一种防治老年痴呆的中药有效部位组合物及其制备方法
专利名称：一种防治老年痴呆的中药有效部位组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种防治老年痴呆的中药复方有效部位及其制备方法，具体说是从当归芍药散精简方及其组方药物中提取分离的防治老年痴呆的有效部位组合物，及其可工业化应用的提取分离方法。
背景技术：
当归芍药散(Danggui Shaoyao San)，记载于汉·张仲景《金匮要略》。其组成为当归3g、白芍16g、川芎8g、茯苓4g、白术4g和泽泻8g。当归芍药散的功效为养血疏肝，健脾利湿。临床主治气郁血虚型老年性痴呆，症见呆滞如愚，健忘，精神恍惚，语言错乱，情绪抑郁或胸闷急躁，频频叹息，悲伤欲哭，虚烦不眠，食少倦怠，腹胀便溏，舌质淡，脉弦细。现代医学研究表明，老年期痴呆主要为阿尔采末病(Alzheimer’s disease，简称AD)与血管性痴呆(vascular dementia，简称VD)两大类型。当归芍药散对AD与VD均有一定的疗效。
本发明人已利用现代药理实验手段，对治疗老年期痴呆具有一定疗效的古方当归芍药散进行拆方，即分别研究组成当归芍药散方剂的六味原料药，再进行优选组合，得到一种防治老年痴呆的中药组合物，其特征在于由茯苓、白术、当归三味原料药组成，其原料药比例为茯苓2-6份∶白术1-3份∶当归0.5-1.5份；其原料药优选的比例为茯苓4份∶白术2份∶当归1份。(参见CN02112711.5，一种防治老年痴呆的中药组合物)比较实验证实，由六味药材组成的古方当归芍药散在防治老年期痴呆病症方面可以精简为三味，精简方简称FBD。精简方FBD对VD的防治效果，明显优于原方(简称DSS)。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是为患VD的老年痴呆病人，研究更具备针对性的治疗药物，以便更加准确地对症治疗，从而提高对老年期痴呆的治疗效果。而且，也为即将步入老年期的中年人预防或减少老年痴呆的发病率提供良好预防用药。
因为无论预防老年痴呆的发病或治疗已发病的老年痴呆患者，都需要长期服药，所以在保证疗效的基础上，应尽量减少用药剂量，改进药物剂型，降低药品成本及价格。
为了进一步保证疗效的稳定、减少用药剂量、改进药物剂型，就需要对精简方FBD及其组成药材进行分析，提取分离具有疗效的有效部位，并设计合理的提取分离工艺。对精简方FBD及其组成药材有效部位的提取分离，是对精简方FBD从化学本质上了解其治疗机理的初步，也是制定准确质量标准的基础。
为了解决这一技术问题，本发明利用现代药理实验手段，对治疗老年期痴呆具有一定疗效的古方当归芍药散精简方FBD及其方中药材，进行多种配伍后，研究有药理作用的化学成分的类型，即分别研究组成当归芍药散精简方的3味药材的有效部位，再进行优选组合，得到如下技术方案。
一种防治老年痴呆的中药组合物，其特征在于主要由茯苓、白术和当归组成的原料药中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成，或者主要由选自茯苓、白术和当归中的一种或两种原料药中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成。
所述中药组合物，其特征在于主要由茯苓或白术或当归，或茯苓和白术，或者茯苓和当归，或者白术和当归，或者茯苓、白术和当归中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成。
所述中药组合物可以是主要由茯苓2-6份∶白术1-3份∶当归0.5-1.5份中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油组成，多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1～1.5克∶5～10克∶0.4～1.2毫升。
所述中药组合物较好的配比是主要由茯苓4份∶白术2份∶当归1份中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油组成，多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1.1～1.2克∶7～8克∶0.6～0.8毫升。
前述中药组合物制备方法如下取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，CO2超临界萃取提取挥发油，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到多糖，合并挥发油与多糖；或者，取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，CO2超临界萃取提取挥发油，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油、多糖及正丁醇提取物；或者，取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物。
所述中药组合物制备方法具体为取茯苓或白术或当归，或者取茯苓和白术，或者取白术和当归，或者取茯苓和当归，或者取茯苓、白术和当归；CO2超临界萃取罐压力8.0-25.0Mpa，夹带剂用乙醇、乙酸乙酯和/或己烷，夹带剂量按体积/重量比是药料量的30.0-150％；加乙醇至含醇浓度为45-95％时沉淀多糖。所述中药组合物制备方法中取茯苓2-6份∶白术1-3份∶当归0.5-1.5份，所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1～1.5克∶5～10克∶0.4～1.2毫升。
前述中药组合物制备方法中，其特征在于所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1.1～1.2克∶7～8克∶0.6～0.8毫升。所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油，可与药学上适用组分混合，制成各种制剂。所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油，可与药学上适用载体混合，制成各种制剂。
常用口服制剂辅料可选用，崩解剂如羟丙基淀粉、羟丙纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；填充剂如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精、微粉纤维素等；润湿剂和粘合剂如乙醇、预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素；润滑剂如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇4000和6000；润湿剂如十二烷基硫酸钠、吐温80。
为叙述方便，将本发明的技术方案茯苓、白术、当归组成的中药组合物简称为FBD。茯苓简称F、白术简称B、当归简称D。
在两种不同类型VD模型上，进行了FBD组方分析。2项实验结果证明，FBD组方全方作用优于其他组合；FD与FB作用优于BD；F、B、D均有各自作用，F为FBD中主药。脑脊液(CSF)药理学研究也发现，10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均可提高二亚硫酸钠与谷氨酸钠损伤PCCN细胞活力；其中，CSF-FBD与CSF-FB对2种细胞损伤均有保护作用；F、B、D单用时，CSF-F抗缺氧作用最为显著，而CSF-D抗缺血作用最强；三者两两合用，作用基本未见增强。
下述三味药材分别或两两组合的药理实验是用其水煎液作的，并未分离其三类有效部位，但是如果按本发明工艺进行实验，同样能分到三类有效部位。
一、当归芍药散精简方防治血管性痴呆的组方分析(一)当归芍药散精简方抗持久性双侧颈总动脉结扎与脑反复缺血再灌注致小鼠血管性痴呆的组方分析1实验材料1.1FBD水提液的制备FBD依据制剂与组方不同分为8个组合FBD、F+B+D(F、B、D分煎合并)、FB、FD、BD、F、B与Z。取8组合用药适量，例行冷浸提取，制备浓度分别为4.60、4.60、3.84、3.32、2.04、2.56、1.28、0.76g生药/100ml的FBD、F+B+D、FB、FD、BD、F、B、Z水提液，4℃下保存备用。1.2动物雄性昆明小鼠，25±2g；37±3g均由中国药科大学新中新药研究中心提供。1.3仪器被动回避反射仪由中国中医研究院中药研究所研制；SMG-2型水迷宫程序自动控制仪由中国医学科学院药物研究所研制，行为学实验1.0软件进行数据采集。Z323K冷冻高速离心机，德国Hermle labor tecknik；DU640核酸蛋白分析仪，美国Beckman coulter；XHF-1高速分散器，上海金达生化仪器厂；电热恒温水浴锅，江苏省医疗器械厂。1.4试剂蛋白质定量试剂盒(批号20010315)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(批号20010315)购自南京建成生物工程研究所。1.5统计分析使用NDST4.4软件进行统计，数据用x±s表示。计时资料用调和均数法将数据对数转换后行组间t或t’检验，计量资料行组间t或t’检验。2方法与结果2.1持久性双侧颈总动脉结扎致小鼠VD方法学建立，参见刘汇波等.双侧颈总动脉结扎对大鼠学习记忆功能和海马组织形态学的影响.基础医学与临床，1998，18(4)54-57；范文辉等，血管性痴呆的动物模型及其胆碱能机制研究.第三军医大学学报，2000，22(4)314-317取雄性昆明种小鼠20只，体重25±2g，随机分为假手术组与模型组，术前禁食10h，ip1g/kg20％乌拉坦麻醉，75％医用酒精消毒颈部，仰卧位固定，颈中开口约2cm，钝性分离出两侧颈总动脉，不剥离迷走神经，双重丝线结扎，创口处点滴庆大霉素2.5×104u/kg2-3滴，缝合创口；假手术组仅显露两侧颈总动脉，其它处理同模型组。
术后模型小鼠10h内苏醒，但食量饮水减少，皮毛蓬松，体重下降；因血管结扎引起颅内压或眼内压升高，两眼外突，眼睑粘连或抬起无力。
术后10d，开始用水迷宫程序自动控制仪连续4d检测小鼠空间分辩能力，水温控制在27.5-28℃，盲端(blind termination，bt)数从1-4bt逐日增加，记录小鼠游泳时间，以游泳时间评价小鼠空间分辩能力。
实验表明模型小鼠在水迷宫内完成任务的游泳时间较假手术小鼠显著延长(p＜0.05-0.01)，提示模型小鼠持续存在空间分辩能力障碍，且随任务难度增加差异日益显著；但模型小鼠的运动机能与平衡机能未出现异常，符合VD临床表现，模型制备成功。2.2FBD抗持久性双侧颈总动脉结扎(PBCAO)致小鼠记忆障碍组方分析筛取合格小鼠100只，随机分为10组假手术组、模型组、FBD组、F+B+D组、FB组、FD组、BD组、F组、B组、D组。d1对小鼠进行PBCAO手术，d2-d6连续ig相应8种水提液，bid×5d，给药量0.5ml/20g体重。d6用被动回避反射仪对小鼠进行避暗训练，d7同一时间检测小鼠避暗潜伏期与5min内错误次数；d7-9每天上午用水迷宫对小鼠逐日进行1-3bt游泳训练，每天下午记录小鼠游泳时间，游泳时间阈值设定1bt30s；1bt60s；3bt90s。
表1、FBD抗持久性双侧颈总动脉结扎与脑反复缺血再灌注致小鼠血管性痴呆的组方分析(x±s)组别剂量(g/kg/d)n Latency(Logs)No.of errors假手术组11 2.26±0.39 1.0±1.2模型组 7 1.50±0.36ΔΔ3.1±2.0ΔFBD 2.30 11 2.17±0.51**0.7±1.2**F+B+D 2.30 7 2.10±0.39*0.7±0.8*FB1.92 7 1.84±0.66 1.6±1.7FD1.66 9 2.11±0.56*0.7±0.7**BD1.02 9 1.25±0.26 1.9±0.8F 1.28 7 2.11±0.53*0.4±0.5*B 0.64 8 2.37±0.29**0.3±0.5**D 0.38 8 1.88±0.59 0.9±1.0*Δp＜0.05，ΔΔp＜0.01vs假手术组；*p＜0.05，**p＜0.01vs模型组stimulate parameters125ms，38V.PP小鼠PBCAO手术后1w，避暗任务中潜伏期显著长于正常小鼠，错误次数显著增多(p＜0.05-0.01)，提示PBCAO对小鼠记忆获得能力造成损伤；FBD的8种不同组合与制剂水提液均可不同程度延长模型小鼠潜伏期和/或减少错误次数，其中以FBD、F+B+D、FD、F、B、D水提液作用显著(p＜0.05-0.01)。结果见表1。
表2、FBD及各组份对水迷宫游泳任务中模型小鼠游泳时间的影响(x±s，n＝7-9)Swimming time(Logs)组别 剂量(g/kg/d) n1bt2bt 3bt假手术组 70.99±0.18 1.17±0.151.21±0.31模型组71.19±0.18Δ1.31±0.301.65±0.23ΔFBD 2.30 81.04±0.20 1.37±0.171.39±0.22*F+B+D2.30 71.24±0.24 1.43±0.311.76±0.29FB 1.92 71.34±0.14 1.62±0.201.49±0.45FD 1.66 81.22±0.23 1.42±0.231.73±0.30BD 1.02 91.24±0.22 1.43±0.221.49±0.18F1.28 71.33±0.22 1.55±0.331.22±0.43*B0.64 81.02±0.26 1.27±0.201.64±0.33D0.38 71.22±0.18 1.32±0.231.72±0.39Δp＜0.05vs假手术组；*p＜0.05vs模型组；water temperature25-26℃由表2可见，水迷宫游泳任务中模型小鼠游泳时间显著长于假手术组(p＜0.05)，提示PBCAO造成小鼠空间分辩能力障碍；随水迷宫任务难度增大，F组与FBD组小鼠游泳时间较模型组显著缩短(p＜0.05)，表明F与FBD水提液可对抗PBCAO致小鼠空间分辩能力障碍；其它6种FBD组方或制剂作用不明确或有一定改善趋势。2.3FBD抗脑反复缺血再灌注致小鼠记忆障碍组方分析用水迷宫淘汰不合格小鼠，合格小鼠100只分为10组假手术组、模型组、FBD组、F+B+D组、FB组、FD组、BD组、F组、B组、D组，每组9-12只小鼠。手术前5d，ig相应8种水提液，bid×5d，给药量0.5ml/20g体重。手术前禁食不禁水10h，对小鼠例行15minI-15minR-15minI缺血再灌注手术，但手术不伴有失血与高温条件，以进一步提高实验平行性。
