rhBTR基因与基因探针的制备及其应用的制作方法
专利名称：rhBTR基因与基因探针的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人脑硫氧还蛋白还原酶基因(rhBTR基因)及其克隆方法，以及rhBTR基因探针、rhBTR基因酶蛋白及其应用。
神经系统退行性疾病如早老性痴呆(AD)，帕金森氏病(PD)，在60岁以上的老年中发病率较高，在美国，AD已是继心脏病、肿瘤、脑卒死中之后的第四位死亡原因。由于AD等病在病因学、临床和病理学上有千差万别，但最终导致细胞功能不良，突触丧失和神经元死亡。在临床诊治方面未能找到有效的方法。而近3-5年内，有关蛋白酶和抗蛋白酶在此类疾病的发病机制以及在临床诊断和治疗方面的探索，成为研究热点之一。
硫氧还蛋白还原酶(TR)是硫氧还蛋白系统(Trx系统)的组成成份之一(参LaurentT.C，et al.J Biol.Chem，1964，2393436-44)。参与细胞增殖、分化，维持细胞内外氧化还原平衡，调节蛋白质正常折叠。Trx系统并在微管装配中起调节作用。研究发现TR参与中枢神经系统抗氧化应激的保护机制，并发现TR可能存在有组织特异性，在神经系统退行性疾病的病理过程中对氧化还原反应起调节作用。该TR酶蛋白可作为生物制品用于神经系统退行性疾病的防治。目前国内外的研究多集中于Thioredoxin蛋白及基因。而人脑TR基因的克隆及酶蛋白的应用研究，尚未有报导本发明的目的在于提供一种从新鲜人脑组织中提取rhBTR基因及其克隆方法、用该基因表达的人脑TR酶蛋白、基因探针及其用途。我们获得的人脑TR基因是一个含有1500bp大小的双链核苷酸，推导其编码为500个氨基酸，分子量为60KD。根据该氨基酸序列可将其分为FAD区，NADPH区、交界区。FAD区与NADPH区为功能区，在该功能区与人胎盘TR基因(参见Gasdaska P.Y，et al.FEBS Letter，1995，3735-9)比较，经Dnasis软件分析人脑TR多肽链上有4个氨基酸的改变。证明该基因具有脑组织特异性，其核苷酸序列见表1。该基因的克隆方法包括下述步骤(1)用常规方法从新鲜人脑组织中获取总RNA；(2)以上一步所述的总RNA为模板，应用相关引物，以RT-PCR方法扩增TR全基因；(3)用电泳分离法分离、回收目的基因；(4)将上一步所回收目的基因插入至克隆载体；(5)用常规方法，将新构建的含有目的基因的重组子导入相应的大肠杆菌中；(7)用常规方法鉴定筛选阳性菌；(8)测序。
利用该基因，经体外扩增制得的重组人脑TR酶蛋白及基因探针分别具有表2所述的氨基酸序列和表3、表4所述的核苷酸序列。
本发明利用体内存在的基因，经体外扩增制备获得的重组TR酶基因或酶蛋白生物制品，可用于神经系统退行性疾病如帕金森氏病，早老性痴呆等，使之抑制氧化，改善或和延缓衰老，且无毒付反应。此外，本发明所述的基因探针制备方法简单、通用、易保存。而且，由于生物细胞中广泛存在有TRX系统，因此本发明所述的基因探针不仅可用以疾病的诊断，还可广泛应用于相关分子生物学研究，临床检测，是一种应用前景广泛的生命科学研究工具。
下面对结合实施例对本发明作进一步说明。
人脑硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase TR)基因的克隆方法(1)取新鲜人脑组织，用异硫氰酸胍一步法提取总RNA；(2)应用Dnasis软件设计相关引物，以RT-PCR方法扩增TR全基因；引物1 5′-AACATATGAACGGACCTGAAGATCTTC-3′引物2 5′-GGATCCACACTGGGCTTAACCTCAGC-3′反转录条件65℃ 5min，42℃ 60min，95-97℃ 5-10minPCR条件为95-96℃变性5min，94℃ 45sec-1min，50-55℃ 30sec-1min，72℃2min，30-35个循环，72℃延伸。
(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，用低熔点琼脂糖凝胶或DEAE膜回收目的DNA片段。
(4)将目的片段在T4连接酶作用下插入至pGEM-T或pUC18载体中，转化到大肠杆菌DH5α或TG1，涂于用X-gal的LB A+(氨苄青霉素)培养液，37℃培养，过夜。
(5)通过挑选白色单菌落，用Ned I或EcoR I和BmaH I限制性内切酶酶切鉴定，筛选阳性重组子。
(6)用LB A+(氨苄青霉素)培养液将阳性重组子扩增，抽提克隆质粒；(7)全自动测序仪进行序列测定与分析后，即可得到具有表1所述核苷酸序列的人脑硫氧还蛋白还原酶基因。
采用上述人脑硫氧还蛋白还原酶基因，可以获得具有如表2所述氨基酸序列的rhBTR基因酶蛋白。
