具抗癌活性的霞草提取物和制备方法及其在制药中的用途的制作方法
专利名称：具抗癌活性的霞草提取物和制备方法及其在制药中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物，更具体地说，本发明涉及一种从石竹科石头花属植物霞草Gypsophila oldhamiana Miq.的根中提取的有效部位，本发明还涉及该药物提取物地制备方法及其应用。
背景技术：
随着医学的进步，恶性肿瘤---癌症，成为常见且严重威胁人类生命及生活质量的主要疾病之一，目前中药用于肿瘤治疗时分为两类，一类为治疗类用药，如某些复方，但存在成分不明，机理不清楚，效价不高等缺点，甚至有的复方中含有巨毒成分，容易产生严重的毒副作用；另一类为治疗肿瘤药中的辅助用药，用以减轻放、化疗副作用，但不具备直接治疗肿瘤的作用。
霞草为石竹科石头花属植物霞草Gypsophila oldhamiana Miq.的根别名长蕊石头花[1]，酸蚂昨菜、山马生菜、山扫帚菜，主产于山东、山西、陕西、宁夏、内蒙古、甘肃、新疆、河北、黑龙江等地。该植物为我国民间常用草药，《中药大辞典》收载，有些地区作为银柴胡的代用品入药。该药性甘、微寒，具有清热凉血、活血散瘀、消肿止痛、化腐生肌等功效。主要治疗虚劳肌热、骨蒸、阴虚久疟、小儿疳热等疾患，同时还可用于跌打损伤、骨拆、外伤等。欧洲的植物化学家对该植物进行过一些研究，分得三萜、三萜皂甙、黄酮、甾醇、多糖、有机酸等化合物。药理实验研究表明，霞草中提取的三萜皂甙，给家兔在形成动脉粥样硬化的同时或以后每天内服，可降低血清胆甾醇浓度，使胆甾醇/脑磷脂系数降低，使主动脉类脂质含量降低。有人认为皂甙可作用于血浆脂蛋白，阻止胆甾醇的酯化及其在血管壁的沉积，也有人认为可以阻止胆甾醇从肠道吸收。有文献报道丝石竹皂甙、九糖甙没有抗菌效果，酶解后除去羧基上的甙键，去5个糖，生成次皂甙具有显著的抗菌作用。国内对该植物研究较少，化学成分及药理作用方面的研究均未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效低毒的具有抗癌活性及抗病毒活性的霞草提取物。
本发明的另一个目的是，提供一种具有抗癌活性及抗病毒活性的霞草提取物的制备方法。
本发明还有一个目的是，提供具有抗癌活性及抗病毒活性的霞草提取物在制备治疗癌症及抗病毒药物中的新用途。
本发明的解决方案是从中药霞草根中提取一种具有抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，该提取物中含有皂苷，其含量在5％以上。
本发明所述的抗癌、抗病毒活性的霞草提取物的提取方法，包括以下主要步骤
1、霞草粗提物的制取
(1)、取霞草根自然干燥后粉碎；
(2)、用溶剂提取；所说的溶剂它选自丙酮、醇类水或水醇混合溶剂，所说的醇类为甲醇、乙醇、异丙醇等短链醇。
(3)、提取液减压浓缩得提取物浸膏，即为霞草粗提物，该粗提物中含有5％-30％的皂苷；
该霞草粗提物也可以按以下方法来提取
A、粉碎的霞草根用水提取；
B、提取液浓缩成相对密度1.04～1.34的稠浸膏；
C、稠浸膏中加入乙醇至乙醇浓度为40～95％；
D、静置，取上清液浓缩成浸膏，即为霞草粗提物。
2、霞草粗提物的精制
(1)、将霞草粗提物加水制成水混悬液；
(2)、过大孔树脂柱，这里所用的大孔树脂孔为中低极性大孔树脂.先用水或1-10％低浓度的乙醇或甲醇溶液洗脱，除去极性溶剂中的杂质；
(3)、再用20％以上的高浓度乙醇或甲醇洗脱；
(4)、收集高浓度醇洗脱液，蒸馏回收溶剂，干燥、制得含皂苷的精制霞草提取物，该提取物中含有30％以上的皂苷。
3、含皂苷霞草提取物的纯化
上述经精制后的霞草提取物，进一步用有机溶剂进行纯化可制得更高纯度的霞草提取物，其中皂苷含量可达到80％以上，这里所说的有机溶剂它选自正丁醇、醋酸乙酯、丙酮-乙醚的混合溶剂、氯仿-甲醇-水的混合溶剂或石油醚。
总之，用本发明提供的提取方法，根据需要可以制备得到皂苷含量在5％以上或10％以上或30％以上或50％以上或80％以上，具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物。
申请人进一步用本发明的霞草提取物进行了急毒和药效试验，观察了霞草提取物(以皂苷计100％)对荷瘤动物用药后肿瘤生长影响，对霞草提取物进行抗肿瘤药效学研究。并对霞草提取物进行了体外抗病实验。
试验一霞草提取物(以皂苷计100％)在体外对10种人癌细胞的细胞毒作用观察。
本发明采用10种人癌细胞株，其中包括Bel-7402(肝癌)，BGC-823(胃癌)，MCF-7(乳腺癌)，HCT-8(结肠癌)，A2780(卵巢癌)，KB(口腔上皮细胞癌)，Hela(宫颈癌)，PC-3M(前列腺癌转移株)，A549(肺腺癌)，KeTr3(肾癌)，用MTT法进行实验。
将细胞培养在含10％小牛血清的RPMI1640培养基中，内含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，于37℃、5％CO2培养箱中传代培养。
0.3％胰酶0.6ml消化贴壁的肿瘤细胞，含10％小牛血清的RPMI 1640培养液配制细胞悬液，浓度为1×104细胞/ml。于96孔培养板内每孔接种100μl(含1000个肿瘤细胞)，37℃培养24小时。给药组加入含有不同浓度药物，每药设3个剂量组，分别为50μg/ml，5μg/ml，0.5μg/ml，每组设三个平行孔，每孔加药100μl。对照组加入与药等体积的溶剂。置37℃，5％CO2温箱中培养4天后弃去培养液，每孔加入200μl 0.2％MTT溶液(RPMI 1640配制)。37℃孵育4小时，弃去上清，每孔加入DMSO 150μl溶解Formazan颗粒，轻度振荡后，用酶标仪，在参考波长450nm、检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)。
结果计算以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，求药物对肿瘤细胞的抑制率。
以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出药物的半数抑制浓度(IC50)。
实验结果见表1
表1.霞草提取物(以皂苷计100％)在体外对人肿瘤细胞生长的影响
续表1
霞草提取物(以皂苷计100％)对A2780，KB，PC-3M，A549，KeTr3五种人癌细胞株有一定的细胞毒作用；对Bel-7402，BGC-823，HCT-8，MCF-7，Hela五种人癌细胞株未见明显细胞毒作用。
试验二霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠移植性肿瘤生长的抑制作用，观察霞草提取物(以皂苷计100％)对荷瘤动物用药后肿瘤生长的影响，对该药进行抗肿瘤药效学研究。
一、霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用
选用C57BL/6小鼠，18-22g，雄性，将肿瘤生长良好、全身状况较好的荷瘤动物处死，无菌条件下取出瘤块，剪碎，用玻璃研磨器加生理盐水(1∶3)磨成匀浆，于每鼠腋窝皮下接种瘤液0.2ml。
接种后24小时，将动物按体重随机分组，每组10只。设空白对照组，环磷酰胺阳性药对照组，霞草提取物(以皂苷计100％)给药组剂量为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。环磷酰胺腹腔注射一次60mg/kg。霞草提取物(以皂苷计100％)灌胃给药20ml/kg，每天一次，连续给药10天。末次给药后24小时，颈椎脱臼处死动物，分别称体重及瘤重，计算肿瘤抑制率，进行疗效评价并将各组结果进行统计学处理。疗效评价公式
