抗－egfr抗体的高浓缩液体制剂的制作方法
专利名称：抗－egfr抗体的高浓缩液体制剂的制作方法
背景技术：
本发明涉及用于通过超滤制备高浓缩液体制剂的方法，所述的液体制剂含有至少一种抗-EGFR抗体和/或其变体和/或片段中的一种，特别是抗EGF受体的单克隆抗体，特别优选Mab C225(西妥昔单抗(cetuximab))和Mab h425(EMD72000)。此外本发明涉及抗-EGFR抗体，特别是抗EGF受体的单克隆抗体，特别优选Mab C225(西妥昔单抗)和Mabh425(EMD72000)和/或其变体和/或片段的高浓缩液体制剂，其特征在于高浓缩液体制剂具有10-250，优选50-180mg/ml，特别优选100-150mg/ml的抗-EGFR抗体含量，并且涉及其用途。
生物技术领域的发展使得在过去十年期间可以通过重组DNA技术制备用于药学应用的一系列蛋白质。蛋白质药物如单克隆抗体用于如肿瘤治疗，例如用于特异性免疫治疗或肿瘤接种。治疗性蛋白质比常规有机和无机活性成分更大而且更复杂，并且它们具有复杂的三维结构和许多官能团，其影响蛋白质的生物学活性或者备选地可以引起不希望的效应。在制备、保存和运输过程中，蛋白质药物暴露于许多外界影响，这些影响对蛋白质活性成分具有减弱稳定性的作用。因此，有必要精确地研究特异性降解反应发生的原因和机制，以便能够稳定蛋白质，例如通过添加某些稳定性辅助剂(见，如Manning M.C.，Patel K.，&Borchardt R.T.(1989)Stability ofprotein pharmaceuticals.Pharm.Res.6，903-918)。
文献中公开了治疗性蛋白质的许多制剂。但是，对于各种蛋白质活性成分的药物制剂的组合物的要求是很不同的，并且通常，由于不同蛋白质的特定理化性质和降解反应，将已确定的蛋白质配方应用于新的蛋白质活性成分是不可能的。因此，这些新的活性成分的适当药物制剂仍然是一个主要的挑战。
虽然在目前的文献中将超滤作为重组蛋白质纯化的下游处理中的标准方法来描述(Taylor和Francis(2000)Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins，London，p.1-212；McPherson A.(1989)Separation Methods，Preparation and Analysis of ProteinCrystalsNew York，Robert E.Krieger Publishing Co，Inc，p.1-51)，然而有利的高浓度未能在下游处理中获得。另外，由于随后的纯化和层析步骤，获得的处理溶液可再次发生稀释。
虽然US 6,252,055描述了通过超滤制备高浓缩抗体制剂，然而，以这种方式制备的抗体制剂甚至在制备后即具有≥4％的高比例可溶性聚集体。而且，获得的该抗体制剂不能用它们的天然结构和稳定性来表征，而这必须认为例如对抗体制剂的免疫原性和功效是非常重要的。
聚集体对蛋白质制剂的免疫原性增强和效力降低以及生物利用度降低的不利影响已经从文献(S.A.Marshall，G.A.Lazar，A.J.Chirino，和J.R.Desjarlais.Rational design and engineering of therapeutic proteins.Drug Discovery Today8(5)212-221，2003；Schellekens H.Bioequivalenceand the immunogenicity of biopharmaceuticals.Nat Rev Drug Discov 1(6)457-462，2002)中得知。
由于上述原因，显然，制备足够长时间稳定的液态高浓缩抗体制剂经证明对本领域技术人员是非常困难的。而且，由于对蛋白质以及特别是抗体甚至在低浓度范围内的极其显著的聚集趋势是十分了解的(S.A.Marshall，G.A.Lazar，A.J.Chirino和J.R.Desjarlais.Rational designand engineering of therapeutic proteins.Drug Discovery Today8(5)212-221，2003)，所以高浓缩液体制剂的制备对本领域技术人员是没有吸引力的。因此，蛋白质的聚集在文献中描述为最普通的物理不稳定性反应(W.Wang.Instability，stabilization，and formulation of liquid proteinpharmaceuticals.Int.J.Pharm.185(2)129-188，1999)。
虽然WO03053465和WO03007988中公开了含有Mab C225(西妥昔单抗)或Mab h425(EMD72000)的制剂，但是，在WO03053465公开的制剂具有相对低的蛋白质浓度并且它们在室温下不是长期稳定的，在WO03/007988中公开的制剂同样地具有相对低的蛋白质浓度并且制剂(冻干物)必须在使用前重构。
用于稳定蛋白质制剂的冷冻干燥方法公开在例如WO9300807和WO9822136中，但是，冻干制剂的严重不利之处在于使用者必须在使用前重构冻干物，这代表在使用前制备中相当大的错误之源。由于与液体制剂相比加入了进一步的制备过程，由于在方法研发(保证冻干期间的稳定性)、制备(制备成本和持续时间)以及例如验证方面的附加工作，此过程是不利的。
在迄今已知的低蛋白质浓度制剂的情况下，在静脉内施用时需要高的输注体积。因此本发明的目的是浓缩根据本发明的抗体，这样，通过减少施用体积，也可考虑皮下施用。经皮下施用的制剂必须不超过1.0-1.5ml的体积而且必须进一步是含水的(euhydric)(pH7.2或pH4.0-9.0)和等渗的(约290mOsm)。皮下制剂的进一步优势在于患者自己施用的可能性。然而，在浓缩过程中蛋白质的稳定性不能受到削弱，即分解和聚集产物的增加应该在规范的范围内是可接受的。而且，这种制剂应该无毒理学上不可接受的物质或只含有生理学可接受浓度的毒理学上不可接受物质。
因为由于预期的困难，已经建立的蛋白质配方通常不能应用于新的蛋白质活性成分，所以本发明的目的是发现新的、稳定的、高浓度的治疗性蛋白质特别是抗EGF受体的单克隆抗体例如Mab C225(西妥昔单抗)和Mab h425(EMD72000)的液体制剂，其对严酷条件例如高温度、空气潮湿和/或剪切力具有增强的稳定性，这样使得在制备、存储、运输和施用过程中它们的效力得以保持并且这些制剂不含毒理学上不可接受的辅助剂。
发明概述令人惊奇的是，高浓缩液体形式的抗-EGFR抗体药物制剂可使用超滤方法获得，所述的制剂具有10-250mg/ml，特别优选是50-180mg/ml，特别优选的是100-150mg/ml的蛋白质浓度。
通过超滤方法获得的制剂优选在长时期内是稳定的或者如果需要，它们可与合适的稳定化辅助剂混合或通过随后的冻干来稳定。
根据本发明的制剂是生理学上很好耐受性的、可容易制备的、可准确配药的并且在整个存储过程、在机械应力以及例如在多次冷冻和解冻过程中是稳定的。
令人惊奇的是，发现根据本发明方法制备的高浓缩抗-EGFR抗体制剂含有＞99％的单体比例。根据本发明获得的高浓缩液体制剂，其具有10-250mg/ml，特别优选50-180mg/ml，特别优选100-150mg/ml的浓度，在物理上和化学上是稳定的，即单体含量的改变及伴随的可溶性聚集体增加没有发生，其可认为是对效力和免疫原性副作用非常关键的(Schellekens H.(2002)Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals.Nat.Rev.Drug Discov.，v.1，p.457-462.)。使用的超滤方法也不引起蛋白质一级结构的改变。而且，与低浓度的蛋白质制剂比较，没有明显的有关机械稳定性和热稳定性方面的缺点。特别是，特征性聚集体产物也在规定的根据本发明的高浓度的、液体抗体制剂的规格范围内。
这是出乎意料的，因为高浓度的蛋白质制剂的不稳定性趋势要远远大于稀释的蛋白质制剂(Fields，G.，Alonso，D.，Stiger，D.，Dill，K.(1992)“Theory for the aggregation of proteins and copolymers.”J.Phys.Chem.96，3974-3981)。在高的蛋白质浓度下，蛋白质分子的“堆积密度”增加。因此，推定碰撞的次数升高，并且可偶尔发生蛋白质缔合。这个过程通常通过成核作用和生长机制发生，此机制中临界核通常是可溶性缔合蛋白质，然而，其可以快速地转变为不可溶的蛋白质沉淀物(变性的蛋白质)(Reithel，J.F.(1962)“The dissociation and association of proteinstructures”，Adv.Protein Chem.18，123)。蛋白质团聚体的大小随着蛋白质浓度的增大而增大，如β-乳球蛋白所显示的那样(Roefs，S.P.F.M.，De Kruif，K.G.(1994)“A model for the denaturation and aggregation ofβ+-lactoglobulin”Eur.J.Biochem.226，883-889)。
下面描述的根据本发明的抗-EGFR抗体制剂令人惊奇地通过一个或多个选自下面的优点而显著高蛋白质浓度、高稳定性、低聚集倾向、低粘度、高纯度、不存在药学上不可接受的试剂从而具有高安全性、好的耐受性和可以直接使用。
下面描述的根据本发明的制备方法令人惊奇地通过一个或多个选自下面的优点而显著简单、节约时间和成本、使用在药学上可接受的试剂、高产量。因此，根据本发明的方法可以优选地以比文献中描述的技术更明显更简单、省时且划算的方式进行，因为，出人意料地，具有上述优点的稳定的、高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂通过超滤获得。
因此本发明涉及用于通过超滤制备含有至少一种抗-EGFR抗体和/或其变体和/或片段之一的高浓度的液体制剂的方法。根据本发明方法的特征特别是在于获得的高浓度的液体制剂具有至少一种10-250mg/ml，优选50-180mg/ml，特别优选100-150mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
而且根据本发明方法的特征在于抗-EGFR抗体是单克隆的并且是鼠或人源的，优选是鼠源的，并且是嵌合的或人源化的。特别优选抗-EGFR抗体Mab C225(西妥昔单抗)或Mab h425(EMD72000)和/或其变体和/或片段。
根据本发明的超滤方法是如搅拌超滤(stirred ultrafiltration)和切向流过滤(TFF)的超滤方法。
根据本发明的抗体的超滤优选地在合适的缓冲系统中进行，即无须例如通过去污剂来稳定反应溶液。在肠胃外施用的制剂中通常应该避免使用去污剂或将其最小化，因为它们引起不能忽视的毒性和免疫原性潜能(Sweetana S.和Akers M.J.(1996)Solubility principles and practices forparenteral drug dosage from development.PDA J.Pharm.Sci.Technol.50，330-342)并且它们也导致蛋白质二级结构的改变(Vermeer A.W.P.和Norde W.(2000)The influence of the binding of low molecular weightsurfactants on the thermal stability and secondary structure of lgG.Colloids and Surfaces APhysicochemical and Engineering Aspects 161，139-150)。而且，由于去污剂可能形成的胶束而使产品中的去污剂发生不利的且不受控的富集，因而含有去污剂的制剂的超滤方法的实施证明是困难的。
关于根据本发明的抗-EGFR抗体和对于本发明目的，术语“生物学活性的”、“天然的”和“有效的”表示根据本发明的抗-EGFR抗体甚至在转化成根据本发明的制剂后能发挥它们的生物学作用，特别是结合EGFR、抑制配体特别是EGF与EGFR的结合；调节作用，特别是抑制EGFR介导的信号转导和对EGFR介导的疾病的预防或治疗。
抗-EGFR抗体根据本发明的抗-EGFR抗体优选是单克隆的并且是鼠或人源的，它们特别优选是鼠源的并且是嵌合的或人源化的。抗表皮生长因子受体(EGFR)的抗体特别优选为Mab C225(西妥昔单抗)或Mabh425(EMD72000)和/或其变体或片段。其它的抗EGFR的抗体描述于例如EP0586002和J.Natl.Cancer Inst.1993，8527-33(Mab 528)中。
Mab C225(西妥昔单抗，ErbituxTM)Mab C225(西妥昔单抗)是一种经临床证明的抗体，其结合EGF受体。Mab C225(西妥昔单抗)是嵌合抗体，它的可变区是鼠源的，恒定区是人源的。它由Naramura等人，Cancer Immuno.Immunotherapy1993，37343-349和在WO 96/40210 A1中首次描述。
Mab h425(EMD 72000)Mab h425(EMD72000)是从鼠抗-EGFR抗体425(Mab 425)获得的一种人源化的单克隆抗体(Mab)(EP 0531472)。鼠单克隆抗体Mab 425在人癌细胞系A431中产生，因为在这里它结合表皮生长因子受体(EGFR)的细胞外表位。已经发现它抑制EGF的结合(Murthy等人，1987)。在多种来源的恶性组织中发现EGFR表达增加，所以，Mab 425是诊断和治疗性治疗人类肿瘤的可能的活性成分。从而，已经发现Mab 425在体外介导肿瘤细胞毒性，并在体外抑制鳞状细胞癌和结肠直肠癌的细胞系的肿瘤生长(Rodeck等人，1987)。另外，据显示Mab 425结合小鼠体内人恶性神经胶质瘤异种移植物(Takahashi等人，1987)。它的人源化和嵌合形式公开在例如EP 0531472；Kettleborough等人，Protein Engineering 1991，4773-783；Bier等人，Cancer Chemother Pharmacol.2001，47519-52；Bier等人，Cancer Immunol.Immunother.1998，46167-173中。Mab h425(EMD72000)是人源化的抗体(h425)，其处于临床I/II期并且它的恒定区由κ链和人γ-1链组成(EP 0531472)。
人抗-EGFR抗体可以通过XenoMouse技术制备，如WO9110741、WO9402602和WO9633735中所描述的。通过这种技术制备的正进行临床试验的抗体是例如ABX-EGF(Abgenix，Crit.Rev.Oncol.Hematol.2001，3817-23；Cancer Research 1999，591236-43)。