(1)将用上述方法克隆的基因从克隆质粒中，用Ned I或EcoR I和BmaH I双酶切，回收目的片段，插入pET9c或pBV220构建表达载体，导入大肠杆菌；(2)用IPTG或温控诱导其表达。
(3)将诱导表达的目的蛋白，分离纯化，即得到有活性的rhBTR酶蛋白。
(4)将纯化得到的rhBTR酶蛋白，加入TRX系统中反应，测酶米氏常数及动力学曲线确定酶活性。
上述方法中提到的pBV220 pET9c与pGEM-T及pUC18在“基因工程实验技术”第二版(彭秀玲等主编，湖南科学技术出版社出版)、“医用分子细胞生物学”(文主编，河南医科大学出版社1997年6月出版，P199-205)及“分子克隆实验指南”(科学技术出版社第二版，金冬雁、黎孟枫译)中有详细的记载，在此就不再赘述了。
采用人脑硫氧还蛋白还原酶基因制备人脑硫氧还蛋白还原酶(TR)基因探针的方法如下(1)将克隆出基因经序列测定后，用Dnasis和Prosis软件分析，找出基因的特异区与保守区。
(2)以上述基因为模板分别用PGR扩增，纯化回收PCR产物。
(3)取第二步回收产物10ng-3μg，溶于20μl反应体积中，在37℃孵育2-6小时。
(4)加2μlEDTA和10％SDS，68℃加热10分钟终止反应。
(5)用0.1体积4μl Licl和2.5-3倍体积冷乙醇沉淀标记的DNA，混匀，在-70℃低温的条件下放置30-45min。
(6)在4℃环境下离心，13000rmp/min，15min。
(7)弃上清，用100μl 70％冷乙醇洗涤沉淀。4℃离心，13000rmp/min，5min。
(8)弃上清，干燥沉淀物。
(9)将干燥的沉淀物溶于50μl pH值为8.0的TE缓冲液中，使沉淀完全溶解。
(10)用地高辛标记的标准DNA对照检测地高辛掺入效率。
(10)将标记好的基因探针在-20℃环境下保存备用。
用上述方法获得的特异区基因探针和保守区基因探针分别具有表3和表4所述的核苷酸序列。
采用本发明所述方法获得的硫氧还蛋白还原酶蛋白及基因探针，可用于AD与PD的动物模型，进行组织学检测，将组织切片原位杂交，检测组织中基因RNA及DNA中的酶含量及分布性。体外神经细胞培养和脑血管的内皮细胞培养用基因探针来检测淀粉样蛋白(Aβ)与TR的关系。
经实验，向脑缺血或帕金森氏病动物模型(鼠)的颅内注射rhBTR酶蛋白5mg/天，可以观察到rhBTR酶蛋白可以促进乙酰胆碱转移酶或多巴胺的代谢，5-6天后即可使症状有所改善。表11500 bpDNA1 ATGAACGGCC CTGAAGATCT TCCCAAGTCC TATGACTATG ACCTTATCAT CATTGGAGGT61 GGCTCAGGAG GTCTGGCAGC TGCTAAGGAG CCAGCCCAAT ATGGCAAGAA GGTGATGGTC121 CTGGACTTTG GCACTCCCAC CCCTCTTGGA ACTAGATGGG GTCTTGGAGG AACATGTGTG181 AATGTGGGTT GCATACCTAA AAAACTGATG CATCAAGCAG CTTTGTTAGG ACAAGCCCTG241 CAAGACTCTC GAAATTATGG ATGGAAAGTC GAGGAGACAG TTAAGCATGA TTGGGACAGA301 ATGATAGAAG CTGTACAGAA TCACATTGGC TCTTTGAATT GGGGCTACCG AGTAGCTCTG361 CGGGAGAAAA AAGTCGTCTA TGAGAATGCT TATGGGCAAT TTATTGGTCC TCACAGGATT421 AAGGCAACAA ATAATAAAGG CAAAGAAAAA ATTTATTCAG CAGAGAGATT TCTCATTGCC481 ACTGGTGAAA GACCACGTTA CTTGGGCATC CCTGGTGACA AAGAATACTG CATCAGCAGT541 GATGATCTTT TCTCCTTGCC TTACTGCCCG GGTAAGACAC TGGTTGTTGG AGCATCCTAT601 GTCGCTTTGG AGTGCGCTGG ATTTCTTGCT GGTATTGGTT TAGACGTCAC TGTTATGGTT661 AGGTCCATTC TTCTTAGAGG ATTTGACCAG GACATGGCCA ACAAAATTGG TGAACACATG721 GAAGAACATG GCATCAAGTT TATAAGACAG TTCGTACCAA TTAAAGTTGA ACAAATTGAA781 GCAGGGACAC CAGGCCGACT CAGAGTAGTA GCTCAGTCCA CCAATAGTGA GGAAATCATT841 GAAGGAGAAT ATAATACGGT GATGCTGGCA ATAGGAAGAG ATGCTTGCAC