从雷公藤多苷中分离雷公藤内酯醇化合物的方法
专利名称：从雷公藤多苷中分离雷公藤内酯醇化合物的方法
技术领域：
本发明涉及从雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii)中提取、分离和纯化雷公藤内酯醇(triptolide)和相关分子如雷公藤羟内酯(tripdiolide)和16-羟基雷公藤内酯醇的方法。
参考文献Z.Cheng et al.，“Research on extraction technologh of Tripterygium”，Chinese J.of Pharmaceuticals 21(10)435-436(1990).
S.M.Kupchan et al.，“Triptolide and tripdiolide，novel antileukemicditerpenoid triepoxides from Tripterygium wilfordii”，J.Am.Chem.Soc.94(20)7194-7195(1972).
S.M.Kupchan et al.，U.S.Patent No.4,005,108(1977).
P.E.Lipsky et al.，U.S.Patent No.5,580,562(Dec 1996).
K.Ren et al.，U.S.Appn，Pubn.No.20040018260(Jan 2004).
T.T.Wiedmann et al.，U.S.Patent No.5,843,452(Dec 1998).
C.P.Zhang et al.，“Studies on diterpenoids form leaves ofTripterygium wilfordii”，Acta Pharmaceutica Sinica 28(2)110-115(1993).
背景技术：
经证明，从中国药用植物雷公藤(TW)(Tripterygium wilfordii)衍生出的化合物具有有用的医疗价值，特别是具有免疫抑制活性和抗癌活性。这些化合物包括雷公藤内酯醇、雷公藤羟内酯和16-羟基雷公藤内酯醇。这些化合物的合成衍生物和前药也被证明具有医疗活性，并往往具有改进的药理学性质。例如，见美国专利Nos.5,468,772(tripterinin化合物及方法)、5,648,376(免疫抑制剂去萜烯化合物)、5,663,335(免疫抑制化合物及方法)、5,759,550(抑制异种移植物排斥的方法)、5,843,452(免疫治疗组合物和方法)、5,962,516(免疫抑制化合物及方法)、6,150,539(具有高水溶性的雷公藤内酯醇前药)、6,294,546(二萜三环氧化合物作为抗增生药物的用途)、6,537,984(二萜三环氧化合物作为抗增生药物的用途)、6,548,537(具有高水溶性的雷公藤内酯醇前药)、6,569,893(作为免疫分子和抗癌药物的雷公藤内酯醇化合物的氨基酸衍生物)、6,599,499(作为抗增生药物的二萜三环氧化合物)和6,620,843(利用雷公藤内酯醇前药进行的抗癌治疗)，这些文献在此通过引用并入本文。
这之前，从植物原料中分离天然化合物典型地需要费力的提取和纯化步骤。在Kupchan et al.(1972，1977)描述的方法中，将根原料用乙醇提取，将所得固态提取物溶解在乙酸乙酯中并用水分层，将乙酸乙酯部分进行硅胶层析。在Cheng et al.(1993)描述的方法中，第一次提取用热水，然后加入乙醇，过滤，然后除去乙醇，用氯仿分层，进行硅胶层析。Lipsky et al描述的方法(1996)采用氯仿、甲醇和甲苯相继提取，其中在每一次提取后都除去溶剂，然后先后在氧化铝和硅胶上进行色层析。Wiedmann et al.(1998)描述的方法中将根原料用回流的乙醇水溶液提取，所得固体提取物在二氯甲烷和水间分层，将二氯甲烷相浓缩并经硅胶层析。Ken et al.(2004)描述的方法中将所述的根用乙醇反复提取，所得提取物经浓缩并用氯仿反复提取，然后层析纯化。
在之前所述的分离方法中，经提取步骤提取后通常会得到仍然含有大量不需要的物质的提取物，这些物质必须经色层析除去，这就需要投入大量的时间和材料。鉴于这些化合物的医疗用途，急需更高效率的分离和纯化方法。
发明内容
本发明涉及从雷公藤多苷(TW)植物原料中分离雷公藤内酯醇及其相关化合物如雷公藤羟内酯和16-羟基雷公藤内酯醇的改进方法。根据所述方法，先形成含有这些化合物的雷公藤多苷植物原料的提取物，然后进行纯化。提出物的初始形成是通过(a)用乙醇水溶液提取TW植物原料，优选为根原料，并浓缩得到残余物；和(b)在有机溶剂中形成这个残余物的浆状物，所述有机溶剂优选为氯化烃溶剂，如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物；
用水将所述浆状物分层约10分钟-10小时；然后除去水。
典型地，步骤(a)的提取包括用回流乙醇进行的三次提取，每一次优选每克植物原料用4-5ml乙醇，然后将提取物和并；相对于残余物的体积，步骤(b)形成的浆状物包括8-12体积的有机溶剂；相对于浆状物的体积，步骤(b)的分层使用1/2到2体积的水。