手术后2d继续ig相应各水提液，bid×5d。d4对小鼠进行避暗训练，d5检测小鼠潜伏期与5min内错误次数；d6处死小鼠取脑组织测定MDA含量，以MDA作为氧化损伤的神经生化指标。
表3、FBD及其各组份对小鼠经脑缺血再灌注损伤后执行避暗任务潜伏期与错误次的影响(step-through)(x±s)组别剂量n Latency(Logs) 错误次数(g/kg/d)假手术组7 1.99±0.39 0.7±0.8模型组 6 1.56±0.56ΔΔ2.5±1.4ΔFBD 2.306 1.99±0.51 0.8±1.2*F+B+D 2.305 2.14±0.26 0.6±0.5*FB 1.9210 2.13±0.39*0.5±0.8**FD 1.666 2.32±0.01*0.0±0.0**BD 1.025 1.89±0.51 1.0±1.0F 1.287 2.28±0.13*0.1±0.4**B 0.648 2.23±0.23*0.4±0.7**D 0.386 2.32±0.01*0.2±0.4Δp＜0.05vs假手术组；*p＜0.05，**p＜0.01vs模型组；stimulate parameters125ms，38V.PP手术后小鼠平均10h内苏醒，但食量饮水减少，体重下降，活动较为正常，有少数小鼠出现死亡，平均2-3只/组；给药后一般情况有所改善。
表3显示，小鼠经脑缺血再灌注损伤后执行避暗任务潜伏期长于假手术组，错误次数显著多于假手术组(p＜0.05)，提示小鼠出现记忆获得能力障碍；F、B与D各自单用均可显著延长小鼠避暗潜伏期，减少错误次数(p＜0.05-0.01)，具有改善小鼠记忆获得能力障碍作用；F、B与D两两合用时，FB与FD也有明显改善作用；三药合用后对记忆获得能力障碍虽有明显改善作用，但作用未显示出协同增效效应，且三药共煎与分煎合并作用无显著差异(p＞0.05)。
实验显示，小鼠经脑缺血再灌注损伤后，大脑皮质组织MDA含量由10.71±5.13nmol/mg升高到14.22±2.94nmol/mg，表明氧化损伤可能参与了记忆损伤；对MDA含量的异常升高，FBD与FB水提液有显著抑制作用(p＜0.05)；其它6种FBD组方水提物对MDA异常升高有一定的抑制趋势或作用不确定。
结论考察8种FBD组方或制剂水提液对小鼠PBCAO手术后记忆获得能力障碍与空间分辨能力障碍改善作用，可发现全方FBD合煎液优于F+B+D分煎合并液；全方FBD优于F、B、D两两伍用与单用，有配伍优势；F、B与D两两合用时，发现FD作用优于FB与BD，且作用优于F与D单用；比较F、B、D单用作用，F作用优于B与D，可能为FBD主药。
考察8种FBD组方或制剂水提液对小鼠脑反复缺血再灌注后记忆获得能力障碍改善作用与抗氧化作用，可发现全方FBD合煎液优于F+B+D分煎合并液；全方FBD抗氧化作用优于F、B、D两两合用与单用，有一定的配伍优势。F、B与D两两合用时，发现BD作用差于FB与FD；比较F、B、D单用作用，F作用优于B与D，可能为FBD主药。
本研究在两种不同类型VD模型上，进行了DSS精简方FBD组方分析。2项实验结果证明，FBD组方全方作用优于其他组合；FD与FB作用优于BD；F、B、D均有各自作用，F为FBD中主药。
(二)当归芍药散精简方防治血管性痴呆的离体水平实验组方分析FBD在整体水平防治2种小鼠VD的组方分析显示三药合用时，合煎水提液作用优于分煎合并液；两药合用时，FB与FD作用优于BD；单用时，F、B、D各自均有作用，且以F作用突出。
缺血/缺氧(ischemia/anoxia)、兴奋性氨基酸(excitatory amino acid，EAA)等可损伤记忆相关脑区大脑皮质与海马结构与功能，在VD发病机理中起重要作用。为验证与深入说明FBD防治VD整体水平的组方分析，本研究初步应用2种细胞缺氧/缺血模型，进行了FBD在细胞水平防治2种细胞损伤模型的组方分析。1实验材料1.1FBD7种含药脑脊液制备当归、炒白芍、白茯苓、炒白术、川芎、炒泽泻均购自南京市药材公司。经鉴定原植物分别为Angelica sinensis(Oliv.)Diels.、Paeonia lactiflora Pall.、Poria cocos(Schw)Wolf、Atractylodesmacrocephala Koidz.、Ligusticum chuanxiong Holt.、Alisma orientale(Sam.)Juzep.。FBD各药用量按比例当归∶茯苓∶白术＝3∶10∶5。双蒸水浸软药材1h，适量水微沸20min，倾取粗水提液，重复6次，合并6次均匀间隔FBD、FB、FD、BD、F、B、D粗水提液，2400rcf×5min离心，合并上清液，4℃储存备用。
2kg体重大耳白兔，分别ig 0.78，0.64，0.55，0.34，0.43，0.22，0.13g/kg FBD、FB、FD、BD、F、B、D水提液，给药量10ml/kg。1h后，ip 20％乌拉坦5ml/kg麻醉，剪去脑后兔毛，70％医用酒精或0.1％新洁尔灭消毒皮肤，用1ml无菌注射器，从头与后颈相连处穿刺，注意应尽量使兔弯低头部，以便针头由枕骨大孔(Foramen occipitale magnum)进入小脑延髓池，针头穿过皮肤后轻轻后抽活塞以制造注射器内负压，然后缓慢深入，一旦针头进入延髓池，600-800μl脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)将涌入针管，迅速抽出针头，随后ip10ml/只生理盐水促兔复苏，6000rcf×10min离心7种含药CSF(CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D)脱细胞，-20℃下冷冻备用。1.2试剂与药品均为市购。统计分析使用NDST4.4软件进行统计，数据用x±s表示，比较组间差异行t或t’检验。2方法与结果2.1原代乳鼠皮层细胞(primary cerebral cortex neurons，PCCN)培养取出生1-4d SD大鼠大脑皮层，用D-Hanks液洗涤2-3次，剪碎后用0.125％胰酶在37℃下消化15min，1000rpm离心7-10min，弃上清，用Hanks液清洗后，过100μm孔径金属网，再离心，用高糖DMEM培养液反复吹打，使细胞密度为1-10×105/ml，接种于涂有多聚赖氨酸的96孔培养板上，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，5-7d后加入10μmol/L阿糖胞苷作用2-3d，以抑制非神经元的过度增殖。2.2MTT比色分析在含100μl/孔培养液的96孔细胞培养板中，加入终浓度0.5mg/mlMTT溶液10μl/孔继续培养4h后，小心吸取上清90μl，再加入50μl DMSO，微型振荡器上振荡5min，ELISA仪测定光吸收值，波长490nm。MTT比色分析的原理是利用活细胞线粒体脱氢酶将染料MTT还原成甲瓒颗粒，以颗粒溶解后所呈现的颜色深浅(以OD490值表示)反映活细胞的数量及细胞代谢的活跃程度。
2.3CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D对连二亚硫酸钠诱导PCCN损伤的影响，参见Watanabe H，NiJW，Sakai Y，et al.Permanent occlusion of bilateral internal carotid arteries produces cognitive deficits intwo learning behavior tasks.Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi，1996，16(1)19-24；Ni JW，OhtaH，Matsumoto K，et al.Progessive cognitive impairment following chronic cerebral hypoperfusioninduced by permanent occlusion of bilateral carotid arteries in rats.Brain Res，1994，653231取长有DIV10 PCCN的96孔培养板，弃原培养液，Earle’s洗涤细胞1次，加无血清DMEM配10％(v/v)CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D与终浓度为2mmol/L的新配Na2S2O4共同作用细胞，设10％CSF作阴性对照。12h后MTT法观察CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D对细胞损伤的影响。
实验显示，与正常组比较，脱氧剂Na2O2S4明显降低模型组PCCN细胞OD490(p＜0.05)，提示PCCN出现缺氧样损伤；10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均可提高损伤PCCN细胞活力(p＜0.05-0.001)。其中，CSF-F作用最为显著，CSF-B与CSF-D作用也非常显著；三者两两合用作用基本未见增强；三者合用作用也非常显著，也未见协同增强。
2.4CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D对谷氨酸钠诱导PCCN损伤的影响，参见De Reuck JL.Evidence for chronic ischaemia in the pathogenesis of vascular dementiafrom neuroPATH to neuroPET.Acta Neurol Belg，1996，96(3)228-31；De Deyn PP，Goeman J，Engelborghs S，et al.From neuronal andvascular impairment to dementia.Pharmacopsychiatry，1999 ，32 Suppl 117-24取长有DIV13 PCCN的96孔培养板，弃原培养液，无血清DMEM洗涤细胞1次，加入无Mg2+-Earle’s溶500μmol/L MSG与细胞作用，20min后，弃去作用液，无血清DMEM洗涤细胞1次，换无血清DMEM配10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D100μl/孔，设10％CSF作阴性对照。16h后MTT法观察CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D对细胞损伤的影响。
实验显示，与正常组比较MSG明显降低模型组PCCN细胞OD490(p＜0.05)，提示PCCN出现缺血样损伤；10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均可不同程度提高损伤PCCN细胞活力。其中，与模型组比较，CSF-FBD、CSF-FB与CSF-D作用显著(p＜0.05)；CSF-F与CSF-B合用作用增强；单用CSF-D作用强于CSF-F或CSF-B。
本研究发现10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均可提高二亚硫酸钠与谷氨酸钠损伤PCCN细胞活力；其中，CSF-FBD与CSF-FB对2种细胞损伤均有保护作用；F、B、D单用时，CSF-F抗缺氧作用最为显著，而CSF-D抗缺血作用最强；三者两两合用，作用基本未见增强。然而，应用0.1，0.01μg/ml水平FBD，FB，FD，BD，F，B，D含药人工脑脊液(artificial CSF，ACSF)对抗谷氨酸钠时，发现ACSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均对神经元损伤有保护作用。并且作用趋势与含药CSF作用相似，如F、B、D单用时，ACSF-F抗缺血作用最为显著；ACSF-F与ACSF-D有协同作用。
VD为虚实夹杂之证，基本发病特点是痰、瘀、虚。FBD由茯苓、白术、当归组成，方中重用茯苓为君，豁痰利湿开窍，健脾安神益智；白术健脾益气，燥湿利水，助茯苓行湿化痰，统血保脉，上通清阳；当归化瘀生新，益精养髓，可助茯苓行湿化痰。全方共用化痰逐瘀，益气养血，而收安神益智，开窍除呆之功。
应用双侧颈总动脉永久性结扎与脑反复缺血再灌注分别制备实验性低灌注性痴呆与多梗塞性痴呆模型，考察了FBD不同组方，即FBD、FB、FD、BD、F、B、D，对2种整体VD模型的保护作用，结果显示FBD、FB、FD、BD、F、B、D对2种整体VD模型均有保护作用；FBD组方全方作用优于其他组合；FD与FB作用优于BD；F、B、D均有各自作用，F为FBD中主药。
应用连二亚硫酸钠与谷氨酸钠分别诱导乳鼠原代皮层细胞缺氧样与缺血样损伤，考察FBD不同组方含药脑脊液对两种离体VD模型的保护作用，结果显示10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均可不同程度保护2种细胞损伤；CSF-FBD与CSF-FB对2种细胞损伤均有显著保护作用；F、B、D单用时，CSF-F抗缺氧作用最为显著，而CSF-D抗缺血作用最强；三者两两合用，作用基本未见增强。
离体水平实验组方分析与整体实验组方分析结果基本一致，稍有区别。F作为FBD抗VD主药，与正交设计FBZ抗VD结果一致，证明F不仅是FBD中抗VD主药，也是DSS中抗VD主药。
二、FBD抗老年期痴呆的有效部位研究之一为了探索FBD抗老年期痴呆的有效部位，经文献检索FBD处方中各味药物的化学成分，药理作用的研究资料，确定茯苓中含三萜和多糖，白术中含挥发油和多糖，当归中含挥发油、有机酸和多糖。根据FBD中含有的化学成分，将FBD分为3个部位(1)FDB CO2超临界萃取部分P2(为小分子和低极性分子，含白术、当归挥发油，有机酸及茯苓三萜)；(2)FBD水提醇溶部分P3(为大极性部分)；(3)FBD水提醇沉部分P1(主要为多糖)。