AAGAAAAATT901 GGCTTAGAAA CCGTAGGGGT GAAGATAAAT GAAAAGACTG GAAAAATACC TGTCACAGAT961 GAAGAACAGA CCAATGTGCC TTACATCTAT GCCATTGGCG ATATATTGGA GGATAAGGTG1021 GAGCTCACCC CAGTTGCAAT CCAGGCAGGA AGATTGCTGG CTCAGAGGCT CTATGCAGGT1081 TCGACTGTCA AGTGTGACTA TGAAAATGTT CCAACCACTG TATTTACTCC TTTGGAATAT1141 GGTGCTTGTG GCCTTTCTGA GGAGAAAGCT GTGGAGAAGT TTGGGGAAGA AAATATTGAG1201 GTTTACCATA GTTACTTTTG GCCATTGGAA TGGACGATTC CGTCAAGAGA TAACAACAAA1261 TGTTATGCAA AAATAATCTG TAATACTAAA GACAATGAAC GTGTTGTGGG CTTTCACGTA1321 CTGGGTCCAA ATGCTGGAGA AGTTACACAA GGCTTTGCAG CTGCGCTCAA ATGTGGACTG1381 ACCAAAAAGC AGCTGGACAG CACAATTGGA ATCCACCCTG TCTGTGCAGA GGTATTCACA1441 ACATTGTCTG TGACCAAGCG CTCTGGGGCA AGCATCCTCC AGGCTGGCTG CTGAGGTTAA表2510152025301 M N G P E D L P K S Y D Y D L I I I G G G S G G L A A A K E31 P A Q Y G K K V M V L D F G T P T P L G T R W G L G G T C V61 N V G C I P K K L M H Q A A L L G Q A L Q D S R N Y G W K V91 E E T V K H D W D R M I E A V Q N H I G S L N W G Y R V A L121 R E K K V V Y E N A Y G Q F I G P H R I K A T N N K G K E K151 I Y S A E R F L I A T G E R P R Y L G I P G D K E Y C I S S181 D D L F S L P Y C P G K T L V V G A S Y V A L E C A G F L A211 G I G L D V T V M V R S I L L R G F D Q D M A N K I G E H M241 E E H G I K F I R Q F V P I K V E Q I E A G T P G R L R V V271 A Q S T N S E E I I E G E Y N T V M L A I G R D A C T R K I301 G L E T V G V K I N E K T G K I P V T D E E Q T N V P Y I Y331 A I G D I L E D K V E L T P V A I Q A G R L L A Q R L Y A G361 S T V K C D Y E N V P T T V F T P L E Y G A C G L S E E K A391 V E K F G E E N I E V Y H S Y F W P L E W T I P S R D N N K421 C Y A K I I C N T K D N E R V V G F H V L G P N A G E V T Q451 G F A A A L K C G L T K K Q L D S T I G I H P V C A E V F T481 T L S V T K R S G A S I L Q A G C * G *表3基因探针1 特异区(1-590)590 bp DNA1 ATGAACGGCC CTGAAGATCT TCCCAAGTCC TATGACTATG ACCTTATCAT CATTGGAGGT61 GGCTCAGGAG GTCTGGCAGC TGCTAAGGAG CCAGCCCAAT ATGGCAAGAA GGTGATGGTC121 CTGGACTTTG GCACTCCCAC CCCTCTTGGA ACTAGATGGG GTCTTGGAGG AACATGTGTG181 AATGTGGGTT GCATACCTAA AAAACTGATG CATCAAGCAG CTTTGTTAGG