接下来进行的纯化包括的步骤为进一步用碱的水溶液分层浆状物，除去碱的水溶液，并从浆状物中除去有机溶剂的至少一部分；用亲脂性溶剂洗涤残余物；和从硅胶吸附剂上洗脱残余物。
在一个实施方案中，该纯化在上述步骤(a)和步骤(b)之后还包括(c)用碱的水溶液分层浆状物，然后除去水溶液，然后再除去有机溶剂，得到另一残余物；(d)用烃溶剂洗涤所得的另一残余物，得到固体产物；和(e)用硅胶层析纯化所得固体产物。
在另一个实施方案中，所述纯化在上述步骤(a)和(b)之后还包括(c)用碱的水溶液分层残余物的浆状物，除去水溶液，并除去有机溶剂的一部分，得到浓缩的浆状物；(d)向浓缩的浆状物中加入硅胶，加入的量为可有效吸收雷公藤内酯醇和其相关化合物；(e)用烃溶剂洗涤残余物和硅胶；和(f)从硅胶上洗脱雷公藤内酯醇和其相关化合物。
在另一个实施方案中，在上述步骤(a)和(b)之后还包括(c)从残余物的浆状物中除去有机溶剂；(d)用烃溶剂洗涤残余物；(e)在有机溶剂中形成另一经洗涤的残余物的浆状物，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物；(f)用碱的水溶液分层所述另一浆状物，然后除去水溶液，然后除去有机溶剂，就得到固态产物；和(g)用硅胶色层析纯化所得固态产物。
在所述碱的水溶液中，所述的碱优选为带有平衡离子(counterion)的水溶性氢氧化物、碳酸盐或重碳酸盐，所述平衡离子选自锂、钠、钾、铯、铵或四烷基铵，其中所述烷基优选为C1-C4烷基。合适的碱包括如NaOH、KOH、NaHCO3、KHCO3、Na2CO3或K2CO3。相应地，所述溶液可选自0.1N-2.5N的NaOH水溶液、0.1N-2.5N的KOH水溶液、10％-15％NaHCO3水溶液或12％-18％KHCO3水溶液。碱分层通常要在经过一段时间(如，5-20分钟，典型地为约10分钟)的搅拌后进行约2天。任选地，在除去碱的水溶液之后，在除去所有或部分有机溶剂之前，将所述的有机溶剂用稀释的酸性水溶液洗涤。
所述的亲脂性溶剂优选为烃溶剂，所述的烃溶剂选自具有5-7个碳原子的直链、支链或环状烃，或它们的混合物；例子包括己烷和环己烷。在一个实施方案中，所述的烃溶剂为己烷。硅胶色层析优选使用含有非极性溶剂如己烷的流动相，并与另外的极性溶剂如乙酸乙酯结合。
发明详述I.综述本发明涉及纯化含有雷公藤内酯醇及其相关化合物如雷公藤羟内酯和/或16-羟基雷公藤内酯醇的雷公藤多苷植物原料提取物的方法，及分离这些化合物的方法。其它有用的化合物如雷公藤内酯三醇、雷公藤氯内酯醇和雷公藤内酯酮也可被分离出来。
如下面要进一步进行说明的那样，所述方法包括用碱的水溶液处理初始有机提取物，该处理会在整个过程的开始阶段除去大量的不纯物质，从而提高产率并减少生产成本。碱处理可有效地从有机TW提取物中除去酸或弱酸化合物(如雷公藤红素、雷藤萜甲A、雷藤萜甲G、3-羟基齐墩果酸、polpunonic酸、tripterygic酸A和酚类化合物如雷酚萜、山海棠素、雷酚内酯和triptonodial)。碱处理也能通过皂化和/或水解从提取物中除去“油性”不纯物。这一步骤已经被证明能从提取物中除去不纯物质的约70％，包括油性物质，该物质的去除在现有技术中会典型地造成后续纯化成本的大量消耗。
本发明的方法也包括用亲脂溶剂提取的步骤，所述亲脂溶剂如环己烷或类似的烃基溶剂，如己烷、戊烷、石油醚，等等，以从提取物中除去极性较小的不纯物。这一步骤进一步简化了其后色层析纯化步骤，否则通过该步骤除去的物质要专门经层析除去。
II.提取步骤雷公藤多苷(TW)提取物最初是通过以下步骤形成的(i)用乙醇水溶液提取经磨碎的、剁碎的或精细切割的TW植物原料，浓缩所得的液体提取物就得到残余物；(ii)形成该残余物在有机溶剂中的浆状物，所述有机溶剂优选为氯化烃溶剂，典型地选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物；(iii)用水分层所得的浆状物约10分钟到10小时；和(iv)从浆状物中除去水。
所述的植物原料包括雷公藤多苷的根、茎和叶；优选地，使用根原料。TW植物来自中国的福建省或其它南方省市。TW植物原料通常可在中国境内获得，或可在美国通过商业渠道获得。
优选地，乙醇提取(i)包括用回流乙醇进行的三次提取，每一次对每克植物原料用4-5ml乙醇，然后将提取物合并。步骤(ii)中使用的有机溶剂(典型地为氯仿或二氯甲烷)的量通常为步骤(i)所得残余物体积的8-12倍。分层步骤(iii)通常使用相对于浆状物体积1/2到2体积的水。
此处使用的两种不相溶液体混合物的“分层”通常指短时间的搅拌，如约10-30分钟，更优选为10-15分钟，然后将所述混合物放置一段时间，典型地为几小时到几天。在这种情况下，将有机浆状物和水首先搅拌在一起，即搅拌约10分钟，然后放置约10分钟-10小时，优选约2小时。
