作为蛋白激酶抑制剂的化合物和组合物的制作方法
专利名称：作为蛋白激酶抑制剂的化合物和组合物的制作方法
相关申请的交叉参考本申请要求2004年2月14日提交的美国临时专利申请号60/544,944的优先权。将该申请的全部披露内容完整地并为所有目的引入本文作为参考。
背景技术：
发明领域本发明提供了一类新的化合物、包括这类化合物的药物组合物和使用这类化合物治疗或预防与异常或失调的激酶活性相关的疾病或病症的方法，所述疾病或病症特别是涉及FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和c-Met激酶异常活化的疾病或病症。
背景技术：
蛋白激酶代表一大族蛋白质，它们在调节各种细胞过程和维持对细胞功能的控制方面起中心作用。这些激酶的部分非限制性实例包括受体酪氨酸激酶，如血小板衍生的生长因子受体激酶(PDGF-R)、干细胞因子的受体激酶、c-kit、神经生长因子受体、trlcB、c-Met和成纤维细胞生长因子受体、FGFR3；非受体酪氨酸激酶，如Abl和融合激酶BCR-Abl、粘着斑激酶(FAK)、Fes、Lck和Syk；和丝氨酸/苏氨酸激酶，如b-RAF、MAP激酶(例如MKK6)和SAPK2β。已经在许多疾病状态中观察到异常激酶活性，包括良性和恶性增殖性病症以及因免疫和神经系统不适当激活产生的疾病。
本发明的新化合物抑制一种或多种蛋白激酶的活性，由此预计它们可用于治疗与激酶相关的疾病。
发明概述本发明一方面提供了选自式Ia、Ib、Ic、Id和Ie的化合物及其N-氧化物衍生物、前体药物衍生物、被保护的衍生物、各异构体和异构体混合物以及这类化合物的药学上可接受的盐和溶剂合物(例如水合物) 其中n选自0、1和2；m选自0、1、2和3；W选自-NR4-、-S-、-O-、-S(O)-和-S(O)2-；其中R4选自氢和C1-6烷基；R1选自C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基-C0-4烷基和C3-8杂环烷基-C0-4烷基；其中R1的任意芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基烷基或杂环烷基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-12环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、卤素-取代的-C1-6烷氧基、-XNR5R5、-XNR5XNR5R5、-XNR5XOR5、-XOR5、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XC(O)NR5R5、-XOXR6和-XC(O)R6；其中X为键或C1-6亚烷基；R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；且R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；其中R1的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基取代基进一步可选地被1-5个独立地选自C1-6烷基和C1-6烷氧基的基团取代；R2选自C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基-C0-4烷基和C3-8杂环烷基-C0-4烷基；其中R2的任意芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基烷基或杂环烷基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、卤素-取代的-C1-6烷氧基、C3-8杂芳基C0-4烷基、-XNR5R5、-XOR5、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XSNR5R5、-XS(O)NR5R5、-XS(O)2NR5R5、-XC(O)OR5、-XOC(O)R5、-XC(O)R5、-XC(O)NR5XNR5R5、-XC(O)NR5R5、XC(O)NR5XC(O)OR5、-XC(O)NR5XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5XNR5C(O)OR5、-XC(O)NR5XOR5、-XC(O)N(XOR5)2、-XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5R6、-XC(O)R6、-XR7、-XR6和-XC(O)NR5XR7；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；且R7为氰基；R3选自卤素、羟基、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XC(O)R5和-XC(O)OR5；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基。
本发明第二方面提供了药物组合物，它含有式I化合物或其N-氧化物衍生物、各异构体和异构体混合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种合适的赋形剂。
本发明第三方面提供了治疗动物疾病的方法，其中抑制激酶活性、特别是FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、cKit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和/或c-Met活性可以预防、抑制或改善所述疾病的病理学和/或症状学，该方法包括对所述动物给予治疗有效量的式I化合物或其N-氧化物衍生物、各异构体和异构体混合物或其药学上可接受的盐。
本发明第四方面提供了式I化合物在制备用于治疗动物疾病的药物中的用途，其中激酶活性、特别是FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、cKit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和/或c-Met活性对所述疾病的病理学和/或症状学有作用。
本发明第五方面提供了制备式I化合物及其N-氧化物衍生物、前体药物衍生物、被保护的衍生物、各异构体和异构体混合物或其药学上可接受的盐的方法。
发明详述定义“烷基”作为基团和作为其它基团例如卤素-取代的烷基和烷氧基的结构部分，可以为直链或支链的。C1-4烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。卤素-取代的烷基包括三氟甲基、五氟乙基等。
“芳基”指的是含有6-10个环碳原子的单环或稠合双环芳族环组合。例如，芳基可以为苯基或萘基，优选苯基。“亚芳基”指的是衍生自芳基的二价基团。“杂芳基”如对芳基所定义，其中一个或多个环成员为杂原子。例如杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并-咪唑基、嘧啶基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
“环烷基”指的是含有所示环原子数的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥连多环组合。例如，C3-10环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
“杂环烷基”指的是如本申请中所定义的环烷基，条件是所示环碳中的一个或多个被选自-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-的部分替代，其中R为氢、C1-4烷基或氮保护基。例如，作为本申请中用于描述本发明化合物的C3-8杂环烷基包括吗啉代、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、哌啶基酮、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基、1，1-二氧代-116-硫吗啉-4-基等。
“卤素”(或卤代)优选表示氯或氟，也可以是溴或碘。
“治疗”指的是减轻或缓解疾病和/或其伴随症状的方法。
优选实施方案的描述本发明的化合物可用于抑制激酶并且由发明概述中详细描述的式I化合物所示。在一个实施方案中，关于式Ia、Ib、Ic、Id和Ie的化合物，W选自-NR4-和-O-；其中R4选自氢和C1-6烷基。
在另一个实施方案中，R1选自C6-10芳基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基；其中R1的任意芳基烷基和杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、C5-10杂芳基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、-XNR5R5、-XOR5、-XSR5、-XNR5XNR5R5、-XNR5XOR5、-XC(O)NR5R5、-XOXR6和-XC(O)R6；其中X为键或C1-6亚烷基；R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；且R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；其中R1的任意杂芳基取代基进一步可选地被1-5个C1-6烷基取代。
在另一个实施方案中，R2选自C6-10芳基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、C3-8杂芳基-C0-4烷基、-XNR5R5、-XOR5、-XSR5、-XS(O)2NR5R5、-XC(O)OR5、-XOC(O)R5、-XC(O)NR5XNR5R5、-XC(O)NR5XC(O)OR5、-XC(O)NR5XNR5C(O)R5-XC(O)NR5XNR5C(O)OR5、-XC(O)NR5XOR5、-XC(O)N(XOR5)2、-XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5R6、-XC(O)R6、-XR7、-XR6和-XC(O)NR5XR7；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；且R7为氰基。
在另一个实施方案中，R3选自卤素、羟基、-XC(O)R5和-XC(O)OR5；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基。
在另一个实施方案中，W选自-NH-和-O-；且R1选自苯基、苄基、5，6，7，8-四氢-萘基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基、1H-吲唑-7-基、茚满-4-基和1H-吲哚基；其中R1的任意芳基烷基和杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自甲氧基、甲基、氨基、卤素、羟甲基、羟基、喹喔啉基、乙基、吡啶基、甲氧基-苯基、哌嗪基-羰基、乙基-(2-羟基-乙基)-氨基2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙氧基、氨基甲酰基、异丙基，甲基-硫基、三-氟-甲基、乙氧基、3-异丙基氨基-丙基氨基、二甲氨基、吗啉代、环丙基-甲氧基、丁氧基、环庚基-氧基和1，4，5，7-四甲基-吡咯并[3，4-d]哒嗪基。
