.模型组模型组7例。3例脑白质部分区域疏松，其间可见大小不等的空网状结构，并见胶质细胞增生、灶性中性白细胞浸浸润。2例脑组织部分区域环死，胶质细胞增生。胞浆噬有脂质、呈空泡状。其余2例无明显病变；c.清开灵组8例，2例脑白质部分区域疏松、呈空泡状，胶质细胞肿胀，血管周围间隙增宽。1例除上述改变外尚见胞浆呈泡沫状的格子细胞。1例局部有大量的中性白细胞集聚，形成小脓肿。其余4例无明显病变；d.高剂量组高剂量组9例。3例脑白质部分区域疏松、呈空网状，胶质细胞肿胀，并见胞浆呈泡沫状的格子细胞，血管周围间隙增宽，有省突胶质细胞形成的血管袖套现象。1例除上述病变外局部区域有大量的中性白细胞集聚，形成小脓肿。其作5例无明显病变；e.中剂量组中剂量组9例，4例脑白质部分区域疏松、呈空网状，胶质细胞肿胀，增生。除上述改变外尚见胞浆呈泡沫状的格子细胞。1例局部有大量的中性白细胞集聚，形成小脓肿。其余4例无明显病变；f.低剂量组低剂量组7例。3例脑白质部分区域疏松呈空网状，胶质细胞肿胀增生，并见胞浆呈泡沫状细胞。4例局部胶质细胞增生、胞浆疏松淡染。
大鼠脑出血动物模型脑部病变表现为脑白质部分区域疏松淡染，其间可见大小不等的空网状结构，部分区域胶质细胞增生，胞浆噬有脂体、呈空泡状，个别动物脑组织内出现小脓肿。灰质部神经细胞基本无见胞体肿胀、胞核固缩、坏死等病理改变。经药物治疗后，各组病变程度如下模型组病变较重，中剂量组、阳性组病变较轻，假手术组未见明显的组织病理学改变。
(5)小结①本实验采用向大鼠脑内尾壳核区注入自体抗凝血的方法制造大鼠脑出血模型，实验结果表明此方法能造成动物明显的行为体征异常和脑水肿。
②本发明注射液能改善实验性脑出血动物的行为体征异常，降低造模侧半脑的含水率和全脑指数，降低造模后动物的死率。提示本发明注射液对实验性脑出血大鼠有一定的治疗作用。
③病理组织学检查结果表明大鼠脑出血动物模型脑部病变表现为脑白质部分区域疏松淡染，其间可见大小不等的空网状结构，部分区域胶质细胞增生，胞浆噬有脂体、呈空泡状，个别动物脑组织内出现小脓肿。灰质部神经细胞基本未见胞体肿胀、胞核固缩、坏死等病理改变。经药物治疗后，各组病变程度如下模型组病变较重，中剂量组、阳性组病变较轻，假手术组未见明显的组织病理学改变。
对凝血酶所致大鼠脑水肿的影响(1)造模方法手术前大鼠称重并记录。仿Xi Guohua[4]及Lee KR[5]方法略加改进，复制大脑水肿模型大鼠戊巴比妥钠30mg/kg体重腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于脑立体定位仪，常规消毒后，纵向切开头背侧中央皮肤约1.5cm，暴露前后囟，使前后囟处于同一水平，参阅大鼠脑立体定位谱，以前囟中点为原点，向后2mm，左侧旁开4mm，左侧尾核壳定位，以牙科钻钻直径约1mm左右的小孔，用固定于立体定位仪上微量注射器，沿针孔垂直进针5mm，模型组缓慢推注10□l凝血酶生理盐水液(含凝血酶20U)，注射时间不少于3min，缓慢退针后缝合头皮，用消毒棉球压迫止血；假手术组造模过程同模型组，但针刺进入尾核壳后注射10ml生理盐水。手术后每只大鼠大腿内侧肌注青霉素2万单位以预防感染。术后大鼠适当保暖。
(2)动物分组给药将造模成功的大鼠随机分为6组，即①模型组，给予生理盐水10ml/kg体重；②本发明注射液低剂量组，给予本发明注射液2g生药/kg体重；③本发明注射液中剂量组，给予本发明注射液4g生药/kg体重；④本发明注射液高剂量组，给予本发明注射液8g生药/kg体重；⑤阳性对照组，给予清开灵注射液3.5ml/kg⑥假手术组，给予生理盐水10ml/kg体重。各组均腹腔注射给药，给药体积均为10ml/kg体重。
(3)观察指标①动物一般情况及死亡数统计观察动物造模后精神状态、毛色、活动能力、体重和死亡数。按下式计算大鼠体重增长率大鼠体重增长率＝(造模后第4天体重-造模前体重)/造模前体重×100％②脑组织含水量测定脱颈椎处死大鼠，断头，剪开头皮，以止血钳小心剥离颅骨和硬脑膜，取脑于滤纸上，吸干残血，去除小脑和嗅球，以手术刀片从正中线分左右大脑，分别称重，计算左右脑重量差。再将左右半脑分别置于事先已干燥至恒重的小玻璃内，于烤箱内70℃下烘干至恒重，分别称左右半脑干重，计算左右半脑含水量。
脑干重＝恒重后的带瓶脑重-称量瓶重脑组织含水率＝(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100％③脑指数计算脑指数＝全脑湿重(左半脑湿重+右半脑湿重)/体重×100④动物神经功能缺损分级动物神经功能缺损分级方案参照Bederson[2]及爱丁堡与斯堪的那维亚研究组[3]方案修订0级正常；I级一侧肢体轻度无力，略有跛行，可以直线行进或有偏行(行进打偏半径超过1m)；II级一测肢体明显无力，头部轻度向另侧歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半径在0.5～0.75m左右；III级一侧偏瘫，站立比较困难，不能行走，但可以正卧位，有显著的歪头、口角歪斜；IV级一侧偏瘫，不能正卧，呈侧卧甚至仰卧，歪头及身体扭曲明显，或不能自主进食，神志迷蒙，或抽搐频繁(10min内2次以上)；V级昏迷或死亡。
(4)实验结果①动物一般状况及死亡数统计造模后，各组大鼠均出现不同程度的精神萎靡、行动迟缓或障碍等表现，4d内，大鼠无一死亡。
②对造模大鼠体重的影响模型组大鼠体重增长率明显低于假手术组，两者相比，有显著性差异(p＜0.01)。本发明注射液高、中、低剂量组和清开灵注射液组的大鼠体重增长率高于模型组，其中本发明注射液中剂量组体重增长率与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。见表7。
表7本发明注射液对凝血酶所脑水肿大鼠体重的影响(X+S)剂量 造模前体重造模后的体重 体重增长率分组 动物数(g/kg) (g) (g)(％)假手术组 15 - 299.00±22.30 303.00±27.101.17±2.21模型组 15 - 290.43±14.43 283.64±12.34-2.30±1.62□□清开灵组 15 3.5ml/kg 292.46±10.89 287.46±10.97-1.69±2.32本发明I组 15 8 290.71±12.39 287.93±11.33-0.89±2.59本发明II组 15 4 287.0±13.28 284.57±10.65-0.72±2.49*本发明III组15 2 289.69±12.39 286.15±12.64-1.20±2.32注与假手术组比较，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05。
③行为体征评分动物经脑内注射凝血酶造成脑水肿，出现明为的行为体征异常。造模第2d后，各给药组动物行为体征评分均低于模型组，造模后第3、4d，本发明注射液高、中、低剂量组和清开灵组行为体征评分，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。模型组大鼠行为体征评分逐日增高，造模后第4d与第1d比较，有显著性差异(p＜0.01)。本发明注射液低剂量组和清开灵组行为体征评分，造模后第4d与第1d相比，无显著性差异(p＞0.05)。提示本发明注射液对脑内注射凝血酶所造的动物行为体征异常有一定的保护作用。见表8。
表8本发明注射液对凝血酶所脑水肿大鼠大鼠神经功能的影响(X+S)剂量 行为体征评分分组 动物数(g/kg) 术后1d 术后2d术后3d术后4d假手术组 15 - - - - -模型组 15 - 1.14±0.772.21±1.123.43±0.76##3.54±0.96##清开灵组 15 3.5ml/kg1.23±0.691.84±0.692.00±0.91**2.11±0.93**本发明I组 15 8 1.07±0.621.93±0.621.93±0.83**1.67±0.92**本发明II组 15 4 0.86±0.661.93±0.921.79±0.58**1.85±0.73**本发明III组15 2 1.23±0.602.15±0.892.92±0.76 2.45±0.78*注与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；同组第4d与第1d组比较，##p＜0.01。
④对脑指数和脑组织含水量的影响大鼠经脑内注射凝血酶后，动物左右半脑重量差、脑指数和左脑组织含水率显著增高，与假手术组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，表明向脑内注射凝血酶可成功造成脑水肿模型。各给药组大鼠左右重量差、脑指数和左脑组织含水率均低于模型组，其中本发明注射液高剂量组和清开灵组动物左右半脑重量差、脑指数和脑组织含水量，与模型组比较，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。提示本发明注射液对凝血酶所致大鼠脑水肿有一定的改善作用。见表9。
表9本发明注射液对凝血酶所脑水肿大鼠左右半脑重量差、脑指数和脑组织含水量的影响(X+S)动物 左右半脑重量差 脑指数脑组织含水率组别数(g) (g/100g体重) (％)假手术组 150.0051±0.0160.430±0.016 77.48±2.13模型组 150.0479±0.017□□0.458±0.009□□79.53±2.61□清开灵组 150.0353±0.013*0.446±0.015*77.27±2.81*本发明I组 150.0308±0.012*0.445±0.008**77.03±3.09*本发明II组 150.0261±0.014**0.447±0.010**78.82±1.87本发明III组150.0429±0.0110.449±0.010*78.55±0.87注与假手术组比较，□p＜0.05，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
(5)小结①大鼠经脑内注射凝血酶后，行为体征出现明显地异常，动物左右半脑重量差、全脑指数和造模侧半脑组织含水率明显增高，表明向脑内注射凝血酶可成功造成动物脑水肿模型。
②本发明注射液能改善造模后大鼠行为体征的异常，降低左左半脑重量差、全脑指数和造模侧半脑组织含水率，表明本发明注射液对凝血酶所致大鼠脑水肿有一定的治疗作用。
3.对出血性大鼠脑血管通透性的影响试验(1)造模方法大鼠适应性喂养一周后开始造模。眼眶取血0.5ml/只，肝素抗凝；大鼠4％戊巴比妥钠按1ml/kg体重腹腔注射麻醉，剪去顶毛，固定于脑立体定位仪；常规局部消毒，切开头皮，以前囟为0点，向右旁开4mrn，向后2mm，牙科钻钻孔，用微量注射器将自体抗凝血100ml缓慢注入尾壳核区，留针3min后拔针，缝合头皮[1]。
(2)分组给药及测定方法将造模成功的大鼠随机分为6组，即①模型组，给予生理盐水10ml/kg体重；②高剂量组(本发明I组)，给予本发明注射液生药8g/kg体重；③中剂量组(本发明II组)，给予本发明注射液4g/kg体重；④低剂量组(本发明III组)，给予本发明注射液2g生药/kg体重；⑤阳性对照组，给予清开灵注射液3.5ml/kg；⑥假手术组(手术方法相同，但不注入自体抗凝血)，给予生理盐水10ml/kg体重。各组均腹腔注射给药，给药体积均为10ml/kg体重，连续给药5d。造模后1d、2d、3d、4d，分别观察大鼠行为体征的变化并进行评分。于造模后第4d、末次给药后1 h将大鼠麻醉，舌下静脉注射伊文斯兰50mg/kg，3h后处死，取脑，分开左右脑，分别称重。剪碎左脑，于70％丙酮溶液中浸泡24h，3000rpm离心15min，取上清液于625nm处比色，读取OD值。
(3)观察指标①动物一般情况及死亡数统计观察动物造模后精神状态、毛色、活动能力、体重和死亡数。按下式计算大鼠体重增长率大鼠体重增长率＝(造模后第4天体重-造模前体重)/造模前体重×100％②动物神经功能缺损分级动物神经功能缺损分级方案参照Bederson[2]及爱丁堡与斯堪的那维亚研究组[3]方案修订0级正常；I级一侧肢体轻度无力，略有跛行，可以直线行进或有偏行(行进打偏半径超过1m)；II级一测肢体明显无力，头部轻度向另侧歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半径在0.5～0.75m左右；III级一侧偏瘫，站立比较困难，不能行走，但可以正卧位，有显著的歪头、口角歪斜；IV级一侧偏瘫，不能正卧，呈侧卧甚至仰卧，歪头及身体扭曲明显，或不能自主进食，神志迷蒙，或抽搐频繁(10min内2次以上)；V级昏迷或死亡。
③脑组织含水量测定脱颈椎处死大鼠，断头，剪开头皮，以止血钳小心剥离颅骨和硬脑膜，取脑于滤纸上，吸干残血，去除小脑和嗅球，以手术刀片从正中线分左右大脑，分别称重，计算左右脑重量差。再将左右半脑分别置于事先已干燥至恒重的小玻璃瓶内，于烤箱内70℃下烘干至恒重，分别称左右半脑干重，计算左右半脑含水量。
脑干重＝恒重后的带瓶脑重-称量瓶重左脑组织含水率＝(左脑湿重-左脑干重)/左脑湿重×100％④脑指数计算脑指数＝全脑湿重(左半脑湿重+右半脑湿重)/体重×100⑤对脑组织浸出液伊文斯兰浓度的影响剪碎左脑，于70％丙酮溶液中浸泡24h，3000rpm离心15min，取上清液于625nm处比色，读取OD值，以OD值代表浸出液伊文斯兰的浓度。