结果见表2霞草提取物(以皂苷计100％)50mg/kg组的抑瘤率为18.3％(P＞0.05)；100mg/kg组的抑瘤率为38.3％(P＜0.05)；200mg/kg组的抑瘤率为41.9％(P＜0.05)。
结果表明，霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠Lewis肺癌生长有一定的抑制作用，并呈一定的剂量效应关系。
二、霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠宫颈癌U14的抑瘤作用
选用昆明种小鼠，18-22g，雌性，将接种后7天的荷瘤动物颈椎脱臼处死。无菌条件下取出腹水，用生理盐水稀释，于每鼠腋窝皮下接种瘤液0.2ml。
接种后24小时，将动物按体重随机分组，每组10只。设空白对照组，环磷酰胺阳性药对照组，霞草提取物(以皂苷计100％)给药组剂量为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。环磷酰胺腹腔注射一次60mg/kg。霞草提取物(以皂苷计100％)灌胃给药20ml/kg，每天一次，连续给药10天。末次给药后24小时，颈椎脱臼处死动物，分别称体重及瘤重，计算肿瘤抑制率，并进行统计学处理。疗效评价公式
结果见表3。霞草提取物(以皂苷计100％)50mg/kg组的抑瘤率为6.8％(P＞0.05)；100mg/kg组的抑瘤率为31.1％(P＜0.05)；200mg/kg组的抑瘤率为36.5％(P＜0.05)。
结果表明，中、大剂量组对小鼠宫颈癌U14生长有一定的抑制作用，并呈一定的剂量效应关系。
三、霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠肝癌H22的抑瘤作用
选用昆明种小鼠，18-22g，雄性，将接种后7天的荷瘤动物颈椎脱臼处死。无菌条件下取出腹水，用生理盐水稀释，于每鼠腋窝皮下接种瘤液0.2ml。
接种后24小时，将动物按体重随机分组，每组10只。设空白对照组，环磷酰胺阳性药对照组，霞草提取物(以皂苷计100％)给药组剂量为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。环磷酰胺腹腔注射一次60mg/kg。霞草提取物(以皂苷计100％)灌胃给药20ml/kg，每天一次，连续给药10天。末次给药后24小时，颈椎脱臼处死动物，分别称体重及瘤重，计算肿瘤抑制率，并进行统计学处理。疗效评价公式
结果见表4。霞草提取物(以皂苷计100％)50mg/kg组的抑瘤率为15.3％(P＞0.05)；100mg/kg组的抑瘤率为43.7％(P＜0.01)；200mg/kg组的抑瘤率为47.7％(P＜0.01)。
结果表明霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠肝癌H22生长有一定的抑制作用，并呈一定的剂量效应关系。
总之，在本实验条件下，霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠Lewis肺癌、宫颈癌U14、肝癌H22均具有一定的生长抑制作用，说明霞草提取物(以皂苷计100％)具有一定的抗肿瘤活性。
表2.霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠Lewis肺癌生长的影响
表3.霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠宫颈癌U14生长的影响
表4.霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠肝癌H22生长的影响
试验三、霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠淋巴细胞转化的影响(中国医学科学院药物研究所肿瘤药理室)
1、实验目的
观察霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠淋巴细胞转化的影响。
2、实验材料
受试药物由山东省医学科学院药物研究所提供，实验时用双蒸水配制成实验所需浓度。
动物C57BL/6小鼠由中国医学科学院实验动物所繁育场提供，合格证号SCXK京2000-0006号。。
3、方法
选用C57BL/6小鼠，将接种后10-14天。肿瘤生长良好的荷瘤动物处死，无菌条件下取出瘤块，称重、剪碎、研磨、过滤，匀浆以生理盐水1∶3稀释，于实验动物腋窝下以每鼠0.2ml瘤液接种。接种次日，将动物按体重随机分为4组，每组10只。设阴性对照组，SJY 50、100、200mg/kg三个剂量给药组。灌胃给药体积为20ml/kg，每日1次，连续给药8天。末次给药后24小时，颈椎脱臼处死动物。无菌条件下取出脾脏，分别在筛网上研磨、离心、计数单个细胞，配成终浓度为2.5×106个细胞/ml，分别加入96孔板中，同时设空白对照孔。置37℃ 5％CO2培养箱中培养72小时，培养结束前6小时向每孔加入[3H]-TdR，终浓度为1μCi/孔。多头收集器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，烤干，放入加有4ml闪烁液的测量瓶中，液闪仪上测定每个样品的cpm值。
4、实验结果
结果见表5。
表5.霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠脾淋巴细胞转化的影响
实验结果各组淋巴细胞增殖无明显差别。
5、结论
结果显示霞草提取物(以皂苷计100％)在荷瘤小鼠未见增强淋巴细胞转化能力的作用。
试验四、霞草提取物(以皂苷计100％)对荷瘤小鼠廓清能力的影响(中国医学科学院药物研究所肿瘤药理室)
1、实验目的
观察霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠廓清功能的影响。
2、实验材料
受试药物由山东省医学科学院药物研究所提供，实验时用双蒸水配制成实验所需浓度。
动物昆明种小鼠由中国医学科学院实验动物所繁育场提供，合格证号SCXK京2000-0006号。
3、实验方法
接种肝癌H22昆明小鼠40只，随机分为4组，每组10只。设空白对照组，样品剂量为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。样品灌胃给药20ml/kg，每天一次，连续给药10天。末次给药后24小时，小鼠尾静脉注射0.5％刚果红(0.1ml/10g体重)，于注射后1分钟及5分钟，眼眶后静脉丛取血，离心取血清。吸25μl血清，加2.5ml生理盐水(pH10)，于510nm比色测吸光度，计算廓清指数k。处死小鼠，取脾脏及胸腺，计算脏器系数。比较上述各组间差别。
4、实验结果
结果见表6。
表6.霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠廓清能力的影响a廓清指数
b脏器系数
实验结果三个剂量组的廓清指数及脾脏和胸腺指数与空白对照组相比均无显著性差别。
试验五霞草提取物(以皂苷计100％)对10mg·kg-1环磷酰胺致小鼠SI80肉瘤抑瘤作用的增效作用。
小鼠购进后适应性饲养24h，禁食12h，左腋下无菌接种由生理盐水稀释的小鼠S180腹水液(含瘤细胞5×106/mL)0.2mL/只，接种后24h，按性别、体重随机分组给药。分组为NS对照组24只(♀♂各12只)，20mg·kg-1环磷酰胺SC组12只(♀♂各6只)，10mg·kg-1环磷酰胺SC组12只(♀♂各6只)，10mg·kg-1环磷酰胺加100mg·kg-1、200mg·kg-1、400mg·kg-1霞草提取物(以皂苷计100％)各1组，每组12只(均为♀♂各6只)，每日给药一次，连续给药9天，末次给药24h后，脱颈处死小鼠，剥离瘤体，GB-303电子天平称瘤体重，t检验比较各组瘤重，并按(NS对照组瘤重-给药组瘤重)/NS对照组瘤重，计算各药物组的抑瘤率，试验连续重复三次，结果见表7。