通过整体动物模型(东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍、脑反复缺血再灌注诱导小鼠记忆障碍)和细胞模型(含药血清对PC12细胞缺氧缺血损伤的影响)相结合，进行有效部位的筛选。
FBD3个化学部位(part，P)性状、得率与用量见表4。
表4、各部位得率和处方剂量化学部位 性状 得率 部位用量总多糖(P1) 粉末 3.8g/100g生药 1.10g挥发油(P2) 油状物 2.29ml/100g生药 0.66ml浸膏(P3) 浸膏 26.6g/100g生药7.65g实验分组依据FBD组方3个化学部位的提取得率，计算出相应实验小鼠的剂量，见表5。
表5、样品浓度和动物剂量化学部位 浓度 剂量FBD 28.75g/500ml 1.15g/kgP1+P2+P3 1.10g+0.66ml+7.65g/500ml 43.7mg/kg+26.3μl/kg+305.9mg/kgP1+P2 1.10g+0.66ml/500ml43.7mg/kg+26.3μl/kgP1+P3 1.10g+7.65g/500ml 4.37mg/kg+305.9mg/kgP2+P3 0.66m1+7.65g/500ml26.3μl/kg+305.9mg/kgP11.10g/500ml 43.7mg/kgP20.66ml/500ml 26.3μl/kgP37.65g/500ml 305.9mg/kg
应用2种实验动物模型对8个样品进行药效学考察，初步明确主要有效部位。
实验模型(1)东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍；(2)脑反复缺血再灌注诱导小鼠记忆障碍；实验方法与结果(1)FBD3部位不同化学部位组合对脑反复缺血再灌注诱导小鼠记忆障碍的影响取雄性ICR小鼠，在进行反复缺血再灌注前置单盲端水迷宫训练，水温21-23℃，观察小鼠游泳时运动机能与空间分辩能力，时间超过15s者，可能存在运动机能、平衡机能与空间分辩能力缺陷，弃去不用。合格小鼠随机分为10组。1-8组连续igbid×6d，(9)-(10)组ig等容量的生理盐水。d4-5进行手术，术前10h禁食不禁水，1-8组小鼠ip 1.2g/kg10％乌拉坦使麻醉，待翻正反射消失后，仰位固定，75％医用酒精消毒颈部，行正中切口，钝性分离两侧颈总动脉，38±1℃下，先后施行10min断流(ischemia)、10min再灌(reperfusion)、10min再断流(ischemia)(10minI-10minR-10minI)手术，并于鼠尾近1cm处截断，使失血约10％全血容量，(1)组小鼠只分离动脉，不断流再灌也不失血。术中注意颈部创面点滴2-3滴2.50×104u/kg庆大霉素。观察手术后小鼠死亡率，以此评价药物抗急性脑缺血作用。
表6、FBD3部位不同化学部位组合对脑反复缺血再灌注诱导小鼠记忆障碍的影响组别 No.of pre-IR No.of post-IR Viability(％)FBD 12 8 66.6P1+P2+P3 12 8 66.6P1+P2 12 7 58.4P1+P3 12 9 75.0P2+P3 12 4 33.3P112 6 50.0P212 6 50.0P312 8 66.6假手术组 88 100模型组16 7 43.8(2)FBD3部位不同化学部位组合对东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍的影响东莨菪碱的配置取0.3mg/ml东莨菪碱注射液，1∶3稀释得0.075mg/ml。给药量为20ml/kg(ip)。
将昆明小鼠随机分为10组，连续ig qd×10d，d7上午1-8，10组ip Scop1.5mg/kg，9组ip等容量生理盐水，15min后用被动回避反射仪进行避暗(step-through)训练，参数为方波刺激波宽125ms；幅度38V.PP(避暗法)，24h后安静环境下测定小鼠从明室进入暗室的潜伏期，以此衡量小鼠的学习记忆能力。
表7、FBD3部位不同化学部位组合对东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍的影响(x±s，n＝8)组别 剂量 Latency(Lgs，x±s)FBD 1.15g/kg 1.82±0.46P1+P2+P3 43.7mg/kg+26.3μl/kg+305.9mg/kg 1.87±0.43P1+P243.7mg/kg+26.3μl/kg 2.27±0.05*P1+P34.37mg/kg+305.9mg/kg 2.02±0.34P2+P326.3μl/kg+305.9mg/kg1.59±0.44P1 43.7mg/kg2.06±0.27P2 26.3μl/kg 2.03±0.33P3 305.9mg/kg 2.19±0.23*假手术组 -2.25±0.08模型组 -1.81±0.44Δ(3)FBD3部位不同化学部位组合含药血清对PC12细胞缺氧缺血损伤的影响d10眼框采血，3500rcf×10min离心分离含药血清，56℃、30min水浴灭活血清，用于抗PC12细胞缺氧缺血损伤的血清药理学研究。
PC12细胞株由中国科学院细胞生理研究所提供，保存于-80℃超低温冰箱。实验前37℃快速复苏，1000rpm×5min离心，无血清DMEM洗涤，1000rpm×5min二次离心，用10％NCS DMEM接种于涂有多聚赖氨酸的75ml培养瓶，待37℃、5％CO2下长成单层后，用0.25％胰酶消化3-5min，10％NCS DMEM终止消化，反复吹打成细胞悬液，接种于涂有多聚赖氨酸的96孔培养板，37℃、5％CO2下长成单层。
取长满单层PC12的96孔培养板，弃原培养液，Earle’s洗涤细胞1次，用终浓度为2mmol/L的新配D-Hanks溶Na2S2O4与细胞作用1h，造成细胞缺氧损伤；Na2S2O4与细胞作用1h后，弃Na2S2O4作用液，Earle’s洗涤细胞1次，换无血清DMEM。加入10％浓度FBD 3部位不同组合小鼠的含药血清，10％空白血清作阴性对照，10％FBD含药血清作阳性对照，每组6孔细胞，均作用18h，MTT法观察含药血清对细胞缺氧损伤的影响。
取长满单层PC12的96孔培养板，弃原培养液，Earle’s液洗涤细胞1次，无Mg2+-Earle’s液溶500μmol/LMSG与细胞作用，20min后弃去作用液，Earle’s液洗涤细胞1次，换无血清DMEM。加入10％浓度FBD 3部位不同组合小鼠的含药血清，10％空白血清作阴性对照，10％FBD含药血清作阳性对照，每组6孔细胞，均作用18h，MTT法观察含药血清对细胞缺氧损伤的影响。
表8、FBD 3部位不同化学部位组合含药血清对2mmol/LNaS2O4and 0.5mmol/LMSG诱导PC12细胞缺氧缺血损伤的影响(x±s，n＝6)OD490组别缺氧 缺血对照组 0.376±0.069 0.438±0.051模型组 0.109±0.014ΔΔΔ0.257±0.037ΔΔΔ血清-FBD 0.165±0.028**0.342±0.052*血清-(P1+P2+P3)0.152±0.023**0.323±0.052*血清-(P1+P2) 0.171±0.021***0.334±0.045**血清-(P1+P3) 0.154±0.036*0.324±0.049*血清-(P2+P3) 0.128±0.024*0.307±0.047血清-P10.139±0.020*0.321±0.037*血清-P20.148±0.023**0.316±0.047*血清-P30.139±0.022*0.311±0.025*ΔΔΔp＜0.001vs对照组；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vs模型组(4)FBD中间水提物部位及其正丁醇萃取物、剩余水提物对东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍的影响用正丁醇萃取FBD中间水提物部位(P3)，得正丁醇萃取物(P3-n-Bu)与剩余水提物(P3-H2O)，得率分别为14.9g/100g生药与6.8g/100g生药。
取雄性昆明小鼠42只，随机分为7组，6只/组，各部位组合药液均按0.5ml/20g给药。1-7组连续igbid×7d，d4上午2-7组ip Scop2.0mg/kg，(1)组ip等容量生理盐水，20min后用被动回避反射仪进行避暗(step-through)训练，参数为方波刺激波宽125ms；幅度35V.PP(避暗法)，24h后安静环境下测定小鼠从明室进入暗室的潜伏期与3.5min内的错误次数(No.of errors)，以潜伏期与错误次数衡量小鼠的学习记忆能力。
表9、FBD中间水提物部位及其正丁醇萃取物、剩余水提物对东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍的影响(x±s，n＝6)组别 剂量(bid×3d)潜伏期(Lgs) 错误次数Normal 2.29±0.07 0.2±0.4模型组 1.80±0.36Δ1.6±0.5ΔΔP1+P2+P3(43.7mg+26.3μl+305.9mg)/kg1.92±0.54 0.6±0.5*P1+P2 (43.7mg+26.3μl)/kg2.06±0.28 0.8±0.4*P3 305.9mg/kg 2.14±0.28 0.3±0.5**P1+P2+P3-n-Bu (43.7mg+26.3μl+78.2mg)/kg 2.20±0.28 0.2±0.4**P1+P2+P3-H2O (43.7mg+26.3μl+171.4mg)/kg1.63±0.39 1.2±0.4Δp＜0.05，ΔΔp＜0.01vsnormal；*p＜0.05，**p＜0.01vs模型组(5)FBD中间水提物部位及其正丁醇萃取物、剩余水提物含药血清对PC12细胞缺氧缺血损伤的影响d7结束行为药理学实验后眼框采血，3500rcf×10min离心分离含药血清，56℃、30min水浴灭活血清，用于抗PC12细胞缺氧缺血损伤的血清药理学研究。实验方法同实验(3)。
表10、FBD正丁醇萃取物、水提物对缺水再灌注致小鼠记忆障碍的影响(避暗法)组别 Latency(Logs)假手术组 2.38±0.00模型组 2.23±0.18*
FBD2.31±0.18P1+P2 2.30±0.20P1+P2+P3-n-Bu 2.28±0.25P1+P2+P3-Wa2.26±0.31表11、FBD正丁醇萃取物、水提物对缺水再灌注致小鼠记忆障碍的影响(水迷宫法)1bt 2bt 3btLearn memorylearn memorylearn memory假手术组 1.07±0.210.90±0.221.33±0.311.24±0.261.47±0.261.67±0.31模型组 1.44±0.23##1.32±0.24##1.66±0.23#1.46±0.241.66±0.23#1.75±0.33FBD1.17±0.281.14±0.191.35±0.301.26±0.251.55±0.261.53±0.43P1+P2 1.31±0.371.04±0.25*1.33±0.271.32±0.231.64±0.211.60±0.32P1+P2+P3-n-Bu 1.19±1.261.08±0.231.41±0.311.41±0.311.63±0.271.78±0.26P1+P2+P3-Wa1.28±0.321.13±0.191.57±0.231.57±0.231.69±0.281.71±0.34表12、FBD正丁醇萃取物，剩余水提物的含药血清对PC12细胞损伤模型的作用OD490组别缺氧缺血对照组 0.597±0.0310.583±0.036模型组 0.284±0.043###0.272±0.059血清-(P1+P2+P3) 0.321±0.0340.314±0.017血清-(P1+P2) 0.340±0.0530.364±0.040*血清-(P1+P2+P3-n-Bu) 0.306±0.0550.340±0.044*血清-(P1+P2+P3-Wa) 0.312±0.0370.344±0.056综合以上实验，确定FBD中P1+P2为FBD防治老年性痴呆的有效部位，其制备工艺为FBD经CO2超临界萃取后，分别得P2部位和药渣。取药渣，用水煎，得水提物，加入乙醇，沉淀为(P1，主含多糖)，上清液是P3。
对P1+P2进行化学成分的研究，为今后的质量标准奠定基础。
精简方FBD有效部位不但保留了而且增强了防治老年期痴呆的作用，特别是对VD的防治效果。
精简方FBD有效部位的原料药比原方DSS减少了一半，所以药物的成本大大降低，病人服用的药量减少，但疗效却相同，某些方面甚至明显增强，尤其适用于VD型老年期痴呆的患者。
精简方FBD有效部位对VD型老年期痴呆的患者治疗更有针对性，用药更加准确，疗效显著提高。
精简方FBD有效部位在制备各种剂型、尤其是在制备现代制剂方面不但比原方而且比精简方FBD具有优势。同时，由于精简方FB有效部位中的杂质及无抗痴呆作用的成份减少，使得质量监测和控制也相对容易。
三、FBD抗老年期痴呆的有效部位研究之二虽然实验证明P1+P2为FBD防治老年性痴呆的有效部位，然而在研究过程中，亦发现其中P3即水提醇溶部分，对小鼠的整体状态有显著改善作用。进而，对P3部分用正丁醇萃取，浓缩正丁醇萃取液后，再与P1+P2部分组合。实验表明P1+P2+P3部分的正丁醇萃取物，不仅具有显著的防治老年性痴呆疗效，而且可小鼠全身精神状态亦有明显改善。
四、FBD抗老年期痴呆的有效部位研究之三考虑到工业化实施，为进一步简化工艺，在上述研究基础上，对FBD有效部位及其提取方法再次进行筛选。制备FBD水提液不同化学部位，用东莨菪碱致小鼠老年痴呆模型筛选有效部位，用老年大鼠颈外动脉注血栓模型检测有效部位对多发脑梗塞性痴呆的治疗作用，以及对大鼠脑梗塞致记忆障碍的影响。发现多糖+正丁醇部位与多糖+水部位对东莨菪碱致小鼠记忆障碍有明显的保护作用，多糖+正丁醇部位对多发脑梗塞性痴呆有明显的治疗作用。1.FBD化学部位的提取工艺及得率FBD水提液经水提醇沉得总多糖部位(Ps)，剩余浸膏部位(Ex)用正丁醇萃取得正丁醇部位(nBu)，和水部位(Wa)。FBD的4个化学部位，提取工艺流程图如下，性状、得率见表13。