抗体为本发明目的，抗体或者免疫球蛋白在最广义上使用，并且尤其涉及多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)和特别优选具有生物学活性的完整单克隆抗体(Mab)以及它们的变体和片段。此术语还包含异种抗体，其由两种或多种抗体或其片段组成和/或具有不同的结合特异性并相互结合。依据它们恒定区的氨基酸序列，抗体可以分为不同的抗体(免疫球蛋白)类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它们中的许多可以进一步细分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。抗体通常具有大约150kDa的分子量，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。单克隆抗体是从纯系细胞获得的。它们具有高特异性并抗一种表位，而多克隆抗体包括抗不同表位的不同抗体。单克隆抗体的制备方法包括例如，由Kohler和Milstein(Nature 256，495(1975))和由Burdon等人(1985)(“Monoclonal Antibody Technology，The Production andCharacterisation of Rodent and Human Hybridomas”，Eds，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，Volume 13，ElsevierScience Publishers，Amsterdam)描述的杂交瘤方法。特别地，它们还可以用已知的重组DNA技术制备(见，例如，US4816567)。通过如在Clackson等人(Nature，352624-628(1991)和Marks等人(J.Mol.Biol.，22258，1-597(1991))描述的技术，可以从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。
变体和片段抗体的变体(突变蛋白)是结构相关的蛋白质，例如通过一级序列(氨基酸序列)的修饰、糖工程化(糖基化位点或结构的变体，以及去糖基化的蛋白质)、通过聚乙二醇化、通过在经修饰的宿主细胞中制备或通过其它技术获得的那些变体。根据本发明的变体不是仅限于上述例子，而是包括根据本发明抗体的本领域技术人员已知的所有变体。抗体的片段(部分节段)是例如通过木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤维蛋白溶酶进行限制性酶消化而获得的抗体的切割产物，或者通过基因工程制备部分片段获得。典型的部分节段是例如，二价F(ab’)2片段、单价Fab片段和Fc片段(Lottspeich F.，H.Zorbas(ed.).Bioanalytik，Heidelberg；BerlinSpektrum AkademischerVerlag GmbH(1998)pp.1035)。根据本发明的片段不局限于上述例子，而是包括根据本发明抗体的本领域技术人员已知的所有片段。
药物制剂对于本发明，术语药物制剂(pharmaceutical formulation)与药物制品(pharmaceutical preparation)是同义的。
如此处用到的“药学上耐受的”涉及药物、赋形剂、辅助剂、稳定剂、溶剂和其它试剂，它们利于从其得到的药物制剂施用于哺乳动物，并且没有不希望的生理学副作用，如恶心、眩晕、消化问题等。
对于肠胃外施用的药物制剂，对制剂的等渗性、euhydria和耐受性和安全性(低毒性)、所用辅助剂和主要包装都有要求。令人惊奇的是，根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体优选具有可能直接使用的优点，因为使用生理学上可接受的试剂制备。因此，根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体的制备，优选同时以高产量得到高纯度的天然的和药学上可接受的蛋白质优选是简单、省时并且价廉的。
超滤是用于分离溶解和悬浮物质的压力驱动的半透膜方法。分离原理是基于分子的大小和尺寸，即小于孔径大小的物质进入滤液(渗透)，而大于孔径大小的物质留在保留物(浓缩)中。进行分离所需的力可例如通过离心力、气压源(如氮)或膜泵施加。
根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂可优选通过超滤方法，通过浓缩根据本发明的含有抗-EGFR抗体的溶液而制备。为此目的，将在其制备中获得的、具有特定浓度(例如C2250.01-150mg/ml，优选是2-100mg/ml，特别优选是约20mg/ml，对于EMD 720000.01-150mg/ml，优选是5-100mg/ml，特别优选约20mg/ml)的根据本发明的抗-EGFR抗体溶液有利地导入至超滤设备中并且使其在特定的、控制的压力条件下浓缩。如果抗体是固体形式，例如冻干物，则通过首先溶解根据本发明的抗-EGFR抗体于水中或含有一种或多种其它成分的含水溶液中并且随后将该溶液进行超滤来制备根据本发明的高浓度的液体制剂。
通过超滤方法获得的产品可随后通过加入下面列出的辅助剂稳定。将得到的含有各抗体的溶液调节至4-10的pH，优选5-9的pH，无菌过滤并且，如必要的话，可通过随后的冻干步骤转化成固体形式以便稳定。
多种辅助剂或根据本发明的抗体的加入顺序基本不依赖于制备方法并且其任凭本领域技术人员处理。
抗-EGFR抗体优选以生物学活性的形式存在于根据本发明的高浓缩液体制剂中，并且根据本发明的方法中优选不发生抗体的变性。从而，蛋白质的生物学效能优选得以保留。
例如，聚醚砜(PES)或再生纤维素可在根据本发明的方法中用作超滤膜理论上可能的截止是5-500kDa，优选是10-100kDa，特别优选30-50kDa。
用于Ultrafree离心管(Millipore)的离心力为1-20,000*g，优选1000-12,000*g，特别优选2000*g。用于Amicon stirred cell(Millipore)的气压为0.1-5psi，优选4psi。用于Labscale TFF系统(Millipore)的进入压力为0.1-85psi，优选10-30psi，特别优选20psi。用于Labscale TFF系统(Millipore)的出口压力是0.1-85psi，优选5-20psi，特别优选10psi。
下面的缓冲液例如可用于根据本发明的方法磷酸盐缓冲液:磷酸钠(或钾)；可能的pH为约6.0-8.2的；柠檬酸缓冲液:柠檬酸钠或柠檬酸，可能的pH为约2.2-6.5；琥珀酸缓冲液，pH为约4.8-6.3；乙酸缓冲液，例如乙酸钠，pH约2.5-6.0；pH约6.0-7.8的组氨酸缓冲液；pH 8.0-10.2的谷氨酸缓冲液；pH约8.6-10.6的甘氨酸(N，N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)；pH约6.5-7.5的氨基乙酸盐缓冲液；pH 6.2-7.8的咪唑；pH约1.0-2.2的氯化钾；pH约3.0-6.0的乳酸盐缓冲液；pH约2.5-5.0的马来酸盐缓冲液；pH约3.0-5.0的酒石酸盐缓冲液；TRISpH约为6.8-7.7；磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液。也可以考虑加入等渗剂(例如NaCl(KCl)或其它盐)来实现等渗性。
上面提及的缓冲液可例如以下列浓度在根据本发明的方法中使用1mM-200mM，优选2-20mM，特别优选约10mM。
可优选使用下列pH范围pH 4-10，优选是pH＝IEP+/-2pH单位(蛋白质等电离点左右2个pH单位)。
可优选使用下列等渗剂(通常浓度)约5mM-305mM的氯化钠；氯化钾；葡萄糖；丙三醇；4-5.5mM的右旋糖；1-1.6mM的硫酸钠。
下列物质可优选地用于减少粘度氯化钠、盐酸精氨酸、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钙、氯化锌、乙酸钠。
可优选使用下列稳定剂1)氨基酸(如盐酸一样，约1-100mg/ml，特别优选3-10mg/ml)精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸。
2)糖和糖醇(约1-200mg/ml，特别优选是30-65mg/ml)蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、蜜三糖、海藻糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、半乳糖胺、神经氨酸。
3)抗氧化剂
0.2％的丙酮合亚硫酸氢钠、0.01％的抗坏血酸、0.015％的抗坏血酸酯、0.02％的丁基羟基苯甲醚(BHA)、0.02％的丁基羟基甲苯(BHT)、0.5％的半胱氨酸、0.01％的去甲二氢愈创木酸(NDGA)，0.5％的单硫代甘油、0.15％的亚硫酸氢钠、0.2％的焦亚硫酸钠、0.5％的生育酚、0.1％的谷胱甘肽。
4)防腐剂约0.1％-0.3％的间甲酚、约0.1％-0.3％的氯代甲酚、约0.5％的酚、约1.0％-2.0％的苯甲醇、约0.2％的对羟基苯甲酸甲酯、约0.02％的对羟基苯甲酸丙酯、约0.015％的对羟基苯甲酸丁酯、约0.25％-0.5％的氯代丁醇、约0.002％的硝酸苯基汞、约0.002％的乙酸苯基汞、约0.01％-0.02％的硫柳汞、0.01％的苯扎氯铵、0.01％的苯索氯铵。
5)环糊精例如羟丙基-β-环糊精、硫代丁基乙基-β-环糊精、γ-环糊精。
6)白蛋白人血清白蛋白(HAS)、牛血清白蛋白(BSA)7)多羟基醇丙三醇、乙醇、甘露醇8)盐乙酸盐(例如乙酸钠)、氯化镁、氯化钙、氨丁三醇、EDTA(例如Na-EDTA)本发明也包括本领域技术人员已知和可以设想的上述试剂的所有水合物、盐和衍生物。
本发明进一步涉及含有至少一种抗-EGFR抗体和/或它的变体和/或片段之一的高浓缩液体制剂。这些高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂可通过上述的超滤方法制备。另外可以设想的浓缩方法是色谱法，例如大小排阻色谱法(例如凝胶过滤)、亲和色谱法(例如蛋白质A色谱法)或离子交换色谱法；膜分离法，例如渗析、电渗析、微过滤法、反渗透；电泳法或干燥处理，例如氮气干燥、真空干燥箱干燥、冻干、在有机溶剂中洗涤并随后风干、流体床(liquid-bed)干燥、流化床(fluidised bed)干燥、喷雾干燥、滚筒干燥、层干燥(layer drying)、在室温下风干并随后在较小量溶剂中重构。
根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂特征特别在于它们含有10-250mg/ml，优选50-180mg/ml，特别优选100-150mg/ml的至少一种抗-EGFR抗体。
根据本发明的高浓缩液体制剂特征特别在于抗-EGFR抗体是单克隆的并且是鼠或人源的，优选是鼠源的，并且是嵌合的或人源化的。抗-EGFR抗体特别优选是Mab C225(西妥昔单抗)或Mab h425(EMD72000)和/或其变体和/或其片段。
本发明此外涉及高浓度的液体制剂，所述的该液体制剂含有至少一种通过根据本发明的方法，即通过上述的超滤方法获得的抗-EGFR抗体和/或其变体和/或片段之一。
本发明还涉及根据本发明的高浓度液体抗-EGFR抗体制剂作为存储稳定的药物。
除了含有根据本发明的抗体外，根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂任选地含有赋形剂和/或辅助剂和/或其它药学活性成分。
根据本发明的方法优选使得高浓度的制剂得以制备而不发生根据本发明抗体的不利的不希望的聚集。因此，具有高活性成分含量的现成溶液可采用根据本发明的方法制备。最近，对于非常高浓度的蛋白质活性成分制剂的需求增加。大多数用于治疗的抗体以mg/kg范围的剂量施用。待施用的高剂量和小体积(例如对于皮下施用，约1到1.5ml)显示了对于具有大于100mg/ml浓度的高浓度蛋白质制剂的需求。另外，高浓度的蛋白质制剂在研究可接受性和体外和体内功效(在动物模型中)的临床前试验中、在研究人体内的可接受性和功效的临床试验中和产品的临床使用中(特别是皮下施用)都有相当大的优点。特别地，它们的优点在于使用较小体积的制剂。相对于灌注或注射相对低浓度的蛋白质药物，这使得能够将例如蛋白质药物皮下施用于患者。皮下施用蛋白质药物可以有多种原因。例如，可以希望与“治疗窗口”有关的特异靶定。而且，皮下施用有这样的优点患者可以不依赖医务人员就可自己进行使用。胰岛素的例子清楚地表明了这些优点。然而，因为皮下施用注射最多为1-1.5ml，所以含有超过100mg/ml的高浓度蛋白质制剂通常是必要的。
令人惊奇的是，蛋白质浓度为10-250mg/ml，优选50-180mg/ml，特别优选100-150mg/ml的、不具有上述缺点的高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂可采用根据本发明的方法获得。
已知高浓度免疫球蛋白制剂的限制是在现成液体抗体制剂中通常为2-50mg/ml(Humira_)。然而，意外的是，使用根据本发明的方法也可制备明显更高浓度的并且仍然稳定的制剂。因此，根据本发明的方法使得能够获得高浓度稳定抗体制剂，所述的制剂与已知的高浓度液体抗体制剂比较，具有降低的粘度和聚集倾向，并且因此简化了肠胃外施用的处理。
根据本发明的制剂可有利地用于制备pH为4-10，优选pH为5-9并且重量摩尔渗透压浓度为250-350mOsmol/kg的含有抗体的溶液。从而，根据本发明的制剂可基本无痛地直接静脉内、动脉内和皮下施用。此制剂还可以加入灌注溶液中，例如葡萄糖溶液、等渗盐溶液、或者林格液，这些溶液可以还含有其它的活性成分，因此也使得能够施用相对大量的活性成分。
根据本发明的制剂是生理上良好耐受的，容易制备，能够精确分配以及在整个保存和运输和在多次冻融的过程中在含量、分解产物和聚集体方面优选是稳定的。优选地，它们可以在冰箱温度(2-8℃)和室温(23-27℃)以及60％的相对大气湿度(R.H.)下以稳定的方式保存很长时期。在升高的温度和大气湿度下根据本发明的制剂也优选是相当稳定的。
术语“有效量”表示可以在组织、系统、动物或人体引起例如研究人员或医生所寻求或期望的生物学或医学反应的药物或药学活性成分的量。
另外，术语“治疗有效量”表示一定量，其与没有接受该量的相应受试者相比，有以下结果疾病、综合征、疾病状态、不适、失调的改善的治疗、康复、预防或消除或者疾病副作用的预防或者疾病、不适或失调的发展减慢。术语“治疗有效量”还包含有效增加正常生理功能的量。
药物可以以剂量单位的形式施用，所述剂量单位为每个剂量单位包含预定量的活性成分。该类型的一个单位可以包含例如0.5mg到1g，优选地，1mg到800mg根据本发明的活性成分，这取决于治疗的疾病状态、施用方法和患者的年龄、体重和健康。优选的剂量单位制剂是包含活性成分的如上指出的日剂量或亚剂量，或者其相应的部分。而且，这种类型的药物可以通过药学领域周知的方法之一来制备。
药物可以适于通过任何所希望的适宜途径施用，例如通过经口(包括口含或舌下)、直肠、肺、鼻、局部(包括口含、舌下、或经皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内或动脉内)途径。这种类型的药物可以通过药学领域已知的所有方法来制备，例如，通过将活性成分与赋形剂或辅助剂组合。
肠胃外施用优选适于施用根据本发明的药物。在肠胃外施用的情况下，静脉内和皮下或皮内施用是特别优选的。在静脉内施用的情况下，可以直接进行注射或者也可以加入到灌注溶液中。
用于皮下或皮内施用的根据本发明的药物是特别适合的，因为通过根据本发明的高浓缩液体制剂可以实现皮下施用必要的施用的小体积。
皮下施用有这样的优点，即患者可以在没有专业的医务救护下自己施用药物。根据本发明的抗-EGFR抗体制剂还适合于制备欲肠胃外施用的药物制剂，其减缓、维持和/或控制活性成分的释放，例如也适合制备延迟释放的制剂，其对患者有益，因为只有在相对大的时间间隔才有必要进行施用。根据本发明的药物制剂还可以直接注射入肿瘤并因此可以直接在所预期的作用位点发挥它们的作用。