III.纯化步骤根据本发明所述的方法，其中用碱的水溶液来分层从上述步骤(iv)得到的浆状物。在这个过程中，将浆状物和溶液先搅拌在一起，即搅拌约10分钟，然后放置一段约10分钟-10天，优选约1-4天，更优选约2天。所述的碱优选为氢氧化物、带有平衡离子的碳酸盐或重碳酸盐，所述平衡离子选自锂、钠、钾、铯或铵。合适的碱包括如NaOH、KOH、NaHCO3、KHCO3、Na2CO3和K2CO3。在优选的实施方案中，所述碱溶液选自0.1N-2.5N的NaOH水溶液、0.1N-2.5N的KOH水溶液、10％-15％NaHCO3水溶液或12％-18％KHCO3水溶液。
除去碱的水溶液，然后任选地用稀释的酸水溶液如1％HCl洗涤有机溶剂。这样就将有机溶剂的至少一部分从浆状物中除去。
然后将所得的可能基本为固体或经浓缩的浆状物的残余物用亲脂溶剂洗涤，随后从硅胶吸附剂中洗脱。优选地，所述亲脂溶剂为烃溶剂，优选为饱和烃，选自具有5-7个碳原子的直链、支链或环烃，或它们的混合物。在一个实施方案中，溶剂为环己烷。
需要注意的是步骤中的一些变化中(如下所述)，纯化过程中某些处理步骤的顺序可以改变。
从硅胶吸附剂中洗脱时优选使用含有非极性溶剂的溶剂混合物或流动相，所述非极性溶剂如烃、烷基醚，或它们的混合物，该非极性溶剂与另外的极性溶剂结合使用，所述极性溶剂如酯或酮溶剂。所述的非极性溶剂包括如己烷、环己烷、石油醚，或THF。所述的极性溶剂包括如乙酸乙酯、丙酮，或甲基乙基酮(MEK)。在一个实施方案中，溶剂混合物包括环己烷和乙酸乙酯。也可以根据已知的方法采用溶剂梯度。
IV.纯化步骤中的变化在一个实施方案中，除去碱的水溶液后，将几乎所有的有机溶剂都从浆状物中除去，就得到了固体或基本为固体的残余物。接着用亲脂溶剂洗涤该残余物就得到固体产物，该固体产物然后经硅胶层析纯化，如上所述。
在另一个实施方案中，除去碱的水溶液后，仅将有机溶剂的一部分从浆状物中除去，就得到了浓缩的浆状物。接着向浓缩的浆状物中加入硅胶，加入的量可有效吸收雷公藤内酯醇及其相关化合物(如，雷公藤羟内酯和/或16-羟基雷公藤内酯醇)。然后将所得的混合物用亲脂溶剂洗涤，并使雷公藤内酯醇及其相关化合物从硅胶上洗脱下来。
在另一个实施方案中，用亲脂溶剂提取这一步骤可在碱处理之前进行。相应地，在用碱分层之前，将有机溶剂从上述步骤(iv)得到的浆状物中除去，所得残余物用亲脂溶剂洗涤。然后再在一种有机溶剂中形成经洗涤的残余物的另外的浆状物，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物，然后如上所述将这个浆状物用碱的水溶液分层10分钟到10天，优选为约2天。将碱的水溶液除去，将几乎所有的有机溶剂除去，就得到基本为固体的残余物，然后经层析纯化。
V.示例性步骤下面是根据本发明实施方案进行的示例性分离步骤。该步骤是用于说明本发明而不是限制本发明。
A.提取1.将干燥的TW生物质(biomass)磨碎成小块(对于根心和茎来说为1×0.1cm-5×0.5cm(长×直径)；对于根皮来说尺寸为0.1-2.0cm(薄片状))。将磨碎的TW生物质用50-95％(优选90％)乙醇回流2-5(优选3)小时，2-5(优选为3)次，对于第一次提取，固体/乙醇的重量/体积比率为1∶4-6(优选为1∶5)，而对于接下来的提取，该比率可为1∶3-5(优选为1∶4)。
2.将提取物合并，然后减压下除去乙醇，得到黑色浆状物。
B.分离(包括碱处理和烃提取)1.将浆状物悬浮在8-12，优选10体积氯仿或二氯乙烷中；2.向悬浮液中以1/2-2体积，优选1/2体积的量加入水。将混合物搅拌10分钟，并放置1-10小时，优选为2小时。
3.将水层除去，将1/2-1体积，优选1/2体积的0.1-2.5N，优选0.5N的NaOH或KOH溶液，或10-15％NaHCO3加入到有机相中。将所得混合物轻微搅拌10分钟，然后放置1-10天，优选4-天，使层分开。
4.除去水相。
5.向有机相中以1/4-1体积，优选1/4体积的量加入水。将所得混合物搅拌约10分钟，放置1-3小时。任选地，所得混合物可在该阶段用1％HCl洗涤两次。
6.将水相除去，向有机相中加入干燥剂如Na2SO4或MgSO4(3g/100ml)。将混合物搅拌过滤除去干燥剂。
7.减压下彻底除去有机溶剂。
8.向所得的固体中加入环己烷，搅拌混合物一定时间如10分钟，以使固体悬浮。
9.通过过滤除去固体，在40-60℃下减压干燥得到黄色粉末状中间产物。
C.进一步纯化(硅胶层析)1.将所得粉末溶解在1∶1环己烷∶乙酸乙酯中，浓度为0.5-1.0g/mL，优选为0.75g/mL。
2.将溶解的物质装在预先装备好的硅胶柱上(200-300目，100×1-20cm)，每1-3g，优选每2g粉末状中间物使用约100g硅胶。
3.使用相同的溶剂混合物以10-30ml/hr的流动速度洗脱产物，优选为18ml/小时。收集富含雷公藤内酯醇的组分，用TLC或HPLC检测。
4.合并富含雷公藤内酯醇的组分，除去溶剂。
典型地，通过调整温度和/或溶剂(如丙酮或乙酸乙酯)，将雷公藤内酯醇和/或相关化合物从所得的产物中结晶。任选地，将柱层析和/或结晶重复进行。
权利要求