FBD各化学部位提取流程详细说明取FBD，用10倍体积水浸泡1小时，煮沸，保持微沸1小时，过滤，得药渣与上清液(1)。取药渣加水8倍，煮沸并保持1小时后，过滤，药渣弃去，得上清液(2)。合并上清液(1)与上清液(2)后浓缩，向浓缩液中加95％乙醇，沉淀得多糖，过滤并用丙酮洗涤所得多糖(Ps，含量56％)。取滤除多糖沉淀的上清液，回收乙醇后的提取物(Ex)，用水饱和的正丁醇萃取5次，分别得到正丁醇部位(nBu)和水部位(Wa)。
本发明方法中多糖是干粉，正丁醇提取物是浸膏，如果能保证原料药质量，而且工艺固定，一般说能保持恒定的比例和重现性。
表13、FBD及各化学部位的性状和得率
2.实验动物雄性ICR小鼠18-22g，中国药科大学动物房提供，雄性SD大鼠(350-400g)，江苏南京青龙山动物房提供，合格证号SCXK苏-20020018。3.实验方法与结果3.1FBD各化学部位对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的影响雄性ICR小鼠18-23g，随机分组，组别与给药剂量如表14(qd，0.2mL/10g)，连续给药6天，正常与模型组给予等量蒸馏水，第6天给药后2h，ip东莨菪碱3mg/kg，20min后进行避暗训练，电压38V，24h后检测避暗潜伏期与5min内错误次数，如表15所示。
表14、小鼠分组及给药剂量(所有部位剂量均相当于小鼠生药剂量2.3g/kg)
注所有药物皆用蒸馏水直接配制，含正丁醇部位的水溶液有少许难溶物，用超声助溶。
表15、FBD及各化学部位对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的影响(x±s)
注ΔΔP＜0.01vsnormal；*P＜0.05vs模型组。
东莨菪碱致痴呆模型(Scop)制备成功，但FBD及其单化学部位并没有显著改善由东莨菪碱导致的小鼠记忆障碍，多糖(P1)与正丁醇部位(nBu)改善作用相对较好，P1+nBu与P1+Wa组合有显著的改善记忆障碍作用，考虑到nBu部位得率只有Wa部位的1/10，用量相对较少，而Wa部分不仅成分复杂，糖分含量较高，有效成份不易提纯，且得率高，会导致剂量太大。所以把P1+nBu作为有效部位来进一步考察其对不同模型导致的动物记忆障碍的改善作用。
3.2P1+nBu部位对颈外动脉注血栓致大鼠多发梗塞性痴呆的影响雄性SD大鼠(300-400g)，参照文献(梅建勋等，多发梗塞性痴呆(MID)动物模型的改进与应用，中风与神经疾病杂志，1999，16(2)100-102)经改进方法造模，改血栓浓度为10mg/mL，手术成功的大鼠随机分组，组别与给药剂量如表16所示(qd，0.7mL/100g)，假手术组仅分离动脉，不进行注栓手术。术后连续灌胃10天，假手术组给等量蒸馏水，第7天按文献(刘景根等蝙蝠葛苏林碱对小鼠和大鼠脑缺血的保护作用，中国药理学通报，1998，14(1)18-21)进行大鼠行为评分，第8天进行避暗训练，电压45V，24h后检测避暗潜伏期，第10天按文献方法(张均田，现代药理实验方法北京医科大学中国协和医科大学联合出版社1241)进行脑组织TTC染色，仔细分离梗塞区域，测量脑梗塞区域占全脑的比例。行为评分结果、避暗成绩及脑组织梗塞比例的测定结果见表17。
表16、大鼠分组及给药剂量(所有部位剂量均相当于大鼠生药剂量1.3g/kg)
注都可喜为糖衣片(duxil，法国施维雅药厂生产。每片含阿米三嗪二甲磺酸盐30mg与萝巴新100mg)，去糖衣后超声助溶成混悬液。
表17、P1+nBu部位对颈外动脉注血栓致大鼠多发梗塞性痴呆的影响(x±s)
注ΔΔP＜0.01Vs假手术组；*P＜0.05VS模型组；**P＜0.01VS模型组；Ps+nBu(L)由FBD临床剂量换算而来，行为评分分值越高，表明行为障碍越严重。由两名操作者同时评分，互不干涉，取两者打分的平均值。
实验表明颈外动脉逆行注射血栓，造成的明显的行为障碍、记忆障碍、脑梗塞占全脑比例明显比假手术组高。阳性药都可喜和Ps+nBu部位的低剂量(L)与高剂量(H)对以上模型障碍有明显改善作用，与模型组相比明显减少脑梗塞面积，但Ps+nBu部位并没有呈现量效关系，可见P1+nBu的剂量设计应该下调。
具体实施例方式
实施例1取茯苓25g 白术12g当归7g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖(2.3g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位(0.71g)，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，压成片剂。
实施例2取茯苓25g白术12g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，压成片剂。
实施例3取茯苓25g当归7g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，压成片剂。
实施例4取茯苓25g，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，压成片剂。
实施例5取当归7g，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，压成片剂。
实施例6取茯苓50g 白术40g当归20g，混合后，CO2超临界萃取提取挥发油(2.5ml)，控制提取罐压力为10.0MP，温度为35℃，提取时间为2小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为90％，沉淀，得到总多糖(4.2g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物(7.5g)，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。
实施例7取茯苓50g、当归20g，混合后，夹带剂用己烷，进行CO2超临界萃取提取挥发油，控制提取罐压力为9.0MP，温度为32℃，提取时间为3小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为95％，沉淀，得到总多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。
实施例8取白术40g当归20g，混合后，CO2超临界萃取提取挥发油，控制提取罐压力为14.0MP，温度为32℃，提取时间为1小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为75％，沉淀，得到总多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。
实施例9取茯苓50g白术40g混合后，CO2超临界萃取提取挥发油，控制提取罐压力为12.0MP，温度为35℃，提取时间为2小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为85％，沉淀，得到总多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。
实施例10取当归20g，用乙酸乙酯作为夹带剂，进行CO2超临界萃取提取挥发油，控制提取罐压力为8.0MP，温度为40℃，提取时间为3小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为90％，沉淀，得到总多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。
实施例11取茯苓40g 白术20g 当归10g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖(3.7g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位(1.1g)，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，灌制胶囊。
实施例12取茯苓40g 白术20g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，灌制胶囊。
实施例13取白术20g 当归10g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，灌制胶囊。
实施例14取茯苓40g 当归10g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，灌制胶囊。
实施例15
取茯苓40g，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，灌制胶囊。
实施例16取茯苓40g白术20g当归12g，混合后，用乙醇用夹带剂，进行CO2超临界萃取提取挥发油(1.64ml)，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到总多糖(2.74g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取(4.9g)，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量淀粉，制粒，灌制胶囊16粒。服用剂量一日服用2次，每次2粒。
实施例17取茯苓50g白术25g当归15g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖(4.77g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位(1.46g)，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，制成片剂18片。服用剂量一日服用2次，每次2片。
权利要求
1.一种防治老年痴呆的中药组合物，其特征在于主要由茯苓、白术和当归组成的原料药中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成，或者主要由选自茯苓、白术和当归中的一种或两种原料药中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成。
2.根据权利要求1所述中药组合物，其特征在于主要由茯苓或白术或当归，或茯苓和白术，或者茯苓和当归，或者白术和当归，或者茯苓、白术和当归中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成。
3.根据权利要求2所述中药组合物，其特征在于主要由茯苓2-6份∶白术1-3份∶当归0.5-1.5份中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油组成，多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1～1.5克∶5～10克∶0.4～1.2毫升。
4.根据权利要求2所述中药组合物，其特征在于主要由茯苓4份∶白术2份∶当归1份中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油组成，多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1.1～1.2克∶7～8克∶0.6～0.8毫升。
5.权利要求1～4之一中药组合物制备方法，其特征在于取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，CO2超临界萃取提取挥发油，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到多糖，合并挥发油与多糖；或者，取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，CO2超临界萃取提取挥发油，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油、多糖及正丁醇提取物；或者，取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物。
6.根据权利要求5所述中药组合物制备方法，其特征在于取茯苓或白术或当归，或者取茯苓和白术，或者取白术和当归，或者取茯苓和当归，或者取茯苓、白术和当归；CO2超临界萃取罐压力8.0-25.0Mpa，夹带剂用乙醇、乙酸乙酯和/或己烷，夹带剂量按体积/重量比是药料量的30.0-150％；加乙醇至含醇浓度为45-95％时沉淀多糖。
7.根据权利要求5或6所述中药组合物制备方法，其特征在于取茯苓2-6份∶白术1-3份∶当归0.5-1.5份，所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1～1.5克∶5～10克∶0.4～1.2毫升。
8.根据权利要求7所述中药组合物制备方法，其特征在于所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1.1～1.2克∶7～8克∶0.6～0.8毫升。
9.根据权利要求5～8之一所述中药组合物制备方法，其特征在于所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油，可与药学上适用组分混合，制成各种制剂。
10.根据权利要求9所述中药组合物制备方法，其特征在于所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油，可与药学上适用载体混合，制成各种制剂。
全文摘要
一种防治老年痴呆的中药组合物，主要由茯苓和/或白术和/或当归中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的有效部位组成，可与药学上适用载体混合，制成各种制剂，本发明还包括可工业化应用的提取分离方法。
文档编号A61P25/28GK1481808SQ0313220
公开日2004年3月17日 申请日期2003年7月31日 优先权日2003年7月31日