适于肠胃外施用的药物包括水性和非水性无菌注射溶液，其包含抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和溶质，通过它们可以使得制剂与待治疗的受者的血液等渗；适于肠胃外施用的药物还包括水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮介质和增稠剂。制剂可以用单剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶递送，并且以冷冻干燥(冻干)状态保存，从而，仅需要在即将使用前加入无菌载体液体，如注射用水。可以从无菌粉剂、粒剂和片剂按照配方制备注射液和悬浮液。
根据本发明的抗-EGFR抗体制剂还可以以脂质体递药系统，例如小单层脂质体、大单层脂质体和多复层脂质体的形式施用。脂质体可由多种磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺或卵磷脂形成。
可以将适于局部施用的药物引入至根据本发明的制剂，配制成软膏剂、乳膏、混悬剂、洗剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
对眼睛或其它外部组织，例如嘴和皮肤的治疗，制剂优选地引入至局部软膏剂或者乳膏并施用。在制剂为软膏剂的情况下，可以将根据本发明的制剂引入至石蜡或者水混溶的乳膏基质。备选地，可以配制根据本发明的制剂以得到具有水包油乳膏基质或者油包水基质的乳膏。
适于局部施用于眼睛的药物包括滴眼液。
适于经直肠施用的药物可以以栓剂或灌肠剂的形式递送。
适于通过吸入施用的药物包括细微的微粒粉尘或喷雾，其可以用气溶胶的多种类型的压力分配器喷雾器或吹入器产生。
适于阴道施用的药物可以作为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫、或喷雾制剂递送。
显而易见，除了上述特别提及的组分外，根据本发明的药物还可以包含本领域中常见的与特定类型的药物制剂有关的其它试剂。
此外，本发明涉及套药包(套药盒)，其由单独包装的a)含有有效量的抗-EGFR抗体，优选抗-EGFR的单克隆抗体，特别优选的是Mab C225(西妥昔单抗)或Mab(EMD 72000)和/或其变体或片段的根据本发明的制剂，和b)含有有效量的其它药物活性成分的制剂。
此套药包包含合适的容器，例如盒子或纸盒、单独的瓶子、袋子或安瓿。此套药包可以，例如含有分开的安瓿，每只含有根据本发明的制剂，其包含有效量的根据本发明的抗-EGFR抗体，以及处于溶解或冻干形式的其它药物活性成分的制剂。
根据本发明的抗-EGFR抗体的治疗有效量取决于许多因素，包括例如，患者的年龄和体重、需要治疗的精确的疾病状态，以及其严重性，制剂的性质和施用方法，并且最终由治疗医生或兽医决定。然而，用于治疗肿瘤生长，例如肠癌或乳腺癌时，本发明的抗-EGFR抗体的有效量通常为每天0.1到100mg/kg受试者(哺乳动物)体重的范围内，特别典型的是每天1到10mg/kg体重范围内。因此，对于体重在70kg的成年哺乳动物来说，实际每天的量通常是70-700mg，此剂量可以每天以单次剂量给药或者通常每天以一系列亚剂量(例如，二、三、四、五、或六次)给药，从而总的日剂量是相同的。合适的抗体滴度通过本领域技术人员已知的方法确定。建议施用的剂量对于实现所希望的肿瘤抑制作用通常是足够的。但是，还应该选择尽可能低的剂量从而不会发生副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等等。
根据本发明的药物尤其可用于疾病和疾病状态的预防和/或治疗。
因此，此外本发明还涉及根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂的用途，其用于制备治疗和/或预防肿瘤和/或肿瘤转移的药物，其中肿瘤选自脑肿瘤、泌尿生殖道肿瘤、淋巴系统的肿瘤、胃肿瘤、喉瘤、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌。
多种体外和体内的研究表明，可以通过抗肿瘤的抗体在多种水平上阻断EGFR，例如通过抑制癌细胞的增殖，减少肿瘤介导的血管发生，诱导癌细胞程序性细胞死亡和加强放射治疗和常规化学治疗的有毒效应。
含有根据本发明的制剂的药物能有效调节、调制或抑制EGFR，并因此可以用于预防和/或治疗与失调或者紊乱的EGFR活性有关的疾病。具体地，根据本发明的抗-EGFR抗体制剂因此可以用于治疗某些形式的癌症和病理性血管发生引起的疾病，例如糖尿病性视网膜病或炎症。
因此，本发明还涉及根据本发明的制剂的用途，用于制备治疗和/或预防由EGFR和/或EGFR介导的信号转导所引起、介导和/或传播的疾病的药物。
根据本发明的药物特别适合治疗和/或预防癌症，包括实体癌，例如，癌(例如肺、胰腺、甲状腺、膀胱或结肠的癌)、骨髓疾病(例如骨髓性白血病)或腺瘤(例如绒毛结肠腺瘤)、病理性血管发生和转移的细胞迁移。而且，所述药物还用于治疗依赖补体活化的慢性炎症(Niculescu等人(2002)Immunol.Res.，24191-199)和由HIV-1(人类1型免疫缺陷病毒)诱导的免疫缺陷(Popik等人(1998)J Virol，726406-6413)。
另外，本药物适宜作为哺乳动物特别是人类的EGFR诱导的疾病治疗中的药学活性成分。术语“EGFR诱导的疾病”涉及依赖EGFR活性的病理状态。EGFR直接或间接涉及多种细胞活性的信号转导通路，包括增殖、粘附和迁移、以及分化。与EGFR活性相关的疾病包括肿瘤细胞的增殖、病理性新血管形成，其促进实体瘤的生长，眼睛的新血管形成(糖尿病性视网膜病、年龄诱导的黄斑变性等等)和炎症(牛皮癣、类风湿性关节炎等等)。
这里讨论的疾病通常分为两组，高度增殖性和非高度增殖性疾病。在这方面，认为牛皮癣、关节炎、炎症、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、免疫性疾病、自身免疫病和免疫缺陷病是非癌性疾病，其中通常认为关节炎、炎症、免疫性疾病、自身免疫病和免疫缺陷病是非高度增殖性疾病。
在这方面，认为脑癌、肺癌、鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、结肠直肠癌、乳腺癌、头部癌症、颈部癌症、食管癌、妇科癌症、甲状腺癌、淋巴瘤、慢性白血病和急性白血病是癌性疾病，所有这些通常算在高度增殖性疾病中。特别地，癌性细胞生长以及特别是由EGFR直接和间接介导的癌性细胞的生长是代表本发明靶标的疾病。
研究表明，根据本发明的药物在异种移植物肿瘤模型中具有体内抗增殖作用。将根据本发明的药物施用于患有高增殖性疾病的患者，例如用以抑制肿瘤生长、减轻淋巴组织增生性疾病相关的炎症、抑制移植排斥或组织修复所导致的神经损伤，等等。本发明的药物可用于预防或治疗目的。此处所用的术语“治疗”用于指疾病的预防和对现有疾病的治疗。通过在明显的疾病发展之前施用根据本发明的药物以达到对增殖的预防，例如防止肿瘤生长、防止转移性生长、减少与心血管手术相关的再狭窄，等等。
另外，此药物通过稳定或改善患者的临床症状用于慢性疾病的治疗。
宿主或患者可以属于任意哺乳动物物种，例如灵长类，特别是人类；啮齿动物，包括小鼠、大鼠和仓鼠；兔、马、奶牛、狗、猫等等。动物模型对于实验研究是重要的，其提供了治疗人类疾病的模型。
某些细胞对于用根据本发明的药物治疗的感受性可以用体外试验来确定。通常，将细胞培养物用不同浓度的根据本发明的药物孵育一段时间，此时间足够使活性成分诱导细胞死亡或抑制迁移，通常约一小时到一周。体外试验可以用从活组织检查样品得到的细胞进行。随后对处理后剩下的活细胞计数。
剂量随所用的特定药物、特定疾病、患者的状态等等而改变。通常，治疗剂量是足够的以便显著减小目标组织中不希望的细胞群体，而保持患者的生命力。通常治疗持续进行直到发生显著减少，例如减少至少大约50％的特定细胞数，并且可以持续到基本上在体内检测不到不希望的细胞。
很多测定系统都可以用来鉴定EGFR抑制剂。在闪烁接近测定法(Sorg等人，J.of Biomolecular Screening，2002，7，11-19)和闪板(flashplate)测定法中，使用γATP测定作为底物的蛋白质或肽的放射性磷酸化。在抑制性化合物存在下，可以检测到减小的放射性信号或根本没有信号。而且，均相时间分辨荧光共振能量转移(HTR-FRET)和荧光偏振(FP)技术通常用作测定方法(Sills等人.，J.of Biomolecular Screening，2002，191-214)。
其它非放射性ELISA测定方法使用特定的磷抗体(phospho-ABs)。此磷抗体只结合磷酸化底物。这种结合可以使用结合有过氧化物酶的抗绵羊二级抗体通过化学发光进行检测(Ross等人，2002，Biochem.J.，待出版，手稿BJ20020786)。
有许多疾病和疾病状态与细胞增殖和细胞死亡(程序性细胞死亡)的失调有关。通过根据本发明的药物可以治疗、预防或改善的疾病和疾病状态包括下面列出的疾病和疾病状态，但并不局限于此。根据本发明的药物可用于治疗和/或预防很多不同的疾病和疾病状态，其涉及血管内膜层平滑肌细胞和/或炎症细胞的增殖和/或迁移，而导致通过该血管的血流受限，例如导致新内膜闭塞性损伤。重要的闭塞性移植血管疾病包括动脉粥样硬化、移植后的冠状血管疾病、静脉移植狭窄、临近吻合的假体再狭窄、血管成形术或支架放置后的再狭窄等等。
本发明涉及根据本发明的药物在治疗或预防肿瘤方面的用途。因此，本发明特别优选地涉及根据本发明的液体抗-EGFR抗体制剂在制备治疗和/或预防肿瘤和/或肿瘤转移的药物中的用途，其中所述肿瘤尤其优选地选自脑肿瘤、泌尿生殖道肿瘤、淋巴系统的肿瘤、胃肿瘤、喉瘤、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，但并不局限与此。
本发明还涉及根据本发明的药物在制备治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自由鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、肾癌、结肠直肠癌、乳腺癌、头癌、颈癌、食道癌、妇科癌症、甲状腺癌、淋巴瘤、慢性白血病和急性白血病组成的癌性疾病。
根据本发明的药物可以施用于患者以治疗肿瘤。所述药物抑制肿瘤血管生成并因此影响肿瘤的生长(J.Rak等人，CancerResearch，554575-4580，1995)。根据本发明的药物的抑制血管生成的特性还适用于治疗与视网膜新血管形成相关的某些形式的失明。
因此，本发明还涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂的用途，用于制备治疗和/或预防由血管生成引起、介导和/或传播的疾病的药物。
与血管生成有关的此类型的一种疾病是眼病，例如视网膜血管形成、糖尿病性视网膜病、年龄诱导的黄斑变性等等。
因此，本发明还涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂的用途，用于制备治疗和/或预防选自视网膜血管形成、糖尿病性视网膜病、年龄诱导的黄斑变性和/或炎症疾病的药物。
而且，本发明涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂的用途，用于治疗和/或预防选自牛皮癣、类风湿性关节炎、接触性皮炎、迟发型过敏反应、炎症、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、免疫疾病、自身免疫病和免疫缺陷病的疾病。
本发明还涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂在治疗和/或预防选自骨肉瘤、骨关节炎和佝偻病的骨病理中的用途。
根据本发明的药物还可以用于在某些现有肿瘤化学疗法和放射疗法中提供相加或者协同效果，和/或可用于恢复某些现有的化学疗法和放射疗法的功效。
因此，本发明还涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂的用途，用于制备治疗和/或预防疾病的药物，其中治疗有效量的根据本发明的抗-EGFR抗体与选自下面的化合物组合施用1)雌激素受体调节剂；2)雄激素受体调节剂；3)类视黄醇受体调节剂；4)细胞毒性剂；5)抗增殖剂；6)异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂；7)HMG-CoA还原酶抑制剂；8)HIV蛋白酶抑制剂；9)逆转录酶抑制剂；10)生长因子受体抑制剂和11)血管生成抑制剂。
因此，本发明还涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂的用途，用于制备治疗和/或预防疾病的药物，其中治疗有效量的根据本发明的抗-EGFR抗体与放射疗法和选自下面的化合物组合施用1)雌激素受体调节剂；2)雄激素受体调节剂；3)类视黄醇受体调节剂；4)细胞毒性剂；5)抗增殖剂；6)异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂；7)HMG-CoA还原酶抑制剂；8)HIV蛋白酶抑制剂；9)逆转录酶抑制剂；10)生长因子受体抑制剂和11)血管生成抑制剂。
根据本发明的药物因此可以与其它熟知的治疗剂一起施用，所述治疗剂因其针对所治疗的疾病特别有用而被选择。例如，在骨疾病的情况下，将有利的组合包括与如下治疗剂的组合抗再吸收的二膦酸盐，例如阿仑特罗和利塞膦酸钠；整联蛋白阻断剂(如下文进一步定义)，如αVβ3拮抗剂；用于激素代替疗法的缀合的雌激素，例如Prempro_、Premarin_和Endometrion_；选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，例如雷洛昔芬、着洛西芬、CP-336.156(Pfizer)和拉索昔芬；组织蛋白酶K抑制剂和ATP质子泵抑制剂。
本发明的药物还适合与已知的抗癌剂组合。这些已知的抗癌剂包括下面的雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视黄醇受体调节剂、细胞毒性剂、抗增殖剂、异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、生长因子受体抑制剂和血管生成抑制剂。本发明化合物特别适合与放射疗法同时施用。
“雌激素受体调节剂”指干扰或抑制雌激素与受体结合的化合物，不管其机制如何。雌激素受体调节剂的实例包括，但不仅限于他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、2，2-二甲基-丙酸4-[7-(2，2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]苯酯、4，4’-二羟基二苯甲酮-2，4-二硝基苯腙和SH646。
“雄激素受体调节剂”指干扰或抑制雄激素与受体结合的化合物，不管其机制如何。雄激素受体调节剂的实例包括非那雄胺和其它5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑和乙酸阿比特龙。
“类视黄醇受体调节剂”指干扰或抑制类视黄醇与受体结合的化合物，不管其机制如何。类视黄醇受体调节剂的实例包括贝沙罗汀、维甲酸、13-顺式-视黄酸、9-顺式-视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反式-N-(4’-羟基苯基)retinamide和N-4-羧基苯基retinamide。