在另一个实施方案中，R2选自吡啶基、苯基、噻唑基、吡啶基-甲基、吡啶基-乙基、噻吩基、苄基、喹啉基、7-氧代-5，6，7，8-四氢-萘基、萘基和嘧啶基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、甲基、丙基-氨磺酰基、甲基-氨磺酰基、甲氧基、甲基-羧基、2-二甲氨基-乙基-氨基甲酰基、羧基、氨基、氰基-乙基、氰基-甲基、乙烯基、三-氟-甲基、羟甲基、乙基、甲基-硫基、丁基、异丁基、羧基-甲基-甲酰胺基、1-羧基-乙基-甲酰胺基、羧基-乙基、氨基-乙基-甲酰胺基、氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-乙基-甲酰胺基、二甲氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基-甲基、2-(2-二甲氨基-乙基氨基甲酰基)-乙基、2-(2-二甲氨基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-乙基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-丙基-甲酰胺基)-乙基、2-(丙基-甲酰胺基)-乙基、氨基-丙基-甲酰胺基-甲基、2-(甲基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、2-(乙基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、吗啉代-乙基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-甲基、氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、环丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基-甲基、二甲基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基-甲基、羟基-丙基-甲酰胺基-甲基、N，N-双-(3-羟基-丙基)-甲酰胺基、环戊基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基-甲基、环戊基-甲酰胺基-甲基、氰基-乙基-甲酰胺基、氰基-甲基-甲酰胺基、吡咯烷基-乙基-甲酰胺基、2-(异丁基-甲酰胺基)-乙基、1H-四唑基、2-(1H-四唑-5-基)-乙基、2-(1H-四唑-5-基)-甲基、2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-甲基、乙酰基-氨基、环丙基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基、羟基-丙基-甲酰胺基、丙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基、1-甲基-哌啶-4-基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-乙基、甲氧基-羰基-甲基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基-甲基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-乙基、1-甲酰基-吡咯烷-2-基-甲酸、(1-羧基-3-甲基-丁基)-甲酰胺基、2-(甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基)-乙基、1-羧基-(2，2-二甲基-丙基)-甲酰胺基、3-叔丁氧基羰基-氨基-丙基-甲酰胺基、乙酰氧基-甲基和1-羧基-乙基-甲酰胺基。
在另一个实施方案中，n为0或1；m是0或1；且R3选自卤素、羟基、-C(O)OH和-C(O)OCH3。
在另一个实施方案中，为式Ig的化合物 其中R2选自吡啶基、苯基、噻唑基、吡啶基-甲基、吡啶基-乙基、噻吩基、苄基、喹啉基、7-氧代-5，6，7，8-四氢-萘基、萘基和嘧啶基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、甲基、丙基-氨磺酰基、甲基氨磺酰基、甲氧基、甲基-羧基、2-二甲氨基-乙基-氨基甲酰基、羧基、氨基、氰基乙基、氰基-甲基、乙烯基、三-氟-甲基、羟甲基、乙基、甲基-硫基、丁基、异丁基、羧基-甲基-甲酰胺基、1-羧基-乙基-甲酰胺基、羧基-乙基、氨基-乙基甲酰胺基、氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-乙基-甲酰胺基、二甲氨基丙基-甲酰胺基、二甲氨基-丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基-甲基、2-(2-二甲氨基-乙基氨基甲酰基)-乙基、2-(2-二甲氨基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-乙基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-丙基-甲酰胺基)-乙基、2-(丙基-甲酰胺基)-乙基、氨基-丙基-甲酰胺基-甲基、2-(甲基-氨基-氨基甲酰基)乙基、2-(乙基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、吗啉代-乙基-甲酰胺基、吗啉代-羰基甲基、氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、环丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基-甲基、二甲基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基-甲基、羟基-丙基-甲酰胺基-甲基、N，N-双-(3-羟基-丙基)-甲酰胺基、环戊基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基-甲基、环戊基-甲酰胺基-甲基、氰基-乙基-甲酰胺基、氰基-甲基-甲酰胺基、吡咯烷基-乙基-甲酰胺基、2-(异丁基-甲酰胺基)-乙基、1H-四唑基、2-(1H-四唑-5-基)-乙基、2-(1H-四唑-5-基)-甲基、2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-甲基、乙酰基-氨基、环丙基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基、羟基-丙基-甲酰胺基、丙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基、1-甲基-哌啶-4-基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-乙基、甲氧基-羰基-甲基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基-甲基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-乙基、1-甲酰基-吡咯烷-2-基-甲酸、(1-羧基-3-甲基-丁基)-甲酰胺基、2-(甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基)-乙基、1-羧基-(2，2-二甲基-丙基)-甲酰胺基、3-叔丁氧基羰基-氨基-丙基-甲酰胺基、乙酰氧基-甲基和1-羧基-乙基-甲酰胺基。
下文实施例和表I中详细描述了式I的优选化合物。
药理学和应用本发明的化合物调节蛋白酪氨酸激酶活性并且照此可用于治疗其中蛋白酪氨酸激酶、特别是FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和c-Met激酶对所述疾病的病理学和/或症状学有作用的疾病或病症。
粘着斑激酶(FAK)，即一种非受体-蛋白酪氨酸激酶，位于细胞基质-胞外基质(ECM)接触位点，后者作为信号传导蛋白的细胞骨架相关网状结构的部分起作用(Schlaepfer等，Prog.Diophys.，Mol.，1999，71，435-478)。在粘附细胞中，FAK通常与粘着斑上的整联蛋白相关(Schlaepfer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，5192-5196)。FAK磷酸化导致促分裂原活化蛋白激酶途径的活化。FAK的过量表达涉及癌症进展。高水平的FAK与结肠肿瘤(Weiner，T.M.等，Lancet，1993，342，1024-1025)、乳腺肿瘤(Owens，L.V.等，Cancer Res.，1995，55，2752-2755)和口腔癌(Kornberg，L.J.，HeadNeck，1998，20，634-639)中的侵袭力和转移可能性有关。FAK在细胞迁移中的作用已经导致如下推断，即它可能与其它疾病相关，如胚胎发育机能障碍和血管生成性病症(Kornberg，L.J.，Head Neck，1998，20，634-639)。
Abelson酪氨酸激酶(即Abl，c-Abl)涉及于细胞周期的调节、细胞对基因毒性应激的反应和有关细胞环境的信息通过整联蛋白信号传导的传播。总之，看来Abl蛋白作为整合各种来自胞外和胞内来源的信号并影响细胞周期和编程性细胞死亡判断的细胞组件。发挥复杂的作用。Abelson酪氨酸激酶包括亚型衍生物，如酪氨酸激酶活性失调的嵌合融合体(癌蛋白)BCR-Abl或v-Abl。BCR-Abl在95％的慢性髓细胞性白血病(CML)和10％的急性淋巴细胞性白血病中的发病机理中是关键性的。STI-571(Gleevec)为致癌的BCR-Abl酪氨酸激酶抑制剂并且用于治疗慢性髓性白血病(CML)。然而，处于CML急性发作阶段中的某些患者因BCR-Abl激酶中的突变而耐受STI-571。迄今为止已经报导了22种以上的突变，其中最常见的为G250E、E255V、T315I、F317L和M351T。
本发明的化合物抑制abl激酶，尤其是v-abl激酶。本发明的化合物还抑制野生型BCR-Abl激酶和BCR-Abl激酶突变，并且由此适合于治疗Bcr-abl-阳性癌症和肿瘤疾病，如白血病(尤其是慢性髓性白血病和急性成淋巴细胞性白血病，其中尤其是发现了编程性细胞死亡的作用机理)，并且还表现出对白血病干细胞亚群的作用，以及在除去所述细胞(例如骨髓移除)后在体外纯化这些细胞并且一旦其癌细胞被清除，再植入所述细胞(例如再植入纯化的骨髓细胞)的可能性。
PDGF(血小板衍生生长因子)为极为常见出现的生长因子，它在正常生长和病理性细胞增殖中起重要作用，如在癌形成和血管平滑肌细胞疾病、例如在动脉粥样硬化和血栓形成中所观察到的。本发明的化合物能够抑制PDGF受体(PDGFR)活性并且由此适合于治疗肿瘤疾病，如神经胶质瘤、肉瘤、前列腺肿瘤和结肠、乳腺和卵巢肿瘤。
本发明的化合物不仅可以用作肿瘤抑制物质，例如在小细胞肺癌中。而且可以用作治疗非恶性增殖性病症如动脉粥样硬化、血栓形成、银屑病、硬皮病和纤维化的活性剂，以及用于保护干细胞，例如对抗化疗剂如5-氟脲嘧啶和哮喘中的血毒素作用。本发明的化合物尤其可以用于治疗响应于PDGF受体激酶抑制的疾病。
本发明的化合物在治疗因移植、例如同种异体移植所致病症中表现出有用的作用，尤其是组织排斥，如尤其是闭塞性细支气管炎(OB)，即同种异体肺移植物的慢性排斥。与未患OB的患者相反，那些患有OB的患者通常表现出在支气管肺泡灌洗液中PDGF浓度升高。
本发明的化合物还对与血管平滑肌细胞迁移和增殖相关的疾病(其中PDGF和PDGF-R通常也起作用)有效，如再狭窄和动脉粥样硬化。这些在体外和体内对血管平滑肌细胞增殖或迁移的作用及其结果可以通过给予本发明的化合物而得到证实，并且还可以通过研究其对体内机械性损伤后血管内膜增厚的作用而得到证实。
本发明的化合物还抑制涉及干细胞因子(SCF也称作c-kit配体或青灰因子)细胞过程，如抑制SCF受体(kit)自磷酸化和SCF-刺激的MAPK激酶(促分裂原活化蛋白激酶)活化。MO7e细胞为人幼巨核细胞(promegalcaryocytic)白血病细胞系，它依赖于SCF进行增殖。本发明的化合物可以抑制SCF受体的自磷酸化。
Ras-Raf-MEK-ERK信号传导途径介导细胞对生长信号的反应。Ras在～15％的人癌中突变成致癌形式。Raf族属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶并且它包括三个成员A-Raf、B-Raf和c-Raf(或Raf-1)。对于作为药物靶的Raf，关注已经集中在Raf作为Ras下游效应物的相关性上。然而，近来的数据提示B-Raf可能在某些肿瘤的形成过程中具有显著的作用，而不需要活化的Ras等位基因(Nature 417，949-954(2002年7月1日)。特别地，已经在大百分比的恶性黑素瘤中检测到了B-Raf突变。
现存的黑素瘤医学疗法在其有效性方面受到局限，尤其是对晚期黑素瘤而言。本发明的化合物还抑制涉及b-Raf激酶的细胞过程，从而为人癌症、尤其是黑素瘤提供了的新的治疗机会。
本发明的化合物还对退行性淋巴瘤酶(ALK)和NPM-ALK融合蛋白的酪氨酸激酶活性表现出强力抑制。这种蛋白酪氨酸激酶由核仁磷酸蛋白(NPM)和退行性淋巴瘤酶(ALK)的基因融合而产生，由此表现出ALK配体-依赖性的蛋白酪氨酸激酶活性。NPM-ALK在大量造血和其它人体细胞的信号传递中起关键作用，导致血液学和肿瘤性疾病，例如在退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)中，特别是在ALK+NHL或Alkomas中、在炎性肌纤维母细胞瘤(IMT)和神经母细胞瘤(Duyster，J.等，2001，Oncogene 20，5623-5637)。除NPM-ALK外，在人血液学和肿瘤性疾病中已鉴定到其它基因融合体；主要是TPM3-ALK(一种非肌肉的原肌球蛋白与ALK的融合体)。使用公知方法，例如使用ALK重组激酶结构域、按照与J.Wood等在Cancer Res.60，2178-2189(2000)中所述VEGF-R激酶试验类似的方式，可以证实对ALK酪氨酸激酶活性的抑制。