实验结果①动物一般状况及死亡数统计造模后，各组大鼠均出现不同程度的精神萎靡、行动迟缓或障碍等表现。大鼠在造模后均有不同程度的死亡，造模后3d内，各给药组动物死亡率低于模型组，造模后第4d，本发明高剂量组组动物死亡率高于模型组，但与模型组比较无显著差异(p＞0.05)。见表10。
表10本发明注射液对实验性脑出血大鼠死亡率的影响剂量 大鼠死亡率(％)分组(g/kg) 术后1d 术后2d 术后3d 术后4d假手术组 - 0(0/18) 0(0/18) 0(0/18) 0(0/18)模型组 - 5.56(1/18) 22.22(4/18) 44.44(8/18) 44.44(8/18)清开灵组 3.5ml/kg 5.56(1/18) 33.33(6/18) 44.44(8/18) 44.44(8/18)本发明I组 8 5.56(1/18) 22.22(4/18) 38.89(7/18) 50(9/18)本发明II组 4 11.11(2/18) 22.22(4/18) 33.33(6/18) 44.44(8/18)本发明III组2 5.56(1/18) 38.89(7/18) 38.89(7/18) 44.44(8/18)②对造模大鼠体重的影响模型组大鼠体重增长率明显低于正常组，两者相比，有显著性差异。本发明注射液高、中、低剂量组和清开灵注射液组的大鼠体重增长率高于模型组，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。见表9。
表9本发明注射液对实验性脑出血大鼠体重的影响(X+S)剂量 造模前体重 造模后的体重 体重增长率分组 动物数(g/kg) (g) (g)(％)假手术组 18 - 306.40±26.15 315.5±29.582.92±2.3模型组 10 - 300.22±24.94 292.89±27.09 -2.45±2.24□□清开灵组 10 3.5ml/kg 280.22±19.94 279.56±18.6-0.18±2.67*本发明I组 9 8 292.67±30.4 292.67±30.24 -0.5±2.45本发明II组 10 4 311.33±8.53 309.9±37.070.42±2.11*本发明III组10 2 305.4±25.24 306.3±27.340.28±3.16*注与假手术组比较，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05。
③行为体征评分动物经脑内自身抗凝血造成实验性脑出血，出现明为的行为体征异常。造模第1d后，各给药组动物行为体征评分均低于模型组，造模后第3、4d，本发明注射液中、低剂量组和清开灵组行为体征评分，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。模型组大鼠行为体征评分造模后第4d与第1d比较，无显著性差异(p＞0.05)，表明造模动物行为体征自身改善不显著。本发明注射液低剂量组和清开灵组行为体征评分，造模后第4d与第1d相比，有显著性差异(p＜0.05)。提示本发明注射液对脑内注射凝血酶所造的动物行为体征异常有一定的改善作用。见表12。
表12本发明注射液对实验性脑出大鼠神经功能的影响(X+S)
注与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；同组第4d与第1d组比较，#p＜0.05。
④对脑指数和脑组织含水量的影响大鼠经脑内注射凝血酶后，动物左右半脑重量差、脑指数和左脑组织含水率显著增高，与假手术组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，表明向脑内注射凝血酶可成功造成脑水肿模型。各给药组大鼠左右重量差、脑指数和左脑组织含水率均低于模型组，其中本发明注射液中剂量组动物左右半脑重量差、脑指数和脑组织含水量，与模型组比较，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。各给药组动物左右半脑重量差，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。提示本发明注射液对凝血酶所致大鼠脑水肿有一定的改善作用。见表13。
表13本发明注射液对实验性脑出血大鼠左右半脑重量差、脑指数和脑组织含水量影响(X+S)动物 左右半脑重量差 脑指数 脑组织含水率组别数 (g) (g/100g体重) (％)假手术组 180.0111±0.0163 0.416±0.05 78.62±1.6模型组 100.0544±0.0204□□0.452±0.041□81.07±2.8□清开灵组 100.0305±0.0288*0.447±0.03680.06±2.27本发明I组 9 0.015±0.0081**0.442±0.03979.7±2.96本发明II组 100.0193±0.0162**0.416±0.143*78.96±3.16*本发明III组100.0277±0.021*0.438±0.14680.86±5.62注与假手术组比较，□p＜0.05，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05。
⑤对脑组织浸出液伊文斯兰浓度的影响经比色法测定，模型组OD值与假手术组比较无显著性差异(p＞0.05)，表明大鼠经脑内注射自身抗凝血造成实验性脑出血后，动物脑血管通性无明显改变。本发明注射液高、中剂量脑组织浸出液OD值小于模型组，与模型组比较有显著性差异(p＜0.05)提示本发明注射液能减少脑血管的通透性。见表14。
表14本发明注射液对实验性脑出血大鼠脑组织浸出液伊文斯兰浓度的影响(X+S)剂量组别 动物数 OD值(g/kg)假手术组 18 3.5ml/kg 0.527±0.246模型组 10 - 0.576±0.214清开灵组 10 2 0.445±0.263本发明I组 9- 0.326±0.147*本发明II组 10 8 0.339±0.251*本发明III组10 4 0.504±0.308注与模型组比较，*p＜0.05。
对实验性家兔脑水肿急性期的研究(1)造模方法家兔适应性喂养一周后开始造模。眼眶取血0.5ml/只，肝素抗凝；大鼠4％戊巴比妥钠按1ml/kg体重耳缘静脉麻醉，剪去顶毛，固定于立体定位仪；常规局部消毒，切开头皮，以前囟为0点，向右旁开4mm，向后1mm，牙科钻钻孔，用微量注射器将自体抗凝血100μl缓慢注入尾壳核区，拔针，缝合头皮[6]。
(2)分组给药将造模成功的家兔随机分为6组，即①模型组，给予生理盐水1.5ml/kg体重；②高剂量组(本发明I组)，给予本发明注射液3.0g生药/kg体重；③中剂量组(本发明II组)，给予本发明注射液1.5g/kg体重；④低剂量组(本发明III组)，给予本发明注射液0.75g生药/kg体重；⑤阳性对照组，给予清开灵注射液2.0ml/kg⑥溶媒组给予本发明溶媒1.5ml/kg体重。另设假手术组(手术操作同模型组，但不注入血凝块)，给予生理盐水1.5ml/kg体重，共7组。各组均耳缘静脉注射给药，除⑤组外，其余各组给药体积均为1.5ml/kg体重。
(3)观测指标及方法①动物一般情况及死亡数统计观察动物造模后精神状态、毛色、活动能力、体重和死亡数。
②动物神经功能缺损分级动物神经功能缺损分级方案参照Bederson[2]及爱丁堡与斯堪的那维亚研究组[3]方案修订0级正常；I级一侧肢体轻度无力，略有跛行，可以直线行进或有偏行(行进打偏半径超过1m)；II级一测肢体明显无力，头部轻度向另侧歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半径在0.5～0.75m左右；III级一侧偏瘫，站立比较困难，不能行走，但可以正卧位，有显著的歪头、口角歪斜；IV级一侧偏瘫，不能正卧，呈侧卧甚至仰卧，歪头及身体扭曲明显，或不能自主进食，神志迷蒙，或抽搐频繁(10min内2次以上)；V级昏迷或死亡。
③脑组织含水量测定处死家兔，断头，剪开头皮，以止血钳小心剥离颅骨和硬脑膜，取脑于滤纸上，吸干残血，去除小脑和嗅球，以手术刀片从正中线分左右大脑，分别称重，计算左右脑重量差。再将左右半脑分别置于事先已干燥至恒重的小玻璃内，于烤箱内70□下烘干至恒重，分别称左右半脑干重，计算左半脑含水量。
脑干重＝恒重后的带瓶脑重-称量瓶重左脑组织含水率＝(左脑湿重-左脑干重)/左脑湿重×100％④脑指数计算脑指数＝全脑湿重(左半脑湿重+右半脑湿重)/体重×1000⑤凝血时间的测定以4号注射针头家兔耳缘动脉放血，滴于载玻片上，以针尖轻挑血滴，每隔15s1次，直至出现丝状物为止，记录出现丝状物时间。
⑤对血液流变学的影响家兔颈动脉放血于抗凝管内，每支5ml。于自清洗施转式粘度计上测定全血粘度和血浆粘度。
(4)实验结果①动物一般状况及死亡数统计造模后，各组家兔均出现不同程度的精神萎靡、行动迟缓或障碍等表现。各组家兔在造模后均有不同程度的死亡，各给药组动物死亡率低于模型组，但给药组动物死亡率与模型组相比，无显著性差异(p＞0.05)。见表15。
表15本发明注射液对实验性脑水肿家兔死亡率的影响剂量家兔死亡率(％)分组(g/kg)术后1d术后2d 术后3d 术后4d 术后5d假手术组 - 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12模型组- 2/12(16.67)5/12(41.67) 5/12(41.67)5/12(41.67)5/12(41.67)清开灵组 2ml/kg1/12(8.33) 3/12(25) 3/12(25) 3/12(25) 3/12(25)本发明I组 3 2/12(16.67)3/12(25) 3/12(25) 3/12(25) 3/12(25)本发明II组1.5 2/12(16.67)2/12(16.67) 2/12(16.67)2/12(16.67)2/12(16.67)本发明III组 0.75 3/12(25) 4/12(33.33) 4/12(33.33)4/12(33.33)4/12(33.33)②神经功能缺损评分家兔经脑内注射自身血凝后，均出现较为明显的行为体征异常。造模后第1d，模型组与4个给药组比较，家兔神经功能缺损分级无显著性差异(p＞0.05)，造模第2d后，各给药组动物行为体征评分均低于模型组，本发明注射液高、中剂量组行为体征评分与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。清开灵组在造模第3d后，行为体征评分与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。造模后第4d，模型组动物行为体征评分与自身第1d比较，无显著性差异(p＞0.05)，表明动物自身恢复不显著；本发明注射液中剂量组动物行为体征评分造模后第4d与第1d比较，有显著性差异。提示本发明注射液对实验性脑出血家兔的行为体征异常有一定的改善作用。见表16。
表16本发明注射液对实验性脑水肿家兔神经功能的影响(X+S)
注与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；同组第4d与第1d组比较，#p＜0.05。
③对脑指数和脑组织含水量的影响家兔经脑内注射自身血凝块后，脑指数和左脑组织含水率均增大，与假手术组相比，有显著性差异(p＜0.05)，表明动物脑内注射自身血凝块后已造成了脑水肿。各给药组动物左右脑重量差均小于模型组，与组相比，有显著性差异(p＜0.05)，本发明注射液中、低剂量组和清开灵组动物的脑指数与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。提示本发明注射液有减轻实验性脑出血家兔脑水肿作用。见表17。
表17本发明注射液对实验性脑水肿家兔脑指数和脑组织含水量影响(X+S)剂量 全脑指数左脑-右脑 左脑含水率组别 动物数(g/kg)(g/1000g)(g)(％)假手术组 12 - 2.76±0.23□0.13±0.12□75.37±2.37□模型组 7 - 3.05±0.260.85±0.29 80.65±3.37清开灵组 9 0.752.90±0.11*0.54±0.26*77.77±2.88本发明I组 9 - 2.93±0.230.76±0.33*77.39±2.75本发明II组 10 3 2.92±0.21*0.45±0.21*76.36±2.13本发明III组9 1.5 2.93±0.19*0.76±0.39*77.40±2.39注与假手术组比较，□p＜0.05；与模型组比较，*p＜0.05。
④对家兔凝血时间的影响模型组凝血时间与假手术组相比，无显著性差异(p＞0.05)，表明造模对家兔凝血时间无显著性影响。本发明注射液各剂量组家兔凝血时间均短于模型组，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.01)。见表18。
表18本发明注射液对实验性脑水肿家兔对家兔凝血时间的影响(X+S)剂量 凝血时间组别 动物数(g/kg) (s)假手术组 12- 118.1±36.
