重组水蛭素的新用途的制作方法
专利名称：重组水蛭素的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组水蛭素的新用途，尤其涉及在制药领域中的用途。
背景技术：
水蛭素是从医用水蛭唾液腺提取的含65-66个氨基酸的蛋白，为单链多肽，分子质量为7000u，分子中含3对二硫键，在1-49位形成了高度折叠、致密的三级结构，使此结构域稳固，而线形的C端序列用以结合凝血酶。作为凝血酶的特异性抑制剂，它有很强的抗凝活性，能有效预防和治疗弥散性血管内凝结，在心血栓及脑血栓等疾病方面均有显著作用。由于天然水蛭素来源有限，目前广泛利用生物工程技术制备重组水蛭素，最广泛的两类细胞表达体系分别为大肠杆菌(E.coli)和釀酒酵母(S.cerevisiae)。CN1319671A中公开了重组水蛭素的制备方法。临床上，重组水蛭素多用于治疗不稳定性心绞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血(DIC)等(MarkwardtF.Hirudin as an inhibitor of thrombin[J].Methods in Enzymelogy，1970，19924)。临床实验表明重组水蛭素不引起过敏、免疫反应，并且不会造成循环功能障碍。但未见有预防和治疗白内障疾病的药理报道及临床应用。
发明内容
本发明公开了重组水蛭素的一种新用途，特别是重组水蛭素在制备预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。
在白内障的发生过程中，均伴有晶体内的种种生化代谢改变如脂质过氧化加速，醛糖还原酶活性增高、超氧化物歧化酶及谷胱甘肽还原酶等活性降低，ATP浓度下降，一些氨基酸、维生素及还原性物质减少，电解质平衡失调以及晶体蛋白聚合和结构性质改变等。因此，防治白内障的途径也是多方面的如利用抗氧化剂或抗氧化激活剂以清除或中和紫外线、电离辐射、化学物质以及代谢产物等对晶体的有害损伤，通过补充维生素、辅酶(NADP)、谷胱甘肽以及ATP等，以减少晶体内的生化代谢改变，通过封闭蛋白质的一些活泼基团，以保护蛋白质免受有盐害化学物质形成加合物而造成损伤。在药理学试验中，检测一个药物是否对改善白内障有益，通常看待测药物是否能使晶体内SOD活力升高、MDA含量下降。
我们的试验发现重组水蛭素对眼无刺激，可显著推迟白内障发生时间，减轻晶状体浑浊程度，降低MDA含量，增大SOD活力。对白内障有显著的防治作用。
为了更好地发挥疗效，将重组水蛭素制备成药学上常用制剂，优选的制剂为滴眼液、眼膏剂、注射剂。滴眼液的制备中，除加入缓冲溶液，还可加入对眼无刺激的促吸收剂、增稠剂、等渗剂、抑菌剂等。局部用眼药的剂量一般为0.001～0.01g/日，也可根据不同情况超出该剂量范围。
以下是本发明的部分药理学试验及数据，所用重组水蛭素依据CN1319671A方法制备得到一、多次眼刺激试验试验动物家兔1.8-2.3Kg，4只。南京安立默科技有限公司，许可证号SCXK(苏)20020-0002试验方法按《临床前研究指导原则汇编》中华人民共和国卫生部药政局标准进行，将重组水蛭素滴眼液(0.5g/100ml)滴入眼结膜囊内。然后轻合眼睑约10秒，以确保受试物与局部的接触充分。另外一只眼将溶剂滴入眼结膜囊内，作为对照。
观察期与观察指标在1、24、48、72hr进行眼部检查，连续观察7天。除了应观察结膜、角膜、虹膜外，其他所观察到的损伤也应记录和报告。每次检查，都应记录眼部的反应的分值。试验结果将每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激性反应分值相加得总积分，将一组的总积分除以动物数，即得最后分值，见下表.