“细胞毒性剂”指主要通过直接作用于细胞功能或抑制或干扰细胞有丝分裂导致细胞死亡的化合物，包括烷化剂、肿瘤坏死因子、嵌入剂、微管蛋白抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。细胞毒性剂的实例包括，但不限于替拉扎明、sertenef、肿瘤坏死因子、异磷酰胺、他索纳明、氯尼达明、卡铂、六甲密胺、泼尼莫司汀、二溴甜醇、雷诺氮芥、福替目丁、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、heptaplatin、雌氮芥、二丙胺磺酯、氯乙环磷酰胺、尼莫司汀、螺溴丙酰胺、嘌米舌泊、洛巴铂、沙铂、甲基丝裂霉素、顺铂、伊罗夫文、dexifosfamide、顺式-胺二氯(2-甲基吡啶)铂、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、(反式，反式，反式)-双-μ-(己烷-1，6-二胺)-μ-[二胺-铂(II)双[二胺(氯)铂(II)]四氯化物、diarizidinyl-精胺、三氧化二砷、1-(11-十二烷基氨基-10-羟基十一烷基)-3，7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、必桑郡、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮、3’-脱氨基-3’-吗啉代-13-脱氧-10-羟基洋红霉素、安那霉素、加柔比星、依利奈法德、MEN10755和4-去甲氧基-3-脱氨基-3-吖丙啶基-4-甲基磺酰基柔红霉素(见(WO 00/50032)。
微管抑制剂的实例包括紫杉醇、硫酸长春地辛、3’，4’-双脱氢-4’-去氧-8’-去甲长春花碱、多西他赛、根霉素、多拉司他汀、羟乙基磺酸米伏布林、auristatin、西马多丁、RPR109881、BMS184476、长春氟宁、cryptophycin、2，3，4，5，6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)-苯磺酰胺、脱水长春花碱、N，N-二甲基-L-缬氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-缬氨酰-L-脯氨酰-L-脯氨酸-叔丁基酰胺、TDX258和BMS188797。
拓扑异构酶抑制剂的一些实例是拓扑替康、hycaptamine、伊立替康、卢比替康、6-乙氧基丙酰基-3’4’-O-外苄叉教酒菌素、9-甲氧基-N，N-二甲基-5-硝基吡唑并[3，4，5-kl]吖啶-2-(6H)-丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’b，7]中氮茚并[1，2b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮、lutotecan、7-[2-(N-异丙基氨基)乙基]-(20S)喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2’-二甲基氨基-2’-去氧依托泊苷、GL331、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-9-羟基-5，6-二甲基-6 H-吡啶并[4，3-b]咔唑-1-甲酰胺、asulacrine、(5a，5aB，8aa，9b)-9-[2-[N-[2-二甲基-氨基]乙基]-N-甲基氨基]乙基]-5-[4-羟基-3，5-二甲氧基苯基]-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并(3’，4’，6，7)萘并(2，3-d)-1，3-间二氧杂环戊烯-6-酮、2，3-(亚甲二氧基)-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]菲啶_、6，9-双[(2-氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5，10-二酮、5-(3-氨基丙基氨基)-7，10-二羟基-2-(2-羟基乙氨基甲基)-6H-吡唑并[4，5，1-de]吖啶-6-酮、N-[1-(2-(二乙基氨基)乙基氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-噻吨-4-基甲基]甲酰胺、N-(2-(二甲基-氨基)乙基)吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2，1-c]-喹啉-7-酮和地美司钠。
“抗增殖剂”包括反义RNA和RNA寡核苷酸，例如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231、和INX3001，以及抗代谢物，例如依诺他滨、卡莫氟、喃氟啶、喷司他丁、去氧氟尿苷、三甲曲沙、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷酯、fosteabine sodium hydrate、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋林、脱氧氮杂胞苷、诺拉曲塞、培美曲塞、nelzarabine、2’-去氧-2’-亚甲基胞苷、2’-氟亚甲基-2’-去氧胞苷、N-[5-(2，3-二氢苯并呋喃基)磺酰基]-N’-(3，4-二氯苯基)脲、N6-[4-去氧-4-[N2-[2(E)，4(E)-十四烷二烯酰基]甘氨酰氨基]-L-甘油基-B-L-甘露庚糖吡喃基]腺嘌呤、aplidine、ecteinascidin、沙曲他滨、4-[2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-b]-1，4-噻嗪-6-基(S)-乙基]2，5-噻吩基-L-谷氨酸、氨基喋呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨甲酰基氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-_-1，11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)四癸-2，4，6-三烯-9-基乙酸酯、苦马豆碱、洛美曲索、右丙亚胺、甲硫氨酸酶、2’-氰基-2’-去氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶和3-氨基吡啶-2-carboxaldehyde氨硫脲。“抗增殖剂”除了上面“血管生成抑制剂”下列出的那些还包括抗生长因子的单克隆抗体，例如曲妥单抗，以及肿瘤抑制基因，例如p53，它可以通过重组病毒介导的基因转移递送(例如，见美国专利号6,069,134，)。根据本发明的药物还可以与所有本领域技术人员已知的所有其他治疗性抗体或者适合与上述疾病联系的药物活性成分联合施用。
而且，根据本发明的抗-EGFR抗体制剂可以用于分离和研究EGFR的活性或表达。另外，它们特别适合用于与失调或者紊乱的EGFR活性有关的疾病的诊断方法中。
对于诊断目的，根据本发明的抗体可以例如经放射性标记。优选的标记方法是iodogen方法(Fraker等人，1978)。对于诊断目的，抗体特别优选地用作F(ab’)2片段。从而得到了非常好的结果，说明背景扣除不是必须的。此类型的片段可以通过已知的方法制备(例如，Herlyn等人，1983)。一般来说，在酸性pH条件进行胃蛋白酶消化，并且用蛋白A SepharoseTM层析法将片段与未消化的IgG和重链片段分离。
在根据本发明的制剂中的抗-EGFR抗体优选地显示出有利的生物学活性，它可以用酶测定法容易地检测，如在实施例中描述的那样。在这种类型的基于酶的测定法中，根据本发明的抗体优选地显示并引起抑制效应，这通常用合适的范围内的IC50值来记录，所述范围优选为微摩尔范围内，更加优选纳摩尔范围。
根据本发明的制剂中的根据本发明的抗体的蛋白质大小、结构的完整性、纯度或糖基化模式的测定包括但不限于SE-HPLC、肽作图(消化)、N-末端测序、SDS-PAGE、TRIS/甘氨酸梯度凝胶电泳(非还原的)、FTIR(傅立叶变换红外光谱)法、CD(圆二色性)、RAMAN光谱法、糖染色(PAS法)、寡糖谱、测定单糖组成或等电聚焦。
根据本发明的制剂的稳定性可以例如但不限于通过稳定性程序确定，例如长时间保存于25℃和60％的相对大气湿度，以及40℃和70％的相对大气湿度，并例如通过上述测定方法(SE-HPLC、FT-IR、SDS-PAGE(还原或非还原的))在规则的时间间隔测定蛋白质的稳定性或结构完整性。
用于测定根据本发明的制剂中的根据本发明的抗体的生物学活性或功效的方法包括但不限于例如ELISA、生物学细胞测定法、FTIR或CD。
用于测定根据本发明的高浓度制剂的聚集倾向减小的方法包括但不限于，例如视觉检查、亚可见颗粒分析、浊度法或比浊法、动态光散射鉴定。
实施例1通过切向流过滤(TFF)制备高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂在20psi的进口压力和10psi的出口压力下，采用Labscale TFF系统(Millipore)将380ml蛋白质(17mg/ml，于10mM磷酸盐+145mM NaCl，pH7.2中)浓缩226分钟，所述的Labscale TFF系统(Millipore)具有截止分子量为30kDa的内置聚醚砜超滤膜。获得的保留液具有约132mg/ml的蛋白质浓度。产率为85％。
或者在20psi的进口压力和10psi的出口压力下，采用Labscale TFF系统(Millipore)将470ml蛋白质(17mg/ml，于10mM柠檬酸盐中)浓缩226分钟，所述的Labscale TFF系统(Millipore)具有截止分子量为30kDa的内置聚醚砜超滤膜。获得的保留液具有大约123mg/ml的蛋白质浓度。产率为95％。
实施例2通过搅拌超滤制备高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂在4巴的氮气压力下，通过Amicon stirred cell将25ml的蛋白质(10mg/ml，于10mM磷酸盐+145mM NaCl，pH 7.2中)浓缩144分钟，所述的Amicon stirred cell具有截止分子量为30kDa的内置聚醚砜超滤膜。获得的保留液具有大约92mg/ml的蛋白质浓度。产率为95％。
或者在4巴的氮气压力下，通过Amicon stirred cell将25ml的蛋白质(10mg/ml，于10mM柠檬酸盐，pH 5.5中)浓缩168分钟，所述的Amiconstirred cell具有截止分子量为30kDa的内置聚醚砜超滤膜。获得的保留液具有大约82mg/ml的蛋白质浓度。产率为95％。
实施例3在离心力作用下通过超滤制备高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂将15ml的蛋白质(2mg/ml，于10mM磷酸盐+145mM NaCl，pH7.2中)在Ultrafree离心管(Millipore)中以2000*g离心90分钟，所述的离心管具有截止分子量为30kDa的聚醚砜超滤膜。获得的保留液具有大约116mg/ml的蛋白质浓度。产率为95％。
实施例4研究高浓度的液体抗EGFR抗体制剂的可溶性聚集体通过SE-HPLC研究实施例1-3中获得的保留液的可溶性聚集体含量。这里浓缩后的单体比率＞99％。
实施例5研究高浓度的液体抗EGFR抗体制剂的天然性(nativity)通过FT-IR光谱测定法研究实施例1中获得的保留液。在这里，在通过切向流过滤浓缩之前的初始材料的酰胺I-2衍生光谱与获得的保留液的酰胺I-2衍生光谱相符合。
权利要求
1.制备含有至少一种抗-EGFR抗体和/或其变体和/或片段之一的高浓缩液体制剂的方法，所述方法是通过超滤进行的。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于获得的高浓缩液体制剂具有10-250mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于获得的高浓缩液体制剂具有50-180mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于获得的高浓缩液体制剂具有100-150mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
5.根据权利要求1-4的一项或多项所述的方法，其特征在于抗-EGFR抗体是单克隆的并且是鼠或人源的。
6.根据权利要求1-5的一项或多项所述的方法，其特征在于抗-EGFR抗体是鼠源的并且是嵌合的或人源化的。
7.根据权利要求1-6的一项或多项的方法，其特征在于抗-EGFR抗体是Mab C225(西妥昔单抗)或Mab h425(EMD72000)。
8.高浓缩液体制剂，其含有至少一种抗-EGFR抗体和/或它的变体和/或片段之一。
9.根据权利要求8的高浓缩液体制剂，其特征在于高浓缩液体制剂具有10-250mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
10.根据权利要求8的高浓缩液体制剂，其特征在于高浓缩液体制剂具有50-180mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
11.根据权利要求8的高浓缩液体制剂，其特征在于高浓缩液体制剂具有100-150mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
12.根据权利要求8-11的一项或多项的高浓缩液体制剂，其特征在于抗-EGFR抗体是单克隆的并且是鼠或人源的。
13.根据权利要求8-12的一项或多项的高浓缩液体制剂，其特征在于抗-EGFR抗体是鼠源的并且是嵌合的或人源化的。
14.根据权利要求8-13的一项或多项的高浓缩液体制剂，其特征在于抗-EGFR抗体是Mab C225(西妥昔单抗)或Mab h425(EMD72000)。
15.含有至少一种抗-EGFR抗体和/或它的变体和/或片段之一的高浓缩液体制剂，其是根据权利要求1-7的一项或多项的方法获得的。
16.根据权利要求8-15的一项或多项的高浓缩液体制剂，其作为保存稳定的药物。
17.根据权利要求8-16的一项或多项的高浓缩液体制剂，其特征在于其任选地包含赋形剂和/或辅助剂和/或其它药学活性成分。
18.根据权利要求8-17的一项或多项的高浓缩液体制剂的用途，其用于制备药物。
19.根据权利要求8-17的一项或多项的高浓缩液体制剂的用途，其用于制备治疗和/或预防肿瘤和/或肿瘤转移的药物。
20.根据权利要求19的用途，其中肿瘤选自脑肿瘤、泌尿生殖道肿瘤、淋巴系统的肿瘤、胃肿瘤、喉瘤、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌。
全文摘要
本发明涉及用于通过超滤制备高浓缩液体制剂的方法，其中所述的液体制剂含有至少一种抗－EGFR抗体和/或其变体和/或片段之一，特别是抗EGF受体的单克隆抗体，特别优选Mab C225(西妥昔单抗)和Mab h425(EMD72000)。此外本发明涉及抗－EGFR抗体，特别是抗EGF受体的单克隆抗体，特别优选Mab C225(西妥昔单抗)和Mab h425(EMD72000)和/或其变体和/或片段的高浓缩液体制剂。本发明的特征在于高浓缩液体制剂具有10－250，优选50－180mg/ml，特别优选100－150mg/ml的抗－EGFR抗体的含量。最后，本发明涉及这些制剂的用途。
文档编号A61P35/00GK1953768SQ200580004883