模型组 7 - 125.5±44.4清开灵组 9 2ml/kg27.3±20.6**本发明I组 9 3 32.4±22.6**本发明II组 101.5 17.5±12.2**本发明III组9 0.75 36.5±19.5**注与模型组比较，**p＜0.01。
⑤对家兔血液流变学的影响模型组血液流变学各项指标与假手术组相比，均无显著性差异(p＞0.05)，表明造模对动物血液流变学无显著性影响。本发明注射液I组和II组全血粘度高切和低切均低于模型组，其中中切粘度与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)；本发明注射液各给药组血浆粘度均低于模型组，但与模型组相比，无显著性差异(p＞0.05)。实验结果表明，本发明注射液对造模动物的血液流变学有一定的改善作用。见表19。
表19本发明注射液对实验性脑水肿家兔血液流变学的影响(X+S)
注与模型组比较，**p＜0.05。
(5)小结①通过向家兔脑内植入自身血凝块可造成家免较为明显的行为体征异常，脑指数和造模侧脑组织含水量显著性增高，表明动物脑内植入自身血凝块可成功复制动物脑水肿模型。
②本发明注射液可改善造模家兔行为体征异常，减轻脑指数和造模侧脑组织含水量，表明本发明注射液对自身血凝块所致家兔脑水肿有一定的治疗作用。
对小鼠耳廓微循环的影响(1)方法及分组给药取ICR小鼠60只，雌雄各半，体重20-22g，随机分为5组。即①空白对照组溶媒10ml/kg；②清开灵组原液7ml/kg；③本发明低剂量组3.5g/kg；④本发明中剂量组7g/kg；⑤本发明高剂量组14g/kg。小鼠腹腔注射25％乌来糖2.5g/kg麻醉。
动物观测指标及方法待小鼠麻醉后按10ml/kg静脉注射各组药物，并立即按方法[7]和文献[8]将小鼠固定在观察台上(耳托上和耳廓表面滴加少许香柏油)(整个操作过程在2min内完成)，用显微系统观察小鼠耳廓微循环，同时腹腔注射盐酸肾上腺素注射液1mg/kg，记录注射肾上腺素前和注射后5、10、20、30min小鼠微循环细静脉、细动脉的管径和血流速度。
实验结果实验结果显示本发明注射液低、中、高三个剂量组对血流速度无明显影响，但均能对抗肾上腺素引起的微血管收缩，扩张小鼠微血管细静脉和细动脉，与空白对照组比较差异显著(p＜0.05或p＜0.01)，且呈剂量依赖性。表明本发明具有改善微循环的作用。结果见表20、21、22。
表20本发明注射液对小鼠耳廓微循环血流速度的影响(X+S)(n＝12)剂量正常值注射肾上腺素后增加百分率(％)组别(g/kg) (μm/s)5min10min20min30min空白对照组- 103.8±9.51.4±7.1 0.7±5.71.1±10.80.1±6.9清开灵组 7ml/kg104.4±10.6 0.6±7.8 2.3±7.9-1.0±8.5-0.4±10.2本发明I组 3.5 102.0±9.3-1.1±4.32.5±9.21.1±9.2 -1.6±8.1本发明II组7 101.3±7.61.2±4.3 1.0±5.6-0.2±7.34.5±8.0本发明III组 14102.9±4.62.5±8.1 3.6±8.31.0±3.6 -0.8±6.1
表21本发明注射液对小鼠耳廓微静脉管径的影响(X+S)(n＝12)剂量正常值注射肾上腺素后增加百分率(％)组别(g/kg)(μm) 5min 10min 20min 30min空白对照组- 11.4±1.2-27.7±10.3-33.6±9.2 -19.0±7.4 -1.5±7.2清开灵组 7ml/kg11.6±1.3-30.9±14.9-19.3±14.4**-4.8±12.1**11.2±8.3**本发明I组 3.5 11.6±0.9-23.4±7.9 -20.3±6.6**-9.4±9**8.3±11.1*本发明II组7 11.3±1.2-23.1±15.7-13.2±23.5*2.5±19.2**15.6±21*本发明III组 1411.4±1.2-27.2±13.3-21.6±14.7*-1.8±19.6**3.6±21.6注与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
表22本发明注射液对小鼠耳廓微动脉管径的影响(X+S)(n＝12)剂量正常 注射肾上腺素后增加百分率(％)组别(g/kg) (μm/s)5min10min20min 30min空白对照组- 9.2±1 -21.4±7.6 -24.8±8.6 -18.3±12.1 -5.3±7.8清开灵组 7ml/kg9.5±1.1-17.4±10.7 -11.2±11.9**2.9±13.1**12.6±15.8**本发明I组 3.5 9.7±1.1-19.9±11.3 -15.5±14.4 -3.6±13.4**3.4±11.7*本发明II组7 8.8±1.4-14±14.4 -9.4±14.8**4.5±18.5**18.1±30*本发明III组 149.8±1 -11.5±7.2**-2.4±18.9**16.2±15.3**22.7±17.6**注与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
结论1.采用向大鼠脑内尾壳核区注入自体抗凝血的方法制造大鼠脑出血模型，实验结果表明此方法能造成动物明显的行为体征异常和脑水肿。本发明注射液能改善实验性脑出血动物的行为体征异常，降低造模侧半脑的含水率和全脑指数，降低造模后动物的死亡率。病理组织学检查结果表明大鼠脑出血动物模型脑部病变表现为脑白质部分区域疏松淡染，其间可见大小不等的空网状结构，部分区域胶质细胞增生，胞浆噬有脂体、呈空泡状，个别动物脑组织内出现小脓肿。灰质部神经细胞基本未见胞体肿胀、胞核固缩、坏死等病理改变。经药物治疗后，各组病变程度如下模型组病变较重，中剂量组、阳性组病变较轻，假手术组未见明显的组织病理学改变。提示本发明注射液对实验性脑出血大鼠有一定的治疗作用。
2.采用向大鼠脑内尾壳核区注入凝血酶的方法制造大鼠脑水肿模型，实验结果显示大鼠经脑内注射凝血酶后，行为体征出现明显地异常，动物左右半脑重量差、全脑指数和造模侧半脑组织含水率明显增高，表明向脑内注射凝血酶可成功造成动物脑水肿模型。本发明注射液能改善造模后大鼠行为体征的异常，降低左半脑重量差、全脑指数和造模侧半脑组织含水率，表明本发明注射液对凝血酶所致大鼠脑水肿有一定的治疗作用。
3.采用向大鼠脑内尾壳核区注入自体抗凝血的方法制造大鼠脑出血模型，舌下静脉注射伊文斯兰，再通过比色测定造模大鼠脑组织浸出液中伊文斯兰的含量，观察本发明注射液对造模动物脑血管通透性的影响。实验结果显示，模型组脑组织浸出液OD值与假手术组无显著性差异，表明大鼠经脑内注射自身抗凝血造成实验性脑出血后，动物脑血管通性无明显改变。本发明注射液高、中剂量脑组织浸出液OD值小于模型组，提示本发明注射液能减少脑血管的通透性。
4.通过向家兔脑内植入自身血凝块方法造成家兔脑出血模型。实验结果显示此方法可造成家免较为明显的行为体征异常，脑指数和造模侧脑组织含水量显著性增高，表明动物脑内植入自身血凝块可成功复制动物脑水肿模型。本发明注射液可改善造模家兔行为体征异常，降低脑指数和造模侧脑组织含水量，表明本发明注射液对自身血凝块所致家兔脑水肿有一定的治疗作用。
5.对小鼠耳廓微循环的影响试验结果表明，本发明注射液低、中、高三个剂量组对血流速度无明显影响，但均能对抗肾上腺素引起的微血管收缩，扩张小鼠微血管细静脉和细动脉，与空白对照组比较差异显著(p＜0.05或p＜0.01)，且呈剂量依赖性。表明本发明具有改善微循环的作用。
综上所述，本发明注射液能降低急性出血性中风动物死亡率，改善行为体征，减轻脑水肿，降低脑组织含水率，改善微循环，提示本发明注射液对出血性中风有一定的治疗作用。根据中医理论研制的本发明注射液具有高效、速效的特点，能满足抢救病人的需要，对提高中医药救治急难重症的能力、降低病死率和致残率有重要的应用价值。
具体实施例方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1，一种治疗出血性脑中风的药物，它是由以下重量配比的原料制成的大黄160栀子200牡丹皮100其生产方法是取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，加入药用辅料，制成颗粒剂。
实施例2，上述的实施例中，其原料重量配比也可为大黄200栀子160牡丹皮150其生产方法是取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH 7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌封，灭菌，检查，包装，即得注射液；实施例3，本发明药物的最佳重量(份)配比是大黄187.5栀子187.5牡丹皮125其生产方法是取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加100～500g甘露醇，0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH 7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌装，经冻干工序制成冻干粉针剂。
用法与用量静脉滴注。每日2次，每次4支，临用前，用10％葡萄糖注射液(糖尿病患者改用生理盐水)500ml稀释。用法与用量静脉滴注。每日2次，每次4支，临用前，用10％葡萄糖注射液(糖尿病患者改用生理盐水)500ml稀释。
规格10ml/支，每支含生药5g。
权利要求
1.一种治疗出血性脑中风的药物，其特征在于它是由以下重量配比的原料制成的大黄 160～200栀子 160～200牡丹皮 100～150
2.根据权利要求1所述的治疗出血性脑中风的药物，其特征在于它是由以下重量配比的原料制成的大黄 187.5栀子 187.5牡丹皮 125
3.根据权利要求1或2所述的治疗出血性脑中风的药物，其特征在于所述的药物剂型为药剂学所述的任何剂型。
4.根据权利要求3所述的治疗出血性脑中风的药物，其特征在于所述的药物剂型的制备方法为取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，加入药用辅料，制成临床可接受的剂型。
5.根据权利要求3所述的治疗出血性脑中风的药物，其特征在于所述的药物剂型为注射剂。
6.权利要求5所述的治疗出血性脑中风的药物的制备方法为取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH 7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌封，灭菌，检查，包装，即得注射液；或取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加100～500g甘露醇，0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH 7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌装，经冻干工序制成冻干粉针剂。
