艾地苯醌用于局部应用的除色素组合物的制备及相应组合物的制作方法
专利名称：艾地苯醌用于局部应用的除色素组合物的制备及相应组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及艾地苯醌在一种组合物中的应用，此组合物用于涂敷在皮肤上以抑制黑素生成。本发明还涉及意欲在皮肤上局部应用的组合物，它含有美容、药学和/或皮肤病学上有效量的艾地苯醌、其衍生物或者它们的混合物。本发明特别涉及一种化妆品制剂，它可对皮肤色素沉着过度具有有益的作用。
本发明优选涉及美容、药学或皮肤病学制剂，此制剂含有艾地苯醌和/或其衍生物，而且可降低黑色素生成增多引起的局部皮肤着色加重。本发明特别涉及一种美容或皮肤病学制剂，它可用于治疗激素刺激和/或物理、化学和/或生物学损害引起的皮肤色素沉着过度。本发明还涉及一种局部应用的药物组合物，其中所含的艾地苯醌为一种皮肤增亮剂。
背景技术：
黑色素是在称为黑素细胞的细胞中产生的，它是可见于皮肤、头发、眼睛和某些神经细胞中的深色色素。
黑素细胞是源于胚胎时期神经嵴的神经外胚层细胞，在胎儿阶段它迁移至表皮的基底层。其他组织中也分布着皮肤外的黑素细胞。
在胎儿阶段，嗜表皮黑素细胞到达表皮最深层，位于基底细胞之间，黑素细胞与基底细胞的比例是1∶10，载体的种族并不重要。一旦处于其最终位置，这些细胞将发出分支状突起，称为树突，这样所有基底细胞将与这些突起接触。
黑素细胞的主要功能是合成深色色素，它称为黑色素。该色素积聚在黑素细胞细胞质内，为分泌颗粒状卵圆形结构，称为黑素体，它在细胞体中形成后就通过黑素细胞的细胞骨架朝树突移动。此过程由激素控制，一些激素促进黑色素形成，而其他则抑制其形成，而且一些激素促进黑素体朝树突外周移动，而其他激素则将它们集中在核周围。尽管此过程在人类中存在，但是它在低级动物中非常明显。
黑素细胞树突的游离端伸入基底角质细胞细胞质，将黑素体逐个注入这些细胞的细胞质中。因此，整个表皮基底层和毛囊含有均匀分布的黑色素，一方面是因为黑素体存在于黑素细胞中，而另一方面并且很大程度上是因为黑素体进入基底角质细胞，按照情况也称为载黑素细胞。在此过程中最突出的是，当色素沉着的基底角质细胞(载黑素细胞)分裂以产生更多的浅表分化棘细胞时，则丢失黑素体，而且另一方面黑素细胞树突也不向分化棘细胞中注入黑素体。这些丢失的黑素体可停留在表皮的细胞间隙，然后随着皮肤的正常脱屑而被除去。这些黑素体完全降解而不再产生其着色功能。
人正常皮肤颜色与黑素体的大小、结构、类型和颜色以及它们在黑素细胞和角质细胞中的分布直接相关。黑色素合成只在黑素体中进行，而且黑色素合成依赖于不同基因的作用。
每个黑素体都是一种球形或卵圆形细胞器，它由三层脂蛋白细胞膜、含水的无定形基质、电解质和不同溶液形成，其中稀释着活性酶和形成膜内微管的微管蛋白超微结构，这些微管或多或少彼此平行。
直到最近以前仍相信黑素体仅由黑色素和黑色素-蛋白构成，黑色素蛋白是与酪氨酸酶相互作用的产物。最近的研究表明黑素体含有两种不同的部分，一种是脂质部分，其脂质位于黑素体外层部分；另一种是蛋白部分，其结构蛋白形成黑素体的中心部分。脂质部分在黑素体的功能调节方面是重要的，而基质的蛋白控制其结构分化。
随着黑素体程序化地完成其功能，形成黑素体和它们的黑素化的过程可被认为是通过被涉及的内部调节控制而传递的一“级联”事件。此过程可总结如下i)黑素体成分的形成和组织在黑素体膜液泡内形成黑素体的结构和酶蛋白。在早期，此膜还加入特异蛋白和脂质。在排列为管状、片状、丝状，没有规定结构的粗面内质网中形成的蛋白，沉积在光面内质网中所形成的液泡内。还加入高尔基体中形成的微囊，所述高尔基体中含有酶或酪氨酸酶后调节因子(诸如多巴色素-互变异构酶)，它们与外层膜融合。在高尔基复合体中糖基化后加入酪氨酸酶。
经过一段时间，结构蛋白持续被加入黑素体，酪氨酸酶也如此。结构蛋白将会成为黑素体膜的一部分，然后它们移动至基质上。
ii)转化为真黑素体和褐黑素体在此点黑素体的变化途径将依赖于黑素体内半胱氨酸水平和/或含巯基化合物(例如谷胱甘肽)的水平。如果此水平低，则产生真黑素生成刺激，伴随真黑素体形成。在此情况下，板层将成为基质的主要成分，并呈平行排列。酪氨酸酶将由高尔基体转移，并与已经形成的泡和板层结合。如果没有抑制性半胱氨酸水平，酪氨酸酶将会通过酪氨酸酶转化为多巴醌而激发黑色素合成。除了多巴色素转化因子调节的那些过程外，通过自氧化过程多巴醌将被转化为真黑色素。显然，吲哚-5，6-醌与其几种前体聚合，以在黑素体内形成黑色素。另一方面，如果半胱氨酸水平高，将形成褐黑素体，而且褐黑色素将沉积在尚未结构化的微丝和小泡的聚集体上。酪氨酸酶将酪氨酸转化为多巴醌，但后者将向基质扩散，并与半胱氨酸结合，形成半胱氨酰多巴，随后进行修饰形成褐黑色素。半胱氨酰多巴与多巴醌竞争，因此改变其代谢，但不改变酪氨酸酶活性。然后5，6-羟基吲哚代谢物的存在抑制后酪氨酸酶活性，它不引起吲哚-5，6-醌合成，降低黑素生成率，使多巴醌在基质中蓄积，阻止正常的真黑素合成。换句话说，半胱氨酸充当黑素体的毒性物质，它可抑制某些酶促步骤，阻止中间产物正常转化为真正的黑色素，将黑色素固定于黑素体结构蛋白的可能性也会丧失。
iii)转移和降解由于黑素体选择性过程中黑素细胞细胞骨架的收缩运动的作用，黑素体从核周体中的合成部位转移至树突末端。一旦黑素体向角质细胞内部转移开始，这些角质细胞细胞吞噬含黑素体的游离树突末端，则发生膜融合现象，黑素体被释放至角质细胞细胞质中。将黑素体加入角质细胞的次级溶酶体中。在此，溶酶体酶将开始降解黑素体，其成分将被稀释至细胞质中，当这些成分被加入代谢底物池时，它们可被再利用。这种降解最重要的特征之一是黑色素从氧化状态转为还原状态，降低其着色强度。
由此完成黑素体循环，开始于黑素细胞中的合成，转移至角质细胞中，最后在连续过程中被降解，确保色素分布均匀。
可将皮肤黑色素沉着分为几种因果成分1)在未暴露于紫外线的情况下，皮肤黑色素按照遗传程序产生(结构性皮肤色素沉着)和2)皮肤直接暴露于UV辐射引起的即刻和延迟晒黑反应(兼性皮肤色素沉着)。条件性色素沉着改变由日光、激素和晒黑能力之间复杂的相互作用引起，这些根据个体遗传结构而不同。
皮肤、头发和眼睛的结构性色素沉着由遗传上的几种基因决定，这些基因缺乏明确的显性优势。另外，这些基因具有很强的自发突变趋势，因此发现具有一个以上黑素细胞群的个体并不罕见，它使此性状变成嵌合体。
尽管人皮肤中黑素细胞群存在区域变异，但是不管皮肤颜色如何，所有人类在给定的解剖区域均具有大约相同数量的表皮黑素细胞。因此，皮肤颜色的人种差异主要是由于黑素体性质造成的，而不是由黑素细胞的数量引起的。
美国黑人、非洲黑人和澳大利亚土著人(组2)中非暴露皮肤黑素细胞内黑素体的数量高于白人、北美欧洲后代和亚洲人(组1)。在组1的个体中大部分黑素体见于形成阶段II和III，而组2个体中大部分黑素体已经完全黑素化(阶段IV)。组2中黑素体不仅数量较多，而且也较大。
结构性色素沉着上的其他遗传和种族差异是由褐黑色素与真黑色素相对数量产生的。褐黑色素的颜色较明亮微红，而真黑色素为黑色。因此在产生不同结构性皮肤色调方面，一种或另一种黑色素的浓度比数量更重要。
另一方面，根据二十世纪六十年代的实验证明，注射α和β促黑素多肽激素(或黑素细胞刺激激素-MSH)诱导色素沉着增强，这种增强继发于表皮黑素细胞内的黑素生成增加和来自黑素细胞的黑素体向角质细胞内部转运的增强。当应用促肾上腺皮质激素(ACTH)时，也可观察到此现象，因为它与MSH共同具有相同的多肽序列，或者其一段多肽序列与MSH非常相似。
当前认识到，成人垂体腺产生大量ACTH和β-促脂解激素，它们具有向黑素的活性。这些激素应当不会影响正常人黑色素沉着。事实上，该激素和性激素(雄激素、雌激素和孕酮)两者在保持成人结构性皮肤色素沉着方面均具有非常有限的作用。然而，MSH产生于婴儿垂体，它应当会影响发育中的黑素细胞系统。
但是，内源性激素在紫外线所致结构性皮肤色素沉着加深方面所起作用的最佳实例是黑斑病。其特征是局部、不规则和通常对称的黑素化，主要见于面颊、前额，有时见于上唇和颈部。
黑斑病频发于正常妊娠，一般在妊娠末期后的短时间内逐渐消失。孕酮和雌激素可能是发生这种皮肤色素沉着过度的基础，暴露于日光下为此情况的触发因素和促进因素。在此情况下，例如黑斑病样色素沉着可在应用口服避孕药的女性中出现。试验研究进一步表明，与单独应用这些引诱剂中的任意一种相比，应用激素与紫外线辐射结合可诱发更强的皮肤色素沉着过度。这些研究还表明，细胞培养中的紫外光决定升高的MSH受体活性，这提示促黑素可增强正常皮肤着色。当垂体功能减退者暴露于紫外线时，其皮肤着色较轻，此情况可对上述论点提供支持。
甚至在没有紫外线刺激的情况下，妊娠期间和某些激素功能紊乱期间所产生的激素也能够增强人黑色素沉着。例如，在阿狄森氏病中(肾上腺皮质机能减退)，由于缺乏肾上腺皮质激素，不可控地产生高ACTH，此促进全身性色素沉着过度。在妊娠期间非暴露区色素沉着也增强，诸如大阴唇、乳晕、乳头和腹中线。
在整个皮肤中黑素细胞分布不均匀。事实上，存在个体差异，而且在单个个体不同机体部分也存在差异。例如，所有人种中，头和前臂皮肤中的黑素细胞超过2000/mm2，而在机体其余部分黑素细胞一般约为1000/mm2。因此，皮肤色素沉着的种族差异不是由于黑素细胞的数量所致，而是由黑色素和黑素体合成的差异引起的。
单个个体中这些局部差异的原因是未知的，但这些差异与生俱来，甚至在胎儿时就存在。在经常暴露于日光与功能性黑素细胞之间没有明显的相关性。但是，即使前臂暴露区域黑素细胞的量大于非暴露区域，也可观察到紫外线照射后非暴露区域皮肤中功能性黑素细胞的数量升高，这与暴露于紫外线皮肤中所观察到的升高相似。尚不确切清楚功能性黑素细胞数量升高是否是由于这些细胞开始有丝分裂，或者是由于变成功能性细胞的静止细胞进行募集之故。
显然，黑素细胞分裂对于增加紫外线照射皮肤中功能性黑素细胞生成至关重要。非照射皮肤中也存在黑素细胞分裂这一事实表明需要进行总体更新(尽管缓慢)，这可能与需要消除遗传损害相关，内在和外来化学和物理因素可造成这些损害。
人一生中皮肤颜色可发生明显变化。例如，所有黑人儿童刚出生时皮肤颜色比一周后浅。雀斑首先仅见于日光暴露后，但在青春期中变得持久。手背皮肤到老年则出现斑点表现。
表皮黑素细胞群中这些数量的变化与个体年龄或经常暴露于日光有关，已对这些变化进行了广泛的研究。成人中可观察到黑素细胞数量的年龄依赖性渐进下降，下降幅度为每10年8-10％。这些对于非暴露区域来说是有价值的，因为暴露区域的减少更小，这可能是紫外线对黑素细胞群的刺激引起的。
在对年龄与慢性日光暴露相互关系的研究中，发现所有受试者暴露区域中数字化黑素细胞密度约为非暴露区域的两倍，但在两种情况中均检测到年龄相关的密度下降。按照黑色素产量，暴露区域的黑素细胞更有活性，这可解释可见区域的色素沉着程度更高。慢性日光暴露不能阻止黑素细胞数量的年龄相关下降，但它影响黑色素产量，而且还诱导黑素细胞活化或增殖。有价值的指出角质细胞为黑素细胞产生有丝分裂物质，而且如果角质细胞暴露于紫外线，则其产量升高6倍。
黑色素生成单位在瘢痕过程中丢失，所以瘢痕的皮肤比周围组织颜色浅。着色在一段时间后可恢复，这有赖于个体年龄、日光暴露和其他因素，诸如激素因素。矛盾的是，还存在瘢痕色素沉着过度的相反情况，这清楚地表明色素沉着过程中所涉及的不同因素之间具有复杂的相互关系。
总之，可以说结构性皮肤色素沉着动力学有赖于遗传和人种因素，而且也有赖于角质细胞和黑素细胞之间的正确相互作用，此关系也可被结构性基础激素状态影响。
相反，兼性皮肤色素沉着在很大程度上有赖于其他外部因素，诸如日光。日光通过促进黑素细胞增殖、黑素细胞活化和黑色素生成而起作用，但某些细胞和激素相互作用现象必须按顺序发生，以便其发挥作用。衰老反而趋于降低皮肤黑色素单位的正常动态平衡，引起色素沉着过程和色素沉着维持的不平衡。
色素沉着细胞中观察到的棕色和黑色是由黑色素的存在引起的。然而，这并不是产生这些颜色的唯一色素，黑色素在化学结构上也不是同质的，因此判断是什么黑色素是困难的。然而哺乳动物的黑色素分为两种主要类型的黑色素真黑色素和褐黑色素。第一种是棕色或黑色，它是不溶解的，含氮，而且来源于酪氨酸。相反，褐黑色素是黄色或红色，可溶于碱，含硫，而且也来源于酪氨酸，但是通过由诸如半胱氨酸等的硫氨基酸存在引起的酶促过程分路。两种类型的黑色素均存在于单个个体中，尽管真黑色素是主要类型。