公开日2007年4月25日 申请日期2005年1月27日 优先权日2004年2月12日
发明者S·马瑟斯, H-C·马勒 申请人:默克专利有限公司
背景技术：
本发明涉及用于通过超滤制备高浓缩液体制剂的方法，所述的液体制剂含有至少一种抗-EGFR抗体和/或其变体和/或片段中的一种，特别是抗EGF受体的单克隆抗体，特别优选Mab C225(西妥昔单抗(cetuximab))和Mab h425(EMD72000)。此外本发明涉及抗-EGFR抗体，特别是抗EGF受体的单克隆抗体，特别优选Mab C225(西妥昔单抗)和Mabh425(EMD72000)和/或其变体和/或片段的高浓缩液体制剂，其特征在于高浓缩液体制剂具有10-250，优选50-180mg/ml，特别优选100-150mg/ml的抗-EGFR抗体含量，并且涉及其用途。
生物技术领域的发展使得在过去十年期间可以通过重组DNA技术制备用于药学应用的一系列蛋白质。蛋白质药物如单克隆抗体用于如肿瘤治疗，例如用于特异性免疫治疗或肿瘤接种。治疗性蛋白质比常规有机和无机活性成分更大而且更复杂，并且它们具有复杂的三维结构和许多官能团，其影响蛋白质的生物学活性或者备选地可以引起不希望的效应。在制备、保存和运输过程中，蛋白质药物暴露于许多外界影响，这些影响对蛋白质活性成分具有减弱稳定性的作用。因此，有必要精确地研究特异性降解反应发生的原因和机制，以便能够稳定蛋白质，例如通过添加某些稳定性辅助剂(见，如Manning M.C.，Patel K.，&Borchardt R.T.(1989)Stability ofprotein pharmaceuticals.Pharm.Res.6，903-918)。
文献中公开了治疗性蛋白质的许多制剂。但是，对于各种蛋白质活性成分的药物制剂的组合物的要求是很不同的，并且通常，由于不同蛋白质的特定理化性质和降解反应，将已确定的蛋白质配方应用于新的蛋白质活性成分是不可能的。因此，这些新的活性成分的适当药物制剂仍然是一个主要的挑战。
虽然在目前的文献中将超滤作为重组蛋白质纯化的下游处理中的标准方法来描述(Taylor和Francis(2000)Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins，London，p.1-212；McPherson A.(1989)Separation Methods，Preparation and Analysis of ProteinCrystalsNew York，Robert E.Krieger Publishing Co，Inc，p.1-51)，然而有利的高浓度未能在下游处理中获得。另外，由于随后的纯化和层析步骤，获得的处理溶液可再次发生稀释。
虽然US 6,252,055描述了通过超滤制备高浓缩抗体制剂，然而，以这种方式制备的抗体制剂甚至在制备后即具有≥4％的高比例可溶性聚集体。而且，获得的该抗体制剂不能用它们的天然结构和稳定性来表征，而这必须认为例如对抗体制剂的免疫原性和功效是非常重要的。
聚集体对蛋白质制剂的免疫原性增强和效力降低以及生物利用度降低的不利影响已经从文献(S.A.Marshall，G.A.Lazar，A.J.Chirino，和J.R.Desjarlais.Rational design and engineering of therapeutic proteins.Drug Discovery Today8(5)212-221，2003；Schellekens H.Bioequivalenceand the immunogenicity of biopharmaceuticals.Nat Rev Drug Discov 1(6)457-462，2002)中得知。
由于上述原因，显然，制备足够长时间稳定的液态高浓缩抗体制剂经证明对本领域技术人员是非常困难的。而且，由于对蛋白质以及特别是抗体甚至在低浓度范围内的极其显著的聚集趋势是十分了解的(S.A.Marshall，G.A.Lazar，A.J.Chirino和J.R.Desjarlais.Rational designand engineering of therapeutic proteins.Drug Discovery Today8(5)212-221，2003)，所以高浓缩液体制剂的制备对本领域技术人员是没有吸引力的。因此，蛋白质的聚集在文献中描述为最普通的物理不稳定性反应(W.Wang.Instability，stabilization，and formulation of liquid proteinpharmaceuticals.Int.J.Pharm.185(2)129-188，1999)。
虽然WO03053465和WO03007988中公开了含有Mab C225(西妥昔单抗)或Mab h425(EMD72000)的制剂，但是，在WO03053465公开的制剂具有相对低的蛋白质浓度并且它们在室温下不是长期稳定的，在WO03/007988中公开的制剂同样地具有相对低的蛋白质浓度并且制剂(冻干物)必须在使用前重构。
用于稳定蛋白质制剂的冷冻干燥方法公开在例如WO9300807和WO9822136中，但是，冻干制剂的严重不利之处在于使用者必须在使用前重构冻干物，这代表在使用前制备中相当大的错误之源。由于与液体制剂相比加入了进一步的制备过程，由于在方法研发(保证冻干期间的稳定性)、制备(制备成本和持续时间)以及例如验证方面的附加工作，此过程是不利的。
在迄今已知的低蛋白质浓度制剂的情况下，在静脉内施用时需要高的输注体积。因此本发明的目的是浓缩根据本发明的抗体，这样，通过减少施用体积，也可考虑皮下施用。经皮下施用的制剂必须不超过1.0-1.5ml的体积而且必须进一步是含水的(euhydric)(pH7.2或pH4.0-9.0)和等渗的(约290mOsm)。皮下制剂的进一步优势在于患者自己施用的可能性。然而，在浓缩过程中蛋白质的稳定性不能受到削弱，即分解和聚集产物的增加应该在规范的范围内是可接受的。而且，这种制剂应该无毒理学上不可接受的物质或只含有生理学可接受浓度的毒理学上不可接受物质。
因为由于预期的困难，已经建立的蛋白质配方通常不能应用于新的蛋白质活性成分，所以本发明的目的是发现新的、稳定的、高浓度的治疗性蛋白质特别是抗EGF受体的单克隆抗体例如Mab C225(西妥昔单抗)和Mab h425(EMD72000)的液体制剂，其对严酷条件例如高温度、空气潮湿和/或剪切力具有增强的稳定性，这样使得在制备、存储、运输和施用过程中它们的效力得以保持并且这些制剂不含毒理学上不可接受的辅助剂。
发明概述令人惊奇的是，高浓缩液体形式的抗-EGFR抗体药物制剂可使用超滤方法获得，所述的制剂具有10-250mg/ml，特别优选是50-180mg/ml，特别优选的是100-150mg/ml的蛋白质浓度。
通过超滤方法获得的制剂优选在长时期内是稳定的或者如果需要，它们可与合适的稳定化辅助剂混合或通过随后的冻干来稳定。
根据本发明的制剂是生理学上很好耐受性的、可容易制备的、可准确配药的并且在整个存储过程、在机械应力以及例如在多次冷冻和解冻过程中是稳定的。
令人惊奇的是，发现根据本发明方法制备的高浓缩抗-EGFR抗体制剂含有＞99％的单体比例。根据本发明获得的高浓缩液体制剂，其具有10-250mg/ml，特别优选50-180mg/ml，特别优选100-150mg/ml的浓度，在物理上和化学上是稳定的，即单体含量的改变及伴随的可溶性聚集体增加没有发生，其可认为是对效力和免疫原性副作用非常关键的(Schellekens H.(2002)Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals.Nat.Rev.Drug Discov.，v.1，p.457-462.)。使用的超滤方法也不引起蛋白质一级结构的改变。而且，与低浓度的蛋白质制剂比较，没有明显的有关机械稳定性和热稳定性方面的缺点。特别是，特征性聚集体产物也在规定的根据本发明的高浓度的、液体抗体制剂的规格范围内。
这是出乎意料的，因为高浓度的蛋白质制剂的不稳定性趋势要远远大于稀释的蛋白质制剂(Fields，G.，Alonso，D.，Stiger，D.，Dill，K.(1992)“Theory for the aggregation of proteins and copolymers.”J.Phys.Chem.96，3974-3981)。在高的蛋白质浓度下，蛋白质分子的“堆积密度”增加。因此，推定碰撞的次数升高，并且可偶尔发生蛋白质缔合。这个过程通常通过成核作用和生长机制发生，此机制中临界核通常是可溶性缔合蛋白质，然而，其可以快速地转变为不可溶的蛋白质沉淀物(变性的蛋白质)(Reithel，J.F.(1962)“The dissociation and association of proteinstructures”，Adv.Protein Chem.18，123)。蛋白质团聚体的大小随着蛋白质浓度的增大而增大，如β-乳球蛋白所显示的那样(Roefs，S.P.F.M.，De Kruif，K.G.(1994)“A model for the denaturation and aggregation ofβ+-lactoglobulin”Eur.J.Biochem.226，883-889)。
下面描述的根据本发明的抗-EGFR抗体制剂令人惊奇地通过一个或多个选自下面的优点而显著高蛋白质浓度、高稳定性、低聚集倾向、低粘度、高纯度、不存在药学上不可接受的试剂从而具有高安全性、好的耐受性和可以直接使用。
下面描述的根据本发明的制备方法令人惊奇地通过一个或多个选自下面的优点而显著简单、节约时间和成本、使用在药学上可接受的试剂、高产量。因此，根据本发明的方法可以优选地以比文献中描述的技术更明显更简单、省时且划算的方式进行，因为，出人意料地，具有上述优点的稳定的、高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂通过超滤获得。
因此本发明涉及用于通过超滤制备含有至少一种抗-EGFR抗体和/或其变体和/或片段之一的高浓度的液体制剂的方法。根据本发明方法的特征特别是在于获得的高浓度的液体制剂具有至少一种10-250mg/ml，优选50-180mg/ml，特别优选100-150mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
而且根据本发明方法的特征在于抗-EGFR抗体是单克隆的并且是鼠或人源的，优选是鼠源的，并且是嵌合的或人源化的。特别优选抗-EGFR抗体Mab C225(西妥昔单抗)或Mab h425(EMD72000)和/或其变体和/或片段。
根据本发明的超滤方法是如搅拌超滤(stirred ultrafiltration)和切向流过滤(TFF)的超滤方法。
根据本发明的抗体的超滤优选地在合适的缓冲系统中进行，即无须例如通过去污剂来稳定反应溶液。在肠胃外施用的制剂中通常应该避免使用去污剂或将其最小化，因为它们引起不能忽视的毒性和免疫原性潜能(Sweetana S.和Akers M.J.(1996)Solubility principles and practices forparenteral drug dosage from development.PDA J.Pharm.Sci.Technol.50，330-342)并且它们也导致蛋白质二级结构的改变(Vermeer A.W.P.和Norde W.(2000)The influence of the binding of low molecular weightsurfactants on the thermal stability and secondary structure of lgG.Colloids and Surfaces APhysicochemical and Engineering Aspects 161，139-150)。而且，由于去污剂可能形成的胶束而使产品中的去污剂发生不利的且不受控的富集，因而含有去污剂的制剂的超滤方法的实施证明是困难的。
关于根据本发明的抗-EGFR抗体和对于本发明目的，术语“生物学活性的”、“天然的”和“有效的”表示根据本发明的抗-EGFR抗体甚至在转化成根据本发明的制剂后能发挥它们的生物学作用，特别是结合EGFR、抑制配体特别是EGF与EGFR的结合；调节作用，特别是抑制EGFR介导的信号转导和对EGFR介导的疾病的预防或治疗。
抗-EGFR抗体根据本发明的抗-EGFR抗体优选是单克隆的并且是鼠或人源的，它们特别优选是鼠源的并且是嵌合的或人源化的。抗表皮生长因子受体(EGFR)的抗体特别优选为Mab C225(西妥昔单抗)或Mabh425(EMD72000)和/或其变体或片段。其它的抗EGFR的抗体描述于例如EP0586002和J.Natl.Cancer Inst.1993，8527-33(Mab 528)中。
Mab C225(西妥昔单抗，ErbituxTM)Mab C225(西妥昔单抗)是一种经临床证明的抗体，其结合EGF受体。Mab C225(西妥昔单抗)是嵌合抗体，它的可变区是鼠源的，恒定区是人源的。它由Naramura等人，Cancer Immuno.Immunotherapy1993，37343-349和在WO 96/40210 A1中首次描述。
Mab h425(EMD 72000)Mab h425(EMD72000)是从鼠抗-EGFR抗体425(Mab 425)获得的一种人源化的单克隆抗体(Mab)(EP 0531472)。鼠单克隆抗体Mab 425在人癌细胞系A431中产生，因为在这里它结合表皮生长因子受体(EGFR)的细胞外表位。已经发现它抑制EGF的结合(Murthy等人，1987)。在多种来源的恶性组织中发现EGFR表达增加，所以，Mab 425是诊断和治疗性治疗人类肿瘤的可能的活性成分。从而，已经发现Mab 425在体外介导肿瘤细胞毒性，并在体外抑制鳞状细胞癌和结肠直肠癌的细胞系的肿瘤生长(Rodeck等人，1987)。另外，据显示Mab 425结合小鼠体内人恶性神经胶质瘤异种移植物(Takahashi等人，1987)。它的人源化和嵌合形式公开在例如EP 0531472；Kettleborough等人，Protein Engineering 1991，4773-783；Bier等人，Cancer Chemother Pharmacol.2001，47519-52；Bier等人，Cancer Immunol.Immunother.1998，46167-173中。Mab h425(EMD72000)是人源化的抗体(h425)，其处于临床I/II期并且它的恒定区由κ链和人γ-1链组成(EP 0531472)。
人抗-EGFR抗体可以通过XenoMouse技术制备，如WO9110741、WO9402602和WO9633735中所描述的。通过这种技术制备的正进行临床试验的抗体是例如ABX-EGF(Abgenix，Crit.Rev.Oncol.Hematol.2001，3817-23；Cancer Research 1999，591236-43)。