ACAAGCCCTG241 CAAGACTCTC GAAATTATGG ATGGAAAGTC GAGGAGACAG TTAAGCATGA TTGGGACAGA301 ATGATAGAAG CTGTACAGAA TCACATTGGC TCTTTGAATT GGGGCTACCG AGTAGCTCTG361 CGGGAGAAAA AAGTCGTCTA TGAGAATGCT TATGGGCAAT TTATTGGTCC TCACAGGATT421 AAGGCAACAA ATAATAAAGG CAAAGAAAAA ATTTATTCAG CAGAGAGATT TCTCATTGCC481 ACTGGTGAAA GACCACGTTA CTTGGGCATC CCTGGTGACA AAGAATACTG CATCAGCAGT541 GATGATCTTT TCTCCTTGCC TTACTGCCCG GGTAAGACAC TGGTTGTTGG AGCATCCTAT表4基因探针2 保守区(921-1500) 580bp DNA901 GGCTTAGAAA CCGTAGGGGT GAAGATAAAT GAAAAGACTG GAAAAATACC TGTCACAGAT961 GAAGAACAGA CCAATGTGCC TTACATCTAT GCCATTGGCG ATATATTGGA GGATAAGGTG1021 GAGCTCACCC CAGTTGCAAT CCAGGCAGGA AGATTGCTGG CTCAGAGGCT CTATGCAGGT1081 TCCACTGTCA AGTGTGACTA TGAAAATGTT CCAACCACTG TATTTACTCC TTTGGAATAT1141 GGTGCTTGTG GCCTTTCTGA GGAGAAAGCT GTGGAGAAGT TTGGGGAAGA AAATATTGAG1201 GTTTACCATA GTTACTTTTG GCCATTGGAA TGGACGATTC CGTCAAGAGA TAACAACAAA1261 TGTTATGCAA AAATAATCTG TAATACTAAA GACAATGAAC GTGTTGTGGG CTTTCACGTA1321 CTGGGTCCAA ATGCTGGAGA AGTTACACAA GGCTTTGCAG CTGCGCTCAA ATGTGGACTG1381 ACCAAAAAGC AGCTGGACAG CACAATTGGA ATCCACCCTG TCTGTGCAGA GGTATTCACA1441 ACATTGTCTG TGACCAAGCG CTCTGGGGCA AGCATCCTCC AGGCTGGCTG CTGAGGTTAA
权利要求
1.一种人脑硫氧还蛋白还原酶基因，其特征在于具有表1所述核苷酸序列。
2.权利要求1所述的人脑硫氧还蛋白还原酶基因的克隆方法，包括下述步骤(1)用常规方法从新鲜人脑组织中获取总RNA；(2)以上一步所述的总RNA为模板，设计相关引物，用RT-PCR方法扩增TR基因片段；(3)用电泳分离法分离、回收目的基因；(4)将上一步所回收目的基因插入至克隆载体；(5)用常规方法，将新构建的含有目的基因的重组子导入至相应的大肠杆菌中；(6)用常规方法鉴定筛选阳性重组子；(7)测序。
3.如权利要求2所述人脑硫氧还蛋白还原酶基因的克隆方法，其特征在于所述的引物包括引物1 5′-AACATATGAACGGACCTGAAGATCTTC-3′，引物2 5′GGATCCACACTGGGCTTAACCTCAGC-3′。
4.如权利要求2所述的脑硫氧还蛋白还原酶基因的克隆方法，其特征在于所述克隆载体可以是pGEM-T，也可以是pUC18。
5.用权利要求1所述的基因表达的蛋白质，其特征在于具有表2所述的氨基酸序列。
6.采用权利要求1所述基因制备的基因探针，其特征在于具有表3所述的核苷酸序列。
7.采用权利要求1所述基因制备的基因探针，其特征在于具有表4所述的核苷酸序列。
8.权利要求5所述的蛋白质在用于神经系统退行性疾病的诊断与治疗。
9.权利要求6或7所述基因探针用于临床检测、神经系统退行性疾病诊治。
全文摘要
本发明涉及rHBTR基因及其克隆方法以及rHBTR基因酶蛋白和基因探针的制备及其应用。该基因是从新鲜人脑组织中获取总RNA,通过RT－PCR方法,克隆、筛选得到全基因,并克隆测序,构建表达载体,导入工程菌,表达酶蛋白。可用于预防及治疗神经系统退行性疾病,如帕金森氏病(PD)及早老性痴呆(AD)。用人脑硫氧还蛋白酶基因制备的基因探针,可以广泛应用于分子生物学研究、临床检测,是一种应用较广的诊断及研究工具。
文档编号A61K38/43GK1258748SQ9912063
公开日2000年7月5日 申请日期1999年12月17日 优先权日1999年12月17日
发明者许琳, 徐江英, 戴荣 申请人:中国人民解放军第二军医大学南京军医学院