哺乳动物真黑色素基本上由吲哚-5，6-醌单位构成。后者来源于酪氨酸，通过去掉5个氧原子并将酪氨酸羧基演化为二氧化碳分子，转化为多巴醌。吲哚来源于多巴醌环化，黑色素被认为主要代表聚-吲哚-醌。
黑色素中吲哚亚单位的精确比率可能受酶的控制，但它们依赖于精确的聚合条件。真黑色素表现为吲哚-醌单位形成的刚性链、杆状分子。黑素体的物理结构表现为共聚物，其中黑色素和黑素体结构蛋白彼此平行，但它们可在平面基团位点连接。在椭圆形黑素体中，黑色素排列为双螺旋形状，并与蛋白聚合。
相反，从化学上来看，通过大量来自氨基酸半胱氨酸向多巴醌的亲核聚集的硫来分化褐黑色素为多巴酯，多巴醌由酪氨酸酶的作用形成。半胱氨酸主要通过1∶6加至酶催化形成的多巴醌而起作用，获得5-S-半胱氨酰多巴化合物。根据褐黑色素硫来源，也可鉴别相似的中间产物。半胱氨酰多巴与多巴不同，它不是酪氨酸酶底物。
最后，根据合成的真黑色素和褐黑色素中间产物的量，可能大多数黑色素是混合类型。这些化合物发生异分子聚合，形成混合的黑色素，这可解释黑色素所获得的不同视觉色调。
在哺乳动物中，酪氨酸酶是具有两种功能的酶它将酪氨酸转化为多巴，然后将多巴转化为多巴醌，然后多巴醌发生环化，再进行氧化，产生真黑色素结构。相反，如果多巴醌与半胱氨酸结合，将会形成褐黑色素。
酪氨酸酶以三种异构体形式存在，尽管可将其认为是一种单加氧酶，它含有铜并催化一元酚羟基化和二元酚氧化，即多巴(左旋多巴)，形成醌。通常将这两种酶催化活性看作是甲酚酶或一元酚酶活性和儿茶酚酶或二元酚酶活性。
有几种因子可改变酪氨酸酶的产生，多巴色素转化因子是其中的一种，它可促进多巴色素转化为5，6-二羟吲哚；吲哚阻滞因子，它可抑制5，6-二羟醌醇转化为黑色素；以及吲哚转化因子，它可促进5，6-二羟醌醇转化为黑色素。特别是吲哚阻滞因子和多巴色素转化因子，它们与可溶性酪氨酸酶异构形式(I型和II型，它们在黑素体中的浓度较低)密切相关，而多巴色素转化因子与固定酪氨酸酶异构体(IV型)相关。这些因素是辅助酶系统，其中多巴色素-氧化还原酶(多巴色素-异构酶或多巴色素互变异构酶)系统较为突出。其功能是形成多巴色素互变异构体，以形成羧基衍生物。如果没有这些因子，黑色素不能成熟以进行聚合。
除了多巴色素互变异构酶，还有其他酶(过氧化物酶、过氧化氢酶、谷氨酰胺代谢酶)和金属离子参与后-酪氨酸酶黑素生成调节。
总之，黑素生成依赖于酪氨酸酶及其底物酪氨酸之间良好的功能性相互作用，以便获得多巴，随后获得多巴醌。后者通过后-酪氨酸酶因子作用，以使其再转化为终止被聚合的吲哚单位，获得含黑素体结构蛋白的共聚物，从而产生真黑色素。黑素体基质中半胱氨酸的存在可阻止这些后-酪氨酸酶因子的作用，产生不能被聚合的其他中间可溶性化合物。但是，根据它们所含的硫浓度，经常发现部分聚合黑色素的混合物。这可解释不同黑色素中可见不同的色调，因为它们变化的结构将会根据黑色素类型而不同地吸收某些波长的可见光。
这一定不能与皮肤颜色混淆，因为这仅适用于色素颜色。其他因素也参与形成皮肤颜色，诸如不同类型黑色素的浓度、后者在黑色素单位中的分散、所产生的黑素体类型和充当漫射屏的表皮所致的衍射。皮肤中存在的其他色素也参与形成皮肤颜色，基本上是血红蛋白色素，在浅色皮肤中可清楚地看到它们，但深色皮肤表皮中的黑色素色素可掩盖它们。
在某些个体中经常发生黑素细胞中黑色素密度显著升高的皮肤区域的皮肤颜色深于周围皮肤。这些区域称为色素沉着过度区，这会引起这些个体的不适。
色素沉着过度最常见的原因是皮肤区域对紫外线刺激的过度反应、对加重辐射作用剂(例如含香柠檬油的化妆品或一般称为光线损害剂)释放的紫外线的过敏、激素紊乱(例如改变的甲状腺激素和性激素、内源性和外源性类固醇以及孕激素)以及继发性色素沉着过度或炎症损害引起或导致的色素沉着过度。特别是，炎症后色素沉着过度表现为不规则的斑点，此斑点比周围皮肤着色深，该斑点发生于炎症后，炎症由例如痤疮、毛囊炎、湿疹、脱发、抓伤等情况引起皮肤损害所致。该炎症后色素沉着过度缓慢消散，但可持续数月甚或数年，而且它是就医的常见原因，而且需要专业护理多次。
到目前为止，已经公开了几种皮肤局部应用组合物，它们含有一种或多种成分，这些成分可降低皮肤黑素细胞中的黑色素密度。一般将这些成分看作是脱色素剂或者漂白剂。通常通过皮肤较深层吸收这些药剂，它们可抑制黑素细胞中黑色素的形成，而且特别作用于黑素生成的某些阶段。最常见的脱色素剂是基于氢醌或其衍生物，诸如苄-氧-酚和氢醌单苯醚(US专利3,060,097)。最后者化合物的缺点是当通过皮肤吸收时，它不适于代谢，因为它与不可逆的脱色素事件刺激性白斑(皮肤脱色素区域逐渐扩大，经常具有色素沉着过度边缘)相关联。苄-氧-酚也具有缺点，它可通过淋巴系统运输至皮肤其他区域，这些区域可远离应用部位，在这些区域也可产生变浅作用。
化合物甲氧酚也被推荐为一种皮肤脱色素剂，它是一种氢醌醚，已用于药用脱色素组合物，但是其缺点是，因为它在水介质中不易溶解，所以将其加入化妆品或皮肤病制剂较为困难。
用于皮肤脱色素的其他化合物是4-异丙基儿茶酚，它是一种取代氢醌衍生物(南非专利申请716,890)和氢醌脂肪酸单和二酯(欧洲专利申请号82301102.8)。
已经提出在化妆品中直接应用氢醌以治疗色素沉着过度，因为它是有效、可溶于水而且可被快速代谢排泄。然而，氢醌的缺点是它在碱性介质中不稳定，可被氧化为奎宁形式，此形式可使任何含有它的药用组合物成为棕色。在这种组合物中需要加入抗氧化剂，诸如抗坏血酸，以防止这种氧化过程。事实上，已经提出，例如将氢醌分子加入无水介质使其稳定。在此意义上，美国专利4,466,955公开了一种化妆品制剂，其中将氢醌溶解在脂肪酯中，并在所得溶液中加入一种不含水的化妆品膏基，在此膏基中氢醌更加稳定而且较难氧化。这是因为与溶于水相比，氧较难溶于腊，因此氧化过程较少发生。另外，按照此公开，这种制剂支持氢醌的皮肤吸收。
氢醌是化合物1，4对苯二酚或p-二羟基苯的属名，其分子量是110.0。其作用机理是趋于抑制酶促酪氨酸氧化为3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)并抑制其他黑素细胞代谢过程。
氢醌的主要缺点是它也是皮肤刺激物，可能引起反常的色素沉着过度，称为褐黄病。最近也公开了氢醌的致癌性，因为在一组每天接触此物质的工人中报道了至少5例皮肤黑素瘤。
另一方面，艾地苯醌是一种具有药效特性的苯醌，例如按照美国专利4,271,083所公开，已在具有细胞保护作用的药物中采用这些特性。艾地苯醌是化合物6-(10-羟癸基)-2，3-二甲氧-5-甲基-1，4-苯醌的属名(JP-B-62 3134(1987)，美国专利号4,139,545)。体外检测所得数据提示，通过促进线粒体呼吸循环中电子的会聚、抑制脂质过氧化作用、减少非呼吸氧的消耗和刺激ATP形成，可获得艾地苯醌的细胞保护作用。
艾地苯醌被认为是一种合成辅酶Q10，并且通过口服给药可用于改善认知障碍、阿耳茨海默氏病、痴呆和脑血管疾病，可用作心脏细胞保护剂。由于具有抗氧化特性，可口服给药，既可单独也可与其他活性成分联合应用，这些其他成分优选具有抗氧化特性，例如维生素E。
专利文件DE 3,049,039、EP 0,788,793、US 4,436,753、US5,059,627和US 5,916,925公开了包括艾地苯醌或其衍生物的口服、胃肠外或经皮给药制剂，它们可用于治疗痴呆、血循环障碍，或者可用于刺激神经生长因子。特别是日本专利JP 1,279,818公开了艾地苯醌及其衍生物在不同制剂中的应用，这些制剂可用于使头发具有外生颜色(艾地苯醌是一种深橙色的粉末)。迄今为止没有报道艾地苯醌具有明显毒性作用(Arzneim.Forsch/drug res.35(II)，11，pp.1704，1985)。
现在惊喜地发现，含有艾地苯醌的皮肤局部应用制剂可使色素沉着区域中色素浓度显著降低，同时不会引起明显的副作用。
本发明详细描述本发明涉及艾地苯醌在一种组合物中的应用，此组合物意欲涂敷于皮肤上以抑制黑素生成。
本发明还涉及一种在皮肤上局部应用的组合物，它含有美容、药学和/或皮肤病学上有效量的艾地苯醌、其衍生物或者它们的混合物。
本发明特别涉及一种化妆品制剂，它可对皮肤色素沉着过度具有有益的作用。本发明优选涉及含有艾地苯醌和/或其衍生物的美容或皮肤病学上的制剂，它可减轻黑色素产生过多所致的皮肤着色局部增强。
本发明还涉及艾地苯醌在一种化妆品组合物中的应用，可将此组合物涂敷在皮肤上，在应用部位产生皮肤脱色素作用。在此文件中，必须将名词“脱色素”理解为在皮肤色素沉着区域获得脱色作用，直到其着色与周围皮肤相似。特别是，此色素沉着区域可由任何皮肤疾病引起，而且尤其是牛皮癣、酒渣鼻、紫外线造成的皮肤损害、特应性皮炎、药物后色素沉着过度、炎症后色素沉着过度、妊娠黄褐斑和皮脂溢性皮炎等皮肤疾病引起。另外，在此文件中，必须将名词“减轻皮肤着色”理解为减轻皮肤的色调，直到获得肉眼可见的比色度下降。
皮肤局部应用的本发明组合物的形式可例如为乳膏、凝胶、封闭贴剂、乳剂或气雾剂。本发明组合物优选为乳膏形式(O/W)。按照本发明，可将艾地苯醌包含在控释局部敷剂中，特别是其中艾地苯醌为脂质体或络合物形成的。这种类型组合物的制剂在现有技术水平范围内。
准备涂敷于皮肤的本发明组合物优选包含艾地苯醌或其衍生物，其含量为0.1％-10％w/w。更优选的是，艾地苯醌或其衍生物的含量为0.3％-5％w/w。
除了别的以外，艾地苯醌衍生化合物的实例可为专利文件US4,139,545、US 4,436,753、DE 3,049,039、EP 0,788,793、US4,436,753、US 5,059,627和US 5,916,925中公开的那些。
采用已知的美容或药学上可接受的赋形剂，可由本领域熟练技术人员配制本发明组合物。此组合物优选包含油性和水溶性成分。油性成分的实例为自乳化腊、凡士林、肉豆蔻酸异丙酯和十六烷醇。水溶性成分的实例为甘油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。本发明组合物也可含有对皮肤有益的药剂，诸如增湿剂、水合剂和维生素，它们都是已知的，而且本领域熟练技术人员可对它们进行选择。如果需要，本发明组合物还可含有美容和/或药学上可接受的抗氧化剂和滤光剂和/或防晒剂。
本发明还涉及治疗不良皮肤色素沉着的方法，它包括将含有脱色素有效剂量艾地苯醌的组合物涂敷在这些部位，使其作用一夜，并在早晨洗去。
实施例实施例1i)含有艾地苯醌(IDB)的含水乳膏制剂(O/W)表1
ii)制备含艾地苯醌乳膏的方法熔化该制剂的油性成分(A)(自乳化腊、凡士林、肉豆蔻酸异丙酯和十六烷醇)，并将其加热至70/75℃。如上所述，将该制剂的水溶性成分(B)(甘油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)溶解在所需量水中，并将它们加热至70/75℃。
然后将油相(A)加入水相(B)中，同时进行有力而持续的搅拌，并控制这些成分的温度。在水浴中将其冷却，缓慢搅拌，直到温度达到45℃。一旦达到所需温度，则如上所述将所需量的艾地苯醌溶解在0.5ml的乙醇中，并加入先前的制剂，同时缓慢搅拌，直到获得均匀的制剂。使其冷却至所需的稠度，并进行适当的包装。
在艾地苯醌浓度超过3％的情况下，可能需要增加油相中成分的比例，以获得活性组分的增溶作用。如果所需艾地苯醌浓度远远超过4％，则可将含水基础乳膏替换为油性乳膏(W/O)。
实施例2应用含艾地苯醌的组合物对试验动物皮肤的作用制备在中性相中含5％和2.5％w/w艾地苯醌(IDB)的乳膏。将该乳膏和含相同制剂而无艾地苯醌的乳膏涂敷在3月龄成年裸鼠上。按照下面列表，将含艾地苯醌的乳膏涂敷在动物身体的右半侧，对照乳膏涂敷在左半侧。涂敷乳膏后(p.a.)1、2、3或4小时处死这些动物。
A批5％IDB处理的动物(1小时p.a.)B批2.5％IDB处理的动物(1小时p.a.)C批5％IDB处理的动物(2小时p.a.)