抗体为本发明目的，抗体或者免疫球蛋白在最广义上使用，并且尤其涉及多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)和特别优选具有生物学活性的完整单克隆抗体(Mab)以及它们的变体和片段。此术语还包含异种抗体，其由两种或多种抗体或其片段组成和/或具有不同的结合特异性并相互结合。依据它们恒定区的氨基酸序列，抗体可以分为不同的抗体(免疫球蛋白)类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它们中的许多可以进一步细分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。抗体通常具有大约150kDa的分子量，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。单克隆抗体是从纯系细胞获得的。它们具有高特异性并抗一种表位，而多克隆抗体包括抗不同表位的不同抗体。单克隆抗体的制备方法包括例如，由Kohler和Milstein(Nature 256，495(1975))和由Burdon等人(1985)(“Monoclonal Antibody Technology，The Production andCharacterisation of Rodent and Human Hybridomas”，Eds，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，Volume 13，ElsevierScience Publishers，Amsterdam)描述的杂交瘤方法。特别地，它们还可以用已知的重组DNA技术制备(见，例如，US4816567)。通过如在Clackson等人(Nature，352624-628(1991)和Marks等人(J.Mol.Biol.，22258，1-597(1991))描述的技术，可以从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。
变体和片段抗体的变体(突变蛋白)是结构相关的蛋白质，例如通过一级序列(氨基酸序列)的修饰、糖工程化(糖基化位点或结构的变体，以及去糖基化的蛋白质)、通过聚乙二醇化、通过在经修饰的宿主细胞中制备或通过其它技术获得的那些变体。根据本发明的变体不是仅限于上述例子，而是包括根据本发明抗体的本领域技术人员已知的所有变体。抗体的片段(部分节段)是例如通过木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤维蛋白溶酶进行限制性酶消化而获得的抗体的切割产物，或者通过基因工程制备部分片段获得。典型的部分节段是例如，二价F(ab’)2片段、单价Fab片段和Fc片段(Lottspeich F.，H.Zorbas(ed.).Bioanalytik，Heidelberg；BerlinSpektrum AkademischerVerlag GmbH(1998)pp.1035)。根据本发明的片段不局限于上述例子，而是包括根据本发明抗体的本领域技术人员已知的所有片段。
药物制剂对于本发明，术语药物制剂(pharmaceutical formulation)与药物制品(pharmaceutical preparation)是同义的。
如此处用到的“药学上耐受的”涉及药物、赋形剂、辅助剂、稳定剂、溶剂和其它试剂，它们利于从其得到的药物制剂施用于哺乳动物，并且没有不希望的生理学副作用，如恶心、眩晕、消化问题等。
对于肠胃外施用的药物制剂，对制剂的等渗性、euhydria和耐受性和安全性(低毒性)、所用辅助剂和主要包装都有要求。令人惊奇的是，根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体优选具有可能直接使用的优点，因为使用生理学上可接受的试剂制备。因此，根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体的制备，优选同时以高产量得到高纯度的天然的和药学上可接受的蛋白质优选是简单、省时并且价廉的。
超滤是用于分离溶解和悬浮物质的压力驱动的半透膜方法。分离原理是基于分子的大小和尺寸，即小于孔径大小的物质进入滤液(渗透)，而大于孔径大小的物质留在保留物(浓缩)中。进行分离所需的力可例如通过离心力、气压源(如氮)或膜泵施加。
根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂可优选通过超滤方法，通过浓缩根据本发明的含有抗-EGFR抗体的溶液而制备。为此目的，将在其制备中获得的、具有特定浓度(例如C2250.01-150mg/ml，优选是2-100mg/ml，特别优选是约20mg/ml，对于EMD 720000.01-150mg/ml，优选是5-100mg/ml，特别优选约20mg/ml)的根据本发明的抗-EGFR抗体溶液有利地导入至超滤设备中并且使其在特定的、控制的压力条件下浓缩。如果抗体是固体形式，例如冻干物，则通过首先溶解根据本发明的抗-EGFR抗体于水中或含有一种或多种其它成分的含水溶液中并且随后将该溶液进行超滤来制备根据本发明的高浓度的液体制剂。
通过超滤方法获得的产品可随后通过加入下面列出的辅助剂稳定。将得到的含有各抗体的溶液调节至4-10的pH，优选5-9的pH，无菌过滤并且，如必要的话，可通过随后的冻干步骤转化成固体形式以便稳定。
多种辅助剂或根据本发明的抗体的加入顺序基本不依赖于制备方法并且其任凭本领域技术人员处理。
抗-EGFR抗体优选以生物学活性的形式存在于根据本发明的高浓缩液体制剂中，并且根据本发明的方法中优选不发生抗体的变性。从而，蛋白质的生物学效能优选得以保留。
例如，聚醚砜(PES)或再生纤维素可在根据本发明的方法中用作超滤膜理论上可能的截止是5-500kDa，优选是10-100kDa，特别优选30-50kDa。
用于Ultrafree离心管(Millipore)的离心力为1-20,000*g，优选1000-12,000*g，特别优选2000*g。用于Amicon stirred cell(Millipore)的气压为0.1-5psi，优选4psi。用于Labscale TFF系统(Millipore)的进入压力为0.1-85psi，优选10-30psi，特别优选20psi。用于Labscale TFF系统(Millipore)的出口压力是0.1-85psi，优选5-20psi，特别优选10psi。
下面的缓冲液例如可用于根据本发明的方法磷酸盐缓冲液:磷酸钠(或钾)；可能的pH为约6.0-8.2的；柠檬酸缓冲液:柠檬酸钠或柠檬酸，可能的pH为约2.2-6.5；琥珀酸缓冲液，pH为约4.8-6.3；乙酸缓冲液，例如乙酸钠，pH约2.5-6.0；pH约6.0-7.8的组氨酸缓冲液；pH 8.0-10.2的谷氨酸缓冲液；pH约8.6-10.6的甘氨酸(N，N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)；pH约6.5-7.5的氨基乙酸盐缓冲液；pH 6.2-7.8的咪唑；pH约1.0-2.2的氯化钾；pH约3.0-6.0的乳酸盐缓冲液；pH约2.5-5.0的马来酸盐缓冲液；pH约3.0-5.0的酒石酸盐缓冲液；TRISpH约为6.8-7.7；磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液。也可以考虑加入等渗剂(例如NaCl(KCl)或其它盐)来实现等渗性。
上面提及的缓冲液可例如以下列浓度在根据本发明的方法中使用1mM-200mM，优选2-20mM，特别优选约10mM。
可优选使用下列pH范围pH 4-10，优选是pH＝IEP+/-2pH单位(蛋白质等电离点左右2个pH单位)。
可优选使用下列等渗剂(通常浓度)约5mM-305mM的氯化钠；氯化钾；葡萄糖；丙三醇；4-5.5mM的右旋糖；1-1.6mM的硫酸钠。
下列物质可优选地用于减少粘度氯化钠、盐酸精氨酸、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钙、氯化锌、乙酸钠。
可优选使用下列稳定剂1)氨基酸(如盐酸一样，约1-100mg/ml，特别优选3-10mg/ml)精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸。
2)糖和糖醇(约1-200mg/ml，特别优选是30-65mg/ml)蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、蜜三糖、海藻糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、半乳糖胺、神经氨酸。
3)抗氧化剂
0.2％的丙酮合亚硫酸氢钠、0.01％的抗坏血酸、0.015％的抗坏血酸酯、0.02％的丁基羟基苯甲醚(BHA)、0.02％的丁基羟基甲苯(BHT)、0.5％的半胱氨酸、0.01％的去甲二氢愈创木酸(NDGA)，0.5％的单硫代甘油、0.15％的亚硫酸氢钠、0.2％的焦亚硫酸钠、0.5％的生育酚、0.1％的谷胱甘肽。
4)防腐剂约0.1％-0.3％的间甲酚、约0.1％-0.3％的氯代甲酚、约0.5％的酚、约1.0％-2.0％的苯甲醇、约0.2％的对羟基苯甲酸甲酯、约0.02％的对羟基苯甲酸丙酯、约0.015％的对羟基苯甲酸丁酯、约0.25％-0.5％的氯代丁醇、约0.002％的硝酸苯基汞、约0.002％的乙酸苯基汞、约0.01％-0.02％的硫柳汞、0.01％的苯扎氯铵、0.01％的苯索氯铵。
5)环糊精例如羟丙基-β-环糊精、硫代丁基乙基-β-环糊精、γ-环糊精。
6)白蛋白人血清白蛋白(HAS)、牛血清白蛋白(BSA)7)多羟基醇丙三醇、乙醇、甘露醇8)盐乙酸盐(例如乙酸钠)、氯化镁、氯化钙、氨丁三醇、EDTA(例如Na-EDTA)本发明也包括本领域技术人员已知和可以设想的上述试剂的所有水合物、盐和衍生物。
本发明进一步涉及含有至少一种抗-EGFR抗体和/或它的变体和/或片段之一的高浓缩液体制剂。这些高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂可通过上述的超滤方法制备。另外可以设想的浓缩方法是色谱法，例如大小排阻色谱法(例如凝胶过滤)、亲和色谱法(例如蛋白质A色谱法)或离子交换色谱法；膜分离法，例如渗析、电渗析、微过滤法、反渗透；电泳法或干燥处理，例如氮气干燥、真空干燥箱干燥、冻干、在有机溶剂中洗涤并随后风干、流体床(liquid-bed)干燥、流化床(fluidised bed)干燥、喷雾干燥、滚筒干燥、层干燥(layer drying)、在室温下风干并随后在较小量溶剂中重构。
根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂特征特别在于它们含有10-250mg/ml，优选50-180mg/ml，特别优选100-150mg/ml的至少一种抗-EGFR抗体。
根据本发明的高浓缩液体制剂特征特别在于抗-EGFR抗体是单克隆的并且是鼠或人源的，优选是鼠源的，并且是嵌合的或人源化的。抗-EGFR抗体特别优选是Mab C225(西妥昔单抗)或Mab h425(EMD72000)和/或其变体和/或其片段。
本发明此外涉及高浓度的液体制剂，所述的该液体制剂含有至少一种通过根据本发明的方法，即通过上述的超滤方法获得的抗-EGFR抗体和/或其变体和/或片段之一。
本发明还涉及根据本发明的高浓度液体抗-EGFR抗体制剂作为存储稳定的药物。
除了含有根据本发明的抗体外，根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂任选地含有赋形剂和/或辅助剂和/或其它药学活性成分。
根据本发明的方法优选使得高浓度的制剂得以制备而不发生根据本发明抗体的不利的不希望的聚集。因此，具有高活性成分含量的现成溶液可采用根据本发明的方法制备。最近，对于非常高浓度的蛋白质活性成分制剂的需求增加。大多数用于治疗的抗体以mg/kg范围的剂量施用。待施用的高剂量和小体积(例如对于皮下施用，约1到1.5ml)显示了对于具有大于100mg/ml浓度的高浓度蛋白质制剂的需求。另外，高浓度的蛋白质制剂在研究可接受性和体外和体内功效(在动物模型中)的临床前试验中、在研究人体内的可接受性和功效的临床试验中和产品的临床使用中(特别是皮下施用)都有相当大的优点。特别地，它们的优点在于使用较小体积的制剂。相对于灌注或注射相对低浓度的蛋白质药物，这使得能够将例如蛋白质药物皮下施用于患者。皮下施用蛋白质药物可以有多种原因。例如，可以希望与“治疗窗口”有关的特异靶定。而且，皮下施用有这样的优点患者可以不依赖医务人员就可自己进行使用。胰岛素的例子清楚地表明了这些优点。然而，因为皮下施用注射最多为1-1.5ml，所以含有超过100mg/ml的高浓度蛋白质制剂通常是必要的。
令人惊奇的是，蛋白质浓度为10-250mg/ml，优选50-180mg/ml，特别优选100-150mg/ml的、不具有上述缺点的高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂可采用根据本发明的方法获得。
已知高浓度免疫球蛋白制剂的限制是在现成液体抗体制剂中通常为2-50mg/ml(Humira_)。然而，意外的是，使用根据本发明的方法也可制备明显更高浓度的并且仍然稳定的制剂。因此，根据本发明的方法使得能够获得高浓度稳定抗体制剂，所述的制剂与已知的高浓度液体抗体制剂比较，具有降低的粘度和聚集倾向，并且因此简化了肠胃外施用的处理。
根据本发明的制剂可有利地用于制备pH为4-10，优选pH为5-9并且重量摩尔渗透压浓度为250-350mOsmol/kg的含有抗体的溶液。从而，根据本发明的制剂可基本无痛地直接静脉内、动脉内和皮下施用。此制剂还可以加入灌注溶液中，例如葡萄糖溶液、等渗盐溶液、或者林格液，这些溶液可以还含有其它的活性成分，因此也使得能够施用相对大量的活性成分。
根据本发明的制剂是生理上良好耐受的，容易制备，能够精确分配以及在整个保存和运输和在多次冻融的过程中在含量、分解产物和聚集体方面优选是稳定的。优选地，它们可以在冰箱温度(2-8℃)和室温(23-27℃)以及60％的相对大气湿度(R.H.)下以稳定的方式保存很长时期。在升高的温度和大气湿度下根据本发明的制剂也优选是相当稳定的。
术语“有效量”表示可以在组织、系统、动物或人体引起例如研究人员或医生所寻求或期望的生物学或医学反应的药物或药学活性成分的量。
另外，术语“治疗有效量”表示一定量，其与没有接受该量的相应受试者相比，有以下结果疾病、综合征、疾病状态、不适、失调的改善的治疗、康复、预防或消除或者疾病副作用的预防或者疾病、不适或失调的发展减慢。术语“治疗有效量”还包含有效增加正常生理功能的量。
药物可以以剂量单位的形式施用，所述剂量单位为每个剂量单位包含预定量的活性成分。该类型的一个单位可以包含例如0.5mg到1g，优选地，1mg到800mg根据本发明的活性成分，这取决于治疗的疾病状态、施用方法和患者的年龄、体重和健康。优选的剂量单位制剂是包含活性成分的如上指出的日剂量或亚剂量，或者其相应的部分。而且，这种类型的药物可以通过药学领域周知的方法之一来制备。
药物可以适于通过任何所希望的适宜途径施用，例如通过经口(包括口含或舌下)、直肠、肺、鼻、局部(包括口含、舌下、或经皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内或动脉内)途径。这种类型的药物可以通过药学领域已知的所有方法来制备，例如，通过将活性成分与赋形剂或辅助剂组合。
肠胃外施用优选适于施用根据本发明的药物。在肠胃外施用的情况下，静脉内和皮下或皮内施用是特别优选的。在静脉内施用的情况下，可以直接进行注射或者也可以加入到灌注溶液中。
用于皮下或皮内施用的根据本发明的药物是特别适合的，因为通过根据本发明的高浓缩液体制剂可以实现皮下施用必要的施用的小体积。
皮下施用有这样的优点，即患者可以在没有专业的医务救护下自己施用药物。根据本发明的抗-EGFR抗体制剂还适合于制备欲肠胃外施用的药物制剂，其减缓、维持和/或控制活性成分的释放，例如也适合制备延迟释放的制剂，其对患者有益，因为只有在相对大的时间间隔才有必要进行施用。根据本发明的药物制剂还可以直接注射入肿瘤并因此可以直接在所预期的作用位点发挥它们的作用。