技术领域：
本发明涉及人脑硫氧还蛋白还原酶基因(rhBTR基因)及其克隆方法，以及rhBTR基因探针、rhBTR基因酶蛋白及其应用。
神经系统退行性疾病如早老性痴呆(AD)，帕金森氏病(PD)，在60岁以上的老年中发病率较高，在美国，AD已是继心脏病、肿瘤、脑卒死中之后的第四位死亡原因。由于AD等病在病因学、临床和病理学上有千差万别，但最终导致细胞功能不良，突触丧失和神经元死亡。在临床诊治方面未能找到有效的方法。而近3-5年内，有关蛋白酶和抗蛋白酶在此类疾病的发病机制以及在临床诊断和治疗方面的探索，成为研究热点之一。
硫氧还蛋白还原酶(TR)是硫氧还蛋白系统(Trx系统)的组成成份之一(参LaurentT.C，et al.J Biol.Chem，1964，2393436-44)。参与细胞增殖、分化，维持细胞内外氧化还原平衡，调节蛋白质正常折叠。Trx系统并在微管装配中起调节作用。研究发现TR参与中枢神经系统抗氧化应激的保护机制，并发现TR可能存在有组织特异性，在神经系统退行性疾病的病理过程中对氧化还原反应起调节作用。该TR酶蛋白可作为生物制品用于神经系统退行性疾病的防治。目前国内外的研究多集中于Thioredoxin蛋白及基因。而人脑TR基因的克隆及酶蛋白的应用研究，尚未有报导本发明的目的在于提供一种从新鲜人脑组织中提取rhBTR基因及其克隆方法、用该基因表达的人脑TR酶蛋白、基因探针及其用途。我们获得的人脑TR基因是一个含有1500bp大小的双链核苷酸，推导其编码为500个氨基酸，分子量为60KD。根据该氨基酸序列可将其分为FAD区，NADPH区、交界区。FAD区与NADPH区为功能区，在该功能区与人胎盘TR基因(参见Gasdaska P.Y，et al.FEBS Letter，1995，3735-9)比较，经Dnasis软件分析人脑TR多肽链上有4个氨基酸的改变。证明该基因具有脑组织特异性，其核苷酸序列见表1。该基因的克隆方法包括下述步骤(1)用常规方法从新鲜人脑组织中获取总RNA；(2)以上一步所述的总RNA为模板，应用相关引物，以RT-PCR方法扩增TR全基因；(3)用电泳分离法分离、回收目的基因；(4)将上一步所回收目的基因插入至克隆载体；(5)用常规方法，将新构建的含有目的基因的重组子导入相应的大肠杆菌中；(7)用常规方法鉴定筛选阳性菌；(8)测序。
利用该基因，经体外扩增制得的重组人脑TR酶蛋白及基因探针分别具有表2所述的氨基酸序列和表3、表4所述的核苷酸序列。
本发明利用体内存在的基因，经体外扩增制备获得的重组TR酶基因或酶蛋白生物制品，可用于神经系统退行性疾病如帕金森氏病，早老性痴呆等，使之抑制氧化，改善或和延缓衰老，且无毒付反应。此外，本发明所述的基因探针制备方法简单、通用、易保存。而且，由于生物细胞中广泛存在有TRX系统，因此本发明所述的基因探针不仅可用以疾病的诊断，还可广泛应用于相关分子生物学研究，临床检测，是一种应用前景广泛的生命科学研究工具。
下面对结合实施例对本发明作进一步说明。
人脑硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase TR)基因的克隆方法(1)取新鲜人脑组织，用异硫氰酸胍一步法提取总RNA；(2)应用Dnasis软件设计相关引物，以RT-PCR方法扩增TR全基因；引物1 5′-AACATATGAACGGACCTGAAGATCTTC-3′引物2 5′-GGATCCACACTGGGCTTAACCTCAGC-3′反转录条件65℃ 5min，42℃ 60min，95-97℃ 5-10minPCR条件为95-96℃变性5min，94℃ 45sec-1min，50-55℃ 30sec-1min，72℃2min，30-35个循环，72℃延伸。
(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，用低熔点琼脂糖凝胶或DEAE膜回收目的DNA片段。
(4)将目的片段在T4连接酶作用下插入至pGEM-T或pUC18载体中，转化到大肠杆菌DH5α或TG1，涂于用X-gal的LB A+(氨苄青霉素)培养液，37℃培养，过夜。
(5)通过挑选白色单菌落，用Ned I或EcoR I和BmaH I限制性内切酶酶切鉴定，筛选阳性重组子。
(6)用LB A+(氨苄青霉素)培养液将阳性重组子扩增，抽提克隆质粒；(7)全自动测序仪进行序列测定与分析后，即可得到具有表1所述核苷酸序列的人脑硫氧还蛋白还原酶基因。
采用上述人脑硫氧还蛋白还原酶基因，可以获得具有如表2所述氨基酸序列的rhBTR基因酶蛋白。
(1)将用上述方法克隆的基因从克隆质粒中，用Ned I或EcoR I和BmaH I双酶切，回收目的片段，插入pET9c或pBV220构建表达载体，导入大肠杆菌；(2)用IPTG或温控诱导其表达。