Flt3为III型受体酪氨酸激酶(RTK)家族中的成员。Flt3(fms-样酪氨酸激酶)也称作FLk-2(胎肝激酶2)。已经在成年人和儿童白血病中证实了Flt3基因的异常表达，包括急性髓性白血病(AML)、具有三谱系脊髓发育不良的AML(AML/TMDS)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和骨髓增生异常综合征(MDS)。已经在约35％的急性髓母细胞性白血病(AML)患者中发现了Flt3受体的活化突变，并且与预后不良有关。最常见的突变包括近膜结构域内符合读框的复制，其中还有5-10％的患者在835位天冬酰胺上存在点突变。这些突变均与Flt3的酪氨酸激酶活性的组成型活化有关，在没有配体存在下产生增殖和存活力信号。已经证实表达该受体突变体形式的患者的治愈机会减少。因此，越来越多的证据表明过度活化的(突变的)Flt3激酶活性在人白血病和骨髓增生异常综合征中扮演角色。这就促使本申请人寻找Flt3受体的新抑制剂作为在这些患者中可能的治疗手段，对他们并且对这类以前用目前可利用药物疗法和/或干细胞移植疗法失败的患者而言，目前的药物疗法几乎无法提供可用性。
白血病一般因骨髓、淋巴结、脾或其它血液和免疫系统器官中未成熟造血细胞的DNA的获得性(非遗传性)基因损伤所致。效果为细胞成熟中的加速生长和阻滞，导致称作“白血病母细胞”的细胞蓄积，它们无法作为正常血细胞起作用；和无法生成正常髓细胞，导致红细胞(贫血)、血小板和正常白细胞缺乏。母细胞通常由骨髓产生且通常发育成成熟血细胞，占全部髓细胞的约1％。在白血病中，母细胞不会适当成熟并且蓄积在骨髓中。在急性髓性白血病(AML)中，它们称作成髓细胞，而在急性成淋巴细胞性白血病(ALL)中，它们称作原淋巴细胞。另一种白血病为混合谱系的白血病(MLL)。
术语“具有三谱系脊髓发育不良的AML(AML/TMDS)”指的是不常见形式的白血病，其特征在于伴随急性白血病的造血机能不全表现、对诱导化疗的反应弱，以及趋向于伴有纯粹骨髓增生异常综合征的复发。
术语“骨髓增生异常综合征(MDS)”指的是一组血液病，其中骨髓停止正常起作用，导致健康血细胞的数量缺乏。与其中一种类型的血小板大量产生的白血病相比，在MDS中任意且有时是所有类型的血细胞均受到影响。在美国每年至少出现10,000个新病例。达三分之一诊断为MDS的患者持续发展成急性髓性白血病。为此，该病有时称作白血病前期。骨髓增生异常综合征有时也称作脊髓发育不良性髓细胞生成障碍或成少突神经胶质细胞性白血病。在大量母细胞仍然遗留在骨髓中时，MDS也称作郁积型白血病(smoldering leukemia)。
骨髓增生异常综合征，如白血病一样，因骨髓中单细胞的DNA基因损伤所致。在MDS患者中存在染色体中的某些异常。这些异常称作易位，它们在一条染色体的部分断裂并且与不同染色体的断裂部分连接时发生。相同的缺陷通常在急性髓性白血病中发现。然而，MDS不同于白血病，因为所有患者的血细胞均异常并且它们均来源于相同受损的干细胞。在白血病患者中，骨髓含有患病和健康血细胞的混合物。
目前使用高剂量的细胞毒性化疗药如阿糖胞苷和柔红霉素治疗AML和晚期骨髓增生异常综合征。这种类型的治疗诱发约70％的患者发生血液学缓解。然而，尽管长期给予化疗，但是进入缓解的患者中超过一半随后复发。几乎所有最初未能缓解的患者或获得缓解后复发的患者最终均将死于白血病。骨髓移植可以治愈达50-60％经历手术的患者，但所有患有AML或MDS的患者中仅有约三分之一适合接受移植。迫切需要新的和有效的药物来治疗使用标准疗法未能进入缓解的患者、随后复发的患者和不适合于干细胞移植的患者。此外，可以将有效的新药物加入到标准疗法中，并合理预期它可以在所有患者中产生改善的诱导化疗。
按照上文所述，本发明进一步提供了在需要这类治疗的受试者中预防或治疗上述疾病或病症的方法，该方法包括对所述受试者给予治疗有效量的(参见下文中的“给药和药物组合物”部分)式I化合物或其药学上可接受的盐。对任意上述应用而言，所需的剂量随给药方式、所治疗的特定疾病和所需作用的不同而改变。
给药和药物组合物一般而言，本发明化合物以治疗有效量、经由本领域中已知的任意常用和可接受的方式单独或与一种或多种治疗剂组合给予。治疗有效量可以随疾病的严重程度、受试者年龄和相对健康情况、所用化合物的功效和其它因素而宽泛变化。一般而言，在约0.03-2.5mg/kg体重的每日剂量下获得令人满意的全身效果。在较大哺乳动物例如人中的适用每日剂量在约0.5mg-约100mg范围内，例如，以至多每日4次的分次剂量或以延缓形式便利地给药。用于口服给药的合适的单位剂型包含约1-50mg活性成分。
本发明的化合物可以通过任意常规的途径作为药物组合物给药，特别是通过肠，例如口服，例如为片剂或胶囊形式；或通过胃肠外，例如为可注射溶液或混悬液形式；局部，例如为洗剂、凝胶、软膏剂或霜剂形式或以鼻用或栓剂形式。包含游离形式或药学上可接受盐形式的本发明化合物与至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物可以通过常规方式、经混合、制粒或包衣方法制备。例如，口服组合物可以为片剂或明胶胶囊，它们包含活性组分以及a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙二醇；就片剂而言还包括c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要，还有d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐或泡腾混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和增甜剂。可注射组合物可以为水性等渗溶液或混悬液，且栓剂可以由脂肪乳剂或混悬液制备。这些组合物可以为无菌的和/或含有佐剂，如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以含有其它治疗上有价值的物质。用于透皮应用的合适的制剂包括有效量的本发明化合物与载体。载体可以包括可吸收的药学上可接受的溶剂以帮助通过宿主皮肤。例如，透皮装置为绷带形式，包括裱背部件(backingmember)、含有可选地混有载体的化合物的贮器、可选的速率控制屏障以在延长时间期限内以受控和预定速率将化合物递送至宿主皮肤和使装置与皮肤固定的用具。还可以使用基质透皮制剂。用于局部应用、例如施用在皮肤和眼部的合适的制剂优选为本领域众所周知的水溶液、软膏剂、霜剂或凝胶。这类制剂可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
本发明的化合物可以以治疗有效量与一种或多种治疗剂共同给药(药物组合)。例如，协同作用可以与其它免疫调节、抗炎或用于治疗上述疾病的任意物质一起发生，例如，当与下列药物联用时环孢素、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制剂类似物，例如环孢素A(CsA)、环孢素G、FK-506、雷帕霉素或相当的化合物、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、白瑞夸尔、来氟洛米、咪唑立宾、麦考酚酸、麦考酚酸吗乙酯、15-脱氧精胍菌素、免疫抑制剂抗体，尤其是白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或其配体或其它免疫调节化合物，如CTLA41g。如果将本发明的化合物与其它疗法共同给予，那么共同给予的化合物的剂量当然随共同使用的药物的类型、所用的具体药物、所治疗的疾病等的不同而异。
本发明还提供了药物组合，例如药盒，包括a)为本文披露的本发明化合物的第一种活性剂，它为游离形式或药学上可接受的盐形式；和b)至少一种共同使用的活性剂(co-agent)。该药盒包括其给药说明书。
本文所用的术语“共同给药”或“联合给药”等指的是对单一患者给予选择的治疗剂，并且预计包括其中活性剂不一定通过相同给药途径或同时给予的治疗方案。
本文所用的术语“药物组合”指的是混合或合并一种以上活性组分而得到的产品并且包括固定和非固定活性组分组合的产品。术语“固定组合”指的是以单一实体或剂量同时对患者给予活性成分，例如式I化合物和共同使用的活性剂。术语“非固定组合”指的是活性成分、例如式I化合物和共同使用的活性剂作为单独的实体同时、伴随或没有具体的时间限制依次对患者给予，其中这类给药在患者体内提供了治疗有效水平的2种化合物。后者还可应用于鸡尾酒疗法，例如给予3种或3种以上活性成分。
制备本发明化合物的方法本发明还包括制备本发明化合物的方法。在所述反应中，如果在终产物中需要，可能有必要保护反应性官能基，例如羟基、氨基、亚氨基、硫代或羧基，以便避免它们参与不需要的反应。可以按照标准实践使用常用的保护基，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts在“Protective Groupsin Organic Chemistry”，John Wiley和Sons，1991中所述。
其中W为-NR4-的式I化合物可以通过下列反应方案I中所述进程制备反应方案I 其中R1、R2、R3、R4和n如发明概述中对式I所定义且Y为离去基团，如卤素(例如氯等)。式Ia的化合物可以通过使式2化合物与式3化合物在合适的碱(例如叔丁醇钾和二异丙基乙胺等)存在下、于合适溶剂(例如1，4-二噁烷和丁醇等)中反应来制备。该反应在50-130℃进行并且可以持续达4小时至完全。类似地，使用合适的原料，与式3化合物的反应生成式Ib、Ic、Id和Ie的化合物。
其中W为-O-的式I化合物可以通过下列反应方案II的进程制备反应方案II 其中R1、R2、R3、R4和n如发明概述中对式I所定义。式Ia化合物可以通过使式4化合物与式5化合物在合适的溶剂(例如DMSO等)和合适的碱(例如叔丁醇钾等)存在下反应来制备。该反应在50-130℃进行并且可以持续达4小时至完全。
合成式I化合物的详细描述可见于下文的实施例。
制备本发明化合物的其它方法通过使化合物的游离碱形式与药学上可接受的无机酸或有机酸反应，可以将本发明的化合物制成药学上可接受的酸加成盐。或者，通过使化合物的游离酸形式与药学上可接受的无机碱或有机碱反应，可以制备本发明化合物的药学上可接受的碱加成盐。或者，本发明化合物的盐形式可以使用原料或中间体的盐制备。
本发明化合物的游离酸或游离碱形式可以分别由相应的碱加成盐或酸加成盐形式制备。例如，通过用合适的碱(例如氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)处理，可以将本发明化合物的酸加成盐形式转化成相应的游离碱。通过用合适的酸(例如盐酸等)处理，可以将本发明化合物的碱加成盐形式转化成相应的游离酸。
通过在0-80℃用还原剂(例如硫、二氧化硫、三苯膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化磷等)在合适的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二噁烷水溶液等)中处理，可以由本发明化合物的N-氧化物制备本发明化合物的未氧化形式。
通过本领域技术人员公知的方法可以制备本发明化合物的前体药物衍生物(例如进一步的详细描述参见Saulnier等，(1994)，Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters，Vol.4，p.1985)。例如，通过使本发明的未衍生的化合物与合适的氨基甲酰化试剂(例如1，1-酰氧基烷基carbanochloridate、碳酸对-硝基苯酯等)反应，可以制备合适的前体药物。
通过本领域技术人员公知的方式可以制备本发明化合物的被保护衍生物。适合于生成保护基及其除去技术的详细描述可见于T.W.Greene，“Protecting Groups in Organic Chemistry”，第3版，John Wiley和Sons，Inc.，1999中。
本发明的化合物可以在本发明的方法中便利地作为溶剂合物(例如水合物)制备或形成。通过使用有机溶剂如二氧芑、四氢呋喃或甲醇从水/有机溶剂混合物中重结晶，可以便利地制备本发明化合物的水合物。