发明者朱丹妮, 余伯阳, 沈平孃, 严永清, 阮克锋, 林志宏, 王鹏, 寇俊萍, 顾维, 周迎新 申请人:中国药科大学, 上海中药制药技术有限公司
技术领域：
本发明涉及一种防治老年痴呆的中药复方有效部位及其制备方法，具体说是从当归芍药散精简方及其组方药物中提取分离的防治老年痴呆的有效部位组合物，及其可工业化应用的提取分离方法。
背景技术：
当归芍药散(Danggui Shaoyao San)，记载于汉·张仲景《金匮要略》。其组成为当归3g、白芍16g、川芎8g、茯苓4g、白术4g和泽泻8g。当归芍药散的功效为养血疏肝，健脾利湿。临床主治气郁血虚型老年性痴呆，症见呆滞如愚，健忘，精神恍惚，语言错乱，情绪抑郁或胸闷急躁，频频叹息，悲伤欲哭，虚烦不眠，食少倦怠，腹胀便溏，舌质淡，脉弦细。现代医学研究表明，老年期痴呆主要为阿尔采末病(Alzheimer’s disease，简称AD)与血管性痴呆(vascular dementia，简称VD)两大类型。当归芍药散对AD与VD均有一定的疗效。
本发明人已利用现代药理实验手段，对治疗老年期痴呆具有一定疗效的古方当归芍药散进行拆方，即分别研究组成当归芍药散方剂的六味原料药，再进行优选组合，得到一种防治老年痴呆的中药组合物，其特征在于由茯苓、白术、当归三味原料药组成，其原料药比例为茯苓2-6份∶白术1-3份∶当归0.5-1.5份；其原料药优选的比例为茯苓4份∶白术2份∶当归1份。(参见CN02112711.5，一种防治老年痴呆的中药组合物)比较实验证实，由六味药材组成的古方当归芍药散在防治老年期痴呆病症方面可以精简为三味，精简方简称FBD。精简方FBD对VD的防治效果，明显优于原方(简称DSS)。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是为患VD的老年痴呆病人，研究更具备针对性的治疗药物，以便更加准确地对症治疗，从而提高对老年期痴呆的治疗效果。而且，也为即将步入老年期的中年人预防或减少老年痴呆的发病率提供良好预防用药。
因为无论预防老年痴呆的发病或治疗已发病的老年痴呆患者，都需要长期服药，所以在保证疗效的基础上，应尽量减少用药剂量，改进药物剂型，降低药品成本及价格。
为了进一步保证疗效的稳定、减少用药剂量、改进药物剂型，就需要对精简方FBD及其组成药材进行分析，提取分离具有疗效的有效部位，并设计合理的提取分离工艺。对精简方FBD及其组成药材有效部位的提取分离，是对精简方FBD从化学本质上了解其治疗机理的初步，也是制定准确质量标准的基础。
为了解决这一技术问题，本发明利用现代药理实验手段，对治疗老年期痴呆具有一定疗效的古方当归芍药散精简方FBD及其方中药材，进行多种配伍后，研究有药理作用的化学成分的类型，即分别研究组成当归芍药散精简方的3味药材的有效部位，再进行优选组合，得到如下技术方案。
一种防治老年痴呆的中药组合物，其特征在于主要由茯苓、白术和当归组成的原料药中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成，或者主要由选自茯苓、白术和当归中的一种或两种原料药中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成。
所述中药组合物，其特征在于主要由茯苓或白术或当归，或茯苓和白术，或者茯苓和当归，或者白术和当归，或者茯苓、白术和当归中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成。
所述中药组合物可以是主要由茯苓2-6份∶白术1-3份∶当归0.5-1.5份中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油组成，多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1～1.5克∶5～10克∶0.4～1.2毫升。
所述中药组合物较好的配比是主要由茯苓4份∶白术2份∶当归1份中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油组成，多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1.1～1.2克∶7～8克∶0.6～0.8毫升。
前述中药组合物制备方法如下取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，CO2超临界萃取提取挥发油，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到多糖，合并挥发油与多糖；或者，取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，CO2超临界萃取提取挥发油，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油、多糖及正丁醇提取物；或者，取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物。
所述中药组合物制备方法具体为取茯苓或白术或当归，或者取茯苓和白术，或者取白术和当归，或者取茯苓和当归，或者取茯苓、白术和当归；CO2超临界萃取罐压力8.0-25.0Mpa，夹带剂用乙醇、乙酸乙酯和/或己烷，夹带剂量按体积/重量比是药料量的30.0-150％；加乙醇至含醇浓度为45-95％时沉淀多糖。所述中药组合物制备方法中取茯苓2-6份∶白术1-3份∶当归0.5-1.5份，所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1～1.5克∶5～10克∶0.4～1.2毫升。
前述中药组合物制备方法中，其特征在于所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1.1～1.2克∶7～8克∶0.6～0.8毫升。所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油，可与药学上适用组分混合，制成各种制剂。所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油，可与药学上适用载体混合，制成各种制剂。
常用口服制剂辅料可选用，崩解剂如羟丙基淀粉、羟丙纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；填充剂如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精、微粉纤维素等；润湿剂和粘合剂如乙醇、预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素；润滑剂如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇4000和6000；润湿剂如十二烷基硫酸钠、吐温80。
为叙述方便，将本发明的技术方案茯苓、白术、当归组成的中药组合物简称为FBD。茯苓简称F、白术简称B、当归简称D。
在两种不同类型VD模型上，进行了FBD组方分析。2项实验结果证明，FBD组方全方作用优于其他组合；FD与FB作用优于BD；F、B、D均有各自作用，F为FBD中主药。脑脊液(CSF)药理学研究也发现，10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均可提高二亚硫酸钠与谷氨酸钠损伤PCCN细胞活力；其中，CSF-FBD与CSF-FB对2种细胞损伤均有保护作用；F、B、D单用时，CSF-F抗缺氧作用最为显著，而CSF-D抗缺血作用最强；三者两两合用，作用基本未见增强。
下述三味药材分别或两两组合的药理实验是用其水煎液作的，并未分离其三类有效部位，但是如果按本发明工艺进行实验，同样能分到三类有效部位。
一、当归芍药散精简方防治血管性痴呆的组方分析(一)当归芍药散精简方抗持久性双侧颈总动脉结扎与脑反复缺血再灌注致小鼠血管性痴呆的组方分析1实验材料1.1FBD水提液的制备FBD依据制剂与组方不同分为8个组合FBD、F+B+D(F、B、D分煎合并)、FB、FD、BD、F、B与Z。取8组合用药适量，例行冷浸提取，制备浓度分别为4.60、4.60、3.84、3.32、2.04、2.56、1.28、0.76g生药/100ml的FBD、F+B+D、FB、FD、BD、F、B、Z水提液，4℃下保存备用。1.2动物雄性昆明小鼠，25±2g；37±3g均由中国药科大学新中新药研究中心提供。1.3仪器被动回避反射仪由中国中医研究院中药研究所研制；SMG-2型水迷宫程序自动控制仪由中国医学科学院药物研究所研制，行为学实验1.0软件进行数据采集。Z323K冷冻高速离心机，德国Hermle labor tecknik；DU640核酸蛋白分析仪，美国Beckman coulter；XHF-1高速分散器，上海金达生化仪器厂；电热恒温水浴锅，江苏省医疗器械厂。1.4试剂蛋白质定量试剂盒(批号20010315)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(批号20010315)购自南京建成生物工程研究所。1.5统计分析使用NDST4.4软件进行统计，数据用x±s表示。计时资料用调和均数法将数据对数转换后行组间t或t’检验，计量资料行组间t或t’检验。2方法与结果2.1持久性双侧颈总动脉结扎致小鼠VD方法学建立，参见刘汇波等.双侧颈总动脉结扎对大鼠学习记忆功能和海马组织形态学的影响.基础医学与临床，1998，18(4)54-57；范文辉等，血管性痴呆的动物模型及其胆碱能机制研究.第三军医大学学报，2000，22(4)314-317取雄性昆明种小鼠20只，体重25±2g，随机分为假手术组与模型组，术前禁食10h，ip1g/kg20％乌拉坦麻醉，75％医用酒精消毒颈部，仰卧位固定，颈中开口约2cm，钝性分离出两侧颈总动脉，不剥离迷走神经，双重丝线结扎，创口处点滴庆大霉素2.5×104u/kg2-3滴，缝合创口；假手术组仅显露两侧颈总动脉，其它处理同模型组。
术后模型小鼠10h内苏醒，但食量饮水减少，皮毛蓬松，体重下降；因血管结扎引起颅内压或眼内压升高，两眼外突，眼睑粘连或抬起无力。
术后10d，开始用水迷宫程序自动控制仪连续4d检测小鼠空间分辩能力，水温控制在27.5-28℃，盲端(blind termination，bt)数从1-4bt逐日增加，记录小鼠游泳时间，以游泳时间评价小鼠空间分辩能力。
实验表明模型小鼠在水迷宫内完成任务的游泳时间较假手术小鼠显著延长(p＜0.05-0.01)，提示模型小鼠持续存在空间分辩能力障碍，且随任务难度增加差异日益显著；但模型小鼠的运动机能与平衡机能未出现异常，符合VD临床表现，模型制备成功。2.2FBD抗持久性双侧颈总动脉结扎(PBCAO)致小鼠记忆障碍组方分析筛取合格小鼠100只，随机分为10组假手术组、模型组、FBD组、F+B+D组、FB组、FD组、BD组、F组、B组、D组。d1对小鼠进行PBCAO手术，d2-d6连续ig相应8种水提液，bid×5d，给药量0.5ml/20g体重。d6用被动回避反射仪对小鼠进行避暗训练，d7同一时间检测小鼠避暗潜伏期与5min内错误次数；d7-9每天上午用水迷宫对小鼠逐日进行1-3bt游泳训练，每天下午记录小鼠游泳时间，游泳时间阈值设定1bt30s；1bt60s；3bt90s。
表1、FBD抗持久性双侧颈总动脉结扎与脑反复缺血再灌注致小鼠血管性痴呆的组方分析(x±s)组别剂量(g/kg/d)n Latency(Logs)No.of errors假手术组11 2.26±0.39 1.0±1.2模型组 7 1.50±0.36ΔΔ3.1±2.0ΔFBD 2.30 11 2.17±0.51**0.7±1.2**F+B+D 2.30 7 2.10±0.39*0.7±0.8*FB1.92 7 1.84±0.66 1.6±1.7FD1.66 9 2.11±0.56*0.7±0.7**BD1.02 9 1.25±0.26 1.9±0.8F 1.28 7 2.11±0.53*0.4±0.5*B 0.64 8 2.37±0.29**0.3±0.5**D 0.38 8 1.88±0.59 0.9±1.0*Δp＜0.05，ΔΔp＜0.01vs假手术组；*p＜0.05，**p＜0.01vs模型组stimulate parameters125ms，38V.PP小鼠PBCAO手术后1w，避暗任务中潜伏期显著长于正常小鼠，错误次数显著增多(p＜0.05-0.01)，提示PBCAO对小鼠记忆获得能力造成损伤；FBD的8种不同组合与制剂水提液均可不同程度延长模型小鼠潜伏期和/或减少错误次数，其中以FBD、F+B+D、FD、F、B、D水提液作用显著(p＜0.05-0.01)。结果见表1。
表2、FBD及各组份对水迷宫游泳任务中模型小鼠游泳时间的影响(x±s，n＝7-9)Swimming time(Logs)组别 剂量(g/kg/d) n1bt2bt 3bt假手术组 70.99±0.18 1.17±0.151.21±0.31模型组71.19±0.18Δ1.31±0.301.65±0.23ΔFBD 2.30 81.04±0.20 1.37±0.171.39±0.22*F+B+D2.30 71.24±0.24 1.43±0.311.76±0.29FB 1.92 71.34±0.14 1.62±0.201.49±0.45FD 1.66 81.22±0.23 1.42±0.231.73±0.30BD 1.02 91.24±0.22 1.43±0.221.49±0.18F1.28 71.33±0.22 1.55±0.331.22±0.43*B0.64 81.02±0.26 1.27±0.201.64±0.33D0.38 71.22±0.18 1.32±0.231.72±0.39Δp＜0.05vs假手术组；*p＜0.05vs模型组；water temperature25-26℃由表2可见，水迷宫游泳任务中模型小鼠游泳时间显著长于假手术组(p＜0.05)，提示PBCAO造成小鼠空间分辩能力障碍；随水迷宫任务难度增大，F组与FBD组小鼠游泳时间较模型组显著缩短(p＜0.05)，表明F与FBD水提液可对抗PBCAO致小鼠空间分辩能力障碍；其它6种FBD组方或制剂作用不明确或有一定改善趋势。2.3FBD抗脑反复缺血再灌注致小鼠记忆障碍组方分析用水迷宫淘汰不合格小鼠，合格小鼠100只分为10组假手术组、模型组、FBD组、F+B+D组、FB组、FD组、BD组、F组、B组、D组，每组9-12只小鼠。手术前5d，ig相应8种水提液，bid×5d，给药量0.5ml/20g体重。手术前禁食不禁水10h，对小鼠例行15minI-15minR-15minI缺血再灌注手术，但手术不伴有失血与高温条件，以进一步提高实验平行性。