表7霞草提取物(以皂苷计100％)对10mg·kg-1环磷酰胺致小鼠S180肉瘤抑瘤作用的增效作用
注与NS对照组比较“*”P＜0.05，“**”P＜0.01，“***”P＜0.001；与10mg·kg-1环磷酰胺组比“△”P＜0.05。
实验提示给予荷瘤小鼠霞草提取物(以皂苷计100％)100-400mg·kg-1，其抑瘤率分别为100mg·kg-125.35-27.78；200mg·kg-135.71-37.40；400mg·kg-139.68-45.07。可以明显提高10mg·kg-1环磷酰胺对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用，表现出明显的化疗协同作用。说明本品与化疗药物同用可以增加化疗药物的抑瘤作用。
含有上述具有抗癌活性的中药提取物，它还可作为癌症治疗过程中配合化疗、放疗的辅助用药及手术后治疗用药。
试验六霞草提取物(以皂苷计100％)体外抗HSV-1、HSV-2病毒作用的研究。
为观察其抗病毒作用，我们对霞草提取物(以皂苷计100％)进行了体外抗病毒实验。用病毒滴定(TCID50)、药物对细胞毒性测定(TD50)及药物对细胞性测定(TD50)等方法研究了霞草提取物的细胞毒性及抗病作用。实验结果霞草提取物(以皂苷计100％)对细胞毒性测定及杀伤作用见表6；抗病毒HSV-1、HSV-2作用及保护指数(PI)见表7、表8。药物抗病毒作用的病毒感染量为100TCID50
表8.不同浓度药物对Hela细胞的杀伤率(％)及TD50
表9.霞草提取物(以皂苷计100％)抗HSV-1病毒作用(ED50)及保护指数(PI)
药物名称TD50 ED50 PI(＝TD50/ED50)
霞草2 0.15700.000375418.6
病毒唑 0.09920.000625158
表10.霞草提取物(以皂苷计100％)抗HSV-2病毒作用(ED50)及保护指数(PI)
药物名称TD50 ED50 PI(＝TD50/ED50)
霞草提取物(以皂 0.202 0.00075 269.3
苷计100％)
病毒唑 0.09920.000125793.6
根据实验结果药物抗HSV-1和/或HSV-2保护指数大于100者，定为有效。其中阳性对照药及霞草提取物(以皂苷计100％)的保护指数对HSV-1、HSV-2均超过100，说明阳性对照药病毒唑符合实验要求。霞草提取物(以皂苷计100％)对两种病毒有良好的抑制作用。
通过以上实验证明，霞草提取物的较好的抗癌、抗病毒活性，毒副作用小，从而确认霞草提取物可以用于制备治疗癌症的药物组合物，在所述药物组合物中含有具抗癌活性的霞草提取物，以及药学上可以接受的载体。实验还证明了霞草提取物也可以用于制备抗病毒药物组合物。
本发明的优点是很明显的，本发明从霞草根中提取的含苷提取物，工艺合理，经提取、精制而得到的含皂苷提取物，其中皂苷含量在50％以上，经进一步纯化最终可以得到皂苷含量100的霞草提取物。经药效学与毒理学试验证明，本发明霞草提取物具有较好的抗癌、抗病毒活性，毒副作用较小，有效成分明显，即其中的皂苷，且皂苷含量越高，其他杂质越少、可减少服用量，在一定程度上可以减少副作用，有利于保护药物的安全性和有效性。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。
实施例一
取霞草10kg，加水90kg，煮沸提取3小时，滤过，滤液备用，药渣再加水90kg煮沸提取3小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩喷雾干燥即得含有皂苷5％的霞草提取物，即得皂苷含量为5％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。将本提取物加水配成相对密度1.09的稀浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用水洗至无色，将此水洗脱液弃去，再用40％甲醇洗脱至无色，收集此40％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.16的稠浸膏，将此稠浸膏喷雾干燥，得到含皂苷30％的霞草提取物，即得皂苷含量为30％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例二
取霞草10kg，加水80kg，煮沸提取2小时，滤过，滤液备用，药渣再加水90kg煮沸提取4小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩成相对密度1.26的稀浸膏，加入乙醇至乙醇含量40％，静置16小时，取上清液，将此上清液回收乙醇，成相对密度为1.12的浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用水洗至无色，将此水洗脱液弃去，再用85％乙醇洗脱至无色，收集此85％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.16的稠浸膏，将此稠浸膏喷雾干燥，得到含皂苷50％的霞草提取物，即得皂苷含量为50％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。在此皂苷含量为50％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物中加4倍水，加热溶解加入正丁醇萃取3次，每次正丁醇的量与水的量相当，合并萃取液，将合并后的萃取液回收正丁醇后干燥，可得皂苷为90％的有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例三
取霞草10kg，加水100kg，煮沸提取8小时，滤过，滤液备用，药渣再加水80kg煮沸提取8小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩成相对密度1.06的稀浸膏，加入乙醇至乙醇含量95％，静置24小时，取上清液，将此上清液回收乙醇，成相对密度为1.05的浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用10％乙醇洗至无色，将此乙醇洗脱液弃去，再用50％乙醇洗脱至无色，收集此50％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.20的稠浸膏，将此稠浸膏减压干燥，得到含皂苷70％的霞草提取物，即得皂苷含量为70％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例四
取霞草10kg，加1％乙醇100kg，煮沸提取5小时，滤过，滤液备用，药渣再加1％的乙醇80kg煮沸提取5小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩成相对密度1.06的稀浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用1％乙醇洗至无色，将此乙醇洗脱液弃去，再用95％乙醇洗脱至无色，收集此95％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.18的稠浸膏，将此稠浸膏冷冻干燥，得到含皂苷30％的霞草提取物，即得皂苷含量为30％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。在此皂苷含量30％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物中加入2倍的水，加热使溶解，再加入24倍的丙酮，静置24小时，收集析出物，晾干，得到含皂苷90％的霞草提取物，即得皂苷含量90％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例五