(3)将诱导表达的目的蛋白，分离纯化，即得到有活性的rhBTR酶蛋白。
(4)将纯化得到的rhBTR酶蛋白，加入TRX系统中反应，测酶米氏常数及动力学曲线确定酶活性。
上述方法中提到的pBV220 pET9c与pGEM-T及pUC18在“基因工程实验技术”第二版(彭秀玲等主编，湖南科学技术出版社出版)、“医用分子细胞生物学”(文主编，河南医科大学出版社1997年6月出版，P199-205)及“分子克隆实验指南”(科学技术出版社第二版，金冬雁、黎孟枫译)中有详细的记载，在此就不再赘述了。
采用人脑硫氧还蛋白还原酶基因制备人脑硫氧还蛋白还原酶(TR)基因探针的方法如下(1)将克隆出基因经序列测定后，用Dnasis和Prosis软件分析，找出基因的特异区与保守区。
(2)以上述基因为模板分别用PGR扩增，纯化回收PCR产物。
(3)取第二步回收产物10ng-3μg，溶于20μl反应体积中，在37℃孵育2-6小时。
(4)加2μlEDTA和10％SDS，68℃加热10分钟终止反应。
(5)用0.1体积4μl Licl和2.5-3倍体积冷乙醇沉淀标记的DNA，混匀，在-70℃低温的条件下放置30-45min。
(6)在4℃环境下离心，13000rmp/min，15min。
(7)弃上清，用100μl 70％冷乙醇洗涤沉淀。4℃离心，13000rmp/min，5min。
(8)弃上清，干燥沉淀物。
(9)将干燥的沉淀物溶于50μl pH值为8.0的TE缓冲液中，使沉淀完全溶解。
(10)用地高辛标记的标准DNA对照检测地高辛掺入效率。
(10)将标记好的基因探针在-20℃环境下保存备用。
用上述方法获得的特异区基因探针和保守区基因探针分别具有表3和表4所述的核苷酸序列。
采用本发明所述方法获得的硫氧还蛋白还原酶蛋白及基因探针，可用于AD与PD的动物模型，进行组织学检测，将组织切片原位杂交，检测组织中基因RNA及DNA中的酶含量及分布性。体外神经细胞培养和脑血管的内皮细胞培养用基因探针来检测淀粉样蛋白(Aβ)与TR的关系。
经实验，向脑缺血或帕金森氏病动物模型(鼠)的颅内注射rhBTR酶蛋白5mg/天，可以观察到rhBTR酶蛋白可以促进乙酰胆碱转移酶或多巴胺的代谢，5-6天后即可使症状有所改善。表11500 bpDNA1 ATGAACGGCC CTGAAGATCT TCCCAAGTCC TATGACTATG ACCTTATCAT CATTGGAGGT61 GGCTCAGGAG GTCTGGCAGC TGCTAAGGAG CCAGCCCAAT ATGGCAAGAA GGTGATGGTC121 CTGGACTTTG GCACTCCCAC CCCTCTTGGA ACTAGATGGG GTCTTGGAGG AACATGTGTG181 AATGTGGGTT GCATACCTAA AAAACTGATG CATCAAGCAG CTTTGTTAGG ACAAGCCCTG241 CAAGACTCTC GAAATTATGG ATGGAAAGTC GAGGAGACAG TTAAGCATGA TTGGGACAGA301 ATGATAGAAG CTGTACAGAA TCACATTGGC TCTTTGAATT GGGGCTACCG AGTAGCTCTG361 CGGGAGAAAA AAGTCGTCTA TGAGAATGCT TATGGGCAAT TTATTGGTCC TCACAGGATT421 AAGGCAACAA ATAATAAAGG CAAAGAAAAA ATTTATTCAG CAGAGAGATT TCTCATTGCC481 ACTGGTGAAA GACCACGTTA CTTGGGCATC CCTGGTGACA AAGAATACTG CATCAGCAGT541 GATGATCTTT TCTCCTTGCC TTACTGCCCG GGTAAGACAC TGGTTGTTGG AGCATCCTAT601 GTCGCTTTGG AGTGCGCTGG ATTTCTTGCT GGTATTGGTT TAGACGTCAC TGTTATGGTT661 AGGTCCATTC TTCTTAGAGG ATTTGACCAG GACATGGCCA ACAAAATTGG TGAACACATG721 GAAGAACATG GCATCAAGTT TATAAGACAG TTCGTACCAA TTAAAGTTGA ACAAATTGAA781 GCAGGGACAC CAGGCCGACT CAGAGTAGTA GCTCAGTCCA CCAATAGTGA GGAAATCATT841 GAAGGAGAAT ATAATACGGT GATGCTGGCA ATAGGAAGAG ATGCTTGCAC AAGAAAAATT901 GGCTTAGAAA CCGTAGGGGT GAAGATAAAT GAAAAGACTG GAAAAATACC