手术后2d继续ig相应各水提液，bid×5d。d4对小鼠进行避暗训练，d5检测小鼠潜伏期与5min内错误次数；d6处死小鼠取脑组织测定MDA含量，以MDA作为氧化损伤的神经生化指标。
表3、FBD及其各组份对小鼠经脑缺血再灌注损伤后执行避暗任务潜伏期与错误次的影响(step-through)(x±s)组别剂量n Latency(Logs) 错误次数(g/kg/d)假手术组7 1.99±0.39 0.7±0.8模型组 6 1.56±0.56ΔΔ2.5±1.4ΔFBD 2.306 1.99±0.51 0.8±1.2*F+B+D 2.305 2.14±0.26 0.6±0.5*FB 1.9210 2.13±0.39*0.5±0.8**FD 1.666 2.32±0.01*0.0±0.0**BD 1.025 1.89±0.51 1.0±1.0F 1.287 2.28±0.13*0.1±0.4**B 0.648 2.23±0.23*0.4±0.7**D 0.386 2.32±0.01*0.2±0.4Δp＜0.05vs假手术组；*p＜0.05，**p＜0.01vs模型组；stimulate parameters125ms，38V.PP手术后小鼠平均10h内苏醒，但食量饮水减少，体重下降，活动较为正常，有少数小鼠出现死亡，平均2-3只/组；给药后一般情况有所改善。
表3显示，小鼠经脑缺血再灌注损伤后执行避暗任务潜伏期长于假手术组，错误次数显著多于假手术组(p＜0.05)，提示小鼠出现记忆获得能力障碍；F、B与D各自单用均可显著延长小鼠避暗潜伏期，减少错误次数(p＜0.05-0.01)，具有改善小鼠记忆获得能力障碍作用；F、B与D两两合用时，FB与FD也有明显改善作用；三药合用后对记忆获得能力障碍虽有明显改善作用，但作用未显示出协同增效效应，且三药共煎与分煎合并作用无显著差异(p＞0.05)。
实验显示，小鼠经脑缺血再灌注损伤后，大脑皮质组织MDA含量由10.71±5.13nmol/mg升高到14.22±2.94nmol/mg，表明氧化损伤可能参与了记忆损伤；对MDA含量的异常升高，FBD与FB水提液有显著抑制作用(p＜0.05)；其它6种FBD组方水提物对MDA异常升高有一定的抑制趋势或作用不确定。
结论考察8种FBD组方或制剂水提液对小鼠PBCAO手术后记忆获得能力障碍与空间分辨能力障碍改善作用，可发现全方FBD合煎液优于F+B+D分煎合并液；全方FBD优于F、B、D两两伍用与单用，有配伍优势；F、B与D两两合用时，发现FD作用优于FB与BD，且作用优于F与D单用；比较F、B、D单用作用，F作用优于B与D，可能为FBD主药。
考察8种FBD组方或制剂水提液对小鼠脑反复缺血再灌注后记忆获得能力障碍改善作用与抗氧化作用，可发现全方FBD合煎液优于F+B+D分煎合并液；全方FBD抗氧化作用优于F、B、D两两合用与单用，有一定的配伍优势。F、B与D两两合用时，发现BD作用差于FB与FD；比较F、B、D单用作用，F作用优于B与D，可能为FBD主药。
本研究在两种不同类型VD模型上，进行了DSS精简方FBD组方分析。2项实验结果证明，FBD组方全方作用优于其他组合；FD与FB作用优于BD；F、B、D均有各自作用，F为FBD中主药。
(二)当归芍药散精简方防治血管性痴呆的离体水平实验组方分析FBD在整体水平防治2种小鼠VD的组方分析显示三药合用时，合煎水提液作用优于分煎合并液；两药合用时，FB与FD作用优于BD；单用时，F、B、D各自均有作用，且以F作用突出。
缺血/缺氧(ischemia/anoxia)、兴奋性氨基酸(excitatory amino acid，EAA)等可损伤记忆相关脑区大脑皮质与海马结构与功能，在VD发病机理中起重要作用。为验证与深入说明FBD防治VD整体水平的组方分析，本研究初步应用2种细胞缺氧/缺血模型，进行了FBD在细胞水平防治2种细胞损伤模型的组方分析。1实验材料1.1FBD7种含药脑脊液制备当归、炒白芍、白茯苓、炒白术、川芎、炒泽泻均购自南京市药材公司。经鉴定原植物分别为Angelica sinensis(Oliv.)Diels.、Paeonia lactiflora Pall.、Poria cocos(Schw)Wolf、Atractylodesmacrocephala Koidz.、Ligusticum chuanxiong Holt.、Alisma orientale(Sam.)Juzep.。FBD各药用量按比例当归∶茯苓∶白术＝3∶10∶5。双蒸水浸软药材1h，适量水微沸20min，倾取粗水提液，重复6次，合并6次均匀间隔FBD、FB、FD、BD、F、B、D粗水提液，2400rcf×5min离心，合并上清液，4℃储存备用。
2kg体重大耳白兔，分别ig 0.78，0.64，0.55，0.34，0.43，0.22，0.13g/kg FBD、FB、FD、BD、F、B、D水提液，给药量10ml/kg。1h后，ip 20％乌拉坦5ml/kg麻醉，剪去脑后兔毛，70％医用酒精或0.1％新洁尔灭消毒皮肤，用1ml无菌注射器，从头与后颈相连处穿刺，注意应尽量使兔弯低头部，以便针头由枕骨大孔(Foramen occipitale magnum)进入小脑延髓池，针头穿过皮肤后轻轻后抽活塞以制造注射器内负压，然后缓慢深入，一旦针头进入延髓池，600-800μl脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)将涌入针管，迅速抽出针头，随后ip10ml/只生理盐水促兔复苏，6000rcf×10min离心7种含药CSF(CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D)脱细胞，-20℃下冷冻备用。1.2试剂与药品均为市购。统计分析使用NDST4.4软件进行统计，数据用x±s表示，比较组间差异行t或t’检验。2方法与结果2.1原代乳鼠皮层细胞(primary cerebral cortex neurons，PCCN)培养取出生1-4d SD大鼠大脑皮层，用D-Hanks液洗涤2-3次，剪碎后用0.125％胰酶在37℃下消化15min，1000rpm离心7-10min，弃上清，用Hanks液清洗后，过100μm孔径金属网，再离心，用高糖DMEM培养液反复吹打，使细胞密度为1-10×105/ml，接种于涂有多聚赖氨酸的96孔培养板上，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，5-7d后加入10μmol/L阿糖胞苷作用2-3d，以抑制非神经元的过度增殖。2.2MTT比色分析在含100μl/孔培养液的96孔细胞培养板中，加入终浓度0.5mg/mlMTT溶液10μl/孔继续培养4h后，小心吸取上清90μl，再加入50μl DMSO，微型振荡器上振荡5min，ELISA仪测定光吸收值，波长490nm。MTT比色分析的原理是利用活细胞线粒体脱氢酶将染料MTT还原成甲瓒颗粒，以颗粒溶解后所呈现的颜色深浅(以OD490值表示)反映活细胞的数量及细胞代谢的活跃程度。
2.3CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D对连二亚硫酸钠诱导PCCN损伤的影响，参见Watanabe H，NiJW，Sakai Y，et al.Permanent occlusion of bilateral internal carotid arteries produces cognitive deficits intwo learning behavior tasks.Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi，1996，16(1)19-24；Ni JW，OhtaH，Matsumoto K，et al.Progessive cognitive impairment following chronic cerebral hypoperfusioninduced by permanent occlusion of bilateral carotid arteries in rats.Brain Res，1994，653231取长有DIV10 PCCN的96孔培养板，弃原培养液，Earle’s洗涤细胞1次，加无血清DMEM配10％(v/v)CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D与终浓度为2mmol/L的新配Na2S2O4共同作用细胞，设10％CSF作阴性对照。12h后MTT法观察CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D对细胞损伤的影响。
实验显示，与正常组比较，脱氧剂Na2O2S4明显降低模型组PCCN细胞OD490(p＜0.05)，提示PCCN出现缺氧样损伤；10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均可提高损伤PCCN细胞活力(p＜0.05-0.001)。其中，CSF-F作用最为显著，CSF-B与CSF-D作用也非常显著；三者两两合用作用基本未见增强；三者合用作用也非常显著，也未见协同增强。
2.4CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D对谷氨酸钠诱导PCCN损伤的影响，参见De Reuck JL.Evidence for chronic ischaemia in the pathogenesis of vascular dementiafrom neuroPATH to neuroPET.Acta Neurol Belg，1996，96(3)228-31；De Deyn PP，Goeman J，Engelborghs S，et al.From neuronal andvascular impairment to dementia.Pharmacopsychiatry，1999 ，32 Suppl 117-24取长有DIV13 PCCN的96孔培养板，弃原培养液，无血清DMEM洗涤细胞1次，加入无Mg2+-Earle’s溶500μmol/L MSG与细胞作用，20min后，弃去作用液，无血清DMEM洗涤细胞1次，换无血清DMEM配10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D100μl/孔，设10％CSF作阴性对照。16h后MTT法观察CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D对细胞损伤的影响。
实验显示，与正常组比较MSG明显降低模型组PCCN细胞OD490(p＜0.05)，提示PCCN出现缺血样损伤；10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均可不同程度提高损伤PCCN细胞活力。其中，与模型组比较，CSF-FBD、CSF-FB与CSF-D作用显著(p＜0.05)；CSF-F与CSF-B合用作用增强；单用CSF-D作用强于CSF-F或CSF-B。
本研究发现10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均可提高二亚硫酸钠与谷氨酸钠损伤PCCN细胞活力；其中，CSF-FBD与CSF-FB对2种细胞损伤均有保护作用；F、B、D单用时，CSF-F抗缺氧作用最为显著，而CSF-D抗缺血作用最强；三者两两合用，作用基本未见增强。然而，应用0.1，0.01μg/ml水平FBD，FB，FD，BD，F，B，D含药人工脑脊液(artificial CSF，ACSF)对抗谷氨酸钠时，发现ACSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均对神经元损伤有保护作用。并且作用趋势与含药CSF作用相似，如F、B、D单用时，ACSF-F抗缺血作用最为显著；ACSF-F与ACSF-D有协同作用。
VD为虚实夹杂之证，基本发病特点是痰、瘀、虚。FBD由茯苓、白术、当归组成，方中重用茯苓为君，豁痰利湿开窍，健脾安神益智；白术健脾益气，燥湿利水，助茯苓行湿化痰，统血保脉，上通清阳；当归化瘀生新，益精养髓，可助茯苓行湿化痰。全方共用化痰逐瘀，益气养血，而收安神益智，开窍除呆之功。
应用双侧颈总动脉永久性结扎与脑反复缺血再灌注分别制备实验性低灌注性痴呆与多梗塞性痴呆模型，考察了FBD不同组方，即FBD、FB、FD、BD、F、B、D，对2种整体VD模型的保护作用，结果显示FBD、FB、FD、BD、F、B、D对2种整体VD模型均有保护作用；FBD组方全方作用优于其他组合；FD与FB作用优于BD；F、B、D均有各自作用，F为FBD中主药。
应用连二亚硫酸钠与谷氨酸钠分别诱导乳鼠原代皮层细胞缺氧样与缺血样损伤，考察FBD不同组方含药脑脊液对两种离体VD模型的保护作用，结果显示10％CSF-FBD，FB，FD，BD，F，B，D均可不同程度保护2种细胞损伤；CSF-FBD与CSF-FB对2种细胞损伤均有显著保护作用；F、B、D单用时，CSF-F抗缺氧作用最为显著，而CSF-D抗缺血作用最强；三者两两合用，作用基本未见增强。
离体水平实验组方分析与整体实验组方分析结果基本一致，稍有区别。F作为FBD抗VD主药，与正交设计FBZ抗VD结果一致，证明F不仅是FBD中抗VD主药，也是DSS中抗VD主药。
二、FBD抗老年期痴呆的有效部位研究之一为了探索FBD抗老年期痴呆的有效部位，经文献检索FBD处方中各味药物的化学成分，药理作用的研究资料，确定茯苓中含三萜和多糖，白术中含挥发油和多糖，当归中含挥发油、有机酸和多糖。根据FBD中含有的化学成分，将FBD分为3个部位(1)FDB CO2超临界萃取部分P2(为小分子和低极性分子，含白术、当归挥发油，有机酸及茯苓三萜)；(2)FBD水提醇溶部分P3(为大极性部分)；(3)FBD水提醇沉部分P1(主要为多糖)。