1.一种纯化含有雷公藤内酯醇及其相关化合物的雷公藤多苷植物原料的提取物的方法，其中所述提取物是通过下述步骤形成的(a)用乙醇水溶液提取植物原料，并浓缩得到残余物；和(b)在氯化有机溶剂中形成所述残余物的浆状物；用水将所述浆状物分层约10分钟-10小时；然后除去水；且所述的纯化包括的步骤为进一步用碱的水溶液分层浆状物，从浆状物中除去碱的水溶液，和所述有机溶剂的至少一部分；用亲脂溶剂洗涤残余物；和从硅胶吸附剂洗脱所得的残余物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括下述步骤(c)用碱的水溶液分层所述浆状物，然后除去水溶液，接着除去有机溶剂，得到另一残余物；(d)用烃溶剂洗涤所述的另一残余物，得到固体产物；和(e)通过硅胶层析纯化所得的固体产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中将含有环己烷和乙酸乙酯的流动相用于所述硅胶层析中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的纯化包括以下步骤(c)用碱的水溶液分层所述浆状物，除去水溶液，除去有机溶剂的一部分，得到浓缩的浆状物；(d)向所述的浓缩的浆状物中加入硅胶，加入的量为能有效地吸收雷公藤内酯醇和相关化合物；(e)用烃溶剂洗涤残余物和硅胶；和(f)从硅胶中洗脱雷公藤内酯醇及相关化合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的纯化包括以下步骤(c)从残余物的浆状物中除去有机溶剂；(d)用烃溶剂洗涤残余物；(e)在一种有机溶剂中形成经洗涤的残余物的另一浆状物，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物；(f)用碱的水溶液分层所述另一浆状物，然后除去水溶液，然后除去有机溶剂，得到固态产物；和(g)用硅胶层析纯化所得固态产物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的提取包括用回流乙醇进行三次提取，其中，每次每克植物原料用4-5mL乙醇，然后合并提取物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述氯化有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)形成的浆状物包括相对于残余物8-12体积的有机溶剂，且步骤(b)的分层使用相对于浆状物1/2到2体积的水。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的碱为带有平衡离子的水溶性氢氧化物、碳酸盐或重碳酸盐，所述平衡离子选自锂、钠、钾铯、铵或四烷基铵。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的碱选自NaOH、KOH、NaHCO3、KHCO3、Na2CO3或K2CO3。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述碱的水溶液选自0.1N-2.5N的NaOH水溶液、0.1N-2.5N的KOH水溶液、10％-15％NaHCO3水溶液或12％-18％KHCO3水溶液。
12.根据权利要求1所述的方法，其中用碱的水溶液进行的分层进行了约2天。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在除去碱的水溶液之后，在除去有机溶剂至少一部分之前，用稀释的酸性水溶液洗涤所述有机溶剂。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的烃溶剂选自含有5-7个碳原子的直链、支链或环烃，或它们的混合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述烃溶剂为环己烷。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述的植物原料包括根原料。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述的相关化合物包括雷公藤羟内酯和/或16-羟基雷公藤内酯醇。
全文摘要
本发明涉及从雷公藤多苷中提取、分离和纯化具有医疗用途的化合物的方法。经证明，分别使用碱的水溶液和烃溶剂的提取步骤可提高该方法的效率，并减少了必须经层析除去的物质的量。
文档编号A61K36/36GK1917893SQ200580004463
公开日2007年2月21日 申请日期2005年2月7日 优先权日2004年2月9日
发明者J·安, R·徐, J·H·马瑟 申请人:美国泛华医药公司
技术领域：
本发明涉及从雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii)中提取、分离和纯化雷公藤内酯醇(triptolide)和相关分子如雷公藤羟内酯(tripdiolide)和16-羟基雷公藤内酯醇的方法。
参考文献Z.Cheng et al.，“Research on extraction technologh of Tripterygium”，Chinese J.of Pharmaceuticals 21(10)435-436(1990).