D批2.5％IDB处理的动物(2小时p.a.)E批5％IDB处理的动物(3小时p.a.)F批2.5％IDB处理的动物(3小时p.a.)G批5％IDB处理的动物(4小时p.a.)H批2.5％IDB处理的动物(4小时p.a.)取下处理和对照皮肤区域，分为3部分一部分用于通过气相色谱法测定艾地苯醌的量，一部分用于测定保留水分量，第三部分用于石蜡包埋。
通过气相色谱法测定艾地苯醌的量将处理和对照皮肤部分置于低温恒温器平台上，表皮侧朝下，并按照同样方法获得平行于表面的厚度300微米的片段，以便获得深层切片、表面切片和中间切片。将每个切片都进行鉴别、均化，并再悬浮在丙酮中。应用Hewlett Packard5890气相色谱仪，选用聚甲基硅酮为固定相的毛细管柱(HP-IMS，25m×0.2mm，0.33μ厚膜)，通过气相色谱法分析每个提取液。温度程序组成为起始温度100℃3分钟，然后用20℃的温度增量持续加热，直到达到300℃。最后温度保持5分钟。应用0.7ml/分钟的氦气流。给此色谱仪连接四极质量检测器(HP型号5972)，SCAN模式下采用在70eV下的电子碰撞电离，质量扫描模式为50-600m/z。在1/25分裂模式下注射2μl样品，注射器温度为250℃，界面温度280℃。
水分测定在分析天平上测定每个处理和对照皮肤部分，然后将它们置于120℃的烘箱中，持续30分钟。然后将这些样品在室温下冷却30分钟，然后再次称重。按照下面公式计算水分百分率 由此通过每个处理部分的百分率除以相应对照部分的百分率而计算处理皮肤水含量与对照皮肤水含量相比的增长。
形态学及形态测定研究测定至少10个不同点的表皮、表皮角质层、真皮乳头层和真皮网织层的厚度，结果表示为10个测定值的均值。还测定至少10个点的毛细血管直径，通过均值表示。应用Quantimet500+(Leica)影像处理设备进行测定。制备结缔组织的特异染色和Giemsa、亚甲蓝、甲苯胺蓝(观察异染性和间隙水分布)和Schorr染色(观察角蛋白状态)。
免疫组化研究应用HSP27单克隆抗体(Dako Labs)，并用APAAP试剂盒(Dako Labs)显色，通过酶免疫标记，测定包埋在石蜡中材料的交互切片中热激蛋白(HSP)过表达。
形态学5％和2.5％IDB乳膏处理的动物皮肤未显示形态学改变，其显微镜影像与对照皮肤的相似。特异染色技术未显示不同试验样品中的差异，甚至不同处理时间之间也未见差异。应用Schorr染色以观察角蛋白性质的不同，其色斑中也没有改变。
表皮形态学测定结果见表II。可见处理皮肤和对照皮肤之间的表皮厚度或表皮角质层厚度没有显著差异。不论是两种试验IDB浓度之间，还是不同乳膏涂敷时间之间均未发现显著差异。因此，可以得出局部涂敷艾地苯醌基本上不会改变表皮厚度，因此它显示对局部无害。
表II含5％和2.5％艾地苯醌乳膏处理小鼠皮肤的总表皮和表皮角质层厚度及其与不含艾地苯醌的中性乳膏处理的对照皮肤的比较。数值单位为微米，表示为10个测定的均值(数值四舍五入至两位小数点)。在对照中，测定值表示为全部测定的均值，即每点两个动物，因为应用两个对照，一个是含5％IDB乳膏的对照，另一个是含2.5％IDB乳膏的对照。
真皮形态学测定不同试验动物之间的真皮乳头层和真皮网织层的厚度没有显著变化。因此，可以得出局部涂敷艾地苯醌基本上不改变表皮厚度，因此它显示对局部无害。
血管直径结果见表III。可见IDB处理皮肤与对照皮肤之间的微循环血管直径没有显著差异，试验IDB浓度或不同乳膏涂敷时间之间也没有显著差异。因此，可以得出局部应用艾地苯醌基本上不改变微循环血管直径，因此显示没有局部血液动力学改变。
表III含5％IDB乳膏、含2.5％IDB乳膏和基础乳膏(无IDB)处理皮肤的真皮毛细血管直径。直径单位为微米，表示为10个测定值的均值(数值四舍五入至2位小数点)。在对照中，测定值表示为全部测定的均值，即每点两个动物，因为应用两个对照，一个是含5％IDB乳膏的对照，另一个是含2.5％IDB乳膏的对照。
HSP过表达对照乳膏(无IDB)处理表皮和含IDB乳膏处理表皮之间的HSP表达没有发现差异。含5％和2.5％IDB乳膏处理的皮肤不同应用后时间之间也没有差异。因此，可以得出所研究的IDB浓度的处理不会增强小鼠皮肤中表皮HSP表达，所以可以推断不存在任何表皮损伤，此损伤可证明存在针对侵入的细胞防御系统的过表达。
水分测定蒸发前后处理和对照皮肤的重量显示，IDB处理组和对照组的水分百分率相似。不同应用后时间之间也没有显著差异。结果见表IV。
表IV处理皮肤与对照的水分百分率和水保留能力。数值单位为克，表示为涂敷乳膏后1、2、3和4小时时测定的均值。
因此，可以得出应用研究浓度的IDB处理不会改变组织中的水含量(IDB处理皮肤和无IDB乳膏处理皮肤之间水保留的差异没有统计学意义)。
皮肤中IDB的渗透涂敷后2小时，5％IDB处理样品和2.5％IDB处理样品两者均在最表面切片中(此切片包括整个表皮和真皮的上部分)获得保留时间17.6分钟的IDB峰值。相反，对应于深层和中间切片(真皮网织层和皮下组织)的样品未显示峰值。另一方面，应用后1小时，无一样品显示此峰值(IDB处理样品没有，对照样品也没有)。因此，可以得出结论IDB透过皮肤，而且在其最表面切片中IDB保留可达应用后的2小时。
实施例3应用含不同浓度艾地苯醌的组合物对人皮肤的作用将患者皮肤样品标识为患者1、2和3，在这些试验中应用这些样品，试验步骤如下患者1和2两名患者(均为女性，年龄分别为74和71)均应用乳房皮肤，由于存在乳腺癌和鲜红发育不良(florid dysplasia)，她们将接受根治性乳房切除术和单纯乳房切除术。
在被送入手术室前45分钟，将其乳房表面分为3个相似的区域，并通过轻微地环状按摩，将含5％IDB的乳膏约120mg加至第一个区域中，直到乳膏完全吸收。其余两个部分进行相似处理，所用乳膏包括约120mg含2.5％IDB的乳膏和对照乳膏。一旦进入手术室，在准备手术野前，用95°乙醇冲洗乳房表面，以除去可能过量的乳膏。
手术(平均外科操作时间45分钟)后即刻切除每个区域约4cm2的皮肤切片，对其进行正确标识。一旦切除此部分，将小心除去皮下脂肪组织，以仅仅获得表皮和真皮。
患者3应用患者(女性，年龄为54岁)的乳房皮肤，由于存在乳腺癌，她将接受根治性乳房切除术。
在被送入手术室前45分钟，将其乳房表面分为3个相似的区域，并通过轻微地环状按摩，将含5％IDB的乳膏约120mg加至第一个区域中，直到乳膏完全吸收。其余两个部分进行相似处理，所用乳膏包括约120mg含0.5％IDB的乳膏和对照乳膏。一旦进入手术室，在准备手术野前，用95°乙醇冲洗乳房表面，以除去可能过量的乳膏。
手术(平均外科操作时间45分钟)后即刻切除每个区域约4cm2的皮肤切片，对其进行正确标识。一旦切除此部分，将小心除去皮下脂肪组织，以仅仅获得表皮和真皮。
在患者1、2和3皮肤样品上研究应用含0.5％、2.5％和5％艾地苯醌乳膏对不同皮肤层、皮肤丛血管形态学和形态学测定的作用，以及对HSP表达的作用，以此来评价表皮对该乳膏有害作用的反应。
将含IDB乳膏和对照乳膏处理的皮肤片段固定在甲醛溶液中，将它们包埋在石蜡中，并通过苏木精和曙红、Schorr、Giemsa和甲苯胺蓝用组织学染色技术进行染色。
形态学测定测定组织学切片的表皮厚度、表皮角质层、真皮乳头层、真皮网织层和真皮毛细血管丛直径。
免疫组化给石蜡中包埋的交互切片进行脱腊，并与市售HSP27的抗血清(Dako Labs)一起进行孵育。用APAAP试剂盒(Dako)显色此反应。
显微外观通过肉眼观察，用含IDB乳膏处理的皮肤区域、无IDB的对照乳膏处理的皮肤区域和未处理皮肤区域之间没有显著差异。因此可以得出，在涂敷期间，不同试验浓度的含IDB乳膏的处理未引起刺激。
显微镜对照乳膏处理的皮肤或含不同IDB浓度的乳膏处理的皮肤中未检测到结构性变化，甚至应用特异染色技术也未发现。特别是，未发现真皮中间质液蓄积、血管改变和炎症成分蓄积。所有研究的表皮层均保持其完整和结构。
表皮厚度的形态学分析下表简要总结所得结果。
表V含不同浓度IDB的乳膏和对照乳膏在不同处理时间的志愿者乳房皮肤总表皮和表皮角质层厚度值。所得值单位为微米，表示为10个测定值的均值。
因此可以得出，在皮肤上应用含不同浓度IDB的乳膏未显著改变表皮厚度。
真皮的形态学测定不同评价样品之间，真皮网织层和真皮乳头层厚度测定值未见显著差异。因此可以得出，应用含不同浓度IDB的乳膏未引起真皮即刻改变。
真皮丛中血管的形态学测定不同评价样品之间，血管直径测定值未见显著差异。所得结果总结在下表中表VI含不同IDB浓度的乳膏及对照乳膏处理的皮肤真皮丛的血管直径。所得值单位为微米，表示为10个测定值的均值。
由所得结果可以得出，应用含不同浓度IDB的乳膏未改变处理皮肤的血管状况。
HSP27分布和表达所有评价患者中，含不同浓度IDB的乳膏和对照乳膏(无IDB)处理的不同样品中HSP表达和分布未见差异。由所得结果可以得出，应用含不同浓度IDB的乳膏未改变HSP27的表达和分布，这种蛋白是表皮对可能损伤的反应参数。
实施例4应用含艾地苯醌的组合物对人皮肤的作用水分测定应用前面实施例中标识为患者3的患者乳房皮肤。
将诸如实施例1中所用的基础乳膏分为3个等分，加入足量的艾地苯醌(纯度99.3％)，使最终IDB浓度为5％。将足量的艾地苯醌(纯度99.3％)加入第二等分中，使最终IDB浓度为0.5％，第三等分用作对照(不含任何IDB)。
水分测定在分析天平上测定每个处理和对照皮肤部分，然后将它们置于120℃的烘箱中，持续30分钟。然后将这些样品在室温下冷却30分钟，然后再次称重。按照下面公式计算水分百分率
通过每个处理部分的百分率除以相应对照部分的百分率而计算处理皮肤水含量与对照皮肤水含量相比的增长。所得结果简要总结在下表中表VII
因此，局部涂敷在皮肤上的IDB在研究浓度下未引起皮肤所含水量的增加。
实施例5艾地苯醌所致的黑素生成抑制按照Dooley等推荐的方法(Skin Pharmacol.1994；7188-200)进行体外测定，以评价艾地苯醌对黑素生成的抑制能力，其方法描述如下材料和方法细胞应用源自人黑素瘤的细胞系进行此研究，该细胞系由ABAC(Asociación Banco Argentino de Células-Cell Bank of Argentina)提供，它具有黑色素合成能力(SK-MEL-28，ATCC起端)。细胞在塑料培养瓶或24孔塑料盘中生长，培养基为添加10％胎牛血清(FBS)的改良Eagle培养基(DMEM)，并将其保持在37℃的5％ CO2空气中。
试验化合物艾地苯醌由阿根廷Droguería Saporiti提供，批号为02107，按照干药计算的纯度为99.80％。氢醌(1，4-苯二醇)由阿根廷Droguería Saporiti提供，批号为010715，按照干药计算的纯度为99.85％。
体外化合物研究将胰蛋白酶分离的SK-MEL细胞种在24孔塑料盘上(密度为每孔1×105细胞)，并在用评价化合物处理之前，将其在添加10％胎牛血清(FBS)的改良Eagle培养基(DMEM)中孵育24小时。24小时结束后，用990μl新鲜培养基置换此培养基。将10μl含不同浓度评价化合物的无菌载体(50％丙二醇、30％乙醇和20％蒸馏水)加入这种新鲜培养基中。SK-MEL细胞可较好耐受1％的这种载体(终浓度0.5％丙二醇和0.3％乙醇)。
制备无菌载体中每种化合物的十进制稀释液，以使研究化合物的终浓度为1.000-0.01μg/ml。每天重复此过程，连续3天。
第四天，不对细胞进行处理，并在第五天按照下述方法分析剩余粘着细胞。因而这些细胞在培养持续的5天中连续暴露于研究化合物。所有浓度的化合物均按一式三份进行研究，将此化合物处理的3个孔的均值与仅接受载体处理的进行比较。
黑色素含量测定在搅拌培养基并用PBS冲洗细胞后，测定SK-MEL细胞黑色素含量。然后通过在每个孔中加入1ml 1N NaOH，并重复手工吸液而溶解这些细胞。应用分光光度计在400和475nm分析未处理的细胞提取液，以分别测定黑色素和多巴醌的含量。结果表达为载体处理的细胞培养物百分率。
用紫色晶体进行细胞数目定量通过间接方法，应用含紫色晶体水溶液的染剂测定在体外处理中存活的粘着于塑料盘的细胞数目。处理期过后，通过颠倒塑料盘从孔中倒出培养基，并在每个孔中置换为0.5ml的0.1％紫色晶体(含于10％乙醇中)。室温下在旋转台上将这些盘染色5分钟，同时进行轻度搅拌。然后通过颠倒塑料盘倒出过量的着色剂，并将整个盘在适宜容器的蒸馏水中浸没4遍。漂净后，将这些盘颠倒，使其在吸水纸上滴水，直到完全除去过量的水。然后通过在每个孔中加入1ml乙醇(95％)，提取粘着细胞中存留的紫色晶体。最后在室温下将这些盘置于旋转搅拌器上，进行30分钟。应用含95％乙醇的塑料透明容器作为空白，借助分光光度计(波长＝590nm)测定这些醇样品的光密度。当细胞密度很高时(例如当光密度大于2.0时)，制备每个样品在95％乙醇中的稀释液，由此对它们进行分光光度分析。