全文摘要
一种治疗出血性脑中风的药物，它是由大黄、栀子、牡丹皮等原料制成的。本发明从中西医理论或临床研究均角度证实，出血性中风应从血论治，此外，出血性中风急性期常出现发热，部分患者虽无体温增高，但有明显的热证表现，如口苦、咽干、烦躁，甚至谵妄、夜不安、大便秘结等而呈阳明腑实之证象。本发明之处方依据上述理论而立法，采用凉血止血、活血化淤、泻下通腑之药为主，辅以清热泻火、行血破瘀之品，用于治疗出血性中风急性期的瘀热阻窍证。
文档编号A61P9/10GK1565531SQ03132119
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月25日 优先权日2003年6月25日
发明者蔡宝昌, 肖伟, 戴翔翎, 金妙文, 凌娅, 潘扬, 王天山, 杨光明, 燕珂 申请人:江苏康缘药业股份有限公司
技术领域：
本发明涉及一种治疗出血性脑中风的药物，本发明还涉及该药物的制备方法。
背景技术：
出血性中风属于中医疾病的概念，又称“中风”、“卒中”，西医相应的病名为脑出血。脑出血是脑血管病中的一种。在世界上，脑血管病病死率居所有疾病的第三位，而脑出血占脑血管病的10％～30％，是脑血管疾病中主要的致死原因。
出血性中风乃一急危重症，发病率、致残率、死亡率均很高。据调查，出血性中风急性期病死率在18％～75％，其病后生存者60％～65％遗有不同程度的瘫痪、失语、痴呆等后遗症，且有40％左右的重残者。随着我国经济的发展，人口老龄化的出现，人群中高血压、肥胖、吸烟、饮酒、高血脂、糖尿病等危险因素水平上升，引起出血性中风的发病率及死亡率也与日剧增，上海市对91428人进行长达4年的疾病监测结果表明，出血性中风的死亡率为60.3％，男性发病率与死亡率均高于女性，且随年龄的增长，其死亡率呈上升趋势。随着人们生活水平的提高和世界范围的社会老龄化，其发病率有逐年增加的趋势。
出血性中风急性期发病急骤，症见多端，变化迅捷，及时救治对提高抢救成功率和病人的生存质量，具有重要意义，医学界一直将其列为重点研究的疾病之一。西医学治疗脑出血的方法分为手术治疗和内科综合治疗两大类，手术治疗主要用于出血量较大而有手术指征的患者，有一定的危险性。内科综合治疗除常规脱水剂减轻脑水肿、降压药物控制血压、防治感染、纠正酸碱平衡和电介质紊乱之外，加用神经细胞功能改善剂和钙通道阻滞剂，但疗效尚不能令人满意。近年来，中医学对出血性中风急性期的病因病机、治疗方法进行了多方面的研究，目前国内专家公认西医综合性治疗合并中医药疗法优于单纯的西医综合治疗。因此，研制抢救出血性中风急性期的新制剂，是当前急需解决的难题。
出血性中风病理机制主要在高血压、动脉硬化等基础上发生的急性颅内出血，出血后形成血肿压迫局部。而致神经功能受损同时，血肿在颅内形成占位性病变，导致颅内压更骤然升高脑组织局部出血，血肿形成所引起的脑水肿，脑组织受压、推移、软化、坏死等。目前出血性中风的西医内科治疗手段是脱水，降低颅内压、止血、抗感染及神经营养剂，但内科保守治疗病死率、致残率均较高，西药中尚无溶化血肿的特效药物。外科手术清除血肿、抽吸引流等为降低病死率和致残率起到了积极作用。但手术和麻醉本身可对机体产生负面影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出了采用凉血止血、活血化瘀、泻下通腑之药为主，辅以清热泻火、行血破瘀的一种治疗出血性脑中风的药物。
本发明另一个要解决的技术问题是提出了该治疗出血性脑中风的药物的制备方法。
本发明要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的，一种治疗出血性脑中风的药物，其特点是它是由以下重量配比的原料制成的大黄160～200栀子160～200牡丹皮100～150本发明药物的最佳重量(份)配比是大黄187.5 栀子187.5 牡丹皮125本发明所述的药物剂型为药剂学所述的任何剂型。其生产方法是取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，加入药用辅料，制成临床可接受的剂型。
本发明所述的药物剂型为注射剂。其生产方法是取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌封，灭菌，检查，包装，即得注射液；或取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加100～500g甘露醇，0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌装，经冻干工序制成冻干粉针剂。
药学原理《内经素问·调经论》曰“血之与气，并走于上，则为大厥，厥则暴死，气复反则生，不反则死”，揭示了出血性中风血随气逆的病理基础。本病的病机主要在于瘀血和火热两种致病因子的共同参与，以致瘀热相搏，冲激上逆，损伤脑络，络破血溢，脑中蓄血，从而表明病证是“瘀热阻窍”型。其特点为离经之血瘀阻脑腑，使脑髓壅滞，闭阻窍络，元神内困，五脏失统，六腑气闭，肢体失相。一旦发病，来势凶险，风火相煽，气血逆乱，升降失调，导致“血之与气，并走于上”，冲脑损络，络破血溢即成“脑中蓄血”。发病过程中，风痰上扰、热迫血行是导致出血性中风的始动因素。离经之血即为瘀血，有学者对“离经之血——脑中蓄血为瘀血”的中医理论进行了实验研究，发现出血性中风有明显的血液流变学指标变化，从而认为其为出血性血瘀证或是血管性血瘀证，现代CT检查更证实颅内有高密度出血性改变灶。
张介宾曰“治风先治血，血行风自灭”，从中西医理论或临床研究均角度证实了这一观点，故出血性中风应从血论治。此外，出血性中风急性期常出现发热，部分患者虽无体温增高，但有明显的热证表现，如口苦、咽干、烦躁，甚至谵妄、夜不安、大便秘结等而呈阳明腑实之证象。“本发明注射液”之处方依据上述理论而立法，采用凉血止血、活血化瘀、泻下通腑之药为主，辅以清热泻火、行血破瘀之品，用于治疗出血性中风急性期的瘀热阻窍证。
药效学实验通过主要药效学实验验证本发明注射液与临床功能主治有关的作用。
药品及试剂本发明注射液(浓缩液)为棕红色液体，药液浓度2.0g/ml(按生药量计算)，成人日用量为40g/60kg(按生药量计算)，由江苏中康新药指纹图谱开发有限公司提供，批号20010818。临用前用无菌溶媒稀释至所需浓度；无菌溶媒，江苏中康新药指纹图谱开发有限公司提供，批号20010818；清开灵注射液，由山西太行药业有限公司生产，批号010606-10；氯化钠注射液，由南京小营制药厂生产，批号010208；戊巴比妥钠，使用前用灭菌注射用水配制成4％的水溶液；青霉素，由哈尔滨制药厂生产，批号980726；硫酸庆大霉素，由江苏宜兴前进制药厂生产，批号980109；2％碘酊，由江苏省常熟市卫生化工厂生产，批号990122；无水乙醇，AR，由南京化学试剂厂生产，批号970302；牛凝血酶(bovine thrombin)，2unit/μl，pH7.0，含50μmol的脆丝盐酸缓冲体系，批号EC3.4.21.5；伊文斯兰，由中国医药集团(上海)化学试剂公司生产，批号990501；生理盐水，由南京小营制药厂生产，批号001209；70％乙醇，由南京化学试剂厂生产的乙醇(AR，批号990302)配制而成；盐酸肾上腺素注射液(1mg/ml)，武汉诺佳药业集团股份有限公司，批号010601，临用前用生理盐水稀释成0.1mg/ml；乌来糖(氨基甲酸乙酯)中国医药(集团)上海化学试剂公司，化学纯，批号C，用蒸馏水配成25％的乌来糖溶液。
实验动物SD大鼠，由南京中医药大学实验动物中心提供。合格证苏(动)质98003。
纯种日本大耳白家兔，雄性，体重1.7～2.3kg，由南京中医药大学实验动物中心提供。苏动(质)98003。
仪器江湾I型C脑立体固定仪，上海第二军医大学器材处；754紫外可见分光光度计，上海第三分析仪器厂；DKZ-2型电热恒温振荡水槽，上海精宏实验设备有限公司；DF110型电子分析天平，常熟衡器公司；YXQ-280电热式压力蒸汽消毒器；752紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂；SB2200超声波清洗器，上海必能超声有限公司；10μl微量进样器，上海医用激光仪器厂；DHJ-9076A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；JA2003型电子秤，上海天平仪器厂；手术刀、止血钳、眼科镊、缝合针线、脱脂棉、纱布等。
实验条件给药前后，实验动物均分笼饲养，喂全价颗粒饲料或青稞饲料(南京市江浦县药检所实验动物饲料加工厂提供)，自由饮水，室温22～25℃，湿度50～70％。
统计方法本实验采用t检验、x2检验。
对大鼠实验性脑出血模型的影响(1)造模方法大鼠适应性喂养一周后开始造模。眼眶取血0.5ml/只，肝素抗凝；大鼠4mg/kg戊巴比妥钠按10ml/kg体重腹腔注射麻醉，剪去顶毛，固定于立体定位仪；常规局部消毒，切开头皮，以前囟为0点，向右旁开4mm，向后2mm，牙科钻钻孔，用微量注射器将自体抗凝血100μl缓慢注入尾壳核区，拔针，缝合头皮[1]。
(2)分组给药将造模成功的大鼠随机分为6组，即①模型组，给予生理盐水10ml/kg体重；②高剂量组(本发明I组)，给予本发明注射液生药8g/kg体重；③中剂量组(本发明II组)，给予本发明注射液4g/kg体重；④低剂量组(本发明III组)，给予本发明注射液2g生药/kg体重；⑤阳性对照组，给予清开灵注射液3.5ml/kg；⑥假手术组(手术方法相同，但不注入自体抗凝血)，给予生理盐水10ml/kg体重。各组均腹腔注射给药，给药体积均为10ml/kg体重连续给药5d。
(3)观测指标及方法①动物一般情况及死亡数统计观察动物造模后精神状态、毛色、活动能力、体重和死亡数。按下式计算大鼠体重增长率大鼠体重增长率＝(造模后第4天体重-造模前体重)/造模前体重×100％②动物神经功能缺损分级动物神经功能缺损分级方案参照Bederson[2]及爱丁堡与斯堪的那维亚研究组[3]方案修订0级正常；I级一侧肢体轻度无力，略有跛行，可以直线行进或有偏行(行进打偏半径超过1m)；II级一测肢体明显无力，头部轻度向另侧歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半径在0.5～0.75m左右；III级一侧偏瘫，站立比较困难，不能行走，但可以正卧位，有显著的歪头、口角歪斜；IV级一侧偏瘫，不能正卧，呈侧卧甚至仰卧，歪头及身体扭曲明显，或不能自主进食，神志迷蒙，或抽搐频繁(10min内2次以上)；V级昏迷或死亡。
③脑组织含水量测定脱颈椎处死大鼠，断头，剪开头皮，以止血钳小心剥离颅骨和硬脑膜，取脑于滤纸上，吸干残血，去除小脑和嗅球，以手术刀片从正中线分左右大脑，分别称重，计算左右脑重量差。再将左右半脑分别置于事先已干燥至恒重的小玻璃瓶内，于烤箱内70□下烘干至恒重，分别称左右半脑干重，计算左半脑含水量。