各个观察时间各组眼睛最后得分试验动物组 1h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 7d给药一侧眼睛00000 0 0 0对照一侧眼睛00000 0 0 0试验结论重组水蛭素滴眼剂对给药一侧眼睛眼角膜、虹膜和结膜未出现刺激性，与对照一侧眼睛一样；重组水蛭素滴眼剂无眼刺激性。
二、防治大鼠白内障试验试验动物28日龄SD大鼠60只，体重53.5-68g，雌雄各半。由中国药科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(苏)2001-001。试验方法28日龄SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只正常对照组(生理盐水)，模型对照组(只造模不给药)，阳性对照组(白内停Pir0.4mg/kg)，结膜囊内点滴高、中、低剂量组(重组水蛭素1.68mg/kg，0.84mg/kg，0.42mg/kg)。各组给药容积均为0.25ml/50g。除正常对照组，其他组腹腔注射0.08％的D-半乳糖溶液，相当于20mg/kg，1次/日，连续腹腔注射14天，给药容积为25ml/kg，并饮用10％D-半乳糖溶液。在诱发半乳糖性白内障的第4天，分别点双眼高剂量(1.68mg/kg)，中剂量(0.84mg/kg)及低剂量(0.42mg/kg)重组水蛭素(5次/日)。第3天开始用检眼仪观察大鼠晶状体的浑浊度，并记录第8，14天晶状体的变化，于实验结束后取大鼠晶状体，测定晶状体中MDA含量和SOD活力。
晶状体观察结果以Ridit法进行统计分析；MDA及SOD测定结果中各组均与白内障模型组进行组间t检验。
试验结果1、重组水蛭素对D-半乳糖所致的大鼠晶状体变化的影响。结果见表1、表2。
表1、 重组水蛭素对白内障大鼠晶状体浑浊度的影响(第8日)(n＝10)组别剂量(mg/kg) / + ++ +++ 合计阴性组 ----10 0 00**10模型组 ----00 2810Pir 0.4 82 00**10高剂量r-H 1.6873 00**10中剂量r-H 0.8482 00**10低剂量r-H 0.4281 10**10合计41 8 3860/无浑浊 +轻微浑浊 ++中等浑浊 +++严重浑浊**表示u＞2.58，与模型组比较表2、重组水蛭素对白内障大鼠晶状体浑浊度的影响(第14日)(n＝10)组别剂量(mg/kg) / +++ +++ 合计阴性组 ---- 10 00 0**10模型组 ---- 0 01 9 10Pir 0.49 10 0**10高剂量r-H 1.68 8 20 0**10中剂量r-H 0.84 7 30 0**10低剂量r-H 0.42 8 11 0**10合计 42 72 9 60/无浑浊 +轻微浑浊 ++中等浑浊 +++严重浑浊**表示u＞2.58，与模型组比较结果表明各给药组晶状体浑浊度较模型组而言均有非常显著差异。2、各组大鼠晶状体中SOD活力比较结果见表3表3重组水蛭素对白内障大鼠晶状体中SOD活力的影响(x±S)(n＝10)组别 剂量(mg/kg) SOD(NU/mgprot)阴性组 ---- 137.2±13.7**模型组 ---- 37.5±19.0pir 0.4 133.5±31.3**高剂量r-H 1.68 130.4±24.9**
中剂量r-H 0.84123.6±18.8**低剂量r-H 0.42122.2±19.2****P＜0.01，与模型组比较结果表明重组水蛭素高剂量组及阳性药白内停均能明显升高SOD活力，与模型对照组比较有极显著差异(p＜0.01)，且与剂量呈正相关性。
3、各组大鼠晶状体中MDA含量比较见表4表4重组水蛭素对白内障大鼠晶状体中MDA含量的影响(x±S)(n＝10)组别剂量(mg/kg) MDA(nmol/mgprot)阴性组 ---- 6.34±1.19**模型组 ---- 24.29±4.72pir0.4 14.81±2.91**高剂量r-H 1.68 15.14±3.32**中剂量r-H 0.84 16.19±3.27**低剂量r-H 0.42 16.87±4.24****P＜0.01，与模型组比较结果表明重组水蛭素高、中、低剂量组及阳性药白内停均能明显降低MDA含量，与模型对照组比较有极显著差异(p＜0.01)，且与剂量呈正相关性。试验结论重组水蛭素可显著推迟白内障发生时间，减轻晶状体浑浊程度，降低MDA含量，增大SOD活力。重组水蛭素对半乳糖诱导的大鼠白内障有显著的防治作用。
具体实施例方式