取霞草10kg，加乙醇80kg，煮沸提取10小时，滤过，滤液备用，药渣再加乙醇80kg煮沸提取10小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩至无醇味，干燥得到含皂苷大于40％的霞草提取物，即得皂苷含量为40％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。次提取物加水稀释成相对密度1.06的稀浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用水洗至无色，将此水洗脱液弃去，再用40％乙醇洗脱至无色，收集此40％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.30的稠浸膏，将此稠浸膏烘干，得到含皂苷80％的霞草提取物，即得皂苷含量为80％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例六
取霞草10kg，加50％甲醇100kg，煮沸提取5小时，滤过，滤液备用，药渣再加50％的甲醇80kg煮沸提取8小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩成相对密度1.06的稀浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用1％甲醇洗至无色，将此甲醇洗脱液弃去，再用40％甲醇洗脱至无色，收集此40％甲醇洗脱液，将回收甲醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.16的稠浸膏，将此稠浸膏冷冻干燥，得到含皂苷40％的霞草提取物，即得皂苷含量为40％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。在此皂苷含量40％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物中加入2倍的水，加热使溶解，加入醋酸乙酯萃取3次，每次醋酸乙酯的量与水的量相当，合并萃取液，将合并后的萃取液回收醋酸乙酯后烘干，得到含皂苷75％的霞草提取物，即得皂苷含量为75％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例七
取霞草10kg，加甲醇120kg，煮沸提取3小时，滤过，滤液备用，药渣再加甲醇80kg煮沸提取3小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液回收甲醇浓缩成相对密度1.26的稠浸膏，烘干即得含皂苷50％的霞草提取物，即得皂苷含量为50％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。将此提取物加水稀释成相对密度1.06的混合物，过大孔吸附树脂，先用水洗至无色，将此水洗脱液弃去，再用80％甲醇洗脱至无色，收集此80％甲醇洗脱液，将回收甲醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.21的稠浸膏，将此稠浸膏喷雾干燥，得到含皂苷80％的霞草提取物，即得皂苷含量为80％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。在此皂苷含量80％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物中加入4倍的水，加热使溶解，加入正丁醇萃取3次，每次正丁醇的量与水的量相当，合并萃取液，将合并后的萃取液回收正丁醇后烘干，得到含皂苷100％的霞草提取物，即得皂苷含量为100％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
权利要求
1、一种具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，其特征在于其中含有5％以上的皂苷。
2、依照权利要求1所述的具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，其特征在于所述的含皂苷的提取物中，皂苷的含量在10％以上。
3、依照权利要求2所述的具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，其特征在于所述的含皂苷的提取物中，皂苷的含量在30％以上。
4、依照权利要求3所述的具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，其特征在于所述的含皂苷的提取物中，皂苷的含量在50％以上。
5、依照权利要求4所述的具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，其特征在于所述的含皂苷的提取物中，皂苷的含量在80％以上。
6、依照权利要求1所述的具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物的提取方法，其特征在于包括以下步骤
6-1、霞草粗提物的制取
6-1-1、取霞草根自然干燥后粉碎；
6-1-2、用溶剂提取；
6-1-3、提取液减压浓缩得提取物浸膏，即得霞草粗提物；
6-2、霞草粗提物精制
6-2-1、将霞草粗提物加水制成水混悬液；
6-2-2、过大孔树脂柱，先用水或1～10％低浓度的乙醇或甲醇洗脱，除去极性溶剂中的杂质；
6-2-3、再用20％以上高浓度的乙醇或甲醇洗脱；
6-2-4、收集高浓度醇洗脱液，回收溶剂，干燥，制得含皂苷的霞草提取物；
6-3、含皂苷霞草提取物的纯化
用有机溶剂对含皂苷霞草提取物进行纯化；所说的有机溶剂它选自正丁醇、醋酸乙酯、丙酮-乙醚、氯仿-甲醇-水或石油醚。
7、依照权利要求6所述的霞草提取物的提取方法，其特征在于在6-1-2步骤中所说的溶剂它选自丙酮、醇类、水或水醇混合溶剂；所说的醇类为甲醇、乙醇、异丙醇等短链醇。
8、依照权利要求6所述的霞草提取物的提取方法，其特征在于所说的霞草粗提物的提取方法包括以下步骤
8-1、用水提取粉碎的霞草根；
8-2、提取液浓缩成相对密度1.04～1.34的稠浸膏；
8-3、稠浸膏中加入乙醇至乙醇浓度为40～95％；
8-4、静置，取上清液浓缩成浸膏，即为霞草粗提物。
9、依照权利要求1或2或3或4或5所述的含皂苷的霞草粗提取物在制备治疗癌症药物组合物中的用途，其中所述的药物组合物中含有抗癌活性的霞草提取物，以及药学上可以接受的载体。
10、依照权利要求1或2或3或4或5所述的含皂苷的霞草提取物在制备抗病毒药物组合物中的用途，其中所述的药物组合物中含有具抗病毒活性的霞草提取物，以及药学上可以接受的载体。
全文摘要
本发明从霞草(Gypsophila oldhamiana Miq.)根中提取的霞草提取物，经提取、精制，其中皂苷含量在5％以上，经进一步纯化最终可得到皂苷含量100％的霞草提取物，工艺合理，操作简便。经药效学及毒理学试验证明，本发明霞草提取物具有较好的抗癌、抗病毒作用，可用于制备抗癌药物及抗病毒药物组合物。该提取物制成的药物，毒副作用较小，其有效成分明确，服用剂量较少，在一定程度上也可减小毒副作用，更有利于保证药物的安全性和有效性。
文档编号A61P35/00GK1723951SQ20051004430