TGTCACAGAT961 GAAGAACAGA CCAATGTGCC TTACATCTAT GCCATTGGCG ATATATTGGA GGATAAGGTG1021 GAGCTCACCC CAGTTGCAAT CCAGGCAGGA AGATTGCTGG CTCAGAGGCT CTATGCAGGT1081 TCGACTGTCA AGTGTGACTA TGAAAATGTT CCAACCACTG TATTTACTCC TTTGGAATAT1141 GGTGCTTGTG GCCTTTCTGA GGAGAAAGCT GTGGAGAAGT TTGGGGAAGA AAATATTGAG1201 GTTTACCATA GTTACTTTTG GCCATTGGAA TGGACGATTC CGTCAAGAGA TAACAACAAA1261 TGTTATGCAA AAATAATCTG TAATACTAAA GACAATGAAC GTGTTGTGGG CTTTCACGTA1321 CTGGGTCCAA ATGCTGGAGA AGTTACACAA GGCTTTGCAG CTGCGCTCAA ATGTGGACTG1381 ACCAAAAAGC AGCTGGACAG CACAATTGGA ATCCACCCTG TCTGTGCAGA GGTATTCACA1441 ACATTGTCTG TGACCAAGCG CTCTGGGGCA AGCATCCTCC AGGCTGGCTG CTGAGGTTAA表2510152025301 M N G P E D L P K S Y D Y D L I I I G G G S G G L A A A K E31 P A Q Y G K K V M V L D F G T P T P L G T R W G L G G T C V61 N V G C I P K K L M H Q A A L L G Q A L Q D S R N Y G W K V91 E E T V K H D W D R M I E A V Q N H I G S L N W G Y R V A L121 R E K K V V Y E N A Y G Q F I G P H R I K A T N N K G K E K151 I Y S A E R F L I A T G E R P R Y L G I P G D K E Y C I S S181 D D L F S L P Y C P G K T L V V G A S Y V A L E C A G F L A211 G I G L D V T V M V R S I L L R G F D Q D M A N K I G E H M241 E E H G I K F I R Q F V P I K V E Q I E A G T P G R L R V V271 A Q S T N S E E I I E G E Y N T V M L A I G R D A C T R K I301 G L E T V G V K I N E K T G K I P V T D E E Q T N V P Y I Y331 A I G D I L E D K V E L T P V A I Q A G R L L A Q R L Y A G361 S T V K C D Y E N V P T T V F T P L E Y G A C G L S E E K A391 V E K F G E E N I E V Y H S Y F W P L E W T I P S R D N N K421 C Y A K I I C N T K D N E R V V G F H V L G P N A G E V T Q451 G F A A A L K C G L T K K Q L D S T I G I H P V C A E V F T481 T L S V T K R S G A S I L Q A G C * G *表3基因探针1 特异区(1-590)590 bp DNA1 ATGAACGGCC CTGAAGATCT TCCCAAGTCC TATGACTATG ACCTTATCAT CATTGGAGGT61 GGCTCAGGAG GTCTGGCAGC TGCTAAGGAG CCAGCCCAAT ATGGCAAGAA GGTGATGGTC121 CTGGACTTTG GCACTCCCAC CCCTCTTGGA ACTAGATGGG GTCTTGGAGG AACATGTGTG181 AATGTGGGTT GCATACCTAA AAAACTGATG CATCAAGCAG CTTTGTTAGG ACAAGCCCTG241 CAAGACTCTC GAAATTATGG ATGGAAAGTC GAGGAGACAG TTAAGCATGA