重组水蛭素滴眼液配方及其制备方法重组水蛭素 0.25g硼酸 1.116g硼砂 0.191g氯化钠 0.22gEDTA 0.5g壳聚糖 0.5g对羟基苯甲酸乙酯 0.03g蒸馏水 加至100ml硼酸、硼砂加水制备成pH7.4的缓冲溶液，用缓冲溶液溶解重组水蛭素、EDTA、壳聚糖、氯化钠、对羟基苯甲酸己酯，混匀、过滤、除菌分装，即得本发明的重组水蛭素滴眼液。
权利要求
重组水蛭素在制备预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了重组水蛭素的一种新用途，具体说是在制备预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。
文档编号A61P27/00GK1483473SQ0313222
公开日2004年3月24日 申请日期2003年8月4日 优先权日2003年8月4日
发明者吴梧桐, 谭树华, 崔莉, 李运曼 申请人:中国药科大学
技术领域：
本发明涉及重组水蛭素的新用途，尤其涉及在制药领域中的用途。
背景技术：
水蛭素是从医用水蛭唾液腺提取的含65-66个氨基酸的蛋白，为单链多肽，分子质量为7000u，分子中含3对二硫键，在1-49位形成了高度折叠、致密的三级结构，使此结构域稳固，而线形的C端序列用以结合凝血酶。作为凝血酶的特异性抑制剂，它有很强的抗凝活性，能有效预防和治疗弥散性血管内凝结，在心血栓及脑血栓等疾病方面均有显著作用。由于天然水蛭素来源有限，目前广泛利用生物工程技术制备重组水蛭素，最广泛的两类细胞表达体系分别为大肠杆菌(E.coli)和釀酒酵母(S.cerevisiae)。CN1319671A中公开了重组水蛭素的制备方法。临床上，重组水蛭素多用于治疗不稳定性心绞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血(DIC)等(MarkwardtF.Hirudin as an inhibitor of thrombin[J].Methods in Enzymelogy，1970，19924)。临床实验表明重组水蛭素不引起过敏、免疫反应，并且不会造成循环功能障碍。但未见有预防和治疗白内障疾病的药理报道及临床应用。
发明内容
本发明公开了重组水蛭素的一种新用途，特别是重组水蛭素在制备预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。
在白内障的发生过程中，均伴有晶体内的种种生化代谢改变如脂质过氧化加速，醛糖还原酶活性增高、超氧化物歧化酶及谷胱甘肽还原酶等活性降低，ATP浓度下降，一些氨基酸、维生素及还原性物质减少，电解质平衡失调以及晶体蛋白聚合和结构性质改变等。因此，防治白内障的途径也是多方面的如利用抗氧化剂或抗氧化激活剂以清除或中和紫外线、电离辐射、化学物质以及代谢产物等对晶体的有害损伤，通过补充维生素、辅酶(NADP)、谷胱甘肽以及ATP等，以减少晶体内的生化代谢改变，通过封闭蛋白质的一些活泼基团，以保护蛋白质免受有盐害化学物质形成加合物而造成损伤。在药理学试验中，检测一个药物是否对改善白内障有益，通常看待测药物是否能使晶体内SOD活力升高、MDA含量下降。
我们的试验发现重组水蛭素对眼无刺激，可显著推迟白内障发生时间，减轻晶状体浑浊程度，降低MDA含量，增大SOD活力。对白内障有显著的防治作用。
为了更好地发挥疗效，将重组水蛭素制备成药学上常用制剂，优选的制剂为滴眼液、眼膏剂、注射剂。滴眼液的制备中，除加入缓冲溶液，还可加入对眼无刺激的促吸收剂、增稠剂、等渗剂、抑菌剂等。局部用眼药的剂量一般为0.001～0.01g/日，也可根据不同情况超出该剂量范围。
以下是本发明的部分药理学试验及数据，所用重组水蛭素依据CN1319671A方法制备得到一、多次眼刺激试验试验动物家兔1.8-2.3Kg，4只。南京安立默科技有限公司，许可证号SCXK(苏)20020-0002试验方法按《临床前研究指导原则汇编》中华人民共和国卫生部药政局标准进行，将重组水蛭素滴眼液(0.5g/100ml)滴入眼结膜囊内。然后轻合眼睑约10秒，以确保受试物与局部的接触充分。另外一只眼将溶剂滴入眼结膜囊内，作为对照。
观察期与观察指标在1、24、48、72hr进行眼部检查，连续观察7天。除了应观察结膜、角膜、虹膜外，其他所观察到的损伤也应记录和报告。每次检查，都应记录眼部的反应的分值。试验结果将每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激性反应分值相加得总积分，将一组的总积分除以动物数，即得最后分值，见下表.