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者仲英, 左春旭, 刘鲁, 王元书, 孙敬勇, 谢砚英, 王菊 申请人:山东省医学科学院药物研究所
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物，更具体地说，本发明涉及一种从石竹科石头花属植物霞草Gypsophila oldhamiana Miq.的根中提取的有效部位，本发明还涉及该药物提取物地制备方法及其应用。
背景技术：
随着医学的进步，恶性肿瘤---癌症，成为常见且严重威胁人类生命及生活质量的主要疾病之一，目前中药用于肿瘤治疗时分为两类，一类为治疗类用药，如某些复方，但存在成分不明，机理不清楚，效价不高等缺点，甚至有的复方中含有巨毒成分，容易产生严重的毒副作用；另一类为治疗肿瘤药中的辅助用药，用以减轻放、化疗副作用，但不具备直接治疗肿瘤的作用。
霞草为石竹科石头花属植物霞草Gypsophila oldhamiana Miq.的根别名长蕊石头花[1]，酸蚂昨菜、山马生菜、山扫帚菜，主产于山东、山西、陕西、宁夏、内蒙古、甘肃、新疆、河北、黑龙江等地。该植物为我国民间常用草药，《中药大辞典》收载，有些地区作为银柴胡的代用品入药。该药性甘、微寒，具有清热凉血、活血散瘀、消肿止痛、化腐生肌等功效。主要治疗虚劳肌热、骨蒸、阴虚久疟、小儿疳热等疾患，同时还可用于跌打损伤、骨拆、外伤等。欧洲的植物化学家对该植物进行过一些研究，分得三萜、三萜皂甙、黄酮、甾醇、多糖、有机酸等化合物。药理实验研究表明，霞草中提取的三萜皂甙，给家兔在形成动脉粥样硬化的同时或以后每天内服，可降低血清胆甾醇浓度，使胆甾醇/脑磷脂系数降低，使主动脉类脂质含量降低。有人认为皂甙可作用于血浆脂蛋白，阻止胆甾醇的酯化及其在血管壁的沉积，也有人认为可以阻止胆甾醇从肠道吸收。有文献报道丝石竹皂甙、九糖甙没有抗菌效果，酶解后除去羧基上的甙键，去5个糖，生成次皂甙具有显著的抗菌作用。国内对该植物研究较少，化学成分及药理作用方面的研究均未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效低毒的具有抗癌活性及抗病毒活性的霞草提取物。
本发明的另一个目的是，提供一种具有抗癌活性及抗病毒活性的霞草提取物的制备方法。
本发明还有一个目的是，提供具有抗癌活性及抗病毒活性的霞草提取物在制备治疗癌症及抗病毒药物中的新用途。
本发明的解决方案是从中药霞草根中提取一种具有抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，该提取物中含有皂苷，其含量在5％以上。
本发明所述的抗癌、抗病毒活性的霞草提取物的提取方法，包括以下主要步骤
1、霞草粗提物的制取
(1)、取霞草根自然干燥后粉碎；
(2)、用溶剂提取；所说的溶剂它选自丙酮、醇类水或水醇混合溶剂，所说的醇类为甲醇、乙醇、异丙醇等短链醇。
(3)、提取液减压浓缩得提取物浸膏，即为霞草粗提物，该粗提物中含有5％-30％的皂苷；
该霞草粗提物也可以按以下方法来提取
A、粉碎的霞草根用水提取；
B、提取液浓缩成相对密度1.04～1.34的稠浸膏；
C、稠浸膏中加入乙醇至乙醇浓度为40～95％；
D、静置，取上清液浓缩成浸膏，即为霞草粗提物。
2、霞草粗提物的精制
(1)、将霞草粗提物加水制成水混悬液；
(2)、过大孔树脂柱，这里所用的大孔树脂孔为中低极性大孔树脂.先用水或1-10％低浓度的乙醇或甲醇溶液洗脱，除去极性溶剂中的杂质；
(3)、再用20％以上的高浓度乙醇或甲醇洗脱；
(4)、收集高浓度醇洗脱液，蒸馏回收溶剂，干燥、制得含皂苷的精制霞草提取物，该提取物中含有30％以上的皂苷。
3、含皂苷霞草提取物的纯化
上述经精制后的霞草提取物，进一步用有机溶剂进行纯化可制得更高纯度的霞草提取物，其中皂苷含量可达到80％以上，这里所说的有机溶剂它选自正丁醇、醋酸乙酯、丙酮-乙醚的混合溶剂、氯仿-甲醇-水的混合溶剂或石油醚。
总之，用本发明提供的提取方法，根据需要可以制备得到皂苷含量在5％以上或10％以上或30％以上或50％以上或80％以上，具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物。
申请人进一步用本发明的霞草提取物进行了急毒和药效试验，观察了霞草提取物(以皂苷计100％)对荷瘤动物用药后肿瘤生长影响，对霞草提取物进行抗肿瘤药效学研究。并对霞草提取物进行了体外抗病实验。
试验一霞草提取物(以皂苷计100％)在体外对10种人癌细胞的细胞毒作用观察。
本发明采用10种人癌细胞株，其中包括Bel-7402(肝癌)，BGC-823(胃癌)，MCF-7(乳腺癌)，HCT-8(结肠癌)，A2780(卵巢癌)，KB(口腔上皮细胞癌)，Hela(宫颈癌)，PC-3M(前列腺癌转移株)，A549(肺腺癌)，KeTr3(肾癌)，用MTT法进行实验。
将细胞培养在含10％小牛血清的RPMI1640培养基中，内含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，于37℃、5％CO2培养箱中传代培养。
0.3％胰酶0.6ml消化贴壁的肿瘤细胞，含10％小牛血清的RPMI 1640培养液配制细胞悬液，浓度为1×104细胞/ml。于96孔培养板内每孔接种100μl(含1000个肿瘤细胞)，37℃培养24小时。给药组加入含有不同浓度药物，每药设3个剂量组，分别为50μg/ml，5μg/ml，0.5μg/ml，每组设三个平行孔，每孔加药100μl。对照组加入与药等体积的溶剂。置37℃，5％CO2温箱中培养4天后弃去培养液，每孔加入200μl 0.2％MTT溶液(RPMI 1640配制)。37℃孵育4小时，弃去上清，每孔加入DMSO 150μl溶解Formazan颗粒，轻度振荡后，用酶标仪，在参考波长450nm、检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)。
结果计算以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，求药物对肿瘤细胞的抑制率。
以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出药物的半数抑制浓度(IC50)。
实验结果见表1
表1.霞草提取物(以皂苷计100％)在体外对人肿瘤细胞生长的影响
续表1
霞草提取物(以皂苷计100％)对A2780，KB，PC-3M，A549，KeTr3五种人癌细胞株有一定的细胞毒作用；对Bel-7402，BGC-823，HCT-8，MCF-7，Hela五种人癌细胞株未见明显细胞毒作用。
试验二霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠移植性肿瘤生长的抑制作用，观察霞草提取物(以皂苷计100％)对荷瘤动物用药后肿瘤生长的影响，对该药进行抗肿瘤药效学研究。
一、霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用
选用C57BL/6小鼠，18-22g，雄性，将肿瘤生长良好、全身状况较好的荷瘤动物处死，无菌条件下取出瘤块，剪碎，用玻璃研磨器加生理盐水(1∶3)磨成匀浆，于每鼠腋窝皮下接种瘤液0.2ml。
接种后24小时，将动物按体重随机分组，每组10只。设空白对照组，环磷酰胺阳性药对照组，霞草提取物(以皂苷计100％)给药组剂量为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。环磷酰胺腹腔注射一次60mg/kg。霞草提取物(以皂苷计100％)灌胃给药20ml/kg，每天一次，连续给药10天。末次给药后24小时，颈椎脱臼处死动物，分别称体重及瘤重，计算肿瘤抑制率，进行疗效评价并将各组结果进行统计学处理。疗效评价公式