本发明的化合物可以如下制成其各立体异构体通过使化合物的外消旋混合物与旋光活性拆分试剂反应，以便形成非对映体化合物对，分离非对映体并且回收光学纯的对映体。尽管使用本发明化合物的共价非对映体衍生物可以拆分对映体，但是优选可解离的复合物(例如结晶非对映体盐)。非对映体具有不同的物理特性(例如熔点、沸点、溶解度、反应性等)并且可利用这些差异容易地分离。非对映体可以通过色谱法或优选通过基于溶解度不同的分离/拆分技术分离。然后通过不会导致外消旋化的任意实用方式回收光学纯的对映体与拆分试剂。用于从外消旋混合物中拆分化合物的立体异构体的技术的更为详细的描述可见于Jean Jacques，Andre Collet，Samuel H.Wilen，“Enantiomers，Racemates and Resolutions”，John Wiley和Sons，Inc.，1981。
概括地说，可以通过一种方法制备式I化合物，该方法包括(a)反应方案I或II的方法；和(b)可选地将本发明的化合物转化成药学上可接受的盐；(c)可选地将本发明化合物的盐形式转化成非盐形式；
(d)可选地将本发明化合物的未氧化形式转化成药学上可接受的N-氧化物；(e)可选地将本发明化合物的N-氧化物形式转化成其未氧化形式；(f)可选地从异构体混合物中拆分本发明化合物的各异构体；(g)可选地将本发明化合物的未衍生形式转化成药学上可接受的前体药物衍生物；和(h)可选地将本发明化合物的前体药物衍生物转化成其非衍生形式。
如果原料的制备没有特别地描述，则这些化合物是已知的或可以按照与本领域公知方法类似的方式或下文实施例中披露的方式制备。
本领域技术人员可以理解上述转化仅是制备本发明化合物的代表方法，可以类似地使用其它众所周知的方法。
实施例通过下列实施例进一步举例说明本发明但不起限定作用，这些实施例阐述本发明式I化合物(实施例)和中间体(参考)的制备。
实施例1 A.KOtBu，THF三甲氧基苯胺 回流B.Pd2(dba)3，(tBu)2联苯基膦，三甲氧基苯胺，K3PO4，1，4-二噁烷 90-110℃5-溴-2-氯嘧啶-4-基胺(1)的合成用47mL氨(330mmol，7.0M甲醇中的溶液)处理5-溴-2，4-二氯嘧啶(25g，110mmol)在200mL THF中的溶液。搅伴15小时后，在减压下浓缩该溶液，通过短过滤纯化(SiO2，己烷∶乙酸乙酯/1∶1)，得到21g(92％)的1，为白色固体。
2-氯-5-(2-乙氧基乙烯基)-嘧啶-4-基胺(2)的合成在500mL圆底烧瓶中加入5-溴-2-氯嘧啶-4-基胺(1)(10g，48mmol)、四(三苯膦)钯(0)(2.8g，2.5mmol)和甲苯(200mL)。加入三丁基-(2-乙氧基乙烯基)-锡烷(22g，60mmol)，将该反应加热至110℃，同时搅拌约15小时。冷却至室温后，将该溶液用100mL乙酸乙酯蒸馏，用水和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机萃取液，过滤，在减压下浓缩。通过柱色谱法纯化(SiO2，己烷∶乙酸乙酯/5∶1)，得到2(4.4g，46％)，为黄色固体。
2-氯-7H-吡咯并-[2，3-d]嘧啶3的制备在500mL圆底烧瓶中加入2-氯-5-(2-乙氧基乙烯基)-嘧啶-4-基胺2(4.4g，20mmol)。加入异丙醇(200mL)，随后加入25mL浓盐酸。将该溶液加热至90℃，搅拌2小时。冷却至室温后，在减压下浓缩该溶液，然后用饱和NaHCO3水溶液碱化至pH 9。用乙酸乙酯萃取水层，合并有机萃取液，用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机萃取液，过滤，在减压下浓缩。通过短过滤纯化(SiO2，己烷∶乙酸乙酯/1∶1)，得到3(3.1g，92％)，为白色固体。
2-氯-7-吡啶-2-基-7H-吡咯并-[2，3-d]嘧啶4的合成将2-氯-7H-吡咯并-[2，3-d]嘧啶3(0.53g，3.5mmol)、2-溴吡啶(0.66mL，1.1g，6.9mmol)、碘化亚铜(I)(0.20g，1.0mmol)、反式-1，2-二氨基环己烷(0.12mL，0.11g，1.0mmol)和磷酸钾(2.2g，10mmol)在10mL 1，4-二噁烷中的混悬液加热至100℃，搅拌4小时。将该反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤。用MgSO4干燥有机萃取液，过滤并且在减压下浓缩。通过柱色谱法纯化(SiO2，己烷∶乙酸乙酯/5∶1)，得到4(0.69g，87％)，为白色固体。
(7-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基)-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺(5)的制备方法1.向2-氯-7-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在1，4-二噁烷中的溶液中加入3，4，5-三甲氧基苯胺(3当量)，随后滴加叔丁醇钾溶液(1.0M在四氢呋喃中的溶液，3当量)。添加后，将该反应混合物在80℃加热2小时。冷却至室温后除去溶剂。通过反相HPLC纯化，得到(7-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基)-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺，为白色固体。
方法2.向装有2-氯-7-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、0.1当量三(二亚苄基丙酮)二钯(0)、0.2当量联苯-2-基-二叔-丁基-phosphane、3当量磷酸钾和1.5当量3，4，5-三甲氧基苯胺的圆底烧瓶中快速通入氮气，随后添加1，4-二噁烷。将该混悬液在110℃加热18小时。通过硅藻土垫过滤除去固体。用乙酸乙酯稀释滤液，用水和盐水洗涤。用硫酸镁干燥后，浓缩产物，通过色谱法纯化(乙酸乙酯∶己烷 1∶1)，得到7-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺，为白色固体。
实施例23-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酸 将3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酸甲酯在1N氢氧化钠(甲醇∶水 1∶1)中的溶液在室温搅拌15小时。用1N盐酸酸化至pH 6，得到沉淀。过滤，用水洗涤，得到3-[2-(3，4，5-三甲氢基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酸，为白色固体。
实施例33-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰氯 向装有3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酸的干燥圆底烧瓶中充氮气，加入二氯甲烷和几滴N，N′-二甲基甲酰胺。滴加草酰氯溶液(2.0M在二氯甲烷中的溶液)。将该反应混合物在室温搅拌30分钟，得到3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰氯的溶液。
实施例4N-甲基-3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰胺 向3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰氯在二氯甲烷中的溶液中加入5当量甲胺溶液(2.0M在四氢呋喃中的溶液)。在室温搅拌1小时后，用水使反应猝灭。除去溶剂，随后用反相HPLC纯化，得到N-甲基-3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰胺，为白色固体。
通过重复上述实施例中所述操作步骤，使用合适的原料获得下列表1中鉴定的式I化合物。
表1
试验试验了本发明的化合物，以便测定其与亲代32D细胞相比选择性抑制表达BCR-Abl(32D-p210)的32D细胞增殖的能力。测试了选择性抑制这些BCR-Abl转化细胞增殖的化合物对表达Bcr-abl野生型或突变体形式的Ba/F3细胞的抗增殖活性。此外，对化合物进行试验，以便测定其抑制FAK、Flt-3、ALK和b-Raf的能力。
细胞BCR-Abl依赖性增殖的抑制(高通量法)所用的鼠细胞系为用BCR-AblcDNA转化的32D造血祖细胞系(32D-p210)。将这些细胞供养在补充了50μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素和200mM L-谷氨酰胺的RPMI/10％胎牛血清(RPMI/FCS)中。类似地供养未转化的32D细胞，同时添加15％的WEHI条件培养基作为IL3源。
将50μl 32D或32D-p210细胞混悬液以5000个细胞/孔的密度平板固定在Greiner 384孔微量平板(黑色)中。将50nl测试化合物(1mM在DMSO中的储备溶液)加入到各孔中(包括STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％ CO2下保温72小时。向各孔中加入10μl 60％ Alamar蓝溶液(Tekdiagnostics)，将细胞再孵育24小时。使用AcquestTM系统(Molecular Devices)对荧光强度进行定量(在530nm处激发，在580nm处发射)。
细胞BCR-Abl依赖性增殖的抑制将32D-p210细胞以15,000个细胞/孔的密度平板固定入96孔TC平板。向各孔中加入50μL 2倍系列稀释的测试化合物(Cmax为40μM)(包括STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％ CO2下孵育48小时后，向各孔中加入15μL MTT(Promega)，将细胞再孵育5小时。通过分光光度法对570nm下的光密度进行定量，根据剂量响应曲线确定IC50值，即50％抑制所需的化合物浓度。
对细胞周期分布的作用将32D和32D-p210细胞以2.5×106个细胞/孔的密度平板固定入6孔TC平板中的5ml培养基中，加入1或10μM的测试化合物(包括STI571作为对照)。然后将细胞在37℃、5％ CO2下孵育24或48小时。用PBS洗涤2ml细胞混悬液，在70％EtOH中固定1小时，用PBS/EDTA/RNaseA处理30分钟。加入碘化丙锭(Cf＝10μg/ml)，在FACScaliburTM系统(BDBiosciences)上通过流式细胞计量术对荧光强度进行定量。本发明的测试化合物表现出对32D-p210细胞的编程性细胞死亡作用，但不会在32D亲代细胞中诱导编程性细胞死亡。
对细胞BCR-Abl自磷酸化的作用使用俘获Elisa、应用c-abl特异性俘获抗体和抗磷酸酪氨酸抗体对BCR-Abl自磷酸化进行定量。将32D-p210细胞以2×105个细胞/孔的密度平板固定在96孔TC平板中的50μl培养基中。加入50μl 2倍系列稀释的测试化合物(Cmax为10μM)(包括STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％ CO2下孵育90分钟。然后用150μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4、150mM NaCl、5mM EDTA、1mM EGTA和1％ NP-40)将细胞在冰上处理1小时。将50μL细胞裂解液加入到预先用抗-abl特异性抗体包被的96孔optiplate中并封闭。将平板在4℃孵育4小时。用TBS-Tween 20缓冲液洗涤后，加入50μL碱性磷酸酶缀合的抗磷酸酪氨酸抗体，将该平板在4℃再孵育过夜。用TBS-Tween 20缓冲液洗涤后，加入90μL发光底物，使用AcquestTM系统(Molecular Devices)对发光进行定量。抑制表达BCR-Abl的细胞增殖的本发明测试化合物以剂量依赖性方式抑制细胞BCR-Abl自磷酸化。
对细胞BCR-Abl自磷酸化的作用对表达突变形Bcr-abl的细胞增殖的作用对本发明的化合物测试其对Ba/F3细胞的抗增殖作用，所述Ba/F3细胞表达野生型BCR-Abl或对STI571具抗性或敏感性降低的突变形BCR-Abl(G250E、E255V、T315I、F317L、M351T)。如上所述在10、3.3、1.1和0.37μM下测试这些化合物对表达突变型-BCR-Abl的细胞和对未转化细胞的抗增殖作用(在缺乏IL3的培养基中)。根据如上所述获得的剂量响应曲线确定缺乏毒性的化合物对未转化细胞的IC50值。