各个观察时间各组眼睛最后得分试验动物组 1h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 7d给药一侧眼睛00000 0 0 0对照一侧眼睛00000 0 0 0试验结论重组水蛭素滴眼剂对给药一侧眼睛眼角膜、虹膜和结膜未出现刺激性，与对照一侧眼睛一样；重组水蛭素滴眼剂无眼刺激性。
二、防治大鼠白内障试验试验动物28日龄SD大鼠60只，体重53.5-68g，雌雄各半。由中国药科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(苏)2001-001。试验方法28日龄SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只正常对照组(生理盐水)，模型对照组(只造模不给药)，阳性对照组(白内停Pir0.4mg/kg)，结膜囊内点滴高、中、低剂量组(重组水蛭素1.68mg/kg，0.84mg/kg，0.42mg/kg)。各组给药容积均为0.25ml/50g。除正常对照组，其他组腹腔注射0.08％的D-半乳糖溶液，相当于20mg/kg，1次/日，连续腹腔注射14天，给药容积为25ml/kg，并饮用10％D-半乳糖溶液。在诱发半乳糖性白内障的第4天，分别点双眼高剂量(1.68mg/kg)，中剂量(0.84mg/kg)及低剂量(0.42mg/kg)重组水蛭素(5次/日)。第3天开始用检眼仪观察大鼠晶状体的浑浊度，并记录第8，14天晶状体的变化，于实验结束后取大鼠晶状体，测定晶状体中MDA含量和SOD活力。
晶状体观察结果以Ridit法进行统计分析；MDA及SOD测定结果中各组均与白内障模型组进行组间t检验。
试验结果1、重组水蛭素对D-半乳糖所致的大鼠晶状体变化的影响。结果见表1、表2。
表1、 重组水蛭素对白内障大鼠晶状体浑浊度的影响(第8日)(n＝10)组别剂量(mg/kg) / + ++ +++ 合计阴性组 ----10 0 00**10模型组 ----00 2810Pir 0.4 82 00**10高剂量r-H 1.6873 00**10中剂量r-H 0.8482 00**10低剂量r-H 0.4281 10**10合计41 8 3860/无浑浊 +轻微浑浊 ++中等浑浊 +++严重浑浊**表示u＞2.58，与模型组比较表2、重组水蛭素对白内障大鼠晶状体浑浊度的影响(第14日)(n＝10)组别剂量(mg/kg) / +++ +++ 合计阴性组 ---- 10 00 0**10模型组 ---- 0 01 9 10Pir 0.49 10 0**10高剂量r-H 1.68 8 20 0**10中剂量r-H 0.84 7 30 0**10低剂量r-H 0.42 8 11 0**10合计 42 72 9 60/无浑浊 +轻微浑浊 ++中等浑浊 +++严重浑浊**表示u＞2.58，与模型组比较结果表明各给药组晶状体浑浊度较模型组而言均有非常显著差异。2、各组大鼠晶状体中SOD活力比较结果见表3表3重组水蛭素对白内障大鼠晶状体中SOD活力的影响(x±S)(n＝10)组别 剂量(mg/kg) SOD(NU/mgprot)阴性组 ---- 137.2±13.7**模型组 ---- 37.5±19.0pir 0.4 133.5±31.3**高剂量r-H 1.68 130.4±24.9**
中剂量r-H 0.84123.6±18.8**低剂量r-H 0.42122.2±19.2****P＜0.01，与模型组比较结果表明重组水蛭素高剂量组及阳性药白内停均能明显升高SOD活力，与模型对照组比较有极显著差异(p＜0.01)，且与剂量呈正相关性。
3、各组大鼠晶状体中MDA含量比较见表4表4重组水蛭素对白内障大鼠晶状体中MDA含量的影响(x±S)(n＝10)组别剂量(mg/kg) MDA(nmol/mgprot)阴性组 ---- 6.34±1.19**模型组 ---- 24.29±4.72pir0.4 14.81±2.91**高剂量r-H 1.68 15.14±3.32**中剂量r-H 0.84 16.19±3.27**低剂量r-H 0.42 16.87±4.24****P＜0.01，与模型组比较结果表明重组水蛭素高、中、低剂量组及阳性药白内停均能明显降低MDA含量，与模型对照组比较有极显著差异(p＜0.01)，且与剂量呈正相关性。试验结论重组水蛭素可显著推迟白内障发生时间，减轻晶状体浑浊程度，降低MDA含量，增大SOD活力。重组水蛭素对半乳糖诱导的大鼠白内障有显著的防治作用。
具体实施例方式
重组水蛭素滴眼液配方及其制备方法重组水蛭素 0.25g硼酸 1.116g硼砂 0.191g氯化钠 0.22gEDTA 0.5g壳聚糖 0.5g对羟基苯甲酸乙酯 0.03g蒸馏水 加至100ml硼酸、硼砂加水制备成pH7.4的缓冲溶液，用缓冲溶液溶解重组水蛭素、EDTA、壳聚糖、氯化钠、对羟基苯甲酸己酯，混匀、过滤、除菌分装，即得本发明的重组水蛭素滴眼液。
权利要求
重组水蛭素在制备预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了重组水蛭素的一种新用途，具体说是在制备预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。
文档编号A61P27/00GK1483473SQ0313222
公开日2004年3月24日 申请日期2003年8月4日 优先权日2003年8月4日
发明者吴梧桐, 谭树华, 崔莉, 李运曼 申请人:中国药科大学
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