为了测定试验药剂特殊浓度处理下存留细胞的分数，将处理孔的OD590(3个测定值的均值)除以应用对照载体孔的OD590(3个测定值的均值)。用该分数乘以100获得细胞存活百分率(表示为对照载体的百分率)。
测定黑色素含量表VIII显示艾地苯醌和氢醌稀释液OD400和OD4753个同时测定值的均值。
表VIII
以及表达为百分率
由所得结果可以得出，在所用模型中，艾地苯醌化合物以剂量依赖型方式抑制黑色素的合成。尽管高浓度时可认为艾地苯醌的作用与氢醌的作用相似，但进行一定的稀释后，后者变得无效。相反，甚至更大的稀释后，艾地苯醌化合物仍继续抑制作用。
多巴醌生成也受到影响，其影响方式类似于黑色素合成，表明这种抑制是复杂的，抑制可能在黑色素代谢途径的几个位点发生。
用紫色晶体进行细胞数目定量下表总结不同艾地苯醌和氢醌稀释液处理后活力细胞的百分率。
表IX
由所得结果可以得出，高浓度艾地苯醌对细胞可能有毒性。氢醌也类似，尽管氢醌的毒性更高。假定此毒性可干扰读取黑色素和多巴醌的光密度，应用其他稀释液、不同的孵育时间以及仅应用艾地苯醌进行了相似的试验(因为文献中已公开了氢醌对此系统的作用)。这些描述在下面实施例中。
实施例6艾地苯醌处理1天后的黑素生成抑制设计与前面实施例所述相似的试验，以证实艾地苯醌是否可抑制培养中细胞的黑素生成，但在此情况下，只将这些细胞处理1天，而在第三天评价结果。应用倒置显微镜评价对细胞培养物的细胞病变作用存在或者不存在，从-2稀释液开始至-6稀释液。
表X显示不同检测稀释液的400和475光密度(分别为黑色素和多巴醌的)，以及它们各自的百分率。
表X
由这些结果可以得出，艾地苯醌处理后24小时就以剂量依赖方式开始抑制黑色素合成及其副产品的合成。在此试验中未考虑-1稀释液，这是因为这种培养物具有细胞病变作用。其余稀释液无论如何没有显示任何细胞病变作用，由此可以认为艾地苯醌所用剂量没有细胞毒性。可以清楚-5和-6稀释液的黑色素和多巴醌的量大于对照。这可能简单地由于方法中的错误，而且因此不明显。但是，不应当受到特殊理论的限制，可能在此孵育时间下和这些稀释液中，艾地苯醌化合物可进行黑素生成刺激作用，它可能是暂时的。
实施例7设计与前面实施例所述相似的试验，以证实艾地苯醌是否可抑制培养中细胞的黑素生成，但在此情况下，将这些细胞处理2天，而在第四天评价结果。应用倒置显微镜评价对细胞培养物的细胞病变作用存在或者不存在，仅评价-4、-5和-6稀释液。
表XI显示不同检测稀释液的400和475光密度(分别为黑色素和多巴醌的)，以及它们各自的百分率。
表XI
这些结果将表明，在-4和-5稀释液中存在黑色素合成刺激，而-6稀释液显示为抑制。这可能表明，如果存在刺激，处理应当在第二天继续进行，尽管值很类似对照的值，-6稀释液显示的抑制与期望相似。未观察到细胞病变作用。
实施例8
艾地苯醌处理3天后的黑素生成抑制设计与前面实施例所述相似的试验，以证实艾地苯醌是否可抑制培养中细胞的黑素生成，但在此情况下，将这些细胞处理5天，而在第五天评价结果。应用倒置显微镜评价存在或者不存在对细胞培养物的细胞病变作用，仅对-4、-5和-6稀释液进行评价。
表XII显示不同检测稀释液的400和475光密度(分别为黑色素和多巴醌的)，以及它们各自的百分率。
表XII
这些结果表明，在第三天处理时存在剂量依赖性黑色素合成抑制。-6稀释液中多巴醌的量与对照相似。未观察到细胞病变作用。
实施例9高度稀释液中艾地苯醌介导的黑素生成抑制设计与实施例6所述相似的试验，以证实低浓度艾地苯醌对培养中细胞黑素生成的作用，但使用-2、-3、-4、-5、-6、-7和-8稀释液。
表XIII显示不同检测稀释液的400和475光密度(分别为黑色素和多巴醌的)，以及它们各自的百分率。
表XIII
此结果显示，甚至当它非常稀时，艾地苯醌化合物仍保留其抑制黑素生成的能力。但是，没有显示明确的剂量-反应比。
实施例10含有2.5％艾地苯醌的乳膏对于妊娠黄褐斑患者的脱色素能力患者是一名女性，43岁，秘鲁国籍，印加人后裔，具有III型小麦色皮肤，她陈述她9年前怀孕生育，而且在第二次妊娠三个月期间，她出现妊娠斑(妊娠黄褐斑)，在面部两侧颧部，呈蝴蝶翅膀状，其中一个斑现在仍存在，而且由于日晒在夏天色素沉着加重，而且此斑与周围皮肤存在显著对比边界。
治疗指导患者每天在上床之前，在斑的位置涂敷足量的按照实施例1的含有2.5％艾地苯醌的乳膏，使该乳膏在皮肤上保留过夜并在第二天早晨用充裕的水和中性皂洗净脸。连续进行涂敷20天不间断。在开始治疗后的7、14和21天对患者进行临床检查，将色素沉着区域与周围的皮肤进行比较。
结果观察到色素沉着过度皮肤的色素沉着逐渐普遍减轻，接近21天时变得显著，尽管未达到与无色素沉着过度的皮肤相似的颜色。色素沉着斑点边界变淡，消失，不再明显清楚，表明从黄褐斑的中心区域向周围皮肤褪色。
结论含2.5％艾地苯醌的乳膏可有效地减弱妊娠黄褐斑的皮肤色素沉着，此疾病的特征是局限性色素沉着过度，而且具有可能的激素病原学。尽管中止处理，结果表明持续处理可使色素沉着过度完全消失。
实施例11含有2.5％艾地苯醌的乳膏对于炎症后色素沉着过度患者的脱色素能力患者是一名女性，40岁，阿根廷国籍，白皮肤II型，具有显著光化性损害，并且她陈述她分别在9，11和14年前孕3产3，并且在用蜡对口外周区域施行脱毛术后，在受影响区域具有残留的色素沉着过度，并持续了3年多，并仍然持续至今，由于光照在夏季月份该色素沉着加重。该色素沉着过度具有非常明确的边缘，与周围的皮肤形成对照。
治疗指导患者每天在上床之前，在斑的位置涂敷足量的按照实施例1的含有2.5％艾地苯醌的乳膏，使该乳膏在皮肤上保留过夜并在第二天早晨用充裕的水和中性皂洗净脸。连续进行涂敷20天不间断。在开始治疗后的7，14和21天对患者进行临床检查，将色素沉着区域与周围的皮肤进行比较。指示患者在整个治疗期间禁止直接暴露在阳光照射下。
结果在开始治疗后的7天，观察到色素沉着过度皮肤的色素沉着有普遍的减轻，接近14天变得有意义，接近21天时，色素沉着过度区域的边缘改变，并且斑的大小以一种不规则的方式缩小。色素沉着斑的边缘变淡，并在一些区域消失。
结论含2.5％艾地苯醌的乳膏可有效地减弱炎症后皮肤色素沉着，此疾病的特征是皮肤炎症过程引起的局限性色素沉着过度。尽管中止处理，但结果表明持续处理可使色素沉着过度完全消失。
实施例12含有5％艾地苯醌的乳膏对于药物后色素沉着过度患者的脱色素能力患者是一名女性，46岁，阿根廷国籍，小麦色皮肤III型，她陈述她在8年前孕1产1，并且在双肘有牛皮癣斑。该患者陈述用补骨脂素治疗后，她在双肘出现色素沉着过度斑，在该处牛皮癣斑仍然发展，它忽重忽轻并恶化，始终留下比患牛皮癣区域更广泛的色素沉着过度的基底。在大约5年前，该色素沉着过度变成了永久性的。
治疗指导患者每天在上床之前，在斑的位置涂敷足量的按照实施例1的含有5％艾地苯醌的乳膏，使该乳膏在皮肤上保留过夜并在第二天早晨用充裕的水和中性皂洗净她的脸。连续进行涂敷15天不间断。在开始治疗后的7和15天对患者进行临床检查，将色素沉着区域与周围的皮肤进行比较。指示患者在整个治疗期间禁止直接暴露在阳光照射下。在治疗完成后的6个月，将该色素沉着过度区域与周围的皮肤再次进行比较。
结果A在开始治疗后的7天，观察到色素沉着过度皮肤的色素沉着有普遍的减轻，接近15天效果变得更显著，色素沉着过度的大小和颜色减轻，并且该区域获得了与周围皮肤一样的颜色。
结论含有5％艾地苯醌的乳膏对于减弱药物后皮肤色素沉着是有效的。
实施例13含有0.3％艾地苯醌的制剂的储藏期稳定性研究对具有相同组分的在不同日期制备的两种制剂的稳定性进行研究。将二者均制备成含有0.3％艾地苯醌的水性乳膏形式(O/W)。
将时间最长的待分析制剂包装于白色聚苯乙烯罐中，并在架子上在室温下避光储存600天。
表XIV显示了一种含有0.3％艾地苯醌的水性乳膏(O/W)的定量配方。数量是针对于100克而言的。
用于定量活性成分的方法是UV-Vis分光光度测定法。
较近时间制备的乳膏(制备后一个月)和较早时间制备的乳膏(制备后20个月)的活性成分，在该测定方法中所观察到的差别是可以忽略不计的。可以推断出该乳膏可以被认为可以稳定至少600天(20个月)。
实施例14含有3％艾地苯醌的制剂的储藏期稳定性研究对具有相同组分的在不同日期制备的两种制剂的稳定性进行研究。将二者均制备成含有3％艾地苯醌的水性乳膏形式(O/W)。
将时间最长的待分析制剂包装于白色聚苯乙烯罐中，并在架子上在室温下避光储存600天。
表XIV显示了一种含有3％艾地苯醌的水性乳膏(O/W)的定量配方。数量是针对于100克而言的。
用于定量活性成分的方法是UV-Vis分光光度测定法。
较近时间制备的乳膏(制备后一个月)和较早时间制备的乳膏(制备后20个月)的活性成分，在该测定方法中所观察到的差别是可以忽略不计的。可以推断出该乳膏可以被认为可以稳定至少600天(20个月)。
权利要求
1.艾地苯醌在一种涂敷于皮肤上的组合物中的应用，其特征在于它用于抑制黑素生成。
2.按照权利要求1的艾地苯醌在一种涂敷于皮肤上的组合物中的应用，其特征在于它用于减轻皮肤着色或者使应用部位皮肤光亮。
3.按照权利要求1的艾地苯醌在一种涂敷于皮肤上的组合物中的应用，其特征在于它用于在应用部位产生皮肤脱色素作用。
4.按照权利要求1的艾地苯醌在一种涂敷于皮肤上的美容、药学和/或皮肤病学组合物中的应用，其特征在于它用于在皮肤疾病所致色素沉着部位产生皮肤脱色素作用。
5.按照权利要求4的艾地苯醌的应用，其特征在于这些皮肤疾病选自牛皮癣、酒渣鼻、光损伤的皮肤、特应性皮炎、药物后色素沉着过度、炎症后色素沉着过度、妊娠黄褐斑和皮脂溢性皮炎。
6.一种涂敷于皮肤上的美容、药学和/或皮肤病学组合物，其特征在于它含有艾地苯醌或其衍生物，而且其特征还在于艾地苯醌或其衍生物是有效量的，以产生皮肤脱色素作用。
7.一种按照权利要求6的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它含有艾地苯醌或其衍生物，而且其特征还在于艾地苯醌或其衍生物是有效量的，含量为0.1％-10％w/w。
8.一种按照权利要求6的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它含有艾地苯醌或其衍生物，而且其特征还在于艾地苯醌或其衍生物是有效量的，含量为0.3％-5％w/w。
9.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它为封闭贴剂形式。
10.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它为乳膏形式。
11.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它为凝胶形式。
12.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它为乳剂形式。
13.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它为气雾剂形式。
14.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于艾地苯醌为脂质体化的、络合的或者在一种控释系统中。
15.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它还含有油性成分和水溶性成分。
16.一种按照权利要求14的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它含有自乳化腊、凡士林、肉豆蔻酸异丙酯和十六烷醇。
17.一种按照权利要求14的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它含有甘油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
18.一种按照权利要求14的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它还含有对皮肤有益的药剂、防晒剂和/或滤光剂。