Flt-3抑制一般技术包括比较可能的抑制剂对依赖于突变Flt3增殖的细胞系的作用与对不依赖于突变Flt3增殖的细胞系的作用。选择具有差别活性(Flt3+细胞系与Flt3-细胞系之间敏感性差异大于或等于10倍)的化合物用于进一步研究。
用于初筛的细胞系为Ba/F3细胞亚系，其被改造成在用表达合适Flt3cDNAs的逆转录病毒感染后过量表达突变型或野生型(未突变的)Flt3。母细胞系Ba/F3依赖于白细胞介素-3进行增殖，当IL-3被除去时，细胞快速终止增殖并死亡。逆转录病毒表达来自逆转录病毒LTR的Flt3和来自IRES位点的neogene。在G418中选择Ba/F3并通过荧光活化的细胞分选(FACS)分析Flt3的表达。使用具有两种不同Flt3突变的细胞系。一种突变体表达在由外显子11编码的近膜结构域中具有14个氨基酸重复的Flt-3，具体重复为....VDFREYEYDLKWEF....(称作Ba/F3-Flt3-ITD)。第二种突变具有将835位天冬酰胺转化成酪氨酸的点突变(称作Ba/F3-Flt3-D835Y)。两种突变均导致Flt-3激酶活化并使得它不依赖于IL-3且表达的细胞在没有IL-3存在下生长。类似地生成表达野生型Flt3的Ba/F3细胞并用作“对照”细胞系。亲代(未感染的)细胞系和野生型“对照”细胞系保持依赖于IL-3进行增殖。
在30mL培养物中将Ba/F3细胞(-对照、-Flt3-ITD或-Flt3-D835Y)培养至500,000个细胞/mL，用含有10％胎牛血清的RPMI 1640作为培养基。用于对照细胞(并非突变-Flt3细胞)的培养基含有来自WEHI-3B细胞系的10％条件培养基作为IL-3源。在二甲亚砜(DMSO)中制备各化合物的10mM“储备”溶液。然后稀释在含有10％胎牛血清的RPMI 1640中，以使药物终浓度一般在1nM-10μM范围。类似的稀释液由DMSO制成，用作载体对照。添加化合物后48小时，检测细胞的增殖率和细胞毒性。
以在NaCl/柠檬酸钠缓冲液中的2.5μM终浓度将Yo-Pro-1碘化物(Molecular Probes)加入到细胞中。将细胞与Yo-Pro一起在室温下孵育10分钟，然后在荧光计上读取，测定细胞毒性。接下来用NP40/EDTA/EGTA缓冲液裂解细胞，在室温下孵育90分钟，读数以测定增殖。
将选择性地对Ba/F3-Flt3-ITD细胞比对野生型对照Ba/F3细胞更具有毒性的化合物用表达Flt3-D835Y的细胞进一步测试。
另外，在暴露于不同浓度的活性化合物之前和之后，使用α-Flt3抗体免疫沉淀Flt3蛋白。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离免疫沉淀的蛋白质，通过电泳转移至PVDF膜上，用α-磷酸591Y-Flt3抗体进行免疫印迹。本试验确定了化合物是否降低了突变形受体特征性的Flt3的“自磷酸化”水平。
本发明的化合物一般表现出对FIt3-ITD在纳摩尔范围内的抗增殖活性，而对对照Flt3在达10μM时也无毒性。
本发明的化合物还在纳摩尔范围内降低细胞Flt-3的自磷酸化活性。
粘着斑激酶(FAK)抑制测试本发明化合物抑制FAK活性的能力。使用基于时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的试验法在384-孔平板中测定FAK激酶活性。在大肠杆菌中表达全长人FAK，作为GST-标记的蛋白，并通过固定化谷胱甘肽柱纯化。将相当于人FAK自磷酸化位点序列的生物素化肽——生物素-SETDDYAEIID(由SynPep Corp.合成)用作本试验中的底物。将大肠杆菌表达的FAK激酶(2.4μg/ml)与FAK肽(133nM)在15μl试验缓冲液(20mMHepes，pH7.4、5mM MgCl2、2mM MnCl2、0.5mM Na3VO4、0.1％ BSA、0.1％ Triton X-100)中彼此混合。然后将本发明的化合物(0.5μl-溶于DMSO)加入到所述酶/肽溶液中。在室温下孵育10分钟后，加入5μl在试验缓冲液中的40μM ATP以引发反应。将该反应混合物在室温下孵育2小时。然后加入50μl检测试剂，该试剂在检测缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.4、6mMEDTA、0.1％ BSA、0.1％ Triton X-100)中含有0.15nM Eu-标记的抗磷酸酪氨酸抗体(PT66-Eu，PerkinElmer)和1.5μg/ml SA-APC(PerkinElmer)。将该混合物在室温下孵育30分钟，使用Acquest平板读出器(MolecularDevice)测定TR-FRET信号。
ALK抑制ALK酪氨酸激酶活性的抑制可以使用公知方法证实，例如使用ALK的重组激酶结构域，类似于J.Wood等在Cancer Res.60，2178-2189(2000)中所述VEGF-R激酶试验。在96-孔平板中，于20mM Tris HClpH＝7.5(3mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM DTT、0.1μCi/试验(＝30μl)[γ-33P]-ATP、2μM ATP、3μg/ml聚(Glu，Trr 4∶1)聚-EY(SigmaP-0275)、1％ DMSO、25ng ALK酶)中进行使用GST-ALK蛋白酪氨酸激酶的体外酶试验，作为滤膜结合试验。将该试验体系在环境温度下孵育10分钟。通过添加50μl 125mM EDTA终止反应，将该反应混合物转移至预先用甲醇湿润并用H2O再水化5分钟的MAIP Multiscreen平板(Millipore，Bedford，MA，USA)上。洗涤后(0.5％H3PO4)，在液体闪烁计数器上对平板计数。通过对抑制百分比进行线性回归分析计算IC50值。与不含抑制剂的对照组相比，式I化合物抑制酶活性达50％(IC50)，例如浓度在0.001-0.5μM，尤其是在0.01-0.1μM。
式I化合物有效地抑制了过量表达人NPM-ALK的鼠BaF3细胞的生长(DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Braunschweig，德国)。通过用编码NPM-ALK的表达载体pCIneoTM(Promega Corp.，Madison WI，USA)转染BaF3细胞系实现NPM-ALK的表达，随后选择G418抗性细胞。未转染的BaF3细胞依赖于IL-3进行细胞存活。相反，表达NPM-ALK的BaF3细胞(下文称作BaF3-NPM-ALK)可以在没有IL-3存在下增殖，因为它们通过NPM-ALK激酶获得增殖信号。NPM-ALK激酶的推定抑制剂由此消除了生长信号并且导致抗增殖活性。然而，NPM-ALK激酶的推定抑制剂的抗增殖活性可以通过添加通过不依赖NPM-ALK机制提供生长信号的IL-3而被抑制。[就使用FLT3激酶的类似细胞系统而言参见E Weisberg等，Cancer Cell；1，433-443(2002)]。简言之，式I化合物的抑制活性如下测定将BaF3-NPM-ALK细胞(15,000个/微量滴定板孔)转移至96-孔微量滴定板。加入一系列浓度的测试化合物[溶于二甲亚砜(DMSO)](系列稀释液)，加入的方式使DMSO的终浓度不超过1％(v/v)。在加入后，在平板孵育2天，在此期间不含测试化合物的对照培养物能够经历两次细胞分裂周期。借助YoproTM染色测定BaF3-NPM-ALK细胞的生长[Tidziorek等，J.Immunol.Methods；185249-258(1995)]将由20mM柠檬酸钠pH 4.0、26.8mM氯化钠、0.4％ NP40、20mM EDTA和20mM组成的25μl裂解缓冲液加入到各孔中。细胞裂解在室温于60分钟内完成，使用具有如下设定的CytofluorII 96-孔读出器(PerSeptive Biosystems)，通过测量确定与DNA结合的Yopro总量激发(nm)485/20和发射(nm)530/25。
使用如下公式、通过计算机辅助系统测定IC50值IC50＝[(ABS测试-ABS起始)/(ABS对照-ABS起始)]×100。(ABS＝吸收)将那些实验中的IC50值表示为使细胞计数较使用不含抑制剂的对照组获得的细胞计数低50％的所述测试化合物浓度。式I化合物表现出抑制活性，IC50为约0.01-1μM。
还可以使用与上述对BaF3-NPM-ALK细胞系所述相同的方法在人KARPAS-299淋巴瘤细胞系中(DSMZ Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，德国)[WGDirks等在Int.J.Cancer 100，49-56(2002)中所述]测定式I化合物的抗增殖作用。式I化合物表现出抑制活性，IC50为约0.01-1uM。
还可以借助免疫印迹，在人KARPAS-299淋巴瘤细胞系中测定式I化合物对ALK自磷酸化的作用，如WG Dirks等在Int.J.Cancer 100，49-56(2002)中所述。即式I化合物表现出约0.001-1μM的IC50。
Upstate KinaseProfilerTM-放射性酶过滤结合试验评价本发明化合物抑制一组激酶中各成员的能力(激酶的部分非限制性实例包括FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和c-Met。按照该一般性方案，以10μM的终浓度测试化合物，一式两份。注意激酶缓冲液组成和底物因“Upstate KinaseProfilerTM”组中包括的激酶不同而异。按照该一般性方案，以10μM的终浓度测试化合物，一式两份。注意激酶缓冲液组成和底物因“Upstate KinaseProfilerTM”组中包括的激酶不同而异。将激酶缓冲液(2.5μL，10x，如果需要含有MnCl2)、活性激酶(0.001-0.01单位；2.5μl)、在激酶缓冲液中的特异性或聚(Glu4-Tyr)肽(5-500μM或0.01mg/ml)和激酶缓冲液(50μM；5μL)在冰上的Eppendorf内混合。加入Mg/ATP混合物(10μl；67.5(或33.75)mM MgCl2，450(或225)μM ATP和1μCi/μl[γ-32P]ATP(3000Ci/mmol))，将该反应在约30℃孵育约10分钟。将该反应混合物点在(20μL)2cm×2cm P81(磷酸纤维素，用于带正电荷的肽底物)或Whatman No.1(用于聚(Glu4-Tyr)肽底物)方形纸上。用0.75％磷酸将该试验方形纸洗涤4次，每次5分钟，并且用丙酮洗涤一次，5分钟。将该试验方形纸转至闪烁瓶中，加入5ml闪烁合剂，使用Beckman闪烁计数器对掺入肽底物的32P定量(cpm)。对每次反应计算抑制百分比。10μM浓度的式I化合物对FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和/或c-Met激酶表现出的抑制百分比优选大于50％、优选大于60％、更优选大于70％。
游离形式或药学上可接受的盐形式的式I化合物表现出有价值的药理学特性，如通过本申请中所述体外试验所证实。例如，式I化合物对如下激酶中的至少一种优选表现出的IC50在1×10-10-1×10-5M范围，更优选低于500nMFAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和c-Met激酶。例如(i)N-(2-二甲氨基-乙基)-3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰胺(实施例73)对FAK的IC50为38nM。
(ii){3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯基}-乙腈(实施例104)分别对FLT3-ITD、FGFR3、JAK2、PDGFR-beta和Tel-TRKC的IC50为29nM、282nM、342nM、33nM和479nM。
(iii){7-[3-(1-甲基-1H-四唑-5-基甲基)-苯基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基}-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺(实施例120)对BaF3/PDGFR-β的IC50为29nM。
(iv)3-{3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯基}-丙腈(实施例85)对FLT3-ITD的IC50为16nM。
(v)(7-吡啶-2-基-6，7-二氢-5H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基)-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺(实施例61)对FGFR3的IC50为284nM。