结果见表2霞草提取物(以皂苷计100％)50mg/kg组的抑瘤率为18.3％(P＞0.05)；100mg/kg组的抑瘤率为38.3％(P＜0.05)；200mg/kg组的抑瘤率为41.9％(P＜0.05)。
结果表明，霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠Lewis肺癌生长有一定的抑制作用，并呈一定的剂量效应关系。
二、霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠宫颈癌U14的抑瘤作用
选用昆明种小鼠，18-22g，雌性，将接种后7天的荷瘤动物颈椎脱臼处死。无菌条件下取出腹水，用生理盐水稀释，于每鼠腋窝皮下接种瘤液0.2ml。
接种后24小时，将动物按体重随机分组，每组10只。设空白对照组，环磷酰胺阳性药对照组，霞草提取物(以皂苷计100％)给药组剂量为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。环磷酰胺腹腔注射一次60mg/kg。霞草提取物(以皂苷计100％)灌胃给药20ml/kg，每天一次，连续给药10天。末次给药后24小时，颈椎脱臼处死动物，分别称体重及瘤重，计算肿瘤抑制率，并进行统计学处理。疗效评价公式
结果见表3。霞草提取物(以皂苷计100％)50mg/kg组的抑瘤率为6.8％(P＞0.05)；100mg/kg组的抑瘤率为31.1％(P＜0.05)；200mg/kg组的抑瘤率为36.5％(P＜0.05)。
结果表明，中、大剂量组对小鼠宫颈癌U14生长有一定的抑制作用，并呈一定的剂量效应关系。
三、霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠肝癌H22的抑瘤作用
选用昆明种小鼠，18-22g，雄性，将接种后7天的荷瘤动物颈椎脱臼处死。无菌条件下取出腹水，用生理盐水稀释，于每鼠腋窝皮下接种瘤液0.2ml。
接种后24小时，将动物按体重随机分组，每组10只。设空白对照组，环磷酰胺阳性药对照组，霞草提取物(以皂苷计100％)给药组剂量为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。环磷酰胺腹腔注射一次60mg/kg。霞草提取物(以皂苷计100％)灌胃给药20ml/kg，每天一次，连续给药10天。末次给药后24小时，颈椎脱臼处死动物，分别称体重及瘤重，计算肿瘤抑制率，并进行统计学处理。疗效评价公式
结果见表4。霞草提取物(以皂苷计100％)50mg/kg组的抑瘤率为15.3％(P＞0.05)；100mg/kg组的抑瘤率为43.7％(P＜0.01)；200mg/kg组的抑瘤率为47.7％(P＜0.01)。
结果表明霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠肝癌H22生长有一定的抑制作用，并呈一定的剂量效应关系。
总之，在本实验条件下，霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠Lewis肺癌、宫颈癌U14、肝癌H22均具有一定的生长抑制作用，说明霞草提取物(以皂苷计100％)具有一定的抗肿瘤活性。
表2.霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠Lewis肺癌生长的影响
表3.霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠宫颈癌U14生长的影响
表4.霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠肝癌H22生长的影响
试验三、霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠淋巴细胞转化的影响(中国医学科学院药物研究所肿瘤药理室)
1、实验目的
观察霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠淋巴细胞转化的影响。
2、实验材料
受试药物由山东省医学科学院药物研究所提供，实验时用双蒸水配制成实验所需浓度。
动物C57BL/6小鼠由中国医学科学院实验动物所繁育场提供，合格证号SCXK京2000-0006号。。
3、方法
选用C57BL/6小鼠，将接种后10-14天。肿瘤生长良好的荷瘤动物处死，无菌条件下取出瘤块，称重、剪碎、研磨、过滤，匀浆以生理盐水1∶3稀释，于实验动物腋窝下以每鼠0.2ml瘤液接种。接种次日，将动物按体重随机分为4组，每组10只。设阴性对照组，SJY 50、100、200mg/kg三个剂量给药组。灌胃给药体积为20ml/kg，每日1次，连续给药8天。末次给药后24小时，颈椎脱臼处死动物。无菌条件下取出脾脏，分别在筛网上研磨、离心、计数单个细胞，配成终浓度为2.5×106个细胞/ml，分别加入96孔板中，同时设空白对照孔。置37℃ 5％CO2培养箱中培养72小时，培养结束前6小时向每孔加入[3H]-TdR，终浓度为1μCi/孔。多头收集器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，烤干，放入加有4ml闪烁液的测量瓶中，液闪仪上测定每个样品的cpm值。
4、实验结果
结果见表5。
表5.霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠脾淋巴细胞转化的影响
实验结果各组淋巴细胞增殖无明显差别。
5、结论
结果显示霞草提取物(以皂苷计100％)在荷瘤小鼠未见增强淋巴细胞转化能力的作用。
试验四、霞草提取物(以皂苷计100％)对荷瘤小鼠廓清能力的影响(中国医学科学院药物研究所肿瘤药理室)
1、实验目的
观察霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠廓清功能的影响。
2、实验材料
受试药物由山东省医学科学院药物研究所提供，实验时用双蒸水配制成实验所需浓度。
动物昆明种小鼠由中国医学科学院实验动物所繁育场提供，合格证号SCXK京2000-0006号。
3、实验方法
接种肝癌H22昆明小鼠40只，随机分为4组，每组10只。设空白对照组，样品剂量为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。样品灌胃给药20ml/kg，每天一次，连续给药10天。末次给药后24小时，小鼠尾静脉注射0.5％刚果红(0.1ml/10g体重)，于注射后1分钟及5分钟，眼眶后静脉丛取血，离心取血清。吸25μl血清，加2.5ml生理盐水(pH10)，于510nm比色测吸光度，计算廓清指数k。处死小鼠，取脾脏及胸腺，计算脏器系数。比较上述各组间差别。
4、实验结果
结果见表6。
表6.霞草提取物(以皂苷计100％)对小鼠廓清能力的影响a廓清指数
b脏器系数
实验结果三个剂量组的廓清指数及脾脏和胸腺指数与空白对照组相比均无显著性差别。
试验五霞草提取物(以皂苷计100％)对10mg·kg-1环磷酰胺致小鼠SI80肉瘤抑瘤作用的增效作用。
小鼠购进后适应性饲养24h，禁食12h，左腋下无菌接种由生理盐水稀释的小鼠S180腹水液(含瘤细胞5×106/mL)0.2mL/只，接种后24h，按性别、体重随机分组给药。分组为NS对照组24只(♀♂各12只)，20mg·kg-1环磷酰胺SC组12只(♀♂各6只)，10mg·kg-1环磷酰胺SC组12只(♀♂各6只)，10mg·kg-1环磷酰胺加100mg·kg-1、200mg·kg-1、400mg·kg-1霞草提取物(以皂苷计100％)各1组，每组12只(均为♀♂各6只)，每日给药一次，连续给药9天，末次给药24h后，脱颈处死小鼠，剥离瘤体，GB-303电子天平称瘤体重，t检验比较各组瘤重，并按(NS对照组瘤重-给药组瘤重)/NS对照组瘤重，计算各药物组的抑瘤率，试验连续重复三次，结果见表7。