TTGGGACAGA301 ATGATAGAAG CTGTACAGAA TCACATTGGC TCTTTGAATT GGGGCTACCG AGTAGCTCTG361 CGGGAGAAAA AAGTCGTCTA TGAGAATGCT TATGGGCAAT TTATTGGTCC TCACAGGATT421 AAGGCAACAA ATAATAAAGG CAAAGAAAAA ATTTATTCAG CAGAGAGATT TCTCATTGCC481 ACTGGTGAAA GACCACGTTA CTTGGGCATC CCTGGTGACA AAGAATACTG CATCAGCAGT541 GATGATCTTT TCTCCTTGCC TTACTGCCCG GGTAAGACAC TGGTTGTTGG AGCATCCTAT表4基因探针2 保守区(921-1500) 580bp DNA901 GGCTTAGAAA CCGTAGGGGT GAAGATAAAT GAAAAGACTG GAAAAATACC TGTCACAGAT961 GAAGAACAGA CCAATGTGCC TTACATCTAT GCCATTGGCG ATATATTGGA GGATAAGGTG1021 GAGCTCACCC CAGTTGCAAT CCAGGCAGGA AGATTGCTGG CTCAGAGGCT CTATGCAGGT1081 TCCACTGTCA AGTGTGACTA TGAAAATGTT CCAACCACTG TATTTACTCC TTTGGAATAT1141 GGTGCTTGTG GCCTTTCTGA GGAGAAAGCT GTGGAGAAGT TTGGGGAAGA AAATATTGAG1201 GTTTACCATA GTTACTTTTG GCCATTGGAA TGGACGATTC CGTCAAGAGA TAACAACAAA1261 TGTTATGCAA AAATAATCTG TAATACTAAA GACAATGAAC GTGTTGTGGG CTTTCACGTA1321 CTGGGTCCAA ATGCTGGAGA AGTTACACAA GGCTTTGCAG CTGCGCTCAA ATGTGGACTG1381 ACCAAAAAGC AGCTGGACAG CACAATTGGA ATCCACCCTG TCTGTGCAGA GGTATTCACA1441 ACATTGTCTG TGACCAAGCG CTCTGGGGCA AGCATCCTCC AGGCTGGCTG CTGAGGTTAA
权利要求
1.一种人脑硫氧还蛋白还原酶基因，其特征在于具有表1所述核苷酸序列。
2.权利要求1所述的人脑硫氧还蛋白还原酶基因的克隆方法，包括下述步骤(1)用常规方法从新鲜人脑组织中获取总RNA；(2)以上一步所述的总RNA为模板，设计相关引物，用RT-PCR方法扩增TR基因片段；(3)用电泳分离法分离、回收目的基因；(4)将上一步所回收目的基因插入至克隆载体；(5)用常规方法，将新构建的含有目的基因的重组子导入至相应的大肠杆菌中；(6)用常规方法鉴定筛选阳性重组子；(7)测序。
3.如权利要求2所述人脑硫氧还蛋白还原酶基因的克隆方法，其特征在于所述的引物包括引物1 5′-AACATATGAACGGACCTGAAGATCTTC-3′，引物2 5′GGATCCACACTGGGCTTAACCTCAGC-3′。
4.如权利要求2所述的脑硫氧还蛋白还原酶基因的克隆方法，其特征在于所述克隆载体可以是pGEM-T，也可以是pUC18。
5.用权利要求1所述的基因表达的蛋白质，其特征在于具有表2所述的氨基酸序列。
6.采用权利要求1所述基因制备的基因探针，其特征在于具有表3所述的核苷酸序列。
7.采用权利要求1所述基因制备的基因探针，其特征在于具有表4所述的核苷酸序列。
8.权利要求5所述的蛋白质在用于神经系统退行性疾病的诊断与治疗。
9.权利要求6或7所述基因探针用于临床检测、神经系统退行性疾病诊治。
全文摘要
本发明涉及rHBTR基因及其克隆方法以及rHBTR基因酶蛋白和基因探针的制备及其应用。该基因是从新鲜人脑组织中获取总RNA,通过RT－PCR方法,克隆、筛选得到全基因,并克隆测序,构建表达载体,导入工程菌,表达酶蛋白。可用于预防及治疗神经系统退行性疾病,如帕金森氏病(PD)及早老性痴呆(AD)。用人脑硫氧还蛋白酶基因制备的基因探针,可以广泛应用于分子生物学研究、临床检测,是一种应用较广的诊断及研究工具。
文档编号A61K38/43GK1258748SQ9912063
公开日2000年7月5日 申请日期1999年12月17日 优先权日1999年12月17日
发明者许琳, 徐江英, 戴荣 申请人:中国人民解放军第二军医大学南京军医学院
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