通过整体动物模型(东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍、脑反复缺血再灌注诱导小鼠记忆障碍)和细胞模型(含药血清对PC12细胞缺氧缺血损伤的影响)相结合，进行有效部位的筛选。
FBD3个化学部位(part，P)性状、得率与用量见表4。
表4、各部位得率和处方剂量化学部位 性状 得率 部位用量总多糖(P1) 粉末 3.8g/100g生药 1.10g挥发油(P2) 油状物 2.29ml/100g生药 0.66ml浸膏(P3) 浸膏 26.6g/100g生药7.65g实验分组依据FBD组方3个化学部位的提取得率，计算出相应实验小鼠的剂量，见表5。
表5、样品浓度和动物剂量化学部位 浓度 剂量FBD 28.75g/500ml 1.15g/kgP1+P2+P3 1.10g+0.66ml+7.65g/500ml 43.7mg/kg+26.3μl/kg+305.9mg/kgP1+P2 1.10g+0.66ml/500ml43.7mg/kg+26.3μl/kgP1+P3 1.10g+7.65g/500ml 4.37mg/kg+305.9mg/kgP2+P3 0.66m1+7.65g/500ml26.3μl/kg+305.9mg/kgP11.10g/500ml 43.7mg/kgP20.66ml/500ml 26.3μl/kgP37.65g/500ml 305.9mg/kg
应用2种实验动物模型对8个样品进行药效学考察，初步明确主要有效部位。
实验模型(1)东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍；(2)脑反复缺血再灌注诱导小鼠记忆障碍；实验方法与结果(1)FBD3部位不同化学部位组合对脑反复缺血再灌注诱导小鼠记忆障碍的影响取雄性ICR小鼠，在进行反复缺血再灌注前置单盲端水迷宫训练，水温21-23℃，观察小鼠游泳时运动机能与空间分辩能力，时间超过15s者，可能存在运动机能、平衡机能与空间分辩能力缺陷，弃去不用。合格小鼠随机分为10组。1-8组连续igbid×6d，(9)-(10)组ig等容量的生理盐水。d4-5进行手术，术前10h禁食不禁水，1-8组小鼠ip 1.2g/kg10％乌拉坦使麻醉，待翻正反射消失后，仰位固定，75％医用酒精消毒颈部，行正中切口，钝性分离两侧颈总动脉，38±1℃下，先后施行10min断流(ischemia)、10min再灌(reperfusion)、10min再断流(ischemia)(10minI-10minR-10minI)手术，并于鼠尾近1cm处截断，使失血约10％全血容量，(1)组小鼠只分离动脉，不断流再灌也不失血。术中注意颈部创面点滴2-3滴2.50×104u/kg庆大霉素。观察手术后小鼠死亡率，以此评价药物抗急性脑缺血作用。
表6、FBD3部位不同化学部位组合对脑反复缺血再灌注诱导小鼠记忆障碍的影响组别 No.of pre-IR No.of post-IR Viability(％)FBD 12 8 66.6P1+P2+P3 12 8 66.6P1+P2 12 7 58.4P1+P3 12 9 75.0P2+P3 12 4 33.3P112 6 50.0P212 6 50.0P312 8 66.6假手术组 88 100模型组16 7 43.8(2)FBD3部位不同化学部位组合对东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍的影响东莨菪碱的配置取0.3mg/ml东莨菪碱注射液，1∶3稀释得0.075mg/ml。给药量为20ml/kg(ip)。
将昆明小鼠随机分为10组，连续ig qd×10d，d7上午1-8，10组ip Scop1.5mg/kg，9组ip等容量生理盐水，15min后用被动回避反射仪进行避暗(step-through)训练，参数为方波刺激波宽125ms；幅度38V.PP(避暗法)，24h后安静环境下测定小鼠从明室进入暗室的潜伏期，以此衡量小鼠的学习记忆能力。
表7、FBD3部位不同化学部位组合对东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍的影响(x±s，n＝8)组别 剂量 Latency(Lgs，x±s)FBD 1.15g/kg 1.82±0.46P1+P2+P3 43.7mg/kg+26.3μl/kg+305.9mg/kg 1.87±0.43P1+P243.7mg/kg+26.3μl/kg 2.27±0.05*P1+P34.37mg/kg+305.9mg/kg 2.02±0.34P2+P326.3μl/kg+305.9mg/kg1.59±0.44P1 43.7mg/kg2.06±0.27P2 26.3μl/kg 2.03±0.33P3 305.9mg/kg 2.19±0.23*假手术组 -2.25±0.08模型组 -1.81±0.44Δ(3)FBD3部位不同化学部位组合含药血清对PC12细胞缺氧缺血损伤的影响d10眼框采血，3500rcf×10min离心分离含药血清，56℃、30min水浴灭活血清，用于抗PC12细胞缺氧缺血损伤的血清药理学研究。
PC12细胞株由中国科学院细胞生理研究所提供，保存于-80℃超低温冰箱。实验前37℃快速复苏，1000rpm×5min离心，无血清DMEM洗涤，1000rpm×5min二次离心，用10％NCS DMEM接种于涂有多聚赖氨酸的75ml培养瓶，待37℃、5％CO2下长成单层后，用0.25％胰酶消化3-5min，10％NCS DMEM终止消化，反复吹打成细胞悬液，接种于涂有多聚赖氨酸的96孔培养板，37℃、5％CO2下长成单层。
取长满单层PC12的96孔培养板，弃原培养液，Earle’s洗涤细胞1次，用终浓度为2mmol/L的新配D-Hanks溶Na2S2O4与细胞作用1h，造成细胞缺氧损伤；Na2S2O4与细胞作用1h后，弃Na2S2O4作用液，Earle’s洗涤细胞1次，换无血清DMEM。加入10％浓度FBD 3部位不同组合小鼠的含药血清，10％空白血清作阴性对照，10％FBD含药血清作阳性对照，每组6孔细胞，均作用18h，MTT法观察含药血清对细胞缺氧损伤的影响。
取长满单层PC12的96孔培养板，弃原培养液，Earle’s液洗涤细胞1次，无Mg2+-Earle’s液溶500μmol/LMSG与细胞作用，20min后弃去作用液，Earle’s液洗涤细胞1次，换无血清DMEM。加入10％浓度FBD 3部位不同组合小鼠的含药血清，10％空白血清作阴性对照，10％FBD含药血清作阳性对照，每组6孔细胞，均作用18h，MTT法观察含药血清对细胞缺氧损伤的影响。
表8、FBD 3部位不同化学部位组合含药血清对2mmol/LNaS2O4and 0.5mmol/LMSG诱导PC12细胞缺氧缺血损伤的影响(x±s，n＝6)OD490组别缺氧 缺血对照组 0.376±0.069 0.438±0.051模型组 0.109±0.014ΔΔΔ0.257±0.037ΔΔΔ血清-FBD 0.165±0.028**0.342±0.052*血清-(P1+P2+P3)0.152±0.023**0.323±0.052*血清-(P1+P2) 0.171±0.021***0.334±0.045**血清-(P1+P3) 0.154±0.036*0.324±0.049*血清-(P2+P3) 0.128±0.024*0.307±0.047血清-P10.139±0.020*0.321±0.037*血清-P20.148±0.023**0.316±0.047*血清-P30.139±0.022*0.311±0.025*ΔΔΔp＜0.001vs对照组；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vs模型组(4)FBD中间水提物部位及其正丁醇萃取物、剩余水提物对东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍的影响用正丁醇萃取FBD中间水提物部位(P3)，得正丁醇萃取物(P3-n-Bu)与剩余水提物(P3-H2O)，得率分别为14.9g/100g生药与6.8g/100g生药。
取雄性昆明小鼠42只，随机分为7组，6只/组，各部位组合药液均按0.5ml/20g给药。1-7组连续igbid×7d，d4上午2-7组ip Scop2.0mg/kg，(1)组ip等容量生理盐水，20min后用被动回避反射仪进行避暗(step-through)训练，参数为方波刺激波宽125ms；幅度35V.PP(避暗法)，24h后安静环境下测定小鼠从明室进入暗室的潜伏期与3.5min内的错误次数(No.of errors)，以潜伏期与错误次数衡量小鼠的学习记忆能力。
表9、FBD中间水提物部位及其正丁醇萃取物、剩余水提物对东莨菪碱诱发小鼠记忆障碍的影响(x±s，n＝6)组别 剂量(bid×3d)潜伏期(Lgs) 错误次数Normal 2.29±0.07 0.2±0.4模型组 1.80±0.36Δ1.6±0.5ΔΔP1+P2+P3(43.7mg+26.3μl+305.9mg)/kg1.92±0.54 0.6±0.5*P1+P2 (43.7mg+26.3μl)/kg2.06±0.28 0.8±0.4*P3 305.9mg/kg 2.14±0.28 0.3±0.5**P1+P2+P3-n-Bu (43.7mg+26.3μl+78.2mg)/kg 2.20±0.28 0.2±0.4**P1+P2+P3-H2O (43.7mg+26.3μl+171.4mg)/kg1.63±0.39 1.2±0.4Δp＜0.05，ΔΔp＜0.01vsnormal；*p＜0.05，**p＜0.01vs模型组(5)FBD中间水提物部位及其正丁醇萃取物、剩余水提物含药血清对PC12细胞缺氧缺血损伤的影响d7结束行为药理学实验后眼框采血，3500rcf×10min离心分离含药血清，56℃、30min水浴灭活血清，用于抗PC12细胞缺氧缺血损伤的血清药理学研究。实验方法同实验(3)。
表10、FBD正丁醇萃取物、水提物对缺水再灌注致小鼠记忆障碍的影响(避暗法)组别 Latency(Logs)假手术组 2.38±0.00模型组 2.23±0.18*
FBD2.31±0.18P1+P2 2.30±0.20P1+P2+P3-n-Bu 2.28±0.25P1+P2+P3-Wa2.26±0.31表11、FBD正丁醇萃取物、水提物对缺水再灌注致小鼠记忆障碍的影响(水迷宫法)1bt 2bt 3btLearn memorylearn memorylearn memory假手术组 1.07±0.210.90±0.221.33±0.311.24±0.261.47±0.261.67±0.31模型组 1.44±0.23##1.32±0.24##1.66±0.23#1.46±0.241.66±0.23#1.75±0.33FBD1.17±0.281.14±0.191.35±0.301.26±0.251.55±0.261.53±0.43P1+P2 1.31±0.371.04±0.25*1.33±0.271.32±0.231.64±0.211.60±0.32P1+P2+P3-n-Bu 1.19±1.261.08±0.231.41±0.311.41±0.311.63±0.271.78±0.26P1+P2+P3-Wa1.28±0.321.13±0.191.57±0.231.57±0.231.69±0.281.71±0.34表12、FBD正丁醇萃取物，剩余水提物的含药血清对PC12细胞损伤模型的作用OD490组别缺氧缺血对照组 0.597±0.0310.583±0.036模型组 0.284±0.043###0.272±0.059血清-(P1+P2+P3) 0.321±0.0340.314±0.017血清-(P1+P2) 0.340±0.0530.364±0.040*血清-(P1+P2+P3-n-Bu) 0.306±0.0550.340±0.044*血清-(P1+P2+P3-Wa) 0.312±0.0370.344±0.056综合以上实验，确定FBD中P1+P2为FBD防治老年性痴呆的有效部位，其制备工艺为FBD经CO2超临界萃取后，分别得P2部位和药渣。取药渣，用水煎，得水提物，加入乙醇，沉淀为(P1，主含多糖)，上清液是P3。
对P1+P2进行化学成分的研究，为今后的质量标准奠定基础。
精简方FBD有效部位不但保留了而且增强了防治老年期痴呆的作用，特别是对VD的防治效果。
精简方FBD有效部位的原料药比原方DSS减少了一半，所以药物的成本大大降低，病人服用的药量减少，但疗效却相同，某些方面甚至明显增强，尤其适用于VD型老年期痴呆的患者。
精简方FBD有效部位对VD型老年期痴呆的患者治疗更有针对性，用药更加准确，疗效显著提高。
精简方FBD有效部位在制备各种剂型、尤其是在制备现代制剂方面不但比原方而且比精简方FBD具有优势。同时，由于精简方FB有效部位中的杂质及无抗痴呆作用的成份减少，使得质量监测和控制也相对容易。
三、FBD抗老年期痴呆的有效部位研究之二虽然实验证明P1+P2为FBD防治老年性痴呆的有效部位，然而在研究过程中，亦发现其中P3即水提醇溶部分，对小鼠的整体状态有显著改善作用。进而，对P3部分用正丁醇萃取，浓缩正丁醇萃取液后，再与P1+P2部分组合。实验表明P1+P2+P3部分的正丁醇萃取物，不仅具有显著的防治老年性痴呆疗效，而且可小鼠全身精神状态亦有明显改善。
四、FBD抗老年期痴呆的有效部位研究之三考虑到工业化实施，为进一步简化工艺，在上述研究基础上，对FBD有效部位及其提取方法再次进行筛选。制备FBD水提液不同化学部位，用东莨菪碱致小鼠老年痴呆模型筛选有效部位，用老年大鼠颈外动脉注血栓模型检测有效部位对多发脑梗塞性痴呆的治疗作用，以及对大鼠脑梗塞致记忆障碍的影响。发现多糖+正丁醇部位与多糖+水部位对东莨菪碱致小鼠记忆障碍有明显的保护作用，多糖+正丁醇部位对多发脑梗塞性痴呆有明显的治疗作用。1.FBD化学部位的提取工艺及得率FBD水提液经水提醇沉得总多糖部位(Ps)，剩余浸膏部位(Ex)用正丁醇萃取得正丁醇部位(nBu)，和水部位(Wa)。FBD的4个化学部位，提取工艺流程图如下，性状、得率见表13。