适于肠胃外施用的药物包括水性和非水性无菌注射溶液，其包含抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和溶质，通过它们可以使得制剂与待治疗的受者的血液等渗；适于肠胃外施用的药物还包括水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮介质和增稠剂。制剂可以用单剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶递送，并且以冷冻干燥(冻干)状态保存，从而，仅需要在即将使用前加入无菌载体液体，如注射用水。可以从无菌粉剂、粒剂和片剂按照配方制备注射液和悬浮液。
根据本发明的抗-EGFR抗体制剂还可以以脂质体递药系统，例如小单层脂质体、大单层脂质体和多复层脂质体的形式施用。脂质体可由多种磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺或卵磷脂形成。
可以将适于局部施用的药物引入至根据本发明的制剂，配制成软膏剂、乳膏、混悬剂、洗剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
对眼睛或其它外部组织，例如嘴和皮肤的治疗，制剂优选地引入至局部软膏剂或者乳膏并施用。在制剂为软膏剂的情况下，可以将根据本发明的制剂引入至石蜡或者水混溶的乳膏基质。备选地，可以配制根据本发明的制剂以得到具有水包油乳膏基质或者油包水基质的乳膏。
适于局部施用于眼睛的药物包括滴眼液。
适于经直肠施用的药物可以以栓剂或灌肠剂的形式递送。
适于通过吸入施用的药物包括细微的微粒粉尘或喷雾，其可以用气溶胶的多种类型的压力分配器喷雾器或吹入器产生。
适于阴道施用的药物可以作为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫、或喷雾制剂递送。
显而易见，除了上述特别提及的组分外，根据本发明的药物还可以包含本领域中常见的与特定类型的药物制剂有关的其它试剂。
此外，本发明涉及套药包(套药盒)，其由单独包装的a)含有有效量的抗-EGFR抗体，优选抗-EGFR的单克隆抗体，特别优选的是Mab C225(西妥昔单抗)或Mab(EMD 72000)和/或其变体或片段的根据本发明的制剂，和b)含有有效量的其它药物活性成分的制剂。
此套药包包含合适的容器，例如盒子或纸盒、单独的瓶子、袋子或安瓿。此套药包可以，例如含有分开的安瓿，每只含有根据本发明的制剂，其包含有效量的根据本发明的抗-EGFR抗体，以及处于溶解或冻干形式的其它药物活性成分的制剂。
根据本发明的抗-EGFR抗体的治疗有效量取决于许多因素，包括例如，患者的年龄和体重、需要治疗的精确的疾病状态，以及其严重性，制剂的性质和施用方法，并且最终由治疗医生或兽医决定。然而，用于治疗肿瘤生长，例如肠癌或乳腺癌时，本发明的抗-EGFR抗体的有效量通常为每天0.1到100mg/kg受试者(哺乳动物)体重的范围内，特别典型的是每天1到10mg/kg体重范围内。因此，对于体重在70kg的成年哺乳动物来说，实际每天的量通常是70-700mg，此剂量可以每天以单次剂量给药或者通常每天以一系列亚剂量(例如，二、三、四、五、或六次)给药，从而总的日剂量是相同的。合适的抗体滴度通过本领域技术人员已知的方法确定。建议施用的剂量对于实现所希望的肿瘤抑制作用通常是足够的。但是，还应该选择尽可能低的剂量从而不会发生副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等等。
根据本发明的药物尤其可用于疾病和疾病状态的预防和/或治疗。
因此，此外本发明还涉及根据本发明的高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂的用途，其用于制备治疗和/或预防肿瘤和/或肿瘤转移的药物，其中肿瘤选自脑肿瘤、泌尿生殖道肿瘤、淋巴系统的肿瘤、胃肿瘤、喉瘤、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌。
多种体外和体内的研究表明，可以通过抗肿瘤的抗体在多种水平上阻断EGFR，例如通过抑制癌细胞的增殖，减少肿瘤介导的血管发生，诱导癌细胞程序性细胞死亡和加强放射治疗和常规化学治疗的有毒效应。
含有根据本发明的制剂的药物能有效调节、调制或抑制EGFR，并因此可以用于预防和/或治疗与失调或者紊乱的EGFR活性有关的疾病。具体地，根据本发明的抗-EGFR抗体制剂因此可以用于治疗某些形式的癌症和病理性血管发生引起的疾病，例如糖尿病性视网膜病或炎症。
因此，本发明还涉及根据本发明的制剂的用途，用于制备治疗和/或预防由EGFR和/或EGFR介导的信号转导所引起、介导和/或传播的疾病的药物。
根据本发明的药物特别适合治疗和/或预防癌症，包括实体癌，例如，癌(例如肺、胰腺、甲状腺、膀胱或结肠的癌)、骨髓疾病(例如骨髓性白血病)或腺瘤(例如绒毛结肠腺瘤)、病理性血管发生和转移的细胞迁移。而且，所述药物还用于治疗依赖补体活化的慢性炎症(Niculescu等人(2002)Immunol.Res.，24191-199)和由HIV-1(人类1型免疫缺陷病毒)诱导的免疫缺陷(Popik等人(1998)J Virol，726406-6413)。
另外，本药物适宜作为哺乳动物特别是人类的EGFR诱导的疾病治疗中的药学活性成分。术语“EGFR诱导的疾病”涉及依赖EGFR活性的病理状态。EGFR直接或间接涉及多种细胞活性的信号转导通路，包括增殖、粘附和迁移、以及分化。与EGFR活性相关的疾病包括肿瘤细胞的增殖、病理性新血管形成，其促进实体瘤的生长，眼睛的新血管形成(糖尿病性视网膜病、年龄诱导的黄斑变性等等)和炎症(牛皮癣、类风湿性关节炎等等)。
这里讨论的疾病通常分为两组，高度增殖性和非高度增殖性疾病。在这方面，认为牛皮癣、关节炎、炎症、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、免疫性疾病、自身免疫病和免疫缺陷病是非癌性疾病，其中通常认为关节炎、炎症、免疫性疾病、自身免疫病和免疫缺陷病是非高度增殖性疾病。
在这方面，认为脑癌、肺癌、鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、结肠直肠癌、乳腺癌、头部癌症、颈部癌症、食管癌、妇科癌症、甲状腺癌、淋巴瘤、慢性白血病和急性白血病是癌性疾病，所有这些通常算在高度增殖性疾病中。特别地，癌性细胞生长以及特别是由EGFR直接和间接介导的癌性细胞的生长是代表本发明靶标的疾病。
研究表明，根据本发明的药物在异种移植物肿瘤模型中具有体内抗增殖作用。将根据本发明的药物施用于患有高增殖性疾病的患者，例如用以抑制肿瘤生长、减轻淋巴组织增生性疾病相关的炎症、抑制移植排斥或组织修复所导致的神经损伤，等等。本发明的药物可用于预防或治疗目的。此处所用的术语“治疗”用于指疾病的预防和对现有疾病的治疗。通过在明显的疾病发展之前施用根据本发明的药物以达到对增殖的预防，例如防止肿瘤生长、防止转移性生长、减少与心血管手术相关的再狭窄，等等。
另外，此药物通过稳定或改善患者的临床症状用于慢性疾病的治疗。
宿主或患者可以属于任意哺乳动物物种，例如灵长类，特别是人类；啮齿动物，包括小鼠、大鼠和仓鼠；兔、马、奶牛、狗、猫等等。动物模型对于实验研究是重要的，其提供了治疗人类疾病的模型。
某些细胞对于用根据本发明的药物治疗的感受性可以用体外试验来确定。通常，将细胞培养物用不同浓度的根据本发明的药物孵育一段时间，此时间足够使活性成分诱导细胞死亡或抑制迁移，通常约一小时到一周。体外试验可以用从活组织检查样品得到的细胞进行。随后对处理后剩下的活细胞计数。
剂量随所用的特定药物、特定疾病、患者的状态等等而改变。通常，治疗剂量是足够的以便显著减小目标组织中不希望的细胞群体，而保持患者的生命力。通常治疗持续进行直到发生显著减少，例如减少至少大约50％的特定细胞数，并且可以持续到基本上在体内检测不到不希望的细胞。
很多测定系统都可以用来鉴定EGFR抑制剂。在闪烁接近测定法(Sorg等人，J.of Biomolecular Screening，2002，7，11-19)和闪板(flashplate)测定法中，使用γATP测定作为底物的蛋白质或肽的放射性磷酸化。在抑制性化合物存在下，可以检测到减小的放射性信号或根本没有信号。而且，均相时间分辨荧光共振能量转移(HTR-FRET)和荧光偏振(FP)技术通常用作测定方法(Sills等人.，J.of Biomolecular Screening，2002，191-214)。
其它非放射性ELISA测定方法使用特定的磷抗体(phospho-ABs)。此磷抗体只结合磷酸化底物。这种结合可以使用结合有过氧化物酶的抗绵羊二级抗体通过化学发光进行检测(Ross等人，2002，Biochem.J.，待出版，手稿BJ20020786)。
有许多疾病和疾病状态与细胞增殖和细胞死亡(程序性细胞死亡)的失调有关。通过根据本发明的药物可以治疗、预防或改善的疾病和疾病状态包括下面列出的疾病和疾病状态，但并不局限于此。根据本发明的药物可用于治疗和/或预防很多不同的疾病和疾病状态，其涉及血管内膜层平滑肌细胞和/或炎症细胞的增殖和/或迁移，而导致通过该血管的血流受限，例如导致新内膜闭塞性损伤。重要的闭塞性移植血管疾病包括动脉粥样硬化、移植后的冠状血管疾病、静脉移植狭窄、临近吻合的假体再狭窄、血管成形术或支架放置后的再狭窄等等。
本发明涉及根据本发明的药物在治疗或预防肿瘤方面的用途。因此，本发明特别优选地涉及根据本发明的液体抗-EGFR抗体制剂在制备治疗和/或预防肿瘤和/或肿瘤转移的药物中的用途，其中所述肿瘤尤其优选地选自脑肿瘤、泌尿生殖道肿瘤、淋巴系统的肿瘤、胃肿瘤、喉瘤、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，但并不局限与此。
本发明还涉及根据本发明的药物在制备治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自由鳞状细胞癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、肾癌、结肠直肠癌、乳腺癌、头癌、颈癌、食道癌、妇科癌症、甲状腺癌、淋巴瘤、慢性白血病和急性白血病组成的癌性疾病。
根据本发明的药物可以施用于患者以治疗肿瘤。所述药物抑制肿瘤血管生成并因此影响肿瘤的生长(J.Rak等人，CancerResearch，554575-4580，1995)。根据本发明的药物的抑制血管生成的特性还适用于治疗与视网膜新血管形成相关的某些形式的失明。
因此，本发明还涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂的用途，用于制备治疗和/或预防由血管生成引起、介导和/或传播的疾病的药物。
与血管生成有关的此类型的一种疾病是眼病，例如视网膜血管形成、糖尿病性视网膜病、年龄诱导的黄斑变性等等。
因此，本发明还涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂的用途，用于制备治疗和/或预防选自视网膜血管形成、糖尿病性视网膜病、年龄诱导的黄斑变性和/或炎症疾病的药物。
而且，本发明涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂的用途，用于治疗和/或预防选自牛皮癣、类风湿性关节炎、接触性皮炎、迟发型过敏反应、炎症、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、免疫疾病、自身免疫病和免疫缺陷病的疾病。
本发明还涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂在治疗和/或预防选自骨肉瘤、骨关节炎和佝偻病的骨病理中的用途。
根据本发明的药物还可以用于在某些现有肿瘤化学疗法和放射疗法中提供相加或者协同效果，和/或可用于恢复某些现有的化学疗法和放射疗法的功效。
因此，本发明还涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂的用途，用于制备治疗和/或预防疾病的药物，其中治疗有效量的根据本发明的抗-EGFR抗体与选自下面的化合物组合施用1)雌激素受体调节剂；2)雄激素受体调节剂；3)类视黄醇受体调节剂；4)细胞毒性剂；5)抗增殖剂；6)异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂；7)HMG-CoA还原酶抑制剂；8)HIV蛋白酶抑制剂；9)逆转录酶抑制剂；10)生长因子受体抑制剂和11)血管生成抑制剂。
因此，本发明还涉及根据本发明的抗-EGFR抗体制剂的用途，用于制备治疗和/或预防疾病的药物，其中治疗有效量的根据本发明的抗-EGFR抗体与放射疗法和选自下面的化合物组合施用1)雌激素受体调节剂；2)雄激素受体调节剂；3)类视黄醇受体调节剂；4)细胞毒性剂；5)抗增殖剂；6)异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂；7)HMG-CoA还原酶抑制剂；8)HIV蛋白酶抑制剂；9)逆转录酶抑制剂；10)生长因子受体抑制剂和11)血管生成抑制剂。
根据本发明的药物因此可以与其它熟知的治疗剂一起施用，所述治疗剂因其针对所治疗的疾病特别有用而被选择。例如，在骨疾病的情况下，将有利的组合包括与如下治疗剂的组合抗再吸收的二膦酸盐，例如阿仑特罗和利塞膦酸钠；整联蛋白阻断剂(如下文进一步定义)，如αVβ3拮抗剂；用于激素代替疗法的缀合的雌激素，例如Prempro_、Premarin_和Endometrion_；选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，例如雷洛昔芬、着洛西芬、CP-336.156(Pfizer)和拉索昔芬；组织蛋白酶K抑制剂和ATP质子泵抑制剂。
本发明的药物还适合与已知的抗癌剂组合。这些已知的抗癌剂包括下面的雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视黄醇受体调节剂、细胞毒性剂、抗增殖剂、异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、生长因子受体抑制剂和血管生成抑制剂。本发明化合物特别适合与放射疗法同时施用。
“雌激素受体调节剂”指干扰或抑制雌激素与受体结合的化合物，不管其机制如何。雌激素受体调节剂的实例包括，但不仅限于他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、2，2-二甲基-丙酸4-[7-(2，2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]苯酯、4，4’-二羟基二苯甲酮-2，4-二硝基苯腙和SH646。
“雄激素受体调节剂”指干扰或抑制雄激素与受体结合的化合物，不管其机制如何。雄激素受体调节剂的实例包括非那雄胺和其它5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑和乙酸阿比特龙。
“类视黄醇受体调节剂”指干扰或抑制类视黄醇与受体结合的化合物，不管其机制如何。类视黄醇受体调节剂的实例包括贝沙罗汀、维甲酸、13-顺式-视黄酸、9-顺式-视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反式-N-(4’-羟基苯基)retinamide和N-4-羧基苯基retinamide。