19.一种按照权利要求14的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它还含有美容和/或药学上可接受的抗氧化剂。
20.一种治疗不良皮肤色素沉着的方法，其特征在于它包括在色素沉着部位涂敷一种组合物，该组合物含有有效脱色素剂量的艾地苯醌，使其作用一夜，并在早晨洗去。
全文摘要
本发明涉及艾地苯醌在一种局部应用组合物制备中的应用，该组合物用于抑制黑素生成、减轻皮肤着色或使皮肤光亮和/或产生皮肤脱色素作用。更特别的是，本发明涉及一种局部应用组合物，它含有一种美容、药学和/或皮肤病学上有效量的艾地苯醌、其衍生物或它们的混合物，其中含有有效量的艾地苯醌或其衍生物以产生皮肤脱色素作用。
文档编号A61P17/00GK1953742SQ200580003637
公开日2007年4月25日 申请日期2005年1月5日 优先权日2004年1月6日
发明者R·马丁拉古恩斯, M·加布里尔齐滕, D·J·伊利亚斯米尔森, I·赫沃伊卡巴维奇 申请人:利普泰股份公司, 克雷亚克迪瓦股份公司
技术领域：
本发明涉及艾地苯醌在一种组合物中的应用，此组合物用于涂敷在皮肤上以抑制黑素生成。本发明还涉及意欲在皮肤上局部应用的组合物，它含有美容、药学和/或皮肤病学上有效量的艾地苯醌、其衍生物或者它们的混合物。本发明特别涉及一种化妆品制剂，它可对皮肤色素沉着过度具有有益的作用。
本发明优选涉及美容、药学或皮肤病学制剂，此制剂含有艾地苯醌和/或其衍生物，而且可降低黑色素生成增多引起的局部皮肤着色加重。本发明特别涉及一种美容或皮肤病学制剂，它可用于治疗激素刺激和/或物理、化学和/或生物学损害引起的皮肤色素沉着过度。本发明还涉及一种局部应用的药物组合物，其中所含的艾地苯醌为一种皮肤增亮剂。
背景技术：
黑色素是在称为黑素细胞的细胞中产生的，它是可见于皮肤、头发、眼睛和某些神经细胞中的深色色素。
黑素细胞是源于胚胎时期神经嵴的神经外胚层细胞，在胎儿阶段它迁移至表皮的基底层。其他组织中也分布着皮肤外的黑素细胞。
在胎儿阶段，嗜表皮黑素细胞到达表皮最深层，位于基底细胞之间，黑素细胞与基底细胞的比例是1∶10，载体的种族并不重要。一旦处于其最终位置，这些细胞将发出分支状突起，称为树突，这样所有基底细胞将与这些突起接触。
黑素细胞的主要功能是合成深色色素，它称为黑色素。该色素积聚在黑素细胞细胞质内，为分泌颗粒状卵圆形结构，称为黑素体，它在细胞体中形成后就通过黑素细胞的细胞骨架朝树突移动。此过程由激素控制，一些激素促进黑色素形成，而其他则抑制其形成，而且一些激素促进黑素体朝树突外周移动，而其他激素则将它们集中在核周围。尽管此过程在人类中存在，但是它在低级动物中非常明显。
黑素细胞树突的游离端伸入基底角质细胞细胞质，将黑素体逐个注入这些细胞的细胞质中。因此，整个表皮基底层和毛囊含有均匀分布的黑色素，一方面是因为黑素体存在于黑素细胞中，而另一方面并且很大程度上是因为黑素体进入基底角质细胞，按照情况也称为载黑素细胞。在此过程中最突出的是，当色素沉着的基底角质细胞(载黑素细胞)分裂以产生更多的浅表分化棘细胞时，则丢失黑素体，而且另一方面黑素细胞树突也不向分化棘细胞中注入黑素体。这些丢失的黑素体可停留在表皮的细胞间隙，然后随着皮肤的正常脱屑而被除去。这些黑素体完全降解而不再产生其着色功能。
人正常皮肤颜色与黑素体的大小、结构、类型和颜色以及它们在黑素细胞和角质细胞中的分布直接相关。黑色素合成只在黑素体中进行，而且黑色素合成依赖于不同基因的作用。
每个黑素体都是一种球形或卵圆形细胞器，它由三层脂蛋白细胞膜、含水的无定形基质、电解质和不同溶液形成，其中稀释着活性酶和形成膜内微管的微管蛋白超微结构，这些微管或多或少彼此平行。
直到最近以前仍相信黑素体仅由黑色素和黑色素-蛋白构成，黑色素蛋白是与酪氨酸酶相互作用的产物。最近的研究表明黑素体含有两种不同的部分，一种是脂质部分，其脂质位于黑素体外层部分；另一种是蛋白部分，其结构蛋白形成黑素体的中心部分。脂质部分在黑素体的功能调节方面是重要的，而基质的蛋白控制其结构分化。
随着黑素体程序化地完成其功能，形成黑素体和它们的黑素化的过程可被认为是通过被涉及的内部调节控制而传递的一“级联”事件。此过程可总结如下i)黑素体成分的形成和组织在黑素体膜液泡内形成黑素体的结构和酶蛋白。在早期，此膜还加入特异蛋白和脂质。在排列为管状、片状、丝状，没有规定结构的粗面内质网中形成的蛋白，沉积在光面内质网中所形成的液泡内。还加入高尔基体中形成的微囊，所述高尔基体中含有酶或酪氨酸酶后调节因子(诸如多巴色素-互变异构酶)，它们与外层膜融合。在高尔基复合体中糖基化后加入酪氨酸酶。
经过一段时间，结构蛋白持续被加入黑素体，酪氨酸酶也如此。结构蛋白将会成为黑素体膜的一部分，然后它们移动至基质上。
ii)转化为真黑素体和褐黑素体在此点黑素体的变化途径将依赖于黑素体内半胱氨酸水平和/或含巯基化合物(例如谷胱甘肽)的水平。如果此水平低，则产生真黑素生成刺激，伴随真黑素体形成。在此情况下，板层将成为基质的主要成分，并呈平行排列。酪氨酸酶将由高尔基体转移，并与已经形成的泡和板层结合。如果没有抑制性半胱氨酸水平，酪氨酸酶将会通过酪氨酸酶转化为多巴醌而激发黑色素合成。除了多巴色素转化因子调节的那些过程外，通过自氧化过程多巴醌将被转化为真黑色素。显然，吲哚-5，6-醌与其几种前体聚合，以在黑素体内形成黑色素。另一方面，如果半胱氨酸水平高，将形成褐黑素体，而且褐黑色素将沉积在尚未结构化的微丝和小泡的聚集体上。酪氨酸酶将酪氨酸转化为多巴醌，但后者将向基质扩散，并与半胱氨酸结合，形成半胱氨酰多巴，随后进行修饰形成褐黑色素。半胱氨酰多巴与多巴醌竞争，因此改变其代谢，但不改变酪氨酸酶活性。然后5，6-羟基吲哚代谢物的存在抑制后酪氨酸酶活性，它不引起吲哚-5，6-醌合成，降低黑素生成率，使多巴醌在基质中蓄积，阻止正常的真黑素合成。换句话说，半胱氨酸充当黑素体的毒性物质，它可抑制某些酶促步骤，阻止中间产物正常转化为真正的黑色素，将黑色素固定于黑素体结构蛋白的可能性也会丧失。
iii)转移和降解由于黑素体选择性过程中黑素细胞细胞骨架的收缩运动的作用，黑素体从核周体中的合成部位转移至树突末端。一旦黑素体向角质细胞内部转移开始，这些角质细胞细胞吞噬含黑素体的游离树突末端，则发生膜融合现象，黑素体被释放至角质细胞细胞质中。将黑素体加入角质细胞的次级溶酶体中。在此，溶酶体酶将开始降解黑素体，其成分将被稀释至细胞质中，当这些成分被加入代谢底物池时，它们可被再利用。这种降解最重要的特征之一是黑色素从氧化状态转为还原状态，降低其着色强度。
由此完成黑素体循环，开始于黑素细胞中的合成，转移至角质细胞中，最后在连续过程中被降解，确保色素分布均匀。
可将皮肤黑色素沉着分为几种因果成分1)在未暴露于紫外线的情况下，皮肤黑色素按照遗传程序产生(结构性皮肤色素沉着)和2)皮肤直接暴露于UV辐射引起的即刻和延迟晒黑反应(兼性皮肤色素沉着)。条件性色素沉着改变由日光、激素和晒黑能力之间复杂的相互作用引起，这些根据个体遗传结构而不同。
皮肤、头发和眼睛的结构性色素沉着由遗传上的几种基因决定，这些基因缺乏明确的显性优势。另外，这些基因具有很强的自发突变趋势，因此发现具有一个以上黑素细胞群的个体并不罕见，它使此性状变成嵌合体。
尽管人皮肤中黑素细胞群存在区域变异，但是不管皮肤颜色如何，所有人类在给定的解剖区域均具有大约相同数量的表皮黑素细胞。因此，皮肤颜色的人种差异主要是由于黑素体性质造成的，而不是由黑素细胞的数量引起的。
美国黑人、非洲黑人和澳大利亚土著人(组2)中非暴露皮肤黑素细胞内黑素体的数量高于白人、北美欧洲后代和亚洲人(组1)。在组1的个体中大部分黑素体见于形成阶段II和III，而组2个体中大部分黑素体已经完全黑素化(阶段IV)。组2中黑素体不仅数量较多，而且也较大。
结构性色素沉着上的其他遗传和种族差异是由褐黑色素与真黑色素相对数量产生的。褐黑色素的颜色较明亮微红，而真黑色素为黑色。因此在产生不同结构性皮肤色调方面，一种或另一种黑色素的浓度比数量更重要。
另一方面，根据二十世纪六十年代的实验证明，注射α和β促黑素多肽激素(或黑素细胞刺激激素-MSH)诱导色素沉着增强，这种增强继发于表皮黑素细胞内的黑素生成增加和来自黑素细胞的黑素体向角质细胞内部转运的增强。当应用促肾上腺皮质激素(ACTH)时，也可观察到此现象，因为它与MSH共同具有相同的多肽序列，或者其一段多肽序列与MSH非常相似。
当前认识到，成人垂体腺产生大量ACTH和β-促脂解激素，它们具有向黑素的活性。这些激素应当不会影响正常人黑色素沉着。事实上，该激素和性激素(雄激素、雌激素和孕酮)两者在保持成人结构性皮肤色素沉着方面均具有非常有限的作用。然而，MSH产生于婴儿垂体，它应当会影响发育中的黑素细胞系统。
但是，内源性激素在紫外线所致结构性皮肤色素沉着加深方面所起作用的最佳实例是黑斑病。其特征是局部、不规则和通常对称的黑素化，主要见于面颊、前额，有时见于上唇和颈部。
黑斑病频发于正常妊娠，一般在妊娠末期后的短时间内逐渐消失。孕酮和雌激素可能是发生这种皮肤色素沉着过度的基础，暴露于日光下为此情况的触发因素和促进因素。在此情况下，例如黑斑病样色素沉着可在应用口服避孕药的女性中出现。试验研究进一步表明，与单独应用这些引诱剂中的任意一种相比，应用激素与紫外线辐射结合可诱发更强的皮肤色素沉着过度。这些研究还表明，细胞培养中的紫外光决定升高的MSH受体活性，这提示促黑素可增强正常皮肤着色。当垂体功能减退者暴露于紫外线时，其皮肤着色较轻，此情况可对上述论点提供支持。
甚至在没有紫外线刺激的情况下，妊娠期间和某些激素功能紊乱期间所产生的激素也能够增强人黑色素沉着。例如，在阿狄森氏病中(肾上腺皮质机能减退)，由于缺乏肾上腺皮质激素，不可控地产生高ACTH，此促进全身性色素沉着过度。在妊娠期间非暴露区色素沉着也增强，诸如大阴唇、乳晕、乳头和腹中线。
在整个皮肤中黑素细胞分布不均匀。事实上，存在个体差异，而且在单个个体不同机体部分也存在差异。例如，所有人种中，头和前臂皮肤中的黑素细胞超过2000/mm2，而在机体其余部分黑素细胞一般约为1000/mm2。因此，皮肤色素沉着的种族差异不是由于黑素细胞的数量所致，而是由黑色素和黑素体合成的差异引起的。
单个个体中这些局部差异的原因是未知的，但这些差异与生俱来，甚至在胎儿时就存在。在经常暴露于日光与功能性黑素细胞之间没有明显的相关性。但是，即使前臂暴露区域黑素细胞的量大于非暴露区域，也可观察到紫外线照射后非暴露区域皮肤中功能性黑素细胞的数量升高，这与暴露于紫外线皮肤中所观察到的升高相似。尚不确切清楚功能性黑素细胞数量升高是否是由于这些细胞开始有丝分裂，或者是由于变成功能性细胞的静止细胞进行募集之故。
显然，黑素细胞分裂对于增加紫外线照射皮肤中功能性黑素细胞生成至关重要。非照射皮肤中也存在黑素细胞分裂这一事实表明需要进行总体更新(尽管缓慢)，这可能与需要消除遗传损害相关，内在和外来化学和物理因素可造成这些损害。
人一生中皮肤颜色可发生明显变化。例如，所有黑人儿童刚出生时皮肤颜色比一周后浅。雀斑首先仅见于日光暴露后，但在青春期中变得持久。手背皮肤到老年则出现斑点表现。
表皮黑素细胞群中这些数量的变化与个体年龄或经常暴露于日光有关，已对这些变化进行了广泛的研究。成人中可观察到黑素细胞数量的年龄依赖性渐进下降，下降幅度为每10年8-10％。这些对于非暴露区域来说是有价值的，因为暴露区域的减少更小，这可能是紫外线对黑素细胞群的刺激引起的。
在对年龄与慢性日光暴露相互关系的研究中，发现所有受试者暴露区域中数字化黑素细胞密度约为非暴露区域的两倍，但在两种情况中均检测到年龄相关的密度下降。按照黑色素产量，暴露区域的黑素细胞更有活性，这可解释可见区域的色素沉着程度更高。慢性日光暴露不能阻止黑素细胞数量的年龄相关下降，但它影响黑色素产量，而且还诱导黑素细胞活化或增殖。有价值的指出角质细胞为黑素细胞产生有丝分裂物质，而且如果角质细胞暴露于紫外线，则其产量升高6倍。
黑色素生成单位在瘢痕过程中丢失，所以瘢痕的皮肤比周围组织颜色浅。着色在一段时间后可恢复，这有赖于个体年龄、日光暴露和其他因素，诸如激素因素。矛盾的是，还存在瘢痕色素沉着过度的相反情况，这清楚地表明色素沉着过程中所涉及的不同因素之间具有复杂的相互关系。
总之，可以说结构性皮肤色素沉着动力学有赖于遗传和人种因素，而且也有赖于角质细胞和黑素细胞之间的正确相互作用，此关系也可被结构性基础激素状态影响。
相反，兼性皮肤色素沉着在很大程度上有赖于其他外部因素，诸如日光。日光通过促进黑素细胞增殖、黑素细胞活化和黑色素生成而起作用，但某些细胞和激素相互作用现象必须按顺序发生，以便其发挥作用。衰老反而趋于降低皮肤黑色素单位的正常动态平衡，引起色素沉着过程和色素沉着维持的不平衡。