FBD各化学部位提取流程详细说明取FBD，用10倍体积水浸泡1小时，煮沸，保持微沸1小时，过滤，得药渣与上清液(1)。取药渣加水8倍，煮沸并保持1小时后，过滤，药渣弃去，得上清液(2)。合并上清液(1)与上清液(2)后浓缩，向浓缩液中加95％乙醇，沉淀得多糖，过滤并用丙酮洗涤所得多糖(Ps，含量56％)。取滤除多糖沉淀的上清液，回收乙醇后的提取物(Ex)，用水饱和的正丁醇萃取5次，分别得到正丁醇部位(nBu)和水部位(Wa)。
本发明方法中多糖是干粉，正丁醇提取物是浸膏，如果能保证原料药质量，而且工艺固定，一般说能保持恒定的比例和重现性。
表13、FBD及各化学部位的性状和得率
2.实验动物雄性ICR小鼠18-22g，中国药科大学动物房提供，雄性SD大鼠(350-400g)，江苏南京青龙山动物房提供，合格证号SCXK苏-20020018。3.实验方法与结果3.1FBD各化学部位对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的影响雄性ICR小鼠18-23g，随机分组，组别与给药剂量如表14(qd，0.2mL/10g)，连续给药6天，正常与模型组给予等量蒸馏水，第6天给药后2h，ip东莨菪碱3mg/kg，20min后进行避暗训练，电压38V，24h后检测避暗潜伏期与5min内错误次数，如表15所示。
表14、小鼠分组及给药剂量(所有部位剂量均相当于小鼠生药剂量2.3g/kg)
注所有药物皆用蒸馏水直接配制，含正丁醇部位的水溶液有少许难溶物，用超声助溶。
表15、FBD及各化学部位对东莨菪碱致小鼠记忆障碍的影响(x±s)
注ΔΔP＜0.01vsnormal；*P＜0.05vs模型组。
东莨菪碱致痴呆模型(Scop)制备成功，但FBD及其单化学部位并没有显著改善由东莨菪碱导致的小鼠记忆障碍，多糖(P1)与正丁醇部位(nBu)改善作用相对较好，P1+nBu与P1+Wa组合有显著的改善记忆障碍作用，考虑到nBu部位得率只有Wa部位的1/10，用量相对较少，而Wa部分不仅成分复杂，糖分含量较高，有效成份不易提纯，且得率高，会导致剂量太大。所以把P1+nBu作为有效部位来进一步考察其对不同模型导致的动物记忆障碍的改善作用。
3.2P1+nBu部位对颈外动脉注血栓致大鼠多发梗塞性痴呆的影响雄性SD大鼠(300-400g)，参照文献(梅建勋等，多发梗塞性痴呆(MID)动物模型的改进与应用，中风与神经疾病杂志，1999，16(2)100-102)经改进方法造模，改血栓浓度为10mg/mL，手术成功的大鼠随机分组，组别与给药剂量如表16所示(qd，0.7mL/100g)，假手术组仅分离动脉，不进行注栓手术。术后连续灌胃10天，假手术组给等量蒸馏水，第7天按文献(刘景根等蝙蝠葛苏林碱对小鼠和大鼠脑缺血的保护作用，中国药理学通报，1998，14(1)18-21)进行大鼠行为评分，第8天进行避暗训练，电压45V，24h后检测避暗潜伏期，第10天按文献方法(张均田，现代药理实验方法北京医科大学中国协和医科大学联合出版社1241)进行脑组织TTC染色，仔细分离梗塞区域，测量脑梗塞区域占全脑的比例。行为评分结果、避暗成绩及脑组织梗塞比例的测定结果见表17。
表16、大鼠分组及给药剂量(所有部位剂量均相当于大鼠生药剂量1.3g/kg)
注都可喜为糖衣片(duxil，法国施维雅药厂生产。每片含阿米三嗪二甲磺酸盐30mg与萝巴新100mg)，去糖衣后超声助溶成混悬液。
表17、P1+nBu部位对颈外动脉注血栓致大鼠多发梗塞性痴呆的影响(x±s)
注ΔΔP＜0.01Vs假手术组；*P＜0.05VS模型组；**P＜0.01VS模型组；Ps+nBu(L)由FBD临床剂量换算而来，行为评分分值越高，表明行为障碍越严重。由两名操作者同时评分，互不干涉，取两者打分的平均值。
实验表明颈外动脉逆行注射血栓，造成的明显的行为障碍、记忆障碍、脑梗塞占全脑比例明显比假手术组高。阳性药都可喜和Ps+nBu部位的低剂量(L)与高剂量(H)对以上模型障碍有明显改善作用，与模型组相比明显减少脑梗塞面积，但Ps+nBu部位并没有呈现量效关系，可见P1+nBu的剂量设计应该下调。
具体实施例方式
实施例1取茯苓25g 白术12g当归7g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖(2.3g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位(0.71g)，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，压成片剂。
实施例2取茯苓25g白术12g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，压成片剂。
实施例3取茯苓25g当归7g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，压成片剂。
实施例4取茯苓25g，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，压成片剂。
实施例5取当归7g，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，压成片剂。
实施例6取茯苓50g 白术40g当归20g，混合后，CO2超临界萃取提取挥发油(2.5ml)，控制提取罐压力为10.0MP，温度为35℃，提取时间为2小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为90％，沉淀，得到总多糖(4.2g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物(7.5g)，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。
实施例7取茯苓50g、当归20g，混合后，夹带剂用己烷，进行CO2超临界萃取提取挥发油，控制提取罐压力为9.0MP，温度为32℃，提取时间为3小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为95％，沉淀，得到总多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。
实施例8取白术40g当归20g，混合后，CO2超临界萃取提取挥发油，控制提取罐压力为14.0MP，温度为32℃，提取时间为1小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为75％，沉淀，得到总多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。
实施例9取茯苓50g白术40g混合后，CO2超临界萃取提取挥发油，控制提取罐压力为12.0MP，温度为35℃，提取时间为2小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为85％，沉淀，得到总多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。
实施例10取当归20g，用乙酸乙酯作为夹带剂，进行CO2超临界萃取提取挥发油，控制提取罐压力为8.0MP，温度为40℃，提取时间为3小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为90％，沉淀，得到总多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。
实施例11取茯苓40g 白术20g 当归10g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖(3.7g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位(1.1g)，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，灌制胶囊。
实施例12取茯苓40g 白术20g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，灌制胶囊。
实施例13取白术20g 当归10g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，灌制胶囊。
实施例14取茯苓40g 当归10g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，灌制胶囊。
实施例15
取茯苓40g，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，灌制胶囊。
实施例16取茯苓40g白术20g当归12g，混合后，用乙醇用夹带剂，进行CO2超临界萃取提取挥发油(1.64ml)，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到总多糖(2.74g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取(4.9g)，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量淀粉，制粒，灌制胶囊16粒。服用剂量一日服用2次，每次2粒。
实施例17取茯苓50g白术25g当归15g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖(4.77g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位(1.46g)，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，制成片剂18片。服用剂量一日服用2次，每次2片。
权利要求
1.一种防治老年痴呆的中药组合物，其特征在于主要由茯苓、白术和当归组成的原料药中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成，或者主要由选自茯苓、白术和当归中的一种或两种原料药中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成。
2.根据权利要求1所述中药组合物，其特征在于主要由茯苓或白术或当归，或茯苓和白术，或者茯苓和当归，或者白术和当归，或者茯苓、白术和当归中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成。
3.根据权利要求2所述中药组合物，其特征在于主要由茯苓2-6份∶白术1-3份∶当归0.5-1.5份中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油组成，多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1～1.5克∶5～10克∶0.4～1.2毫升。
4.根据权利要求2所述中药组合物，其特征在于主要由茯苓4份∶白术2份∶当归1份中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油组成，多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1.1～1.2克∶7～8克∶0.6～0.8毫升。
5.权利要求1～4之一中药组合物制备方法，其特征在于取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，CO2超临界萃取提取挥发油，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到多糖，合并挥发油与多糖；或者，取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，CO2超临界萃取提取挥发油，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并挥发油、多糖及正丁醇提取物；或者，取茯苓、白术和当归，或者选自茯苓、白术和当归中的一种或两种，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位，合并多糖与正丁醇提取物。
6.根据权利要求5所述中药组合物制备方法，其特征在于取茯苓或白术或当归，或者取茯苓和白术，或者取白术和当归，或者取茯苓和当归，或者取茯苓、白术和当归；CO2超临界萃取罐压力8.0-25.0Mpa，夹带剂用乙醇、乙酸乙酯和/或己烷，夹带剂量按体积/重量比是药料量的30.0-150％；加乙醇至含醇浓度为45-95％时沉淀多糖。
7.根据权利要求5或6所述中药组合物制备方法，其特征在于取茯苓2-6份∶白术1-3份∶当归0.5-1.5份，所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1～1.5克∶5～10克∶0.4～1.2毫升。
8.根据权利要求7所述中药组合物制备方法，其特征在于所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的比为1.1～1.2克∶7～8克∶0.6～0.8毫升。
9.根据权利要求5～8之一所述中药组合物制备方法，其特征在于所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油，可与药学上适用组分混合，制成各种制剂。
10.根据权利要求9所述中药组合物制备方法，其特征在于所得多糖、正丁醇提取物和/或挥发油，可与药学上适用载体混合，制成各种制剂。
全文摘要
一种防治老年痴呆的中药组合物，主要由茯苓和/或白术和/或当归中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油的有效部位组成，可与药学上适用载体混合，制成各种制剂，本发明还包括可工业化应用的提取分离方法。
文档编号A61P25/28GK1481808SQ0313220
公开日2004年3月17日 申请日期2003年7月31日 优先权日2003年7月31日
发明者朱丹妮, 余伯阳, 沈平孃, 严永清, 阮克锋, 林志宏, 王鹏, 寇俊萍, 顾维, 周迎新 申请人:中国药科大学, 上海中药制药技术有限公司
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