表7霞草提取物(以皂苷计100％)对10mg·kg-1环磷酰胺致小鼠S180肉瘤抑瘤作用的增效作用
注与NS对照组比较“*”P＜0.05，“**”P＜0.01，“***”P＜0.001；与10mg·kg-1环磷酰胺组比“△”P＜0.05。
实验提示给予荷瘤小鼠霞草提取物(以皂苷计100％)100-400mg·kg-1，其抑瘤率分别为100mg·kg-125.35-27.78；200mg·kg-135.71-37.40；400mg·kg-139.68-45.07。可以明显提高10mg·kg-1环磷酰胺对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用，表现出明显的化疗协同作用。说明本品与化疗药物同用可以增加化疗药物的抑瘤作用。
含有上述具有抗癌活性的中药提取物，它还可作为癌症治疗过程中配合化疗、放疗的辅助用药及手术后治疗用药。
试验六霞草提取物(以皂苷计100％)体外抗HSV-1、HSV-2病毒作用的研究。
为观察其抗病毒作用，我们对霞草提取物(以皂苷计100％)进行了体外抗病毒实验。用病毒滴定(TCID50)、药物对细胞毒性测定(TD50)及药物对细胞性测定(TD50)等方法研究了霞草提取物的细胞毒性及抗病作用。实验结果霞草提取物(以皂苷计100％)对细胞毒性测定及杀伤作用见表6；抗病毒HSV-1、HSV-2作用及保护指数(PI)见表7、表8。药物抗病毒作用的病毒感染量为100TCID50
表8.不同浓度药物对Hela细胞的杀伤率(％)及TD50
表9.霞草提取物(以皂苷计100％)抗HSV-1病毒作用(ED50)及保护指数(PI)
药物名称TD50 ED50 PI(＝TD50/ED50)
霞草2 0.15700.000375418.6
病毒唑 0.09920.000625158
表10.霞草提取物(以皂苷计100％)抗HSV-2病毒作用(ED50)及保护指数(PI)
药物名称TD50 ED50 PI(＝TD50/ED50)
霞草提取物(以皂 0.202 0.00075 269.3
苷计100％)
病毒唑 0.09920.000125793.6
根据实验结果药物抗HSV-1和/或HSV-2保护指数大于100者，定为有效。其中阳性对照药及霞草提取物(以皂苷计100％)的保护指数对HSV-1、HSV-2均超过100，说明阳性对照药病毒唑符合实验要求。霞草提取物(以皂苷计100％)对两种病毒有良好的抑制作用。
通过以上实验证明，霞草提取物的较好的抗癌、抗病毒活性，毒副作用小，从而确认霞草提取物可以用于制备治疗癌症的药物组合物，在所述药物组合物中含有具抗癌活性的霞草提取物，以及药学上可以接受的载体。实验还证明了霞草提取物也可以用于制备抗病毒药物组合物。
本发明的优点是很明显的，本发明从霞草根中提取的含苷提取物，工艺合理，经提取、精制而得到的含皂苷提取物，其中皂苷含量在50％以上，经进一步纯化最终可以得到皂苷含量100的霞草提取物。经药效学与毒理学试验证明，本发明霞草提取物具有较好的抗癌、抗病毒活性，毒副作用较小，有效成分明显，即其中的皂苷，且皂苷含量越高，其他杂质越少、可减少服用量，在一定程度上可以减少副作用，有利于保护药物的安全性和有效性。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。
实施例一
取霞草10kg，加水90kg，煮沸提取3小时，滤过，滤液备用，药渣再加水90kg煮沸提取3小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩喷雾干燥即得含有皂苷5％的霞草提取物，即得皂苷含量为5％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。将本提取物加水配成相对密度1.09的稀浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用水洗至无色，将此水洗脱液弃去，再用40％甲醇洗脱至无色，收集此40％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.16的稠浸膏，将此稠浸膏喷雾干燥，得到含皂苷30％的霞草提取物，即得皂苷含量为30％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例二
取霞草10kg，加水80kg，煮沸提取2小时，滤过，滤液备用，药渣再加水90kg煮沸提取4小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩成相对密度1.26的稀浸膏，加入乙醇至乙醇含量40％，静置16小时，取上清液，将此上清液回收乙醇，成相对密度为1.12的浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用水洗至无色，将此水洗脱液弃去，再用85％乙醇洗脱至无色，收集此85％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.16的稠浸膏，将此稠浸膏喷雾干燥，得到含皂苷50％的霞草提取物，即得皂苷含量为50％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。在此皂苷含量为50％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物中加4倍水，加热溶解加入正丁醇萃取3次，每次正丁醇的量与水的量相当，合并萃取液，将合并后的萃取液回收正丁醇后干燥，可得皂苷为90％的有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例三
取霞草10kg，加水100kg，煮沸提取8小时，滤过，滤液备用，药渣再加水80kg煮沸提取8小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩成相对密度1.06的稀浸膏，加入乙醇至乙醇含量95％，静置24小时，取上清液，将此上清液回收乙醇，成相对密度为1.05的浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用10％乙醇洗至无色，将此乙醇洗脱液弃去，再用50％乙醇洗脱至无色，收集此50％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.20的稠浸膏，将此稠浸膏减压干燥，得到含皂苷70％的霞草提取物，即得皂苷含量为70％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例四
取霞草10kg，加1％乙醇100kg，煮沸提取5小时，滤过，滤液备用，药渣再加1％的乙醇80kg煮沸提取5小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩成相对密度1.06的稀浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用1％乙醇洗至无色，将此乙醇洗脱液弃去，再用95％乙醇洗脱至无色，收集此95％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.18的稠浸膏，将此稠浸膏冷冻干燥，得到含皂苷30％的霞草提取物，即得皂苷含量为30％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。在此皂苷含量30％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物中加入2倍的水，加热使溶解，再加入24倍的丙酮，静置24小时，收集析出物，晾干，得到含皂苷90％的霞草提取物，即得皂苷含量90％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例五