脑干重＝恒重后的带瓶脑重-称量瓶重左脑组织含水率＝(左脑湿重-左脑干重)/左脑湿重×100％④脑指数计算脑指数＝全脑湿重(左半脑湿重+右半脑湿重)/体重×100⑥脑组织病理形态学的光镜观察标本福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，HE染色，光镜观察。
(4)实验结果①动物一般状况及死亡数统计造模后，各组大鼠均出现不同程度的精神萎靡、行动迟缓或障碍等表现。各组大鼠在造模后均有不同程度的死亡，各给药组动物死亡率低于模型组，但给药组动物死亡率与模型组相比，无显著性差异(p＞0.05)。见表1。
表1本发明注射液对实验性脑出血大鼠死亡率的影响大鼠死亡率(％)分组动物数 剂量(g/kg)术后1d 术后2d 术后3d 术后4d假手术组20-0(0/20)0(0/20) (0/20) (0/20)模型组 25-20(5/25) 36(9/25) 36(9/25) 45.45(9/25)清开灵组253.5ml/kg 8(2/25)36(9/25) 36(9/25) 35(9/25)本发明I组 25812(3/25) 28.00(7/25) 32(8/25) 40(8/25)本发明II组 25412(3/25) 32(8/25) 32(8/25) 35(8/25)本发明III组 2528(2/25)32(8/25) 36(9/25) 35(9/25)②对大鼠体重的影响造模前各组动物体重无显著性差异，造模后第4d，模型组大鼠体重增长率低于正常组，两者相比，有显著性差异(p＜0.01)。各给药组动物体重增长率均大于模型组，其中本发明注射液中剂量组动物体重增长率与模型组两者相比，有显著性差异(p＜0.05)。见表2。
表2本发明注射液对实验性脑出血大鼠体重的影响(X+S)剂量 造模前体重 造模后的体重 体重增长率分组动物数(g/kg) (g) (g) (％)假手术组20 - 299±22.3303±27.11 1.17±2.21模型组 16 - 302.33±23.15292.83±27.26-3.18±4.7□□清开灵组16 3.5ml/kg 287.75±26.57285.42±30.15-0.89±2.97本发明I组 17 8 290±13.64 284.67±14.38-1.83±2.24本发明II组 17 4 289.62±17.22290.69±21.760.24±2.9*本发明III组 16 2 300.83±27.85295.08±32.89-2.04±3.21注与假手术组比较，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05。
③神经功能缺损评分大鼠经脑内注射自身抗凝血后，均出现较为明显的行为体征异常。造模后第1d，模型组与4个给药组比较，大鼠神经功能缺损分级无显著性差异(p＞0.05)，造模第2d后，各给药组动物行为体征评分均低于模型组，本发明注射液高、中剂量组行为体征评分与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。清开灵组在造模第3d后，行为体征评分与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。造模后第4d，模型组动物行为体征评分与自身第1d比较，无显著性差，表明动物自身恢复不显著；本发明注射液中剂量组动物行为体征评分造模后第4d与第1d比较，有显著性差异。提示本发明注射液对实验性脑出血大鼠的行为体征异常有一定的改善作用。见表3。
表3本发明注射液对实验性脑出血大鼠神经功能的影响(X+S)
注与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；同组第4d与第1d组比较，#p＜0.05。
④对脑指数和脑组织含水量的影响大鼠经脑内注射自身抗凝血后，左右半脑重量差、脑指数和左脑组织含水率均增大，与假手术组相比，有显著性差异(p＜0.01)，表明动物脑内注射自身抗凝血后已造成了脑水肿。各给药组动物左右半脑重量差和脑指数均小于模型组，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，本发明注射液中剂量组动物的左脑组织含水率与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。提示本发明注射液有减轻实验性脑出血大鼠脑水肿作用。见表4。
表4本发明对实验性脑出血大鼠左右半脑重量差、脑指数和脑组织含水量影响的比较(X+S)左右半脑重量动物脑指数左脑组织含水量组别差数 (g/100g体重) (％)(g)假手术组 11 0.015±0.004 0.429±0.024 77.62±1.87模型组 9 0.087±0.042□□0.471±0.039□□82.01±2.63□清开灵组 8 0.038±0.006**0.437±0.07*79.21±2.61本发明I组 8 0.036±0.013**0.435±0.028*78.74±2.47本发明II组 8 0.035±0**0.431±0.049*78.92±2.76*本发明III组9 0.037±0.015*0.435±0.075*81.35±3.73注与假手术组比较，□p＜0.05，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
⑤对造模大鼠血清内皮素的影响大鼠经脑内注射自身抗凝血造成实验性出血性中风模型后，模型组动物血清内皮素含量升高，但与假手术组相比，无显著性差异(p＞0.05)。本发明注射液高、中剂量给药组动物血清内皮素含量均低于模型组，但与模型组相比，无显著性差异(p＞0.05)。提示本发明注射液对造模动物血清内皮素的升高有一定的抑制作用。见表5。
表5本发明注射液对实验性脑出血大鼠血清内皮素的影响(X+S)动物数剂量组别 ET(只)(g/kg)假手术组 11 - 85.91±60.59模型组 9- 181.16±84清开灵组 83.5ml/kg 129.93±80.05本发明I组 88 109.88±95.09本发明II组 84 109.59±74.33本发明III组92 157.33±116.91⑥脑组织病理形态学的光镜观察各组大鼠光镜观察结果如下(表6)
表6本发明对实验性脑出血大鼠脑组织病理形态学的影响动物数 脑白质部分 脑组织胶质细胞肿胀或见胞浆中性白细 无明显组别 剂量(g/kg)(只)区域疏松坏死 呈泡沫状的格子细胞 胞集聚病变假手术组 99模型组 7 -322清开灵组 8 3.5ml/kg 2 2 1 4本发明I组 9 84 5本发明II组 9 44 1 4本发明III组7 23 4 0由表6可见a.假手术组假手术组9例，神经细胞未见胞体肿胀，胞核固缩、坏死等病理改变。未见软化灶形成。胶质细胞无增生，间质血管无扩张充血、出血、水肿、炎细胞浸润等；b.模型组模型组7例。3例脑白质部分区域疏松，其间可见大小不等的空网状结构，并见胶质细胞增生、灶性中性白细胞浸浸润。2例脑组织部分区域环死，胶质细胞增生。胞浆噬有脂质、呈空泡状。其余2例无明显病变；c.清开灵组8例，2例脑白质部分区域疏松、呈空泡状，胶质细胞肿胀，血管周围间隙增宽。1例除上述改变外尚见胞浆呈泡沫状的格子细胞。1例局部有大量的中性白细胞集聚，形成小脓肿。其余4例无明显病变；d.高剂量组高剂量组9例。3例脑白质部分区域疏松、呈空网状，胶质细胞肿胀，并见胞浆呈泡沫状的格子细胞，血管周围间隙增宽，有省突胶质细胞形成的血管袖套现象。1例除上述病变外局部区域有大量的中性白细胞集聚，形成小脓肿。其作5例无明显病变；e.中剂量组中剂量组9例，4例脑白质部分区域疏松、呈空网状，胶质细胞肿胀，增生。除上述改变外尚见胞浆呈泡沫状的格子细胞。1例局部有大量的中性白细胞集聚，形成小脓肿。其余4例无明显病变；f.低剂量组低剂量组7例。3例脑白质部分区域疏松呈空网状，胶质细胞肿胀增生，并见胞浆呈泡沫状细胞。4例局部胶质细胞增生、胞浆疏松淡染。
大鼠脑出血动物模型脑部病变表现为脑白质部分区域疏松淡染，其间可见大小不等的空网状结构，部分区域胶质细胞增生，胞浆噬有脂体、呈空泡状，个别动物脑组织内出现小脓肿。灰质部神经细胞基本无见胞体肿胀、胞核固缩、坏死等病理改变。经药物治疗后，各组病变程度如下模型组病变较重，中剂量组、阳性组病变较轻，假手术组未见明显的组织病理学改变。
(5)小结①本实验采用向大鼠脑内尾壳核区注入自体抗凝血的方法制造大鼠脑出血模型，实验结果表明此方法能造成动物明显的行为体征异常和脑水肿。
②本发明注射液能改善实验性脑出血动物的行为体征异常，降低造模侧半脑的含水率和全脑指数，降低造模后动物的死率。提示本发明注射液对实验性脑出血大鼠有一定的治疗作用。
③病理组织学检查结果表明大鼠脑出血动物模型脑部病变表现为脑白质部分区域疏松淡染，其间可见大小不等的空网状结构，部分区域胶质细胞增生，胞浆噬有脂体、呈空泡状，个别动物脑组织内出现小脓肿。灰质部神经细胞基本未见胞体肿胀、胞核固缩、坏死等病理改变。经药物治疗后，各组病变程度如下模型组病变较重，中剂量组、阳性组病变较轻，假手术组未见明显的组织病理学改变。
对凝血酶所致大鼠脑水肿的影响(1)造模方法手术前大鼠称重并记录。仿Xi Guohua[4]及Lee KR[5]方法略加改进，复制大脑水肿模型大鼠戊巴比妥钠30mg/kg体重腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于脑立体定位仪，常规消毒后，纵向切开头背侧中央皮肤约1.5cm，暴露前后囟，使前后囟处于同一水平，参阅大鼠脑立体定位谱，以前囟中点为原点，向后2mm，左侧旁开4mm，左侧尾核壳定位，以牙科钻钻直径约1mm左右的小孔，用固定于立体定位仪上微量注射器，沿针孔垂直进针5mm，模型组缓慢推注10□l凝血酶生理盐水液(含凝血酶20U)，注射时间不少于3min，缓慢退针后缝合头皮，用消毒棉球压迫止血；假手术组造模过程同模型组，但针刺进入尾核壳后注射10ml生理盐水。手术后每只大鼠大腿内侧肌注青霉素2万单位以预防感染。术后大鼠适当保暖。
(2)动物分组给药将造模成功的大鼠随机分为6组，即①模型组，给予生理盐水10ml/kg体重；②本发明注射液低剂量组，给予本发明注射液2g生药/kg体重；③本发明注射液中剂量组，给予本发明注射液4g生药/kg体重；④本发明注射液高剂量组，给予本发明注射液8g生药/kg体重；⑤阳性对照组，给予清开灵注射液3.5ml/kg⑥假手术组，给予生理盐水10ml/kg体重。各组均腹腔注射给药，给药体积均为10ml/kg体重。
(3)观察指标①动物一般情况及死亡数统计观察动物造模后精神状态、毛色、活动能力、体重和死亡数。按下式计算大鼠体重增长率大鼠体重增长率＝(造模后第4天体重-造模前体重)/造模前体重×100％②脑组织含水量测定脱颈椎处死大鼠，断头，剪开头皮，以止血钳小心剥离颅骨和硬脑膜，取脑于滤纸上，吸干残血，去除小脑和嗅球，以手术刀片从正中线分左右大脑，分别称重，计算左右脑重量差。再将左右半脑分别置于事先已干燥至恒重的小玻璃内，于烤箱内70℃下烘干至恒重，分别称左右半脑干重，计算左右半脑含水量。