(vi)[7-(2-氯-吡啶-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基]-(4-甲氧基-2-甲基-苯基)-胺(实施例47)对BCR-Abl的IC50为408nM。
应理解本文所述的实施例和实施方案仅用于解释目的，本领域技术人员将可以想到依据其进行各种修改或改变，这些修改或改变也包括在本申请的实质和范围和所附权利要求的范围内。本文引述的所有公开文献、专利和专利申请为所有目的引入本文作为参考。
权利要求
1.选自式Ia、Ib、Ic、Id和Ie的化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、异构体和前体药物 其中n选自0、1和2；m选自0、1、2和3；W选自-NR4-、-S-、-O-、-S(O)-和-S(O)2-；其中R4选自氢和C1-6烷基；R1选自C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基-C0-4烷基和C3-8杂环烷基-C0-4烷基；其中R1的任意芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基烷基或杂环烷基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-12环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、卤素-取代的-C1-6烷氧基、-XNR5R5、-XNR5XNR5R5、-XNR5XOR5、-XOR5、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XC(O)NR5R5、-XOXR6和-XC(O)R6；其中X为键或C1-6亚烷基；R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；且R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；其中R1的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基取代基进一步可选地被1-5个独立地选自C1-6烷基和C1-6烷氧基的基团取代；R2选自C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基-C0-4烷基和C3-8杂环烷基-C0-4烷基；其中R2的任意芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基烷基或杂环烷基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、卤素-取代的-C1-6烷氧基、C3-8杂芳基C0-4烷基、-XNR5R5、XOR5、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XSNR5R5、-XS(O)NR5R5、-XS(O)2NR5R5、XC(O)OR5、-XOC(O)R5、-XC(O)R5、-XC(O)NR5XNR5R5、-XC(O)NR5R5、-XC(O)NR5XC(O)OR5、-XC(O)NR5XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5XNR5C(O)OR5、-XC(O)NR5XOR5、-XC(O)N(XOR5)2、-XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5R6、-XC(O)R6、-XR7、-XC(O)R7、-XR6和-XC(O)NR5XR7；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；且R7选自卤素和氰基；R3选自卤素、羟基、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XC(O)R5和-XC(O)OR5；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基。
2.权利要求1的化合物，其中W选自-NR4-和-O-；其中R4选自氢和C1-6烷基；R1选自C6-10芳基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基；其中R1的任意芳基烷基和杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、C5-10杂芳基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、-XNR5R5、-XOR5、-XSR5、-XNR5XNR5R5、-XNR5XOR5、-XC(O)NR5R5、-XOXR6和-XC(O)R6；其中X为键或C1-6亚烷基；R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；且R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；其中R1的任意杂芳基取代基进一步可选地被1-5个C1-6烷基取代；R2选自C6-10芳基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、C3-8杂芳基-C0-4烷基、-XNR5R5、-XOR5、-XSR5、-XS(O)2NR5R5、-XC(O)OR5，-XOC(O)R5、-XC(O)NR5XNR5R5、-XC(O)NR5XC(O)OR5、-XC(O)NR5XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5XNR5C(O)OR5、-XC(O)NR5XOR5、-XC(O)N(XOR5)2、-XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5R6、-XC(O)R6、-XR7、-XR6和-XC(O)NR5XR7；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；且R7为氰基；且R3选自卤素、羟基、-XC(O)R5和-XC(O)OR5；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基。
3.权利要求1的化合物，其中W选自-NH-和-O-；和R1选自苯基、苄基、5，6，7，8-四氢-萘基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基、1H-吲唑-7-基、茚满-4-基和1H-吲哚基；其中R1的任意芳基烷基和杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自甲氧基、甲基、氨基、卤素、羟甲基、羟基、喹喔啉基、乙基、吡啶基、甲氧基-苯基、哌嗪基-羰基、乙基-(2-羟基-乙基)-氨基、2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙氧基、氨基甲酰基、异丙基、甲基-硫基、三-氟-甲基、乙氧基、3-异丙基氨基-丙基氨基、二甲氨基、吗啉代、环丙基-甲氧基、丁氧基、环庚基-氧基和1，4，5，7-四甲基-吡咯并[3，4-d]哒嗪基。
4.权利要求1的化合物，其中R2选自吡啶基、苯基、噻唑基、吡啶基-甲基、吡啶基-乙基、噻吩基、苄基、喹啉基、7-氧代-5，6，7，8-四氢-萘基、萘基和嘧啶基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、甲基、丙基-氨磺酰基、甲基-氨磺酰基、甲氧基、甲基-羧基、2-二甲氨基-乙基-氨基甲酰基、羧基、氨基、氰基-乙基、氰基-甲基、乙烯基、三-氟-甲基、羟甲基、乙基、甲基-硫基、丁基、异丁基、羧基-甲基-甲酰胺基、1-羧基-乙基-甲酰胺基、羧基-乙基、氨基-乙基-甲酰胺基、氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-乙基-甲酰胺基、二甲氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基-甲基、2-(2-二甲氨基-乙基氨基甲酰基)-乙基、2-(2-二甲氨基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-乙基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-丙基-甲酰胺基)-乙基、2-(丙基-甲酰胺基)-乙基、氨基-丙基-甲酰胺基-甲基、2-(甲基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、2-(乙基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、吗啉代-乙基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-甲基、氨基-乙基-甲酰胺基甲基、环丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基-甲基、二甲基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基-甲基、羟基-丙基-甲酰胺基-甲基、N，N-双-(3-羟基丙基)-甲酰胺基、环戊基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基甲基、环戊基-甲酰胺基-甲基、氰基-乙基-甲酰胺基、氰基-甲基-甲酰胺基、吡咯烷基-乙基-甲酰胺基、2-(异丁基-甲酰胺基)-乙基、1H-四唑基、2-(1H-四唑-5-基)-乙基、2-(1H-四唑-5-基)-甲基、2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-甲基、乙酰基-氨基、环丙基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基、羟基-丙基-甲酰胺基、丙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基、1-甲基-哌啶-4-基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-乙基、甲氧基-羰基-甲基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基-甲基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-乙基、1-甲酰基-吡咯烷-2-基-甲酸、(1-羧基-3-甲基-丁基)-甲酰胺基、2-(甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基)-乙基、1-羧基-(2，2-二甲基-丙基)-甲酰胺基、3-叔丁氧基羰基-氨基-丙基-甲酰胺基、乙酰氧基-甲基和1-羧基-乙基-甲酰胺基。
5.权利要求1的化合物，其中n为0或1；m为0或1；且R3选自卤素、羟基、-C(O)OH和-C(O))CH3。