S.M.Kupchan et al.，“Triptolide and tripdiolide，novel antileukemicditerpenoid triepoxides from Tripterygium wilfordii”，J.Am.Chem.Soc.94(20)7194-7195(1972).
S.M.Kupchan et al.，U.S.Patent No.4,005,108(1977).
P.E.Lipsky et al.，U.S.Patent No.5,580,562(Dec 1996).
K.Ren et al.，U.S.Appn，Pubn.No.20040018260(Jan 2004).
T.T.Wiedmann et al.，U.S.Patent No.5,843,452(Dec 1998).
C.P.Zhang et al.，“Studies on diterpenoids form leaves ofTripterygium wilfordii”，Acta Pharmaceutica Sinica 28(2)110-115(1993).
背景技术：
经证明，从中国药用植物雷公藤(TW)(Tripterygium wilfordii)衍生出的化合物具有有用的医疗价值，特别是具有免疫抑制活性和抗癌活性。这些化合物包括雷公藤内酯醇、雷公藤羟内酯和16-羟基雷公藤内酯醇。这些化合物的合成衍生物和前药也被证明具有医疗活性，并往往具有改进的药理学性质。例如，见美国专利Nos.5,468,772(tripterinin化合物及方法)、5,648,376(免疫抑制剂去萜烯化合物)、5,663,335(免疫抑制化合物及方法)、5,759,550(抑制异种移植物排斥的方法)、5,843,452(免疫治疗组合物和方法)、5,962,516(免疫抑制化合物及方法)、6,150,539(具有高水溶性的雷公藤内酯醇前药)、6,294,546(二萜三环氧化合物作为抗增生药物的用途)、6,537,984(二萜三环氧化合物作为抗增生药物的用途)、6,548,537(具有高水溶性的雷公藤内酯醇前药)、6,569,893(作为免疫分子和抗癌药物的雷公藤内酯醇化合物的氨基酸衍生物)、6,599,499(作为抗增生药物的二萜三环氧化合物)和6,620,843(利用雷公藤内酯醇前药进行的抗癌治疗)，这些文献在此通过引用并入本文。
这之前，从植物原料中分离天然化合物典型地需要费力的提取和纯化步骤。在Kupchan et al.(1972，1977)描述的方法中，将根原料用乙醇提取，将所得固态提取物溶解在乙酸乙酯中并用水分层，将乙酸乙酯部分进行硅胶层析。在Cheng et al.(1993)描述的方法中，第一次提取用热水，然后加入乙醇，过滤，然后除去乙醇，用氯仿分层，进行硅胶层析。Lipsky et al描述的方法(1996)采用氯仿、甲醇和甲苯相继提取，其中在每一次提取后都除去溶剂，然后先后在氧化铝和硅胶上进行色层析。Wiedmann et al.(1998)描述的方法中将根原料用回流的乙醇水溶液提取，所得固体提取物在二氯甲烷和水间分层，将二氯甲烷相浓缩并经硅胶层析。Ken et al.(2004)描述的方法中将所述的根用乙醇反复提取，所得提取物经浓缩并用氯仿反复提取，然后层析纯化。
在之前所述的分离方法中，经提取步骤提取后通常会得到仍然含有大量不需要的物质的提取物，这些物质必须经色层析除去，这就需要投入大量的时间和材料。鉴于这些化合物的医疗用途，急需更高效率的分离和纯化方法。
发明内容
本发明涉及从雷公藤多苷(TW)植物原料中分离雷公藤内酯醇及其相关化合物如雷公藤羟内酯和16-羟基雷公藤内酯醇的改进方法。根据所述方法，先形成含有这些化合物的雷公藤多苷植物原料的提取物，然后进行纯化。提出物的初始形成是通过(a)用乙醇水溶液提取TW植物原料，优选为根原料，并浓缩得到残余物；和(b)在有机溶剂中形成这个残余物的浆状物，所述有机溶剂优选为氯化烃溶剂，如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物；
用水将所述浆状物分层约10分钟-10小时；然后除去水。
典型地，步骤(a)的提取包括用回流乙醇进行的三次提取，每一次优选每克植物原料用4-5ml乙醇，然后将提取物和并；相对于残余物的体积，步骤(b)形成的浆状物包括8-12体积的有机溶剂；相对于浆状物的体积，步骤(b)的分层使用1/2到2体积的水。
接下来进行的纯化包括的步骤为进一步用碱的水溶液分层浆状物，除去碱的水溶液，并从浆状物中除去有机溶剂的至少一部分；用亲脂性溶剂洗涤残余物；和从硅胶吸附剂上洗脱残余物。
在一个实施方案中，该纯化在上述步骤(a)和步骤(b)之后还包括(c)用碱的水溶液分层浆状物，然后除去水溶液，然后再除去有机溶剂，得到另一残余物；(d)用烃溶剂洗涤所得的另一残余物，得到固体产物；和(e)用硅胶层析纯化所得固体产物。