脑干重＝恒重后的带瓶脑重-称量瓶重脑组织含水率＝(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100％③脑指数计算脑指数＝全脑湿重(左半脑湿重+右半脑湿重)/体重×100④动物神经功能缺损分级动物神经功能缺损分级方案参照Bederson[2]及爱丁堡与斯堪的那维亚研究组[3]方案修订0级正常；I级一侧肢体轻度无力，略有跛行，可以直线行进或有偏行(行进打偏半径超过1m)；II级一测肢体明显无力，头部轻度向另侧歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半径在0.5～0.75m左右；III级一侧偏瘫，站立比较困难，不能行走，但可以正卧位，有显著的歪头、口角歪斜；IV级一侧偏瘫，不能正卧，呈侧卧甚至仰卧，歪头及身体扭曲明显，或不能自主进食，神志迷蒙，或抽搐频繁(10min内2次以上)；V级昏迷或死亡。
(4)实验结果①动物一般状况及死亡数统计造模后，各组大鼠均出现不同程度的精神萎靡、行动迟缓或障碍等表现，4d内，大鼠无一死亡。
②对造模大鼠体重的影响模型组大鼠体重增长率明显低于假手术组，两者相比，有显著性差异(p＜0.01)。本发明注射液高、中、低剂量组和清开灵注射液组的大鼠体重增长率高于模型组，其中本发明注射液中剂量组体重增长率与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。见表7。
表7本发明注射液对凝血酶所脑水肿大鼠体重的影响(X+S)剂量 造模前体重造模后的体重 体重增长率分组 动物数(g/kg) (g) (g)(％)假手术组 15 - 299.00±22.30 303.00±27.101.17±2.21模型组 15 - 290.43±14.43 283.64±12.34-2.30±1.62□□清开灵组 15 3.5ml/kg 292.46±10.89 287.46±10.97-1.69±2.32本发明I组 15 8 290.71±12.39 287.93±11.33-0.89±2.59本发明II组 15 4 287.0±13.28 284.57±10.65-0.72±2.49*本发明III组15 2 289.69±12.39 286.15±12.64-1.20±2.32注与假手术组比较，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05。
③行为体征评分动物经脑内注射凝血酶造成脑水肿，出现明为的行为体征异常。造模第2d后，各给药组动物行为体征评分均低于模型组，造模后第3、4d，本发明注射液高、中、低剂量组和清开灵组行为体征评分，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。模型组大鼠行为体征评分逐日增高，造模后第4d与第1d比较，有显著性差异(p＜0.01)。本发明注射液低剂量组和清开灵组行为体征评分，造模后第4d与第1d相比，无显著性差异(p＞0.05)。提示本发明注射液对脑内注射凝血酶所造的动物行为体征异常有一定的保护作用。见表8。
表8本发明注射液对凝血酶所脑水肿大鼠大鼠神经功能的影响(X+S)剂量 行为体征评分分组 动物数(g/kg) 术后1d 术后2d术后3d术后4d假手术组 15 - - - - -模型组 15 - 1.14±0.772.21±1.123.43±0.76##3.54±0.96##清开灵组 15 3.5ml/kg1.23±0.691.84±0.692.00±0.91**2.11±0.93**本发明I组 15 8 1.07±0.621.93±0.621.93±0.83**1.67±0.92**本发明II组 15 4 0.86±0.661.93±0.921.79±0.58**1.85±0.73**本发明III组15 2 1.23±0.602.15±0.892.92±0.76 2.45±0.78*注与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；同组第4d与第1d组比较，##p＜0.01。
④对脑指数和脑组织含水量的影响大鼠经脑内注射凝血酶后，动物左右半脑重量差、脑指数和左脑组织含水率显著增高，与假手术组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，表明向脑内注射凝血酶可成功造成脑水肿模型。各给药组大鼠左右重量差、脑指数和左脑组织含水率均低于模型组，其中本发明注射液高剂量组和清开灵组动物左右半脑重量差、脑指数和脑组织含水量，与模型组比较，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。提示本发明注射液对凝血酶所致大鼠脑水肿有一定的改善作用。见表9。
表9本发明注射液对凝血酶所脑水肿大鼠左右半脑重量差、脑指数和脑组织含水量的影响(X+S)动物 左右半脑重量差 脑指数脑组织含水率组别数(g) (g/100g体重) (％)假手术组 150.0051±0.0160.430±0.016 77.48±2.13模型组 150.0479±0.017□□0.458±0.009□□79.53±2.61□清开灵组 150.0353±0.013*0.446±0.015*77.27±2.81*本发明I组 150.0308±0.012*0.445±0.008**77.03±3.09*本发明II组 150.0261±0.014**0.447±0.010**78.82±1.87本发明III组150.0429±0.0110.449±0.010*78.55±0.87注与假手术组比较，□p＜0.05，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
(5)小结①大鼠经脑内注射凝血酶后，行为体征出现明显地异常，动物左右半脑重量差、全脑指数和造模侧半脑组织含水率明显增高，表明向脑内注射凝血酶可成功造成动物脑水肿模型。
②本发明注射液能改善造模后大鼠行为体征的异常，降低左左半脑重量差、全脑指数和造模侧半脑组织含水率，表明本发明注射液对凝血酶所致大鼠脑水肿有一定的治疗作用。
3.对出血性大鼠脑血管通透性的影响试验(1)造模方法大鼠适应性喂养一周后开始造模。眼眶取血0.5ml/只，肝素抗凝；大鼠4％戊巴比妥钠按1ml/kg体重腹腔注射麻醉，剪去顶毛，固定于脑立体定位仪；常规局部消毒，切开头皮，以前囟为0点，向右旁开4mrn，向后2mm，牙科钻钻孔，用微量注射器将自体抗凝血100ml缓慢注入尾壳核区，留针3min后拔针，缝合头皮[1]。
(2)分组给药及测定方法将造模成功的大鼠随机分为6组，即①模型组，给予生理盐水10ml/kg体重；②高剂量组(本发明I组)，给予本发明注射液生药8g/kg体重；③中剂量组(本发明II组)，给予本发明注射液4g/kg体重；④低剂量组(本发明III组)，给予本发明注射液2g生药/kg体重；⑤阳性对照组，给予清开灵注射液3.5ml/kg；⑥假手术组(手术方法相同，但不注入自体抗凝血)，给予生理盐水10ml/kg体重。各组均腹腔注射给药，给药体积均为10ml/kg体重，连续给药5d。造模后1d、2d、3d、4d，分别观察大鼠行为体征的变化并进行评分。于造模后第4d、末次给药后1 h将大鼠麻醉，舌下静脉注射伊文斯兰50mg/kg，3h后处死，取脑，分开左右脑，分别称重。剪碎左脑，于70％丙酮溶液中浸泡24h，3000rpm离心15min，取上清液于625nm处比色，读取OD值。
(3)观察指标①动物一般情况及死亡数统计观察动物造模后精神状态、毛色、活动能力、体重和死亡数。按下式计算大鼠体重增长率大鼠体重增长率＝(造模后第4天体重-造模前体重)/造模前体重×100％②动物神经功能缺损分级动物神经功能缺损分级方案参照Bederson[2]及爱丁堡与斯堪的那维亚研究组[3]方案修订0级正常；I级一侧肢体轻度无力，略有跛行，可以直线行进或有偏行(行进打偏半径超过1m)；II级一测肢体明显无力，头部轻度向另侧歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半径在0.5～0.75m左右；III级一侧偏瘫，站立比较困难，不能行走，但可以正卧位，有显著的歪头、口角歪斜；IV级一侧偏瘫，不能正卧，呈侧卧甚至仰卧，歪头及身体扭曲明显，或不能自主进食，神志迷蒙，或抽搐频繁(10min内2次以上)；V级昏迷或死亡。
③脑组织含水量测定脱颈椎处死大鼠，断头，剪开头皮，以止血钳小心剥离颅骨和硬脑膜，取脑于滤纸上，吸干残血，去除小脑和嗅球，以手术刀片从正中线分左右大脑，分别称重，计算左右脑重量差。再将左右半脑分别置于事先已干燥至恒重的小玻璃瓶内，于烤箱内70℃下烘干至恒重，分别称左右半脑干重，计算左右半脑含水量。
脑干重＝恒重后的带瓶脑重-称量瓶重左脑组织含水率＝(左脑湿重-左脑干重)/左脑湿重×100％④脑指数计算脑指数＝全脑湿重(左半脑湿重+右半脑湿重)/体重×100⑤对脑组织浸出液伊文斯兰浓度的影响剪碎左脑，于70％丙酮溶液中浸泡24h，3000rpm离心15min，取上清液于625nm处比色，读取OD值，以OD值代表浸出液伊文斯兰的浓度。
实验结果①动物一般状况及死亡数统计造模后，各组大鼠均出现不同程度的精神萎靡、行动迟缓或障碍等表现。大鼠在造模后均有不同程度的死亡，造模后3d内，各给药组动物死亡率低于模型组，造模后第4d，本发明高剂量组组动物死亡率高于模型组，但与模型组比较无显著差异(p＞0.05)。见表10。
表10本发明注射液对实验性脑出血大鼠死亡率的影响剂量 大鼠死亡率(％)分组(g/kg) 术后1d 术后2d 术后3d 术后4d假手术组 - 0(0/18) 0(0/18) 0(0/18) 0(0/18)模型组 - 5.56(1/18) 22.22(4/18) 44.44(8/18) 44.44(8/18)清开灵组 3.5ml/kg 5.56(1/18) 33.33(6/18) 44.44(8/18) 44.44(8/18)本发明I组 8 5.56(1/18) 22.22(4/18) 38.89(7/18) 50(9/18)本发明II组 4 11.11(2/18) 22.22(4/18) 33.33(6/18) 44.44(8/18)本发明III组2 5.56(1/18) 38.89(7/18) 38.89(7/18) 44.44(8/18)②对造模大鼠体重的影响模型组大鼠体重增长率明显低于正常组，两者相比，有显著性差异。本发明注射液高、中、低剂量组和清开灵注射液组的大鼠体重增长率高于模型组，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。见表9。