“细胞毒性剂”指主要通过直接作用于细胞功能或抑制或干扰细胞有丝分裂导致细胞死亡的化合物，包括烷化剂、肿瘤坏死因子、嵌入剂、微管蛋白抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。细胞毒性剂的实例包括，但不限于替拉扎明、sertenef、肿瘤坏死因子、异磷酰胺、他索纳明、氯尼达明、卡铂、六甲密胺、泼尼莫司汀、二溴甜醇、雷诺氮芥、福替目丁、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、heptaplatin、雌氮芥、二丙胺磺酯、氯乙环磷酰胺、尼莫司汀、螺溴丙酰胺、嘌米舌泊、洛巴铂、沙铂、甲基丝裂霉素、顺铂、伊罗夫文、dexifosfamide、顺式-胺二氯(2-甲基吡啶)铂、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、(反式，反式，反式)-双-μ-(己烷-1，6-二胺)-μ-[二胺-铂(II)双[二胺(氯)铂(II)]四氯化物、diarizidinyl-精胺、三氧化二砷、1-(11-十二烷基氨基-10-羟基十一烷基)-3，7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、必桑郡、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮、3’-脱氨基-3’-吗啉代-13-脱氧-10-羟基洋红霉素、安那霉素、加柔比星、依利奈法德、MEN10755和4-去甲氧基-3-脱氨基-3-吖丙啶基-4-甲基磺酰基柔红霉素(见(WO 00/50032)。
微管抑制剂的实例包括紫杉醇、硫酸长春地辛、3’，4’-双脱氢-4’-去氧-8’-去甲长春花碱、多西他赛、根霉素、多拉司他汀、羟乙基磺酸米伏布林、auristatin、西马多丁、RPR109881、BMS184476、长春氟宁、cryptophycin、2，3，4，5，6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)-苯磺酰胺、脱水长春花碱、N，N-二甲基-L-缬氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-缬氨酰-L-脯氨酰-L-脯氨酸-叔丁基酰胺、TDX258和BMS188797。
拓扑异构酶抑制剂的一些实例是拓扑替康、hycaptamine、伊立替康、卢比替康、6-乙氧基丙酰基-3’4’-O-外苄叉教酒菌素、9-甲氧基-N，N-二甲基-5-硝基吡唑并[3，4，5-kl]吖啶-2-(6H)-丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’b，7]中氮茚并[1，2b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮、lutotecan、7-[2-(N-异丙基氨基)乙基]-(20S)喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2’-二甲基氨基-2’-去氧依托泊苷、GL331、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-9-羟基-5，6-二甲基-6 H-吡啶并[4，3-b]咔唑-1-甲酰胺、asulacrine、(5a，5aB，8aa，9b)-9-[2-[N-[2-二甲基-氨基]乙基]-N-甲基氨基]乙基]-5-[4-羟基-3，5-二甲氧基苯基]-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并(3’，4’，6，7)萘并(2，3-d)-1，3-间二氧杂环戊烯-6-酮、2，3-(亚甲二氧基)-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]菲啶_、6，9-双[(2-氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5，10-二酮、5-(3-氨基丙基氨基)-7，10-二羟基-2-(2-羟基乙氨基甲基)-6H-吡唑并[4，5，1-de]吖啶-6-酮、N-[1-(2-(二乙基氨基)乙基氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-噻吨-4-基甲基]甲酰胺、N-(2-(二甲基-氨基)乙基)吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2，1-c]-喹啉-7-酮和地美司钠。
“抗增殖剂”包括反义RNA和RNA寡核苷酸，例如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231、和INX3001，以及抗代谢物，例如依诺他滨、卡莫氟、喃氟啶、喷司他丁、去氧氟尿苷、三甲曲沙、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷酯、fosteabine sodium hydrate、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋林、脱氧氮杂胞苷、诺拉曲塞、培美曲塞、nelzarabine、2’-去氧-2’-亚甲基胞苷、2’-氟亚甲基-2’-去氧胞苷、N-[5-(2，3-二氢苯并呋喃基)磺酰基]-N’-(3，4-二氯苯基)脲、N6-[4-去氧-4-[N2-[2(E)，4(E)-十四烷二烯酰基]甘氨酰氨基]-L-甘油基-B-L-甘露庚糖吡喃基]腺嘌呤、aplidine、ecteinascidin、沙曲他滨、4-[2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-b]-1，4-噻嗪-6-基(S)-乙基]2，5-噻吩基-L-谷氨酸、氨基喋呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨甲酰基氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-_-1，11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)四癸-2，4，6-三烯-9-基乙酸酯、苦马豆碱、洛美曲索、右丙亚胺、甲硫氨酸酶、2’-氰基-2’-去氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶和3-氨基吡啶-2-carboxaldehyde氨硫脲。“抗增殖剂”除了上面“血管生成抑制剂”下列出的那些还包括抗生长因子的单克隆抗体，例如曲妥单抗，以及肿瘤抑制基因，例如p53，它可以通过重组病毒介导的基因转移递送(例如，见美国专利号6,069,134，)。根据本发明的药物还可以与所有本领域技术人员已知的所有其他治疗性抗体或者适合与上述疾病联系的药物活性成分联合施用。
而且，根据本发明的抗-EGFR抗体制剂可以用于分离和研究EGFR的活性或表达。另外，它们特别适合用于与失调或者紊乱的EGFR活性有关的疾病的诊断方法中。
对于诊断目的，根据本发明的抗体可以例如经放射性标记。优选的标记方法是iodogen方法(Fraker等人，1978)。对于诊断目的，抗体特别优选地用作F(ab’)2片段。从而得到了非常好的结果，说明背景扣除不是必须的。此类型的片段可以通过已知的方法制备(例如，Herlyn等人，1983)。一般来说，在酸性pH条件进行胃蛋白酶消化，并且用蛋白A SepharoseTM层析法将片段与未消化的IgG和重链片段分离。
在根据本发明的制剂中的抗-EGFR抗体优选地显示出有利的生物学活性，它可以用酶测定法容易地检测，如在实施例中描述的那样。在这种类型的基于酶的测定法中，根据本发明的抗体优选地显示并引起抑制效应，这通常用合适的范围内的IC50值来记录，所述范围优选为微摩尔范围内，更加优选纳摩尔范围。
根据本发明的制剂中的根据本发明的抗体的蛋白质大小、结构的完整性、纯度或糖基化模式的测定包括但不限于SE-HPLC、肽作图(消化)、N-末端测序、SDS-PAGE、TRIS/甘氨酸梯度凝胶电泳(非还原的)、FTIR(傅立叶变换红外光谱)法、CD(圆二色性)、RAMAN光谱法、糖染色(PAS法)、寡糖谱、测定单糖组成或等电聚焦。
根据本发明的制剂的稳定性可以例如但不限于通过稳定性程序确定，例如长时间保存于25℃和60％的相对大气湿度，以及40℃和70％的相对大气湿度，并例如通过上述测定方法(SE-HPLC、FT-IR、SDS-PAGE(还原或非还原的))在规则的时间间隔测定蛋白质的稳定性或结构完整性。
用于测定根据本发明的制剂中的根据本发明的抗体的生物学活性或功效的方法包括但不限于例如ELISA、生物学细胞测定法、FTIR或CD。
用于测定根据本发明的高浓度制剂的聚集倾向减小的方法包括但不限于，例如视觉检查、亚可见颗粒分析、浊度法或比浊法、动态光散射鉴定。
实施例1通过切向流过滤(TFF)制备高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂在20psi的进口压力和10psi的出口压力下，采用Labscale TFF系统(Millipore)将380ml蛋白质(17mg/ml，于10mM磷酸盐+145mM NaCl，pH7.2中)浓缩226分钟，所述的Labscale TFF系统(Millipore)具有截止分子量为30kDa的内置聚醚砜超滤膜。获得的保留液具有约132mg/ml的蛋白质浓度。产率为85％。
或者在20psi的进口压力和10psi的出口压力下，采用Labscale TFF系统(Millipore)将470ml蛋白质(17mg/ml，于10mM柠檬酸盐中)浓缩226分钟，所述的Labscale TFF系统(Millipore)具有截止分子量为30kDa的内置聚醚砜超滤膜。获得的保留液具有大约123mg/ml的蛋白质浓度。产率为95％。
实施例2通过搅拌超滤制备高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂在4巴的氮气压力下，通过Amicon stirred cell将25ml的蛋白质(10mg/ml，于10mM磷酸盐+145mM NaCl，pH 7.2中)浓缩144分钟，所述的Amicon stirred cell具有截止分子量为30kDa的内置聚醚砜超滤膜。获得的保留液具有大约92mg/ml的蛋白质浓度。产率为95％。
或者在4巴的氮气压力下，通过Amicon stirred cell将25ml的蛋白质(10mg/ml，于10mM柠檬酸盐，pH 5.5中)浓缩168分钟，所述的Amiconstirred cell具有截止分子量为30kDa的内置聚醚砜超滤膜。获得的保留液具有大约82mg/ml的蛋白质浓度。产率为95％。
实施例3在离心力作用下通过超滤制备高浓度的液体抗-EGFR抗体制剂将15ml的蛋白质(2mg/ml，于10mM磷酸盐+145mM NaCl，pH7.2中)在Ultrafree离心管(Millipore)中以2000*g离心90分钟，所述的离心管具有截止分子量为30kDa的聚醚砜超滤膜。获得的保留液具有大约116mg/ml的蛋白质浓度。产率为95％。
实施例4研究高浓度的液体抗EGFR抗体制剂的可溶性聚集体通过SE-HPLC研究实施例1-3中获得的保留液的可溶性聚集体含量。这里浓缩后的单体比率＞99％。
实施例5研究高浓度的液体抗EGFR抗体制剂的天然性(nativity)通过FT-IR光谱测定法研究实施例1中获得的保留液。在这里，在通过切向流过滤浓缩之前的初始材料的酰胺I-2衍生光谱与获得的保留液的酰胺I-2衍生光谱相符合。
权利要求
1.制备含有至少一种抗-EGFR抗体和/或其变体和/或片段之一的高浓缩液体制剂的方法，所述方法是通过超滤进行的。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于获得的高浓缩液体制剂具有10-250mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于获得的高浓缩液体制剂具有50-180mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于获得的高浓缩液体制剂具有100-150mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
5.根据权利要求1-4的一项或多项所述的方法，其特征在于抗-EGFR抗体是单克隆的并且是鼠或人源的。
6.根据权利要求1-5的一项或多项所述的方法，其特征在于抗-EGFR抗体是鼠源的并且是嵌合的或人源化的。
7.根据权利要求1-6的一项或多项的方法，其特征在于抗-EGFR抗体是Mab C225(西妥昔单抗)或Mab h425(EMD72000)。
8.高浓缩液体制剂，其含有至少一种抗-EGFR抗体和/或它的变体和/或片段之一。
9.根据权利要求8的高浓缩液体制剂，其特征在于高浓缩液体制剂具有10-250mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
10.根据权利要求8的高浓缩液体制剂，其特征在于高浓缩液体制剂具有50-180mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
11.根据权利要求8的高浓缩液体制剂，其特征在于高浓缩液体制剂具有100-150mg/ml的抗-EGFR抗体含量。
12.根据权利要求8-11的一项或多项的高浓缩液体制剂，其特征在于抗-EGFR抗体是单克隆的并且是鼠或人源的。
13.根据权利要求8-12的一项或多项的高浓缩液体制剂，其特征在于抗-EGFR抗体是鼠源的并且是嵌合的或人源化的。
14.根据权利要求8-13的一项或多项的高浓缩液体制剂，其特征在于抗-EGFR抗体是Mab C225(西妥昔单抗)或Mab h425(EMD72000)。
15.含有至少一种抗-EGFR抗体和/或它的变体和/或片段之一的高浓缩液体制剂，其是根据权利要求1-7的一项或多项的方法获得的。
16.根据权利要求8-15的一项或多项的高浓缩液体制剂，其作为保存稳定的药物。
17.根据权利要求8-16的一项或多项的高浓缩液体制剂，其特征在于其任选地包含赋形剂和/或辅助剂和/或其它药学活性成分。
18.根据权利要求8-17的一项或多项的高浓缩液体制剂的用途，其用于制备药物。
19.根据权利要求8-17的一项或多项的高浓缩液体制剂的用途，其用于制备治疗和/或预防肿瘤和/或肿瘤转移的药物。
20.根据权利要求19的用途，其中肿瘤选自脑肿瘤、泌尿生殖道肿瘤、淋巴系统的肿瘤、胃肿瘤、喉瘤、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌。
全文摘要
本发明涉及用于通过超滤制备高浓缩液体制剂的方法，其中所述的液体制剂含有至少一种抗－EGFR抗体和/或其变体和/或片段之一，特别是抗EGF受体的单克隆抗体，特别优选Mab C225(西妥昔单抗)和Mab h425(EMD72000)。此外本发明涉及抗－EGFR抗体，特别是抗EGF受体的单克隆抗体，特别优选Mab C225(西妥昔单抗)和Mab h425(EMD72000)和/或其变体和/或片段的高浓缩液体制剂。本发明的特征在于高浓缩液体制剂具有10－250，优选50－180mg/ml，特别优选100－150mg/ml的抗－EGFR抗体的含量。最后，本发明涉及这些制剂的用途。
文档编号A61P35/00GK1953768SQ200580004883
公开日2007年4月25日 申请日期2005年1月27日 优先权日2004年2月12日
发明者S·马瑟斯, H-C·马勒 申请人:默克专利有限公司
最新回复(0)