在另一个实施方案中，所述纯化在上述步骤(a)和(b)之后还包括(c)用碱的水溶液分层残余物的浆状物，除去水溶液，并除去有机溶剂的一部分，得到浓缩的浆状物；(d)向浓缩的浆状物中加入硅胶，加入的量为可有效吸收雷公藤内酯醇和其相关化合物；(e)用烃溶剂洗涤残余物和硅胶；和(f)从硅胶上洗脱雷公藤内酯醇和其相关化合物。
在另一个实施方案中，在上述步骤(a)和(b)之后还包括(c)从残余物的浆状物中除去有机溶剂；(d)用烃溶剂洗涤残余物；(e)在有机溶剂中形成另一经洗涤的残余物的浆状物，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物；(f)用碱的水溶液分层所述另一浆状物，然后除去水溶液，然后除去有机溶剂，就得到固态产物；和(g)用硅胶色层析纯化所得固态产物。
在所述碱的水溶液中，所述的碱优选为带有平衡离子(counterion)的水溶性氢氧化物、碳酸盐或重碳酸盐，所述平衡离子选自锂、钠、钾、铯、铵或四烷基铵，其中所述烷基优选为C1-C4烷基。合适的碱包括如NaOH、KOH、NaHCO3、KHCO3、Na2CO3或K2CO3。相应地，所述溶液可选自0.1N-2.5N的NaOH水溶液、0.1N-2.5N的KOH水溶液、10％-15％NaHCO3水溶液或12％-18％KHCO3水溶液。碱分层通常要在经过一段时间(如，5-20分钟，典型地为约10分钟)的搅拌后进行约2天。任选地，在除去碱的水溶液之后，在除去所有或部分有机溶剂之前，将所述的有机溶剂用稀释的酸性水溶液洗涤。
所述的亲脂性溶剂优选为烃溶剂，所述的烃溶剂选自具有5-7个碳原子的直链、支链或环状烃，或它们的混合物；例子包括己烷和环己烷。在一个实施方案中，所述的烃溶剂为己烷。硅胶色层析优选使用含有非极性溶剂如己烷的流动相，并与另外的极性溶剂如乙酸乙酯结合。
发明详述I.综述本发明涉及纯化含有雷公藤内酯醇及其相关化合物如雷公藤羟内酯和/或16-羟基雷公藤内酯醇的雷公藤多苷植物原料提取物的方法，及分离这些化合物的方法。其它有用的化合物如雷公藤内酯三醇、雷公藤氯内酯醇和雷公藤内酯酮也可被分离出来。
如下面要进一步进行说明的那样，所述方法包括用碱的水溶液处理初始有机提取物，该处理会在整个过程的开始阶段除去大量的不纯物质，从而提高产率并减少生产成本。碱处理可有效地从有机TW提取物中除去酸或弱酸化合物(如雷公藤红素、雷藤萜甲A、雷藤萜甲G、3-羟基齐墩果酸、polpunonic酸、tripterygic酸A和酚类化合物如雷酚萜、山海棠素、雷酚内酯和triptonodial)。碱处理也能通过皂化和/或水解从提取物中除去“油性”不纯物。这一步骤已经被证明能从提取物中除去不纯物质的约70％，包括油性物质，该物质的去除在现有技术中会典型地造成后续纯化成本的大量消耗。
本发明的方法也包括用亲脂溶剂提取的步骤，所述亲脂溶剂如环己烷或类似的烃基溶剂，如己烷、戊烷、石油醚，等等，以从提取物中除去极性较小的不纯物。这一步骤进一步简化了其后色层析纯化步骤，否则通过该步骤除去的物质要专门经层析除去。
II.提取步骤雷公藤多苷(TW)提取物最初是通过以下步骤形成的(i)用乙醇水溶液提取经磨碎的、剁碎的或精细切割的TW植物原料，浓缩所得的液体提取物就得到残余物；(ii)形成该残余物在有机溶剂中的浆状物，所述有机溶剂优选为氯化烃溶剂，典型地选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物；(iii)用水分层所得的浆状物约10分钟到10小时；和(iv)从浆状物中除去水。
所述的植物原料包括雷公藤多苷的根、茎和叶；优选地，使用根原料。TW植物来自中国的福建省或其它南方省市。TW植物原料通常可在中国境内获得，或可在美国通过商业渠道获得。
优选地，乙醇提取(i)包括用回流乙醇进行的三次提取，每一次对每克植物原料用4-5ml乙醇，然后将提取物合并。步骤(ii)中使用的有机溶剂(典型地为氯仿或二氯甲烷)的量通常为步骤(i)所得残余物体积的8-12倍。分层步骤(iii)通常使用相对于浆状物体积1/2到2体积的水。
此处使用的两种不相溶液体混合物的“分层”通常指短时间的搅拌，如约10-30分钟，更优选为10-15分钟，然后将所述混合物放置一段时间，典型地为几小时到几天。在这种情况下，将有机浆状物和水首先搅拌在一起，即搅拌约10分钟，然后放置约10分钟-10小时，优选约2小时。
III.纯化步骤根据本发明所述的方法，其中用碱的水溶液来分层从上述步骤(iv)得到的浆状物。在这个过程中，将浆状物和溶液先搅拌在一起，即搅拌约10分钟，然后放置一段约10分钟-10天，优选约1-4天，更优选约2天。所述的碱优选为氢氧化物、带有平衡离子的碳酸盐或重碳酸盐，所述平衡离子选自锂、钠、钾、铯或铵。合适的碱包括如NaOH、KOH、NaHCO3、KHCO3、Na2CO3和K2CO3。在优选的实施方案中，所述碱溶液选自0.1N-2.5N的NaOH水溶液、0.1N-2.5N的KOH水溶液、10％-15％NaHCO3水溶液或12％-18％KHCO3水溶液。