表9本发明注射液对实验性脑出血大鼠体重的影响(X+S)剂量 造模前体重 造模后的体重 体重增长率分组 动物数(g/kg) (g) (g)(％)假手术组 18 - 306.40±26.15 315.5±29.582.92±2.3模型组 10 - 300.22±24.94 292.89±27.09 -2.45±2.24□□清开灵组 10 3.5ml/kg 280.22±19.94 279.56±18.6-0.18±2.67*本发明I组 9 8 292.67±30.4 292.67±30.24 -0.5±2.45本发明II组 10 4 311.33±8.53 309.9±37.070.42±2.11*本发明III组10 2 305.4±25.24 306.3±27.340.28±3.16*注与假手术组比较，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05。
③行为体征评分动物经脑内自身抗凝血造成实验性脑出血，出现明为的行为体征异常。造模第1d后，各给药组动物行为体征评分均低于模型组，造模后第3、4d，本发明注射液中、低剂量组和清开灵组行为体征评分，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。模型组大鼠行为体征评分造模后第4d与第1d比较，无显著性差异(p＞0.05)，表明造模动物行为体征自身改善不显著。本发明注射液低剂量组和清开灵组行为体征评分，造模后第4d与第1d相比，有显著性差异(p＜0.05)。提示本发明注射液对脑内注射凝血酶所造的动物行为体征异常有一定的改善作用。见表12。
表12本发明注射液对实验性脑出大鼠神经功能的影响(X+S)
注与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；同组第4d与第1d组比较，#p＜0.05。
④对脑指数和脑组织含水量的影响大鼠经脑内注射凝血酶后，动物左右半脑重量差、脑指数和左脑组织含水率显著增高，与假手术组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，表明向脑内注射凝血酶可成功造成脑水肿模型。各给药组大鼠左右重量差、脑指数和左脑组织含水率均低于模型组，其中本发明注射液中剂量组动物左右半脑重量差、脑指数和脑组织含水量，与模型组比较，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。各给药组动物左右半脑重量差，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。提示本发明注射液对凝血酶所致大鼠脑水肿有一定的改善作用。见表13。
表13本发明注射液对实验性脑出血大鼠左右半脑重量差、脑指数和脑组织含水量影响(X+S)动物 左右半脑重量差 脑指数 脑组织含水率组别数 (g) (g/100g体重) (％)假手术组 180.0111±0.0163 0.416±0.05 78.62±1.6模型组 100.0544±0.0204□□0.452±0.041□81.07±2.8□清开灵组 100.0305±0.0288*0.447±0.03680.06±2.27本发明I组 9 0.015±0.0081**0.442±0.03979.7±2.96本发明II组 100.0193±0.0162**0.416±0.143*78.96±3.16*本发明III组100.0277±0.021*0.438±0.14680.86±5.62注与假手术组比较，□p＜0.05，□□p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05。
⑤对脑组织浸出液伊文斯兰浓度的影响经比色法测定，模型组OD值与假手术组比较无显著性差异(p＞0.05)，表明大鼠经脑内注射自身抗凝血造成实验性脑出血后，动物脑血管通性无明显改变。本发明注射液高、中剂量脑组织浸出液OD值小于模型组，与模型组比较有显著性差异(p＜0.05)提示本发明注射液能减少脑血管的通透性。见表14。
表14本发明注射液对实验性脑出血大鼠脑组织浸出液伊文斯兰浓度的影响(X+S)剂量组别 动物数 OD值(g/kg)假手术组 18 3.5ml/kg 0.527±0.246模型组 10 - 0.576±0.214清开灵组 10 2 0.445±0.263本发明I组 9- 0.326±0.147*本发明II组 10 8 0.339±0.251*本发明III组10 4 0.504±0.308注与模型组比较，*p＜0.05。
对实验性家兔脑水肿急性期的研究(1)造模方法家兔适应性喂养一周后开始造模。眼眶取血0.5ml/只，肝素抗凝；大鼠4％戊巴比妥钠按1ml/kg体重耳缘静脉麻醉，剪去顶毛，固定于立体定位仪；常规局部消毒，切开头皮，以前囟为0点，向右旁开4mm，向后1mm，牙科钻钻孔，用微量注射器将自体抗凝血100μl缓慢注入尾壳核区，拔针，缝合头皮[6]。
(2)分组给药将造模成功的家兔随机分为6组，即①模型组，给予生理盐水1.5ml/kg体重；②高剂量组(本发明I组)，给予本发明注射液3.0g生药/kg体重；③中剂量组(本发明II组)，给予本发明注射液1.5g/kg体重；④低剂量组(本发明III组)，给予本发明注射液0.75g生药/kg体重；⑤阳性对照组，给予清开灵注射液2.0ml/kg⑥溶媒组给予本发明溶媒1.5ml/kg体重。另设假手术组(手术操作同模型组，但不注入血凝块)，给予生理盐水1.5ml/kg体重，共7组。各组均耳缘静脉注射给药，除⑤组外，其余各组给药体积均为1.5ml/kg体重。
(3)观测指标及方法①动物一般情况及死亡数统计观察动物造模后精神状态、毛色、活动能力、体重和死亡数。
②动物神经功能缺损分级动物神经功能缺损分级方案参照Bederson[2]及爱丁堡与斯堪的那维亚研究组[3]方案修订0级正常；I级一侧肢体轻度无力，略有跛行，可以直线行进或有偏行(行进打偏半径超过1m)；II级一测肢体明显无力，头部轻度向另侧歪斜，跛行，不能向正前方直行，偏行半径在0.5～0.75m左右；III级一侧偏瘫，站立比较困难，不能行走，但可以正卧位，有显著的歪头、口角歪斜；IV级一侧偏瘫，不能正卧，呈侧卧甚至仰卧，歪头及身体扭曲明显，或不能自主进食，神志迷蒙，或抽搐频繁(10min内2次以上)；V级昏迷或死亡。
③脑组织含水量测定处死家兔，断头，剪开头皮，以止血钳小心剥离颅骨和硬脑膜，取脑于滤纸上，吸干残血，去除小脑和嗅球，以手术刀片从正中线分左右大脑，分别称重，计算左右脑重量差。再将左右半脑分别置于事先已干燥至恒重的小玻璃内，于烤箱内70□下烘干至恒重，分别称左右半脑干重，计算左半脑含水量。
脑干重＝恒重后的带瓶脑重-称量瓶重左脑组织含水率＝(左脑湿重-左脑干重)/左脑湿重×100％④脑指数计算脑指数＝全脑湿重(左半脑湿重+右半脑湿重)/体重×1000⑤凝血时间的测定以4号注射针头家兔耳缘动脉放血，滴于载玻片上，以针尖轻挑血滴，每隔15s1次，直至出现丝状物为止，记录出现丝状物时间。
⑤对血液流变学的影响家兔颈动脉放血于抗凝管内，每支5ml。于自清洗施转式粘度计上测定全血粘度和血浆粘度。
(4)实验结果①动物一般状况及死亡数统计造模后，各组家兔均出现不同程度的精神萎靡、行动迟缓或障碍等表现。各组家兔在造模后均有不同程度的死亡，各给药组动物死亡率低于模型组，但给药组动物死亡率与模型组相比，无显著性差异(p＞0.05)。见表15。
表15本发明注射液对实验性脑水肿家兔死亡率的影响剂量家兔死亡率(％)分组(g/kg)术后1d术后2d 术后3d 术后4d 术后5d假手术组 - 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12模型组- 2/12(16.67)5/12(41.67) 5/12(41.67)5/12(41.67)5/12(41.67)清开灵组 2ml/kg1/12(8.33) 3/12(25) 3/12(25) 3/12(25) 3/12(25)本发明I组 3 2/12(16.67)3/12(25) 3/12(25) 3/12(25) 3/12(25)本发明II组1.5 2/12(16.67)2/12(16.67) 2/12(16.67)2/12(16.67)2/12(16.67)本发明III组 0.75 3/12(25) 4/12(33.33) 4/12(33.33)4/12(33.33)4/12(33.33)②神经功能缺损评分家兔经脑内注射自身血凝后，均出现较为明显的行为体征异常。造模后第1d，模型组与4个给药组比较，家兔神经功能缺损分级无显著性差异(p＞0.05)，造模第2d后，各给药组动物行为体征评分均低于模型组，本发明注射液高、中剂量组行为体征评分与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。清开灵组在造模第3d后，行为体征评分与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。造模后第4d，模型组动物行为体征评分与自身第1d比较，无显著性差异(p＞0.05)，表明动物自身恢复不显著；本发明注射液中剂量组动物行为体征评分造模后第4d与第1d比较，有显著性差异。提示本发明注射液对实验性脑出血家兔的行为体征异常有一定的改善作用。见表16。
表16本发明注射液对实验性脑水肿家兔神经功能的影响(X+S)
注与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；同组第4d与第1d组比较，#p＜0.05。
③对脑指数和脑组织含水量的影响家兔经脑内注射自身血凝块后，脑指数和左脑组织含水率均增大，与假手术组相比，有显著性差异(p＜0.05)，表明动物脑内注射自身血凝块后已造成了脑水肿。各给药组动物左右脑重量差均小于模型组，与组相比，有显著性差异(p＜0.05)，本发明注射液中、低剂量组和清开灵组动物的脑指数与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)。提示本发明注射液有减轻实验性脑出血家兔脑水肿作用。见表17。
表17本发明注射液对实验性脑水肿家兔脑指数和脑组织含水量影响(X+S)剂量 全脑指数左脑-右脑 左脑含水率组别 动物数(g/kg)(g/1000g)(g)(％)假手术组 12 - 2.76±0.23□0.13±0.12□75.37±2.37□模型组 7 - 3.05±0.260.85±0.29 80.65±3.37清开灵组 9 0.752.90±0.11*0.54±0.26*77.77±2.88本发明I组 9 - 2.93±0.230.76±0.33*77.39±2.75本发明II组 10 3 2.92±0.21*0.45±0.21*76.36±2.13本发明III组9 1.5 2.93±0.19*0.76±0.39*77.40±2.39注与假手术组比较，□p＜0.05；与模型组比较，*p＜0.05。
④对家兔凝血时间的影响模型组凝血时间与假手术组相比，无显著性差异(p＞0.05)，表明造模对家兔凝血时间无显著性影响。本发明注射液各剂量组家兔凝血时间均短于模型组，与模型组相比，有显著性差异(p＜0.01)。见表18。
表18本发明注射液对实验性脑水肿家兔对家兔凝血时间的影响(X+S)剂量 凝血时间组别 动物数(g/kg) (s)假手术组 12- 118.1±36.