取霞草10kg，加乙醇80kg，煮沸提取10小时，滤过，滤液备用，药渣再加乙醇80kg煮沸提取10小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩至无醇味，干燥得到含皂苷大于40％的霞草提取物，即得皂苷含量为40％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。次提取物加水稀释成相对密度1.06的稀浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用水洗至无色，将此水洗脱液弃去，再用40％乙醇洗脱至无色，收集此40％乙醇洗脱液，将回收乙醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.30的稠浸膏，将此稠浸膏烘干，得到含皂苷80％的霞草提取物，即得皂苷含量为80％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例六
取霞草10kg，加50％甲醇100kg，煮沸提取5小时，滤过，滤液备用，药渣再加50％的甲醇80kg煮沸提取8小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液浓缩成相对密度1.06的稀浸膏，将此稀浸膏过大孔吸附树脂，先用1％甲醇洗至无色，将此甲醇洗脱液弃去，再用40％甲醇洗脱至无色，收集此40％甲醇洗脱液，将回收甲醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.16的稠浸膏，将此稠浸膏冷冻干燥，得到含皂苷40％的霞草提取物，即得皂苷含量为40％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。在此皂苷含量40％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物中加入2倍的水，加热使溶解，加入醋酸乙酯萃取3次，每次醋酸乙酯的量与水的量相当，合并萃取液，将合并后的萃取液回收醋酸乙酯后烘干，得到含皂苷75％的霞草提取物，即得皂苷含量为75％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
实施例七
取霞草10kg，加甲醇120kg，煮沸提取3小时，滤过，滤液备用，药渣再加甲醇80kg煮沸提取3小时，滤过，合并两次滤液，将合并后的滤液回收甲醇浓缩成相对密度1.26的稠浸膏，烘干即得含皂苷50％的霞草提取物，即得皂苷含量为50％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。将此提取物加水稀释成相对密度1.06的混合物，过大孔吸附树脂，先用水洗至无色，将此水洗脱液弃去，再用80％甲醇洗脱至无色，收集此80％甲醇洗脱液，将回收甲醇后的洗脱液浓缩成相对密度1.21的稠浸膏，将此稠浸膏喷雾干燥，得到含皂苷80％的霞草提取物，即得皂苷含量为80％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。在此皂苷含量80％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物中加入4倍的水，加热使溶解，加入正丁醇萃取3次，每次正丁醇的量与水的量相当，合并萃取液，将合并后的萃取液回收正丁醇后烘干，得到含皂苷100％的霞草提取物，即得皂苷含量为100％的具有抗癌活性及抗病毒活性的中药提取物。
权利要求
1、一种具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，其特征在于其中含有5％以上的皂苷。
2、依照权利要求1所述的具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，其特征在于所述的含皂苷的提取物中，皂苷的含量在10％以上。
3、依照权利要求2所述的具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，其特征在于所述的含皂苷的提取物中，皂苷的含量在30％以上。
4、依照权利要求3所述的具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，其特征在于所述的含皂苷的提取物中，皂苷的含量在50％以上。
5、依照权利要求4所述的具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物，其特征在于所述的含皂苷的提取物中，皂苷的含量在80％以上。
6、依照权利要求1所述的具抗癌、抗病毒活性的霞草提取物的提取方法，其特征在于包括以下步骤
6-1、霞草粗提物的制取
6-1-1、取霞草根自然干燥后粉碎；
6-1-2、用溶剂提取；
6-1-3、提取液减压浓缩得提取物浸膏，即得霞草粗提物；
6-2、霞草粗提物精制
6-2-1、将霞草粗提物加水制成水混悬液；
6-2-2、过大孔树脂柱，先用水或1～10％低浓度的乙醇或甲醇洗脱，除去极性溶剂中的杂质；
6-2-3、再用20％以上高浓度的乙醇或甲醇洗脱；
6-2-4、收集高浓度醇洗脱液，回收溶剂，干燥，制得含皂苷的霞草提取物；
6-3、含皂苷霞草提取物的纯化
用有机溶剂对含皂苷霞草提取物进行纯化；所说的有机溶剂它选自正丁醇、醋酸乙酯、丙酮-乙醚、氯仿-甲醇-水或石油醚。
7、依照权利要求6所述的霞草提取物的提取方法，其特征在于在6-1-2步骤中所说的溶剂它选自丙酮、醇类、水或水醇混合溶剂；所说的醇类为甲醇、乙醇、异丙醇等短链醇。
8、依照权利要求6所述的霞草提取物的提取方法，其特征在于所说的霞草粗提物的提取方法包括以下步骤
8-1、用水提取粉碎的霞草根；
8-2、提取液浓缩成相对密度1.04～1.34的稠浸膏；
8-3、稠浸膏中加入乙醇至乙醇浓度为40～95％；
8-4、静置，取上清液浓缩成浸膏，即为霞草粗提物。
9、依照权利要求1或2或3或4或5所述的含皂苷的霞草粗提取物在制备治疗癌症药物组合物中的用途，其中所述的药物组合物中含有抗癌活性的霞草提取物，以及药学上可以接受的载体。
10、依照权利要求1或2或3或4或5所述的含皂苷的霞草提取物在制备抗病毒药物组合物中的用途，其中所述的药物组合物中含有具抗病毒活性的霞草提取物，以及药学上可以接受的载体。
全文摘要
本发明从霞草(Gypsophila oldhamiana Miq.)根中提取的霞草提取物，经提取、精制，其中皂苷含量在5％以上，经进一步纯化最终可得到皂苷含量100％的霞草提取物，工艺合理，操作简便。经药效学及毒理学试验证明，本发明霞草提取物具有较好的抗癌、抗病毒作用，可用于制备抗癌药物及抗病毒药物组合物。该提取物制成的药物，毒副作用较小，其有效成分明确，服用剂量较少，在一定程度上也可减小毒副作用，更有利于保证药物的安全性和有效性。
文档编号A61P35/00GK1723951SQ20051004430
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者仲英, 左春旭, 刘鲁, 王元书, 孙敬勇, 谢砚英, 王菊 申请人:山东省医学科学院药物研究所
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