6.权利要求1的式Ig的化合物 其中R2选自吡啶基、苯基、噻唑基、吡啶基-甲基、吡啶基-乙基、噻吩基、苄基、喹啉基、7-氧代-5，6，7，8-四氢-萘基、萘基和嘧啶基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、甲基、丙基-氨磺酰基、甲基氨磺酰基、甲氧基、甲基-羧基、2-二甲氨基-乙基-氨基甲酰基、羧基、氨基、氰基乙基、氰基-甲基、乙烯基、三-氟-甲基、羟甲基、乙基、甲基-硫基、丁基、异丁基、羧基-甲基-甲酰胺基、1-羧基-乙基-甲酰胺基、羧基-乙基、氨基-乙基甲酰胺基、氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-乙基-甲酰胺基、二甲氨基丙基-甲酰胺基、二甲氨基-丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基-甲基、2-(2-二甲氨基-乙基氨基甲酰基)-乙基、2-(2-二甲氨基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-乙基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-丙基-甲酰胺基)-乙基、2-(丙基-甲酰胺基)-乙基、氨基-丙基-甲酰胺基-甲基、2-(甲基-氨基-氨基甲酰基)乙基、2-(乙基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、吗啉代-乙基-甲酰胺基、吗啉代-羰基甲基、氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、环丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基-甲基、二甲基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基-甲基、羟基-丙基-甲酰胺基-甲基、N，N-双-(3-羟基-丙基)-甲酰胺基、环戊基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基-甲基、环戊基-甲酰胺基-甲基、氰基-乙基-甲酰胺基、氰基-甲基-甲酰胺基、吡咯烷基-乙基-甲酰胺基、2-(异丁基-甲酰胺基)-乙基、1H-四唑基、2-(1H-四唑-5-基)-乙基、2-(1H-四唑-5-基)-甲基、2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-甲基、乙酰基-氨基、环丙基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基、羟基-丙基-甲酰胺基、丙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基、1-甲基-哌啶-4-基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-乙基、甲氧基-羰基-甲基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基-甲基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-乙基、1-甲酰基-吡咯烷-2-基-甲酸、(1-羧基-3-甲基-丁基)-甲酰胺基、2-(甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基)-乙基、1-羧基-(2，2-二甲基-丙基)-甲酰胺基、3-叔丁氧基羰基-氨基-丙基-甲酰胺基、乙酰氧基-甲基和1-羧基-乙基-甲酰胺基。
7.药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1的化合物与药学上可接受的赋形剂。
8.治疗动物疾病的方法，其中抑制激酶活性可以预防、抑制或改善所述疾病的病理学和/或症状学，该方法包括对所述动物给予治疗有效量的权利要求1的化合物。
9.权利要求7的方法，其中所述激酶选自FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和c-Met。
10.权利要求1的化合物在制备用于治疗动物疾病的药物中的用途，其中FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、cKit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和/或c-Met的激酶活性对所述疾病的病理学和/或症状学有作用。
全文摘要
本发明提供了一类新的化合物、包括这类化合物的药物组合物和使用这类化合物治疗或预防与异常或失调的激酶活性相关的疾病或病症的方法，所述疾病或病症特别是涉及FAK、Abl、BCR－Abl、PDGF－R、c－Kit、NPM－ALK、Flt－3、JAK2和c－Met激酶异常活化的疾病或病症。
文档编号A61K31/519GK1918158SQ200580004895
公开日2007年2月21日 申请日期2005年2月14日 优先权日2004年2月14日
发明者崔夏洵, 王志成, N·S·格雷, 顾祥巨, 贺晓晖, 贺耘, 江涛, 刘异, W·里希蒙德, 沈台辅, 杨鲲泳 申请人:Irm责任有限公司
相关申请的交叉参考本申请要求2004年2月14日提交的美国临时专利申请号60/544,944的优先权。将该申请的全部披露内容完整地并为所有目的引入本文作为参考。
背景技术：
发明领域本发明提供了一类新的化合物、包括这类化合物的药物组合物和使用这类化合物治疗或预防与异常或失调的激酶活性相关的疾病或病症的方法，所述疾病或病症特别是涉及FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和c-Met激酶异常活化的疾病或病症。
背景技术：
蛋白激酶代表一大族蛋白质，它们在调节各种细胞过程和维持对细胞功能的控制方面起中心作用。这些激酶的部分非限制性实例包括受体酪氨酸激酶，如血小板衍生的生长因子受体激酶(PDGF-R)、干细胞因子的受体激酶、c-kit、神经生长因子受体、trlcB、c-Met和成纤维细胞生长因子受体、FGFR3；非受体酪氨酸激酶，如Abl和融合激酶BCR-Abl、粘着斑激酶(FAK)、Fes、Lck和Syk；和丝氨酸/苏氨酸激酶，如b-RAF、MAP激酶(例如MKK6)和SAPK2β。已经在许多疾病状态中观察到异常激酶活性，包括良性和恶性增殖性病症以及因免疫和神经系统不适当激活产生的疾病。
本发明的新化合物抑制一种或多种蛋白激酶的活性，由此预计它们可用于治疗与激酶相关的疾病。
发明概述本发明一方面提供了选自式Ia、Ib、Ic、Id和Ie的化合物及其N-氧化物衍生物、前体药物衍生物、被保护的衍生物、各异构体和异构体混合物以及这类化合物的药学上可接受的盐和溶剂合物(例如水合物) 其中n选自0、1和2；m选自0、1、2和3；W选自-NR4-、-S-、-O-、-S(O)-和-S(O)2-；其中R4选自氢和C1-6烷基；R1选自C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基-C0-4烷基和C3-8杂环烷基-C0-4烷基；其中R1的任意芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基烷基或杂环烷基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-12环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、卤素-取代的-C1-6烷氧基、-XNR5R5、-XNR5XNR5R5、-XNR5XOR5、-XOR5、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XC(O)NR5R5、-XOXR6和-XC(O)R6；其中X为键或C1-6亚烷基；R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；且R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；其中R1的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基取代基进一步可选地被1-5个独立地选自C1-6烷基和C1-6烷氧基的基团取代；R2选自C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基-C0-4烷基和C3-8杂环烷基-C0-4烷基；其中R2的任意芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基烷基或杂环烷基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、卤素-取代的-C1-6烷氧基、C3-8杂芳基C0-4烷基、-XNR5R5、-XOR5、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XSNR5R5、-XS(O)NR5R5、-XS(O)2NR5R5、-XC(O)OR5、-XOC(O)R5、-XC(O)R5、-XC(O)NR5XNR5R5、-XC(O)NR5R5、XC(O)NR5XC(O)OR5、-XC(O)NR5XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5XNR5C(O)OR5、-XC(O)NR5XOR5、-XC(O)N(XOR5)2、-XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5R6、-XC(O)R6、-XR7、-XR6和-XC(O)NR5XR7；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；且R7为氰基；R3选自卤素、羟基、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XC(O)R5和-XC(O)OR5；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基。
本发明第二方面提供了药物组合物，它含有式I化合物或其N-氧化物衍生物、各异构体和异构体混合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种合适的赋形剂。
本发明第三方面提供了治疗动物疾病的方法，其中抑制激酶活性、特别是FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、cKit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和/或c-Met活性可以预防、抑制或改善所述疾病的病理学和/或症状学，该方法包括对所述动物给予治疗有效量的式I化合物或其N-氧化物衍生物、各异构体和异构体混合物或其药学上可接受的盐。
本发明第四方面提供了式I化合物在制备用于治疗动物疾病的药物中的用途，其中激酶活性、特别是FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、cKit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和/或c-Met活性对所述疾病的病理学和/或症状学有作用。
本发明第五方面提供了制备式I化合物及其N-氧化物衍生物、前体药物衍生物、被保护的衍生物、各异构体和异构体混合物或其药学上可接受的盐的方法。
发明详述定义“烷基”作为基团和作为其它基团例如卤素-取代的烷基和烷氧基的结构部分，可以为直链或支链的。C1-4烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。卤素-取代的烷基包括三氟甲基、五氟乙基等。
“芳基”指的是含有6-10个环碳原子的单环或稠合双环芳族环组合。例如，芳基可以为苯基或萘基，优选苯基。“亚芳基”指的是衍生自芳基的二价基团。“杂芳基”如对芳基所定义，其中一个或多个环成员为杂原子。例如杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并-咪唑基、嘧啶基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
“环烷基”指的是含有所示环原子数的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥连多环组合。例如，C3-10环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
“杂环烷基”指的是如本申请中所定义的环烷基，条件是所示环碳中的一个或多个被选自-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-的部分替代，其中R为氢、C1-4烷基或氮保护基。例如，作为本申请中用于描述本发明化合物的C3-8杂环烷基包括吗啉代、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、哌啶基酮、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基、1，1-二氧代-116-硫吗啉-4-基等。
“卤素”(或卤代)优选表示氯或氟，也可以是溴或碘。
“治疗”指的是减轻或缓解疾病和/或其伴随症状的方法。
优选实施方案的描述本发明的化合物可用于抑制激酶并且由发明概述中详细描述的式I化合物所示。在一个实施方案中，关于式Ia、Ib、Ic、Id和Ie的化合物，W选自-NR4-和-O-；其中R4选自氢和C1-6烷基。