色素沉着细胞中观察到的棕色和黑色是由黑色素的存在引起的。然而，这并不是产生这些颜色的唯一色素，黑色素在化学结构上也不是同质的，因此判断是什么黑色素是困难的。然而哺乳动物的黑色素分为两种主要类型的黑色素真黑色素和褐黑色素。第一种是棕色或黑色，它是不溶解的，含氮，而且来源于酪氨酸。相反，褐黑色素是黄色或红色，可溶于碱，含硫，而且也来源于酪氨酸，但是通过由诸如半胱氨酸等的硫氨基酸存在引起的酶促过程分路。两种类型的黑色素均存在于单个个体中，尽管真黑色素是主要类型。
哺乳动物真黑色素基本上由吲哚-5，6-醌单位构成。后者来源于酪氨酸，通过去掉5个氧原子并将酪氨酸羧基演化为二氧化碳分子，转化为多巴醌。吲哚来源于多巴醌环化，黑色素被认为主要代表聚-吲哚-醌。
黑色素中吲哚亚单位的精确比率可能受酶的控制，但它们依赖于精确的聚合条件。真黑色素表现为吲哚-醌单位形成的刚性链、杆状分子。黑素体的物理结构表现为共聚物，其中黑色素和黑素体结构蛋白彼此平行，但它们可在平面基团位点连接。在椭圆形黑素体中，黑色素排列为双螺旋形状，并与蛋白聚合。
相反，从化学上来看，通过大量来自氨基酸半胱氨酸向多巴醌的亲核聚集的硫来分化褐黑色素为多巴酯，多巴醌由酪氨酸酶的作用形成。半胱氨酸主要通过1∶6加至酶催化形成的多巴醌而起作用，获得5-S-半胱氨酰多巴化合物。根据褐黑色素硫来源，也可鉴别相似的中间产物。半胱氨酰多巴与多巴不同，它不是酪氨酸酶底物。
最后，根据合成的真黑色素和褐黑色素中间产物的量，可能大多数黑色素是混合类型。这些化合物发生异分子聚合，形成混合的黑色素，这可解释黑色素所获得的不同视觉色调。
在哺乳动物中，酪氨酸酶是具有两种功能的酶它将酪氨酸转化为多巴，然后将多巴转化为多巴醌，然后多巴醌发生环化，再进行氧化，产生真黑色素结构。相反，如果多巴醌与半胱氨酸结合，将会形成褐黑色素。
酪氨酸酶以三种异构体形式存在，尽管可将其认为是一种单加氧酶，它含有铜并催化一元酚羟基化和二元酚氧化，即多巴(左旋多巴)，形成醌。通常将这两种酶催化活性看作是甲酚酶或一元酚酶活性和儿茶酚酶或二元酚酶活性。
有几种因子可改变酪氨酸酶的产生，多巴色素转化因子是其中的一种，它可促进多巴色素转化为5，6-二羟吲哚；吲哚阻滞因子，它可抑制5，6-二羟醌醇转化为黑色素；以及吲哚转化因子，它可促进5，6-二羟醌醇转化为黑色素。特别是吲哚阻滞因子和多巴色素转化因子，它们与可溶性酪氨酸酶异构形式(I型和II型，它们在黑素体中的浓度较低)密切相关，而多巴色素转化因子与固定酪氨酸酶异构体(IV型)相关。这些因素是辅助酶系统，其中多巴色素-氧化还原酶(多巴色素-异构酶或多巴色素互变异构酶)系统较为突出。其功能是形成多巴色素互变异构体，以形成羧基衍生物。如果没有这些因子，黑色素不能成熟以进行聚合。
除了多巴色素互变异构酶，还有其他酶(过氧化物酶、过氧化氢酶、谷氨酰胺代谢酶)和金属离子参与后-酪氨酸酶黑素生成调节。
总之，黑素生成依赖于酪氨酸酶及其底物酪氨酸之间良好的功能性相互作用，以便获得多巴，随后获得多巴醌。后者通过后-酪氨酸酶因子作用，以使其再转化为终止被聚合的吲哚单位，获得含黑素体结构蛋白的共聚物，从而产生真黑色素。黑素体基质中半胱氨酸的存在可阻止这些后-酪氨酸酶因子的作用，产生不能被聚合的其他中间可溶性化合物。但是，根据它们所含的硫浓度，经常发现部分聚合黑色素的混合物。这可解释不同黑色素中可见不同的色调，因为它们变化的结构将会根据黑色素类型而不同地吸收某些波长的可见光。
这一定不能与皮肤颜色混淆，因为这仅适用于色素颜色。其他因素也参与形成皮肤颜色，诸如不同类型黑色素的浓度、后者在黑色素单位中的分散、所产生的黑素体类型和充当漫射屏的表皮所致的衍射。皮肤中存在的其他色素也参与形成皮肤颜色，基本上是血红蛋白色素，在浅色皮肤中可清楚地看到它们，但深色皮肤表皮中的黑色素色素可掩盖它们。
在某些个体中经常发生黑素细胞中黑色素密度显著升高的皮肤区域的皮肤颜色深于周围皮肤。这些区域称为色素沉着过度区，这会引起这些个体的不适。
色素沉着过度最常见的原因是皮肤区域对紫外线刺激的过度反应、对加重辐射作用剂(例如含香柠檬油的化妆品或一般称为光线损害剂)释放的紫外线的过敏、激素紊乱(例如改变的甲状腺激素和性激素、内源性和外源性类固醇以及孕激素)以及继发性色素沉着过度或炎症损害引起或导致的色素沉着过度。特别是，炎症后色素沉着过度表现为不规则的斑点，此斑点比周围皮肤着色深，该斑点发生于炎症后，炎症由例如痤疮、毛囊炎、湿疹、脱发、抓伤等情况引起皮肤损害所致。该炎症后色素沉着过度缓慢消散，但可持续数月甚或数年，而且它是就医的常见原因，而且需要专业护理多次。
到目前为止，已经公开了几种皮肤局部应用组合物，它们含有一种或多种成分，这些成分可降低皮肤黑素细胞中的黑色素密度。一般将这些成分看作是脱色素剂或者漂白剂。通常通过皮肤较深层吸收这些药剂，它们可抑制黑素细胞中黑色素的形成，而且特别作用于黑素生成的某些阶段。最常见的脱色素剂是基于氢醌或其衍生物，诸如苄-氧-酚和氢醌单苯醚(US专利3,060,097)。最后者化合物的缺点是当通过皮肤吸收时，它不适于代谢，因为它与不可逆的脱色素事件刺激性白斑(皮肤脱色素区域逐渐扩大，经常具有色素沉着过度边缘)相关联。苄-氧-酚也具有缺点，它可通过淋巴系统运输至皮肤其他区域，这些区域可远离应用部位，在这些区域也可产生变浅作用。
化合物甲氧酚也被推荐为一种皮肤脱色素剂，它是一种氢醌醚，已用于药用脱色素组合物，但是其缺点是，因为它在水介质中不易溶解，所以将其加入化妆品或皮肤病制剂较为困难。
用于皮肤脱色素的其他化合物是4-异丙基儿茶酚，它是一种取代氢醌衍生物(南非专利申请716,890)和氢醌脂肪酸单和二酯(欧洲专利申请号82301102.8)。
已经提出在化妆品中直接应用氢醌以治疗色素沉着过度，因为它是有效、可溶于水而且可被快速代谢排泄。然而，氢醌的缺点是它在碱性介质中不稳定，可被氧化为奎宁形式，此形式可使任何含有它的药用组合物成为棕色。在这种组合物中需要加入抗氧化剂，诸如抗坏血酸，以防止这种氧化过程。事实上，已经提出，例如将氢醌分子加入无水介质使其稳定。在此意义上，美国专利4,466,955公开了一种化妆品制剂，其中将氢醌溶解在脂肪酯中，并在所得溶液中加入一种不含水的化妆品膏基，在此膏基中氢醌更加稳定而且较难氧化。这是因为与溶于水相比，氧较难溶于腊，因此氧化过程较少发生。另外，按照此公开，这种制剂支持氢醌的皮肤吸收。
氢醌是化合物1，4对苯二酚或p-二羟基苯的属名，其分子量是110.0。其作用机理是趋于抑制酶促酪氨酸氧化为3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)并抑制其他黑素细胞代谢过程。
氢醌的主要缺点是它也是皮肤刺激物，可能引起反常的色素沉着过度，称为褐黄病。最近也公开了氢醌的致癌性，因为在一组每天接触此物质的工人中报道了至少5例皮肤黑素瘤。
另一方面，艾地苯醌是一种具有药效特性的苯醌，例如按照美国专利4,271,083所公开，已在具有细胞保护作用的药物中采用这些特性。艾地苯醌是化合物6-(10-羟癸基)-2，3-二甲氧-5-甲基-1，4-苯醌的属名(JP-B-62 3134(1987)，美国专利号4,139,545)。体外检测所得数据提示，通过促进线粒体呼吸循环中电子的会聚、抑制脂质过氧化作用、减少非呼吸氧的消耗和刺激ATP形成，可获得艾地苯醌的细胞保护作用。
艾地苯醌被认为是一种合成辅酶Q10，并且通过口服给药可用于改善认知障碍、阿耳茨海默氏病、痴呆和脑血管疾病，可用作心脏细胞保护剂。由于具有抗氧化特性，可口服给药，既可单独也可与其他活性成分联合应用，这些其他成分优选具有抗氧化特性，例如维生素E。
专利文件DE 3,049,039、EP 0,788,793、US 4,436,753、US5,059,627和US 5,916,925公开了包括艾地苯醌或其衍生物的口服、胃肠外或经皮给药制剂，它们可用于治疗痴呆、血循环障碍，或者可用于刺激神经生长因子。特别是日本专利JP 1,279,818公开了艾地苯醌及其衍生物在不同制剂中的应用，这些制剂可用于使头发具有外生颜色(艾地苯醌是一种深橙色的粉末)。迄今为止没有报道艾地苯醌具有明显毒性作用(Arzneim.Forsch/drug res.35(II)，11，pp.1704，1985)。
现在惊喜地发现，含有艾地苯醌的皮肤局部应用制剂可使色素沉着区域中色素浓度显著降低，同时不会引起明显的副作用。
本发明详细描述本发明涉及艾地苯醌在一种组合物中的应用，此组合物意欲涂敷于皮肤上以抑制黑素生成。
本发明还涉及一种在皮肤上局部应用的组合物，它含有美容、药学和/或皮肤病学上有效量的艾地苯醌、其衍生物或者它们的混合物。
本发明特别涉及一种化妆品制剂，它可对皮肤色素沉着过度具有有益的作用。本发明优选涉及含有艾地苯醌和/或其衍生物的美容或皮肤病学上的制剂，它可减轻黑色素产生过多所致的皮肤着色局部增强。
本发明还涉及艾地苯醌在一种化妆品组合物中的应用，可将此组合物涂敷在皮肤上，在应用部位产生皮肤脱色素作用。在此文件中，必须将名词“脱色素”理解为在皮肤色素沉着区域获得脱色作用，直到其着色与周围皮肤相似。特别是，此色素沉着区域可由任何皮肤疾病引起，而且尤其是牛皮癣、酒渣鼻、紫外线造成的皮肤损害、特应性皮炎、药物后色素沉着过度、炎症后色素沉着过度、妊娠黄褐斑和皮脂溢性皮炎等皮肤疾病引起。另外，在此文件中，必须将名词“减轻皮肤着色”理解为减轻皮肤的色调，直到获得肉眼可见的比色度下降。
皮肤局部应用的本发明组合物的形式可例如为乳膏、凝胶、封闭贴剂、乳剂或气雾剂。本发明组合物优选为乳膏形式(O/W)。按照本发明，可将艾地苯醌包含在控释局部敷剂中，特别是其中艾地苯醌为脂质体或络合物形成的。这种类型组合物的制剂在现有技术水平范围内。
准备涂敷于皮肤的本发明组合物优选包含艾地苯醌或其衍生物，其含量为0.1％-10％w/w。更优选的是，艾地苯醌或其衍生物的含量为0.3％-5％w/w。
除了别的以外，艾地苯醌衍生化合物的实例可为专利文件US4,139,545、US 4,436,753、DE 3,049,039、EP 0,788,793、US4,436,753、US 5,059,627和US 5,916,925中公开的那些。
采用已知的美容或药学上可接受的赋形剂，可由本领域熟练技术人员配制本发明组合物。此组合物优选包含油性和水溶性成分。油性成分的实例为自乳化腊、凡士林、肉豆蔻酸异丙酯和十六烷醇。水溶性成分的实例为甘油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。本发明组合物也可含有对皮肤有益的药剂，诸如增湿剂、水合剂和维生素，它们都是已知的，而且本领域熟练技术人员可对它们进行选择。如果需要，本发明组合物还可含有美容和/或药学上可接受的抗氧化剂和滤光剂和/或防晒剂。
本发明还涉及治疗不良皮肤色素沉着的方法，它包括将含有脱色素有效剂量艾地苯醌的组合物涂敷在这些部位，使其作用一夜，并在早晨洗去。
实施例实施例1i)含有艾地苯醌(IDB)的含水乳膏制剂(O/W)表1
ii)制备含艾地苯醌乳膏的方法熔化该制剂的油性成分(A)(自乳化腊、凡士林、肉豆蔻酸异丙酯和十六烷醇)，并将其加热至70/75℃。如上所述，将该制剂的水溶性成分(B)(甘油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)溶解在所需量水中，并将它们加热至70/75℃。
然后将油相(A)加入水相(B)中，同时进行有力而持续的搅拌，并控制这些成分的温度。在水浴中将其冷却，缓慢搅拌，直到温度达到45℃。一旦达到所需温度，则如上所述将所需量的艾地苯醌溶解在0.5ml的乙醇中，并加入先前的制剂，同时缓慢搅拌，直到获得均匀的制剂。使其冷却至所需的稠度，并进行适当的包装。
在艾地苯醌浓度超过3％的情况下，可能需要增加油相中成分的比例，以获得活性组分的增溶作用。如果所需艾地苯醌浓度远远超过4％，则可将含水基础乳膏替换为油性乳膏(W/O)。
实施例2应用含艾地苯醌的组合物对试验动物皮肤的作用制备在中性相中含5％和2.5％w/w艾地苯醌(IDB)的乳膏。将该乳膏和含相同制剂而无艾地苯醌的乳膏涂敷在3月龄成年裸鼠上。按照下面列表，将含艾地苯醌的乳膏涂敷在动物身体的右半侧，对照乳膏涂敷在左半侧。涂敷乳膏后(p.a.)1、2、3或4小时处死这些动物。
A批5％IDB处理的动物(1小时p.a.)B批2.5％IDB处理的动物(1小时p.a.)C批5％IDB处理的动物(2小时p.a.)