除去碱的水溶液，然后任选地用稀释的酸水溶液如1％HCl洗涤有机溶剂。这样就将有机溶剂的至少一部分从浆状物中除去。
然后将所得的可能基本为固体或经浓缩的浆状物的残余物用亲脂溶剂洗涤，随后从硅胶吸附剂中洗脱。优选地，所述亲脂溶剂为烃溶剂，优选为饱和烃，选自具有5-7个碳原子的直链、支链或环烃，或它们的混合物。在一个实施方案中，溶剂为环己烷。
需要注意的是步骤中的一些变化中(如下所述)，纯化过程中某些处理步骤的顺序可以改变。
从硅胶吸附剂中洗脱时优选使用含有非极性溶剂的溶剂混合物或流动相，所述非极性溶剂如烃、烷基醚，或它们的混合物，该非极性溶剂与另外的极性溶剂结合使用，所述极性溶剂如酯或酮溶剂。所述的非极性溶剂包括如己烷、环己烷、石油醚，或THF。所述的极性溶剂包括如乙酸乙酯、丙酮，或甲基乙基酮(MEK)。在一个实施方案中，溶剂混合物包括环己烷和乙酸乙酯。也可以根据已知的方法采用溶剂梯度。
IV.纯化步骤中的变化在一个实施方案中，除去碱的水溶液后，将几乎所有的有机溶剂都从浆状物中除去，就得到了固体或基本为固体的残余物。接着用亲脂溶剂洗涤该残余物就得到固体产物，该固体产物然后经硅胶层析纯化，如上所述。
在另一个实施方案中，除去碱的水溶液后，仅将有机溶剂的一部分从浆状物中除去，就得到了浓缩的浆状物。接着向浓缩的浆状物中加入硅胶，加入的量可有效吸收雷公藤内酯醇及其相关化合物(如，雷公藤羟内酯和/或16-羟基雷公藤内酯醇)。然后将所得的混合物用亲脂溶剂洗涤，并使雷公藤内酯醇及其相关化合物从硅胶上洗脱下来。
在另一个实施方案中，用亲脂溶剂提取这一步骤可在碱处理之前进行。相应地，在用碱分层之前，将有机溶剂从上述步骤(iv)得到的浆状物中除去，所得残余物用亲脂溶剂洗涤。然后再在一种有机溶剂中形成经洗涤的残余物的另外的浆状物，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物，然后如上所述将这个浆状物用碱的水溶液分层10分钟到10天，优选为约2天。将碱的水溶液除去，将几乎所有的有机溶剂除去，就得到基本为固体的残余物，然后经层析纯化。
V.示例性步骤下面是根据本发明实施方案进行的示例性分离步骤。该步骤是用于说明本发明而不是限制本发明。
A.提取1.将干燥的TW生物质(biomass)磨碎成小块(对于根心和茎来说为1×0.1cm-5×0.5cm(长×直径)；对于根皮来说尺寸为0.1-2.0cm(薄片状))。将磨碎的TW生物质用50-95％(优选90％)乙醇回流2-5(优选3)小时，2-5(优选为3)次，对于第一次提取，固体/乙醇的重量/体积比率为1∶4-6(优选为1∶5)，而对于接下来的提取，该比率可为1∶3-5(优选为1∶4)。
2.将提取物合并，然后减压下除去乙醇，得到黑色浆状物。
B.分离(包括碱处理和烃提取)1.将浆状物悬浮在8-12，优选10体积氯仿或二氯乙烷中；2.向悬浮液中以1/2-2体积，优选1/2体积的量加入水。将混合物搅拌10分钟，并放置1-10小时，优选为2小时。
3.将水层除去，将1/2-1体积，优选1/2体积的0.1-2.5N，优选0.5N的NaOH或KOH溶液，或10-15％NaHCO3加入到有机相中。将所得混合物轻微搅拌10分钟，然后放置1-10天，优选4-天，使层分开。
4.除去水相。
5.向有机相中以1/4-1体积，优选1/4体积的量加入水。将所得混合物搅拌约10分钟，放置1-3小时。任选地，所得混合物可在该阶段用1％HCl洗涤两次。
6.将水相除去，向有机相中加入干燥剂如Na2SO4或MgSO4(3g/100ml)。将混合物搅拌过滤除去干燥剂。
7.减压下彻底除去有机溶剂。
8.向所得的固体中加入环己烷，搅拌混合物一定时间如10分钟，以使固体悬浮。
9.通过过滤除去固体，在40-60℃下减压干燥得到黄色粉末状中间产物。
C.进一步纯化(硅胶层析)1.将所得粉末溶解在1∶1环己烷∶乙酸乙酯中，浓度为0.5-1.0g/mL，优选为0.75g/mL。
2.将溶解的物质装在预先装备好的硅胶柱上(200-300目，100×1-20cm)，每1-3g，优选每2g粉末状中间物使用约100g硅胶。
3.使用相同的溶剂混合物以10-30ml/hr的流动速度洗脱产物，优选为18ml/小时。收集富含雷公藤内酯醇的组分，用TLC或HPLC检测。
4.合并富含雷公藤内酯醇的组分，除去溶剂。
典型地，通过调整温度和/或溶剂(如丙酮或乙酸乙酯)，将雷公藤内酯醇和/或相关化合物从所得的产物中结晶。任选地，将柱层析和/或结晶重复进行。
权利要求