模型组 7 - 125.5±44.4清开灵组 9 2ml/kg27.3±20.6**本发明I组 9 3 32.4±22.6**本发明II组 101.5 17.5±12.2**本发明III组9 0.75 36.5±19.5**注与模型组比较，**p＜0.01。
⑤对家兔血液流变学的影响模型组血液流变学各项指标与假手术组相比，均无显著性差异(p＞0.05)，表明造模对动物血液流变学无显著性影响。本发明注射液I组和II组全血粘度高切和低切均低于模型组，其中中切粘度与模型组相比，有显著性差异(p＜0.05)；本发明注射液各给药组血浆粘度均低于模型组，但与模型组相比，无显著性差异(p＞0.05)。实验结果表明，本发明注射液对造模动物的血液流变学有一定的改善作用。见表19。
表19本发明注射液对实验性脑水肿家兔血液流变学的影响(X+S)
注与模型组比较，**p＜0.05。
(5)小结①通过向家兔脑内植入自身血凝块可造成家免较为明显的行为体征异常，脑指数和造模侧脑组织含水量显著性增高，表明动物脑内植入自身血凝块可成功复制动物脑水肿模型。
②本发明注射液可改善造模家兔行为体征异常，减轻脑指数和造模侧脑组织含水量，表明本发明注射液对自身血凝块所致家兔脑水肿有一定的治疗作用。
对小鼠耳廓微循环的影响(1)方法及分组给药取ICR小鼠60只，雌雄各半，体重20-22g，随机分为5组。即①空白对照组溶媒10ml/kg；②清开灵组原液7ml/kg；③本发明低剂量组3.5g/kg；④本发明中剂量组7g/kg；⑤本发明高剂量组14g/kg。小鼠腹腔注射25％乌来糖2.5g/kg麻醉。
动物观测指标及方法待小鼠麻醉后按10ml/kg静脉注射各组药物，并立即按方法[7]和文献[8]将小鼠固定在观察台上(耳托上和耳廓表面滴加少许香柏油)(整个操作过程在2min内完成)，用显微系统观察小鼠耳廓微循环，同时腹腔注射盐酸肾上腺素注射液1mg/kg，记录注射肾上腺素前和注射后5、10、20、30min小鼠微循环细静脉、细动脉的管径和血流速度。
实验结果实验结果显示本发明注射液低、中、高三个剂量组对血流速度无明显影响，但均能对抗肾上腺素引起的微血管收缩，扩张小鼠微血管细静脉和细动脉，与空白对照组比较差异显著(p＜0.05或p＜0.01)，且呈剂量依赖性。表明本发明具有改善微循环的作用。结果见表20、21、22。
表20本发明注射液对小鼠耳廓微循环血流速度的影响(X+S)(n＝12)剂量正常值注射肾上腺素后增加百分率(％)组别(g/kg) (μm/s)5min10min20min30min空白对照组- 103.8±9.51.4±7.1 0.7±5.71.1±10.80.1±6.9清开灵组 7ml/kg104.4±10.6 0.6±7.8 2.3±7.9-1.0±8.5-0.4±10.2本发明I组 3.5 102.0±9.3-1.1±4.32.5±9.21.1±9.2 -1.6±8.1本发明II组7 101.3±7.61.2±4.3 1.0±5.6-0.2±7.34.5±8.0本发明III组 14102.9±4.62.5±8.1 3.6±8.31.0±3.6 -0.8±6.1
表21本发明注射液对小鼠耳廓微静脉管径的影响(X+S)(n＝12)剂量正常值注射肾上腺素后增加百分率(％)组别(g/kg)(μm) 5min 10min 20min 30min空白对照组- 11.4±1.2-27.7±10.3-33.6±9.2 -19.0±7.4 -1.5±7.2清开灵组 7ml/kg11.6±1.3-30.9±14.9-19.3±14.4**-4.8±12.1**11.2±8.3**本发明I组 3.5 11.6±0.9-23.4±7.9 -20.3±6.6**-9.4±9**8.3±11.1*本发明II组7 11.3±1.2-23.1±15.7-13.2±23.5*2.5±19.2**15.6±21*本发明III组 1411.4±1.2-27.2±13.3-21.6±14.7*-1.8±19.6**3.6±21.6注与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
表22本发明注射液对小鼠耳廓微动脉管径的影响(X+S)(n＝12)剂量正常 注射肾上腺素后增加百分率(％)组别(g/kg) (μm/s)5min10min20min 30min空白对照组- 9.2±1 -21.4±7.6 -24.8±8.6 -18.3±12.1 -5.3±7.8清开灵组 7ml/kg9.5±1.1-17.4±10.7 -11.2±11.9**2.9±13.1**12.6±15.8**本发明I组 3.5 9.7±1.1-19.9±11.3 -15.5±14.4 -3.6±13.4**3.4±11.7*本发明II组7 8.8±1.4-14±14.4 -9.4±14.8**4.5±18.5**18.1±30*本发明III组 149.8±1 -11.5±7.2**-2.4±18.9**16.2±15.3**22.7±17.6**注与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
结论1.采用向大鼠脑内尾壳核区注入自体抗凝血的方法制造大鼠脑出血模型，实验结果表明此方法能造成动物明显的行为体征异常和脑水肿。本发明注射液能改善实验性脑出血动物的行为体征异常，降低造模侧半脑的含水率和全脑指数，降低造模后动物的死亡率。病理组织学检查结果表明大鼠脑出血动物模型脑部病变表现为脑白质部分区域疏松淡染，其间可见大小不等的空网状结构，部分区域胶质细胞增生，胞浆噬有脂体、呈空泡状，个别动物脑组织内出现小脓肿。灰质部神经细胞基本未见胞体肿胀、胞核固缩、坏死等病理改变。经药物治疗后，各组病变程度如下模型组病变较重，中剂量组、阳性组病变较轻，假手术组未见明显的组织病理学改变。提示本发明注射液对实验性脑出血大鼠有一定的治疗作用。
2.采用向大鼠脑内尾壳核区注入凝血酶的方法制造大鼠脑水肿模型，实验结果显示大鼠经脑内注射凝血酶后，行为体征出现明显地异常，动物左右半脑重量差、全脑指数和造模侧半脑组织含水率明显增高，表明向脑内注射凝血酶可成功造成动物脑水肿模型。本发明注射液能改善造模后大鼠行为体征的异常，降低左半脑重量差、全脑指数和造模侧半脑组织含水率，表明本发明注射液对凝血酶所致大鼠脑水肿有一定的治疗作用。
3.采用向大鼠脑内尾壳核区注入自体抗凝血的方法制造大鼠脑出血模型，舌下静脉注射伊文斯兰，再通过比色测定造模大鼠脑组织浸出液中伊文斯兰的含量，观察本发明注射液对造模动物脑血管通透性的影响。实验结果显示，模型组脑组织浸出液OD值与假手术组无显著性差异，表明大鼠经脑内注射自身抗凝血造成实验性脑出血后，动物脑血管通性无明显改变。本发明注射液高、中剂量脑组织浸出液OD值小于模型组，提示本发明注射液能减少脑血管的通透性。
4.通过向家兔脑内植入自身血凝块方法造成家兔脑出血模型。实验结果显示此方法可造成家免较为明显的行为体征异常，脑指数和造模侧脑组织含水量显著性增高，表明动物脑内植入自身血凝块可成功复制动物脑水肿模型。本发明注射液可改善造模家兔行为体征异常，降低脑指数和造模侧脑组织含水量，表明本发明注射液对自身血凝块所致家兔脑水肿有一定的治疗作用。
5.对小鼠耳廓微循环的影响试验结果表明，本发明注射液低、中、高三个剂量组对血流速度无明显影响，但均能对抗肾上腺素引起的微血管收缩，扩张小鼠微血管细静脉和细动脉，与空白对照组比较差异显著(p＜0.05或p＜0.01)，且呈剂量依赖性。表明本发明具有改善微循环的作用。
综上所述，本发明注射液能降低急性出血性中风动物死亡率，改善行为体征，减轻脑水肿，降低脑组织含水率，改善微循环，提示本发明注射液对出血性中风有一定的治疗作用。根据中医理论研制的本发明注射液具有高效、速效的特点，能满足抢救病人的需要，对提高中医药救治急难重症的能力、降低病死率和致残率有重要的应用价值。
具体实施例方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1，一种治疗出血性脑中风的药物，它是由以下重量配比的原料制成的大黄160栀子200牡丹皮100其生产方法是取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，加入药用辅料，制成颗粒剂。
实施例2，上述的实施例中，其原料重量配比也可为大黄200栀子160牡丹皮150其生产方法是取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH 7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌封，灭菌，检查，包装，即得注射液；实施例3，本发明药物的最佳重量(份)配比是大黄187.5栀子187.5牡丹皮125其生产方法是取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加100～500g甘露醇，0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH 7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌装，经冻干工序制成冻干粉针剂。
用法与用量静脉滴注。每日2次，每次4支，临用前，用10％葡萄糖注射液(糖尿病患者改用生理盐水)500ml稀释。用法与用量静脉滴注。每日2次，每次4支，临用前，用10％葡萄糖注射液(糖尿病患者改用生理盐水)500ml稀释。
规格10ml/支，每支含生药5g。
权利要求
1.一种治疗出血性脑中风的药物，其特征在于它是由以下重量配比的原料制成的大黄 160～200栀子 160～200牡丹皮 100～150
2.根据权利要求1所述的治疗出血性脑中风的药物，其特征在于它是由以下重量配比的原料制成的大黄 187.5栀子 187.5牡丹皮 125
3.根据权利要求1或2所述的治疗出血性脑中风的药物，其特征在于所述的药物剂型为药剂学所述的任何剂型。
4.根据权利要求3所述的治疗出血性脑中风的药物，其特征在于所述的药物剂型的制备方法为取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，加入药用辅料，制成临床可接受的剂型。
5.根据权利要求3所述的治疗出血性脑中风的药物，其特征在于所述的药物剂型为注射剂。
6.权利要求5所述的治疗出血性脑中风的药物的制备方法为取牡丹皮，通5％氯化钠溶液水蒸气蒸馏，重蒸馏，初蒸馏液与重蒸馏液合并，放置析出结晶，重结晶得到丹皮酚针晶，加浓硫酸和发烟硫酸(5∶4)至磺化完全，制成丹皮酚磺酸钠。剩余的牡丹皮药渣及残留液，与大黄、栀子一起，加水煎煮3次，滤过，水煎液浓缩，加乙醇使沉淀，滤取上清液，回收溶媒至无醇味，加1～5倍水稀释，调pH值为7.5～8，滤过，滤液调pH值为3，用水饱和的正丁醇逆流萃取，收集正丁醇液，回收溶媒至无醇味，干燥得到干浸膏，取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH 7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌封，灭菌，检查，包装，即得注射液；或取丹皮酚磺酸钠和干浸膏，用100～200ml丙二醇溶解后，缓缓加入400～700ml水中，搅拌、加热溶解，加100～500g甘露醇，0.8～1.2g亚硫酸钠、0.3～0.8g乙二胺四乙酸二钠，调节pH 7.5～8，滤过，滤液通过活性炭脱色，再加水稀释至1000ml，使每ml含生药量0.5g，滤过，灌装，经冻干工序制成冻干粉针剂。
全文摘要
一种治疗出血性脑中风的药物，它是由大黄、栀子、牡丹皮等原料制成的。本发明从中西医理论或临床研究均角度证实，出血性中风应从血论治，此外，出血性中风急性期常出现发热，部分患者虽无体温增高，但有明显的热证表现，如口苦、咽干、烦躁，甚至谵妄、夜不安、大便秘结等而呈阳明腑实之证象。本发明之处方依据上述理论而立法，采用凉血止血、活血化淤、泻下通腑之药为主，辅以清热泻火、行血破瘀之品，用于治疗出血性中风急性期的瘀热阻窍证。
文档编号A61P9/10GK1565531SQ03132119
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月25日 优先权日2003年6月25日
发明者蔡宝昌, 肖伟, 戴翔翎, 金妙文, 凌娅, 潘扬, 王天山, 杨光明, 燕珂 申请人:江苏康缘药业股份有限公司
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