D批2.5％IDB处理的动物(2小时p.a.)E批5％IDB处理的动物(3小时p.a.)F批2.5％IDB处理的动物(3小时p.a.)G批5％IDB处理的动物(4小时p.a.)H批2.5％IDB处理的动物(4小时p.a.)取下处理和对照皮肤区域，分为3部分一部分用于通过气相色谱法测定艾地苯醌的量，一部分用于测定保留水分量，第三部分用于石蜡包埋。
通过气相色谱法测定艾地苯醌的量将处理和对照皮肤部分置于低温恒温器平台上，表皮侧朝下，并按照同样方法获得平行于表面的厚度300微米的片段，以便获得深层切片、表面切片和中间切片。将每个切片都进行鉴别、均化，并再悬浮在丙酮中。应用Hewlett Packard5890气相色谱仪，选用聚甲基硅酮为固定相的毛细管柱(HP-IMS，25m×0.2mm，0.33μ厚膜)，通过气相色谱法分析每个提取液。温度程序组成为起始温度100℃3分钟，然后用20℃的温度增量持续加热，直到达到300℃。最后温度保持5分钟。应用0.7ml/分钟的氦气流。给此色谱仪连接四极质量检测器(HP型号5972)，SCAN模式下采用在70eV下的电子碰撞电离，质量扫描模式为50-600m/z。在1/25分裂模式下注射2μl样品，注射器温度为250℃，界面温度280℃。
水分测定在分析天平上测定每个处理和对照皮肤部分，然后将它们置于120℃的烘箱中，持续30分钟。然后将这些样品在室温下冷却30分钟，然后再次称重。按照下面公式计算水分百分率 由此通过每个处理部分的百分率除以相应对照部分的百分率而计算处理皮肤水含量与对照皮肤水含量相比的增长。
形态学及形态测定研究测定至少10个不同点的表皮、表皮角质层、真皮乳头层和真皮网织层的厚度，结果表示为10个测定值的均值。还测定至少10个点的毛细血管直径，通过均值表示。应用Quantimet500+(Leica)影像处理设备进行测定。制备结缔组织的特异染色和Giemsa、亚甲蓝、甲苯胺蓝(观察异染性和间隙水分布)和Schorr染色(观察角蛋白状态)。
免疫组化研究应用HSP27单克隆抗体(Dako Labs)，并用APAAP试剂盒(Dako Labs)显色，通过酶免疫标记，测定包埋在石蜡中材料的交互切片中热激蛋白(HSP)过表达。
形态学5％和2.5％IDB乳膏处理的动物皮肤未显示形态学改变，其显微镜影像与对照皮肤的相似。特异染色技术未显示不同试验样品中的差异，甚至不同处理时间之间也未见差异。应用Schorr染色以观察角蛋白性质的不同，其色斑中也没有改变。
表皮形态学测定结果见表II。可见处理皮肤和对照皮肤之间的表皮厚度或表皮角质层厚度没有显著差异。不论是两种试验IDB浓度之间，还是不同乳膏涂敷时间之间均未发现显著差异。因此，可以得出局部涂敷艾地苯醌基本上不会改变表皮厚度，因此它显示对局部无害。
表II含5％和2.5％艾地苯醌乳膏处理小鼠皮肤的总表皮和表皮角质层厚度及其与不含艾地苯醌的中性乳膏处理的对照皮肤的比较。数值单位为微米，表示为10个测定的均值(数值四舍五入至两位小数点)。在对照中，测定值表示为全部测定的均值，即每点两个动物，因为应用两个对照，一个是含5％IDB乳膏的对照，另一个是含2.5％IDB乳膏的对照。
真皮形态学测定不同试验动物之间的真皮乳头层和真皮网织层的厚度没有显著变化。因此，可以得出局部涂敷艾地苯醌基本上不改变表皮厚度，因此它显示对局部无害。
血管直径结果见表III。可见IDB处理皮肤与对照皮肤之间的微循环血管直径没有显著差异，试验IDB浓度或不同乳膏涂敷时间之间也没有显著差异。因此，可以得出局部应用艾地苯醌基本上不改变微循环血管直径，因此显示没有局部血液动力学改变。
表III含5％IDB乳膏、含2.5％IDB乳膏和基础乳膏(无IDB)处理皮肤的真皮毛细血管直径。直径单位为微米，表示为10个测定值的均值(数值四舍五入至2位小数点)。在对照中，测定值表示为全部测定的均值，即每点两个动物，因为应用两个对照，一个是含5％IDB乳膏的对照，另一个是含2.5％IDB乳膏的对照。
HSP过表达对照乳膏(无IDB)处理表皮和含IDB乳膏处理表皮之间的HSP表达没有发现差异。含5％和2.5％IDB乳膏处理的皮肤不同应用后时间之间也没有差异。因此，可以得出所研究的IDB浓度的处理不会增强小鼠皮肤中表皮HSP表达，所以可以推断不存在任何表皮损伤，此损伤可证明存在针对侵入的细胞防御系统的过表达。
水分测定蒸发前后处理和对照皮肤的重量显示，IDB处理组和对照组的水分百分率相似。不同应用后时间之间也没有显著差异。结果见表IV。
表IV处理皮肤与对照的水分百分率和水保留能力。数值单位为克，表示为涂敷乳膏后1、2、3和4小时时测定的均值。
因此，可以得出应用研究浓度的IDB处理不会改变组织中的水含量(IDB处理皮肤和无IDB乳膏处理皮肤之间水保留的差异没有统计学意义)。
皮肤中IDB的渗透涂敷后2小时，5％IDB处理样品和2.5％IDB处理样品两者均在最表面切片中(此切片包括整个表皮和真皮的上部分)获得保留时间17.6分钟的IDB峰值。相反，对应于深层和中间切片(真皮网织层和皮下组织)的样品未显示峰值。另一方面，应用后1小时，无一样品显示此峰值(IDB处理样品没有，对照样品也没有)。因此，可以得出结论IDB透过皮肤，而且在其最表面切片中IDB保留可达应用后的2小时。
实施例3应用含不同浓度艾地苯醌的组合物对人皮肤的作用将患者皮肤样品标识为患者1、2和3，在这些试验中应用这些样品，试验步骤如下患者1和2两名患者(均为女性，年龄分别为74和71)均应用乳房皮肤，由于存在乳腺癌和鲜红发育不良(florid dysplasia)，她们将接受根治性乳房切除术和单纯乳房切除术。
在被送入手术室前45分钟，将其乳房表面分为3个相似的区域，并通过轻微地环状按摩，将含5％IDB的乳膏约120mg加至第一个区域中，直到乳膏完全吸收。其余两个部分进行相似处理，所用乳膏包括约120mg含2.5％IDB的乳膏和对照乳膏。一旦进入手术室，在准备手术野前，用95°乙醇冲洗乳房表面，以除去可能过量的乳膏。
手术(平均外科操作时间45分钟)后即刻切除每个区域约4cm2的皮肤切片，对其进行正确标识。一旦切除此部分，将小心除去皮下脂肪组织，以仅仅获得表皮和真皮。
患者3应用患者(女性，年龄为54岁)的乳房皮肤，由于存在乳腺癌，她将接受根治性乳房切除术。
在被送入手术室前45分钟，将其乳房表面分为3个相似的区域，并通过轻微地环状按摩，将含5％IDB的乳膏约120mg加至第一个区域中，直到乳膏完全吸收。其余两个部分进行相似处理，所用乳膏包括约120mg含0.5％IDB的乳膏和对照乳膏。一旦进入手术室，在准备手术野前，用95°乙醇冲洗乳房表面，以除去可能过量的乳膏。
手术(平均外科操作时间45分钟)后即刻切除每个区域约4cm2的皮肤切片，对其进行正确标识。一旦切除此部分，将小心除去皮下脂肪组织，以仅仅获得表皮和真皮。
在患者1、2和3皮肤样品上研究应用含0.5％、2.5％和5％艾地苯醌乳膏对不同皮肤层、皮肤丛血管形态学和形态学测定的作用，以及对HSP表达的作用，以此来评价表皮对该乳膏有害作用的反应。
将含IDB乳膏和对照乳膏处理的皮肤片段固定在甲醛溶液中，将它们包埋在石蜡中，并通过苏木精和曙红、Schorr、Giemsa和甲苯胺蓝用组织学染色技术进行染色。
形态学测定测定组织学切片的表皮厚度、表皮角质层、真皮乳头层、真皮网织层和真皮毛细血管丛直径。
免疫组化给石蜡中包埋的交互切片进行脱腊，并与市售HSP27的抗血清(Dako Labs)一起进行孵育。用APAAP试剂盒(Dako)显色此反应。
显微外观通过肉眼观察，用含IDB乳膏处理的皮肤区域、无IDB的对照乳膏处理的皮肤区域和未处理皮肤区域之间没有显著差异。因此可以得出，在涂敷期间，不同试验浓度的含IDB乳膏的处理未引起刺激。
显微镜对照乳膏处理的皮肤或含不同IDB浓度的乳膏处理的皮肤中未检测到结构性变化，甚至应用特异染色技术也未发现。特别是，未发现真皮中间质液蓄积、血管改变和炎症成分蓄积。所有研究的表皮层均保持其完整和结构。
表皮厚度的形态学分析下表简要总结所得结果。
表V含不同浓度IDB的乳膏和对照乳膏在不同处理时间的志愿者乳房皮肤总表皮和表皮角质层厚度值。所得值单位为微米，表示为10个测定值的均值。
因此可以得出，在皮肤上应用含不同浓度IDB的乳膏未显著改变表皮厚度。
真皮的形态学测定不同评价样品之间，真皮网织层和真皮乳头层厚度测定值未见显著差异。因此可以得出，应用含不同浓度IDB的乳膏未引起真皮即刻改变。
真皮丛中血管的形态学测定不同评价样品之间，血管直径测定值未见显著差异。所得结果总结在下表中表VI含不同IDB浓度的乳膏及对照乳膏处理的皮肤真皮丛的血管直径。所得值单位为微米，表示为10个测定值的均值。
由所得结果可以得出，应用含不同浓度IDB的乳膏未改变处理皮肤的血管状况。
HSP27分布和表达所有评价患者中，含不同浓度IDB的乳膏和对照乳膏(无IDB)处理的不同样品中HSP表达和分布未见差异。由所得结果可以得出，应用含不同浓度IDB的乳膏未改变HSP27的表达和分布，这种蛋白是表皮对可能损伤的反应参数。
实施例4应用含艾地苯醌的组合物对人皮肤的作用水分测定应用前面实施例中标识为患者3的患者乳房皮肤。
将诸如实施例1中所用的基础乳膏分为3个等分，加入足量的艾地苯醌(纯度99.3％)，使最终IDB浓度为5％。将足量的艾地苯醌(纯度99.3％)加入第二等分中，使最终IDB浓度为0.5％，第三等分用作对照(不含任何IDB)。
水分测定在分析天平上测定每个处理和对照皮肤部分，然后将它们置于120℃的烘箱中，持续30分钟。然后将这些样品在室温下冷却30分钟，然后再次称重。按照下面公式计算水分百分率
通过每个处理部分的百分率除以相应对照部分的百分率而计算处理皮肤水含量与对照皮肤水含量相比的增长。所得结果简要总结在下表中表VII
因此，局部涂敷在皮肤上的IDB在研究浓度下未引起皮肤所含水量的增加。
实施例5艾地苯醌所致的黑素生成抑制按照Dooley等推荐的方法(Skin Pharmacol.1994；7188-200)进行体外测定，以评价艾地苯醌对黑素生成的抑制能力，其方法描述如下材料和方法细胞应用源自人黑素瘤的细胞系进行此研究，该细胞系由ABAC(Asociación Banco Argentino de Células-Cell Bank of Argentina)提供，它具有黑色素合成能力(SK-MEL-28，ATCC起端)。细胞在塑料培养瓶或24孔塑料盘中生长，培养基为添加10％胎牛血清(FBS)的改良Eagle培养基(DMEM)，并将其保持在37℃的5％ CO2空气中。
试验化合物艾地苯醌由阿根廷Droguería Saporiti提供，批号为02107，按照干药计算的纯度为99.80％。氢醌(1，4-苯二醇)由阿根廷Droguería Saporiti提供，批号为010715，按照干药计算的纯度为99.85％。
体外化合物研究将胰蛋白酶分离的SK-MEL细胞种在24孔塑料盘上(密度为每孔1×105细胞)，并在用评价化合物处理之前，将其在添加10％胎牛血清(FBS)的改良Eagle培养基(DMEM)中孵育24小时。24小时结束后，用990μl新鲜培养基置换此培养基。将10μl含不同浓度评价化合物的无菌载体(50％丙二醇、30％乙醇和20％蒸馏水)加入这种新鲜培养基中。SK-MEL细胞可较好耐受1％的这种载体(终浓度0.5％丙二醇和0.3％乙醇)。
制备无菌载体中每种化合物的十进制稀释液，以使研究化合物的终浓度为1.000-0.01μg/ml。每天重复此过程，连续3天。
第四天，不对细胞进行处理，并在第五天按照下述方法分析剩余粘着细胞。因而这些细胞在培养持续的5天中连续暴露于研究化合物。所有浓度的化合物均按一式三份进行研究，将此化合物处理的3个孔的均值与仅接受载体处理的进行比较。
黑色素含量测定在搅拌培养基并用PBS冲洗细胞后，测定SK-MEL细胞黑色素含量。然后通过在每个孔中加入1ml 1N NaOH，并重复手工吸液而溶解这些细胞。应用分光光度计在400和475nm分析未处理的细胞提取液，以分别测定黑色素和多巴醌的含量。结果表达为载体处理的细胞培养物百分率。
用紫色晶体进行细胞数目定量通过间接方法，应用含紫色晶体水溶液的染剂测定在体外处理中存活的粘着于塑料盘的细胞数目。处理期过后，通过颠倒塑料盘从孔中倒出培养基，并在每个孔中置换为0.5ml的0.1％紫色晶体(含于10％乙醇中)。室温下在旋转台上将这些盘染色5分钟，同时进行轻度搅拌。然后通过颠倒塑料盘倒出过量的着色剂，并将整个盘在适宜容器的蒸馏水中浸没4遍。漂净后，将这些盘颠倒，使其在吸水纸上滴水，直到完全除去过量的水。然后通过在每个孔中加入1ml乙醇(95％)，提取粘着细胞中存留的紫色晶体。最后在室温下将这些盘置于旋转搅拌器上，进行30分钟。应用含95％乙醇的塑料透明容器作为空白，借助分光光度计(波长＝590nm)测定这些醇样品的光密度。当细胞密度很高时(例如当光密度大于2.0时)，制备每个样品在95％乙醇中的稀释液，由此对它们进行分光光度分析。
为了测定试验药剂特殊浓度处理下存留细胞的分数，将处理孔的OD590(3个测定值的均值)除以应用对照载体孔的OD590(3个测定值的均值)。用该分数乘以100获得细胞存活百分率(表示为对照载体的百分率)。