1.一种纯化含有雷公藤内酯醇及其相关化合物的雷公藤多苷植物原料的提取物的方法，其中所述提取物是通过下述步骤形成的(a)用乙醇水溶液提取植物原料，并浓缩得到残余物；和(b)在氯化有机溶剂中形成所述残余物的浆状物；用水将所述浆状物分层约10分钟-10小时；然后除去水；且所述的纯化包括的步骤为进一步用碱的水溶液分层浆状物，从浆状物中除去碱的水溶液，和所述有机溶剂的至少一部分；用亲脂溶剂洗涤残余物；和从硅胶吸附剂洗脱所得的残余物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括下述步骤(c)用碱的水溶液分层所述浆状物，然后除去水溶液，接着除去有机溶剂，得到另一残余物；(d)用烃溶剂洗涤所述的另一残余物，得到固体产物；和(e)通过硅胶层析纯化所得的固体产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中将含有环己烷和乙酸乙酯的流动相用于所述硅胶层析中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的纯化包括以下步骤(c)用碱的水溶液分层所述浆状物，除去水溶液，除去有机溶剂的一部分，得到浓缩的浆状物；(d)向所述的浓缩的浆状物中加入硅胶，加入的量为能有效地吸收雷公藤内酯醇和相关化合物；(e)用烃溶剂洗涤残余物和硅胶；和(f)从硅胶中洗脱雷公藤内酯醇及相关化合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的纯化包括以下步骤(c)从残余物的浆状物中除去有机溶剂；(d)用烃溶剂洗涤残余物；(e)在一种有机溶剂中形成经洗涤的残余物的另一浆状物，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物；(f)用碱的水溶液分层所述另一浆状物，然后除去水溶液，然后除去有机溶剂，得到固态产物；和(g)用硅胶层析纯化所得固态产物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的提取包括用回流乙醇进行三次提取，其中，每次每克植物原料用4-5mL乙醇，然后合并提取物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述氯化有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它们的混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)形成的浆状物包括相对于残余物8-12体积的有机溶剂，且步骤(b)的分层使用相对于浆状物1/2到2体积的水。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的碱为带有平衡离子的水溶性氢氧化物、碳酸盐或重碳酸盐，所述平衡离子选自锂、钠、钾铯、铵或四烷基铵。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的碱选自NaOH、KOH、NaHCO3、KHCO3、Na2CO3或K2CO3。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述碱的水溶液选自0.1N-2.5N的NaOH水溶液、0.1N-2.5N的KOH水溶液、10％-15％NaHCO3水溶液或12％-18％KHCO3水溶液。
12.根据权利要求1所述的方法，其中用碱的水溶液进行的分层进行了约2天。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在除去碱的水溶液之后，在除去有机溶剂至少一部分之前，用稀释的酸性水溶液洗涤所述有机溶剂。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的烃溶剂选自含有5-7个碳原子的直链、支链或环烃，或它们的混合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述烃溶剂为环己烷。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述的植物原料包括根原料。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述的相关化合物包括雷公藤羟内酯和/或16-羟基雷公藤内酯醇。
全文摘要
本发明涉及从雷公藤多苷中提取、分离和纯化具有医疗用途的化合物的方法。经证明，分别使用碱的水溶液和烃溶剂的提取步骤可提高该方法的效率，并减少了必须经层析除去的物质的量。
文档编号A61K36/36GK1917893SQ200580004463
公开日2007年2月21日 申请日期2005年2月7日 优先权日2004年2月9日
发明者J·安, R·徐, J·H·马瑟 申请人:美国泛华医药公司
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