测定黑色素含量表VIII显示艾地苯醌和氢醌稀释液OD400和OD4753个同时测定值的均值。
表VIII
以及表达为百分率
由所得结果可以得出，在所用模型中，艾地苯醌化合物以剂量依赖型方式抑制黑色素的合成。尽管高浓度时可认为艾地苯醌的作用与氢醌的作用相似，但进行一定的稀释后，后者变得无效。相反，甚至更大的稀释后，艾地苯醌化合物仍继续抑制作用。
多巴醌生成也受到影响，其影响方式类似于黑色素合成，表明这种抑制是复杂的，抑制可能在黑色素代谢途径的几个位点发生。
用紫色晶体进行细胞数目定量下表总结不同艾地苯醌和氢醌稀释液处理后活力细胞的百分率。
表IX
由所得结果可以得出，高浓度艾地苯醌对细胞可能有毒性。氢醌也类似，尽管氢醌的毒性更高。假定此毒性可干扰读取黑色素和多巴醌的光密度，应用其他稀释液、不同的孵育时间以及仅应用艾地苯醌进行了相似的试验(因为文献中已公开了氢醌对此系统的作用)。这些描述在下面实施例中。
实施例6艾地苯醌处理1天后的黑素生成抑制设计与前面实施例所述相似的试验，以证实艾地苯醌是否可抑制培养中细胞的黑素生成，但在此情况下，只将这些细胞处理1天，而在第三天评价结果。应用倒置显微镜评价对细胞培养物的细胞病变作用存在或者不存在，从-2稀释液开始至-6稀释液。
表X显示不同检测稀释液的400和475光密度(分别为黑色素和多巴醌的)，以及它们各自的百分率。
表X
由这些结果可以得出，艾地苯醌处理后24小时就以剂量依赖方式开始抑制黑色素合成及其副产品的合成。在此试验中未考虑-1稀释液，这是因为这种培养物具有细胞病变作用。其余稀释液无论如何没有显示任何细胞病变作用，由此可以认为艾地苯醌所用剂量没有细胞毒性。可以清楚-5和-6稀释液的黑色素和多巴醌的量大于对照。这可能简单地由于方法中的错误，而且因此不明显。但是，不应当受到特殊理论的限制，可能在此孵育时间下和这些稀释液中，艾地苯醌化合物可进行黑素生成刺激作用，它可能是暂时的。
实施例7设计与前面实施例所述相似的试验，以证实艾地苯醌是否可抑制培养中细胞的黑素生成，但在此情况下，将这些细胞处理2天，而在第四天评价结果。应用倒置显微镜评价对细胞培养物的细胞病变作用存在或者不存在，仅评价-4、-5和-6稀释液。
表XI显示不同检测稀释液的400和475光密度(分别为黑色素和多巴醌的)，以及它们各自的百分率。
表XI
这些结果将表明，在-4和-5稀释液中存在黑色素合成刺激，而-6稀释液显示为抑制。这可能表明，如果存在刺激，处理应当在第二天继续进行，尽管值很类似对照的值，-6稀释液显示的抑制与期望相似。未观察到细胞病变作用。
实施例8
艾地苯醌处理3天后的黑素生成抑制设计与前面实施例所述相似的试验，以证实艾地苯醌是否可抑制培养中细胞的黑素生成，但在此情况下，将这些细胞处理5天，而在第五天评价结果。应用倒置显微镜评价存在或者不存在对细胞培养物的细胞病变作用，仅对-4、-5和-6稀释液进行评价。
表XII显示不同检测稀释液的400和475光密度(分别为黑色素和多巴醌的)，以及它们各自的百分率。
表XII
这些结果表明，在第三天处理时存在剂量依赖性黑色素合成抑制。-6稀释液中多巴醌的量与对照相似。未观察到细胞病变作用。
实施例9高度稀释液中艾地苯醌介导的黑素生成抑制设计与实施例6所述相似的试验，以证实低浓度艾地苯醌对培养中细胞黑素生成的作用，但使用-2、-3、-4、-5、-6、-7和-8稀释液。
表XIII显示不同检测稀释液的400和475光密度(分别为黑色素和多巴醌的)，以及它们各自的百分率。
表XIII
此结果显示，甚至当它非常稀时，艾地苯醌化合物仍保留其抑制黑素生成的能力。但是，没有显示明确的剂量-反应比。
实施例10含有2.5％艾地苯醌的乳膏对于妊娠黄褐斑患者的脱色素能力患者是一名女性，43岁，秘鲁国籍，印加人后裔，具有III型小麦色皮肤，她陈述她9年前怀孕生育，而且在第二次妊娠三个月期间，她出现妊娠斑(妊娠黄褐斑)，在面部两侧颧部，呈蝴蝶翅膀状，其中一个斑现在仍存在，而且由于日晒在夏天色素沉着加重，而且此斑与周围皮肤存在显著对比边界。
治疗指导患者每天在上床之前，在斑的位置涂敷足量的按照实施例1的含有2.5％艾地苯醌的乳膏，使该乳膏在皮肤上保留过夜并在第二天早晨用充裕的水和中性皂洗净脸。连续进行涂敷20天不间断。在开始治疗后的7、14和21天对患者进行临床检查，将色素沉着区域与周围的皮肤进行比较。
结果观察到色素沉着过度皮肤的色素沉着逐渐普遍减轻，接近21天时变得显著，尽管未达到与无色素沉着过度的皮肤相似的颜色。色素沉着斑点边界变淡，消失，不再明显清楚，表明从黄褐斑的中心区域向周围皮肤褪色。
结论含2.5％艾地苯醌的乳膏可有效地减弱妊娠黄褐斑的皮肤色素沉着，此疾病的特征是局限性色素沉着过度，而且具有可能的激素病原学。尽管中止处理，结果表明持续处理可使色素沉着过度完全消失。
实施例11含有2.5％艾地苯醌的乳膏对于炎症后色素沉着过度患者的脱色素能力患者是一名女性，40岁，阿根廷国籍，白皮肤II型，具有显著光化性损害，并且她陈述她分别在9，11和14年前孕3产3，并且在用蜡对口外周区域施行脱毛术后，在受影响区域具有残留的色素沉着过度，并持续了3年多，并仍然持续至今，由于光照在夏季月份该色素沉着加重。该色素沉着过度具有非常明确的边缘，与周围的皮肤形成对照。
治疗指导患者每天在上床之前，在斑的位置涂敷足量的按照实施例1的含有2.5％艾地苯醌的乳膏，使该乳膏在皮肤上保留过夜并在第二天早晨用充裕的水和中性皂洗净脸。连续进行涂敷20天不间断。在开始治疗后的7，14和21天对患者进行临床检查，将色素沉着区域与周围的皮肤进行比较。指示患者在整个治疗期间禁止直接暴露在阳光照射下。
结果在开始治疗后的7天，观察到色素沉着过度皮肤的色素沉着有普遍的减轻，接近14天变得有意义，接近21天时，色素沉着过度区域的边缘改变，并且斑的大小以一种不规则的方式缩小。色素沉着斑的边缘变淡，并在一些区域消失。
结论含2.5％艾地苯醌的乳膏可有效地减弱炎症后皮肤色素沉着，此疾病的特征是皮肤炎症过程引起的局限性色素沉着过度。尽管中止处理，但结果表明持续处理可使色素沉着过度完全消失。
实施例12含有5％艾地苯醌的乳膏对于药物后色素沉着过度患者的脱色素能力患者是一名女性，46岁，阿根廷国籍，小麦色皮肤III型，她陈述她在8年前孕1产1，并且在双肘有牛皮癣斑。该患者陈述用补骨脂素治疗后，她在双肘出现色素沉着过度斑，在该处牛皮癣斑仍然发展，它忽重忽轻并恶化，始终留下比患牛皮癣区域更广泛的色素沉着过度的基底。在大约5年前，该色素沉着过度变成了永久性的。
治疗指导患者每天在上床之前，在斑的位置涂敷足量的按照实施例1的含有5％艾地苯醌的乳膏，使该乳膏在皮肤上保留过夜并在第二天早晨用充裕的水和中性皂洗净她的脸。连续进行涂敷15天不间断。在开始治疗后的7和15天对患者进行临床检查，将色素沉着区域与周围的皮肤进行比较。指示患者在整个治疗期间禁止直接暴露在阳光照射下。在治疗完成后的6个月，将该色素沉着过度区域与周围的皮肤再次进行比较。
结果A在开始治疗后的7天，观察到色素沉着过度皮肤的色素沉着有普遍的减轻，接近15天效果变得更显著，色素沉着过度的大小和颜色减轻，并且该区域获得了与周围皮肤一样的颜色。
结论含有5％艾地苯醌的乳膏对于减弱药物后皮肤色素沉着是有效的。
实施例13含有0.3％艾地苯醌的制剂的储藏期稳定性研究对具有相同组分的在不同日期制备的两种制剂的稳定性进行研究。将二者均制备成含有0.3％艾地苯醌的水性乳膏形式(O/W)。
将时间最长的待分析制剂包装于白色聚苯乙烯罐中，并在架子上在室温下避光储存600天。
表XIV显示了一种含有0.3％艾地苯醌的水性乳膏(O/W)的定量配方。数量是针对于100克而言的。
用于定量活性成分的方法是UV-Vis分光光度测定法。
较近时间制备的乳膏(制备后一个月)和较早时间制备的乳膏(制备后20个月)的活性成分，在该测定方法中所观察到的差别是可以忽略不计的。可以推断出该乳膏可以被认为可以稳定至少600天(20个月)。
实施例14含有3％艾地苯醌的制剂的储藏期稳定性研究对具有相同组分的在不同日期制备的两种制剂的稳定性进行研究。将二者均制备成含有3％艾地苯醌的水性乳膏形式(O/W)。
将时间最长的待分析制剂包装于白色聚苯乙烯罐中，并在架子上在室温下避光储存600天。
表XIV显示了一种含有3％艾地苯醌的水性乳膏(O/W)的定量配方。数量是针对于100克而言的。
用于定量活性成分的方法是UV-Vis分光光度测定法。
较近时间制备的乳膏(制备后一个月)和较早时间制备的乳膏(制备后20个月)的活性成分，在该测定方法中所观察到的差别是可以忽略不计的。可以推断出该乳膏可以被认为可以稳定至少600天(20个月)。
权利要求
1.艾地苯醌在一种涂敷于皮肤上的组合物中的应用，其特征在于它用于抑制黑素生成。
2.按照权利要求1的艾地苯醌在一种涂敷于皮肤上的组合物中的应用，其特征在于它用于减轻皮肤着色或者使应用部位皮肤光亮。
3.按照权利要求1的艾地苯醌在一种涂敷于皮肤上的组合物中的应用，其特征在于它用于在应用部位产生皮肤脱色素作用。
4.按照权利要求1的艾地苯醌在一种涂敷于皮肤上的美容、药学和/或皮肤病学组合物中的应用，其特征在于它用于在皮肤疾病所致色素沉着部位产生皮肤脱色素作用。
5.按照权利要求4的艾地苯醌的应用，其特征在于这些皮肤疾病选自牛皮癣、酒渣鼻、光损伤的皮肤、特应性皮炎、药物后色素沉着过度、炎症后色素沉着过度、妊娠黄褐斑和皮脂溢性皮炎。
6.一种涂敷于皮肤上的美容、药学和/或皮肤病学组合物，其特征在于它含有艾地苯醌或其衍生物，而且其特征还在于艾地苯醌或其衍生物是有效量的，以产生皮肤脱色素作用。
7.一种按照权利要求6的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它含有艾地苯醌或其衍生物，而且其特征还在于艾地苯醌或其衍生物是有效量的，含量为0.1％-10％w/w。
8.一种按照权利要求6的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它含有艾地苯醌或其衍生物，而且其特征还在于艾地苯醌或其衍生物是有效量的，含量为0.3％-5％w/w。
9.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它为封闭贴剂形式。
10.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它为乳膏形式。
11.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它为凝胶形式。
12.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它为乳剂形式。
13.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它为气雾剂形式。
14.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于艾地苯醌为脂质体化的、络合的或者在一种控释系统中。
15.一种按照权利要求6或7的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它还含有油性成分和水溶性成分。
16.一种按照权利要求14的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它含有自乳化腊、凡士林、肉豆蔻酸异丙酯和十六烷醇。
17.一种按照权利要求14的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它含有甘油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
18.一种按照权利要求14的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它还含有对皮肤有益的药剂、防晒剂和/或滤光剂。
19.一种按照权利要求14的涂敷于皮肤上的组合物，其特征在于它还含有美容和/或药学上可接受的抗氧化剂。
20.一种治疗不良皮肤色素沉着的方法，其特征在于它包括在色素沉着部位涂敷一种组合物，该组合物含有有效脱色素剂量的艾地苯醌，使其作用一夜，并在早晨洗去。
全文摘要
本发明涉及艾地苯醌在一种局部应用组合物制备中的应用，该组合物用于抑制黑素生成、减轻皮肤着色或使皮肤光亮和/或产生皮肤脱色素作用。更特别的是，本发明涉及一种局部应用组合物，它含有一种美容、药学和/或皮肤病学上有效量的艾地苯醌、其衍生物或它们的混合物，其中含有有效量的艾地苯醌或其衍生物以产生皮肤脱色素作用。
文档编号A61P17/00GK1953742SQ200580003637
公开日2007年4月25日 申请日期2005年1月5日 优先权日2004年1月6日
发明者R·马丁拉古恩斯, M·加布里尔齐滕, D·J·伊利亚斯米尔森, I·赫沃伊卡巴维奇 申请人:利普泰股份公司, 克雷亚克迪瓦股份公司
最新回复(0)