在另一个实施方案中，R1选自C6-10芳基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基；其中R1的任意芳基烷基和杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、C5-10杂芳基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、-XNR5R5、-XOR5、-XSR5、-XNR5XNR5R5、-XNR5XOR5、-XC(O)NR5R5、-XOXR6和-XC(O)R6；其中X为键或C1-6亚烷基；R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；且R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；其中R1的任意杂芳基取代基进一步可选地被1-5个C1-6烷基取代。
在另一个实施方案中，R2选自C6-10芳基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、C3-8杂芳基-C0-4烷基、-XNR5R5、-XOR5、-XSR5、-XS(O)2NR5R5、-XC(O)OR5、-XOC(O)R5、-XC(O)NR5XNR5R5、-XC(O)NR5XC(O)OR5、-XC(O)NR5XNR5C(O)R5-XC(O)NR5XNR5C(O)OR5、-XC(O)NR5XOR5、-XC(O)N(XOR5)2、-XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5R6、-XC(O)R6、-XR7、-XR6和-XC(O)NR5XR7；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；且R7为氰基。
在另一个实施方案中，R3选自卤素、羟基、-XC(O)R5和-XC(O)OR5；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基。
在另一个实施方案中，W选自-NH-和-O-；且R1选自苯基、苄基、5，6，7，8-四氢-萘基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基、1H-吲唑-7-基、茚满-4-基和1H-吲哚基；其中R1的任意芳基烷基和杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自甲氧基、甲基、氨基、卤素、羟甲基、羟基、喹喔啉基、乙基、吡啶基、甲氧基-苯基、哌嗪基-羰基、乙基-(2-羟基-乙基)-氨基2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙氧基、氨基甲酰基、异丙基，甲基-硫基、三-氟-甲基、乙氧基、3-异丙基氨基-丙基氨基、二甲氨基、吗啉代、环丙基-甲氧基、丁氧基、环庚基-氧基和1，4，5，7-四甲基-吡咯并[3，4-d]哒嗪基。
在另一个实施方案中，R2选自吡啶基、苯基、噻唑基、吡啶基-甲基、吡啶基-乙基、噻吩基、苄基、喹啉基、7-氧代-5，6，7，8-四氢-萘基、萘基和嘧啶基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、甲基、丙基-氨磺酰基、甲基-氨磺酰基、甲氧基、甲基-羧基、2-二甲氨基-乙基-氨基甲酰基、羧基、氨基、氰基-乙基、氰基-甲基、乙烯基、三-氟-甲基、羟甲基、乙基、甲基-硫基、丁基、异丁基、羧基-甲基-甲酰胺基、1-羧基-乙基-甲酰胺基、羧基-乙基、氨基-乙基-甲酰胺基、氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-乙基-甲酰胺基、二甲氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基-甲基、2-(2-二甲氨基-乙基氨基甲酰基)-乙基、2-(2-二甲氨基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-乙基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-丙基-甲酰胺基)-乙基、2-(丙基-甲酰胺基)-乙基、氨基-丙基-甲酰胺基-甲基、2-(甲基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、2-(乙基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、吗啉代-乙基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-甲基、氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、环丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基-甲基、二甲基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基-甲基、羟基-丙基-甲酰胺基-甲基、N，N-双-(3-羟基-丙基)-甲酰胺基、环戊基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基-甲基、环戊基-甲酰胺基-甲基、氰基-乙基-甲酰胺基、氰基-甲基-甲酰胺基、吡咯烷基-乙基-甲酰胺基、2-(异丁基-甲酰胺基)-乙基、1H-四唑基、2-(1H-四唑-5-基)-乙基、2-(1H-四唑-5-基)-甲基、2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-甲基、乙酰基-氨基、环丙基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基、羟基-丙基-甲酰胺基、丙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基、1-甲基-哌啶-4-基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-乙基、甲氧基-羰基-甲基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基-甲基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-乙基、1-甲酰基-吡咯烷-2-基-甲酸、(1-羧基-3-甲基-丁基)-甲酰胺基、2-(甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基)-乙基、1-羧基-(2，2-二甲基-丙基)-甲酰胺基、3-叔丁氧基羰基-氨基-丙基-甲酰胺基、乙酰氧基-甲基和1-羧基-乙基-甲酰胺基。
在另一个实施方案中，n为0或1；m是0或1；且R3选自卤素、羟基、-C(O)OH和-C(O)OCH3。
在另一个实施方案中，为式Ig的化合物 其中R2选自吡啶基、苯基、噻唑基、吡啶基-甲基、吡啶基-乙基、噻吩基、苄基、喹啉基、7-氧代-5，6，7，8-四氢-萘基、萘基和嘧啶基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、甲基、丙基-氨磺酰基、甲基氨磺酰基、甲氧基、甲基-羧基、2-二甲氨基-乙基-氨基甲酰基、羧基、氨基、氰基乙基、氰基-甲基、乙烯基、三-氟-甲基、羟甲基、乙基、甲基-硫基、丁基、异丁基、羧基-甲基-甲酰胺基、1-羧基-乙基-甲酰胺基、羧基-乙基、氨基-乙基甲酰胺基、氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-乙基-甲酰胺基、二甲氨基丙基-甲酰胺基、二甲氨基-丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基-甲基、2-(2-二甲氨基-乙基氨基甲酰基)-乙基、2-(2-二甲氨基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-乙基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-丙基-甲酰胺基)-乙基、2-(丙基-甲酰胺基)-乙基、氨基-丙基-甲酰胺基-甲基、2-(甲基-氨基-氨基甲酰基)乙基、2-(乙基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、吗啉代-乙基-甲酰胺基、吗啉代-羰基甲基、氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、环丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基-甲基、二甲基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基-甲基、羟基-丙基-甲酰胺基-甲基、N，N-双-(3-羟基-丙基)-甲酰胺基、环戊基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基-甲基、环戊基-甲酰胺基-甲基、氰基-乙基-甲酰胺基、氰基-甲基-甲酰胺基、吡咯烷基-乙基-甲酰胺基、2-(异丁基-甲酰胺基)-乙基、1H-四唑基、2-(1H-四唑-5-基)-乙基、2-(1H-四唑-5-基)-甲基、2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-甲基、乙酰基-氨基、环丙基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基、羟基-丙基-甲酰胺基、丙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基、1-甲基-哌啶-4-基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-乙基、甲氧基-羰基-甲基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基-甲基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-乙基、1-甲酰基-吡咯烷-2-基-甲酸、(1-羧基-3-甲基-丁基)-甲酰胺基、2-(甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基)-乙基、1-羧基-(2，2-二甲基-丙基)-甲酰胺基、3-叔丁氧基羰基-氨基-丙基-甲酰胺基、乙酰氧基-甲基和1-羧基-乙基-甲酰胺基。
下文实施例和表I中详细描述了式I的优选化合物。
药理学和应用本发明的化合物调节蛋白酪氨酸激酶活性并且照此可用于治疗其中蛋白酪氨酸激酶、特别是FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和c-Met激酶对所述疾病的病理学和/或症状学有作用的疾病或病症。
粘着斑激酶(FAK)，即一种非受体-蛋白酪氨酸激酶，位于细胞基质-胞外基质(ECM)接触位点，后者作为信号传导蛋白的细胞骨架相关网状结构的部分起作用(Schlaepfer等，Prog.Diophys.，Mol.，1999，71，435-478)。在粘附细胞中，FAK通常与粘着斑上的整联蛋白相关(Schlaepfer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，5192-5196)。FAK磷酸化导致促分裂原活化蛋白激酶途径的活化。FAK的过量表达涉及癌症进展。高水平的FAK与结肠肿瘤(Weiner，T.M.等，Lancet，1993，342，1024-1025)、乳腺肿瘤(Owens，L.V.等，Cancer Res.，1995，55，2752-2755)和口腔癌(Kornberg，L.J.，HeadNeck，1998，20，634-639)中的侵袭力和转移可能性有关。FAK在细胞迁移中的作用已经导致如下推断，即它可能与其它疾病相关，如胚胎发育机能障碍和血管生成性病症(Kornberg，L.J.，Head Neck，1998，20，634-639)。
Abelson酪氨酸激酶(即Abl，c-Abl)涉及于细胞周期的调节、细胞对基因毒性应激的反应和有关细胞环境的信息通过整联蛋白信号传导的传播。总之，看来Abl蛋白作为整合各种来自胞外和胞内来源的信号并影响细胞周期和编程性细胞死亡判断的细胞组件。发挥复杂的作用。Abelson酪氨酸激酶包括亚型衍生物，如酪氨酸激酶活性失调的嵌合融合体(癌蛋白)BCR-Abl或v-Abl。BCR-Abl在95％的慢性髓细胞性白血病(CML)和10％的急性淋巴细胞性白血病中的发病机理中是关键性的。STI-571(Gleevec)为致癌的BCR-Abl酪氨酸激酶抑制剂并且用于治疗慢性髓性白血病(CML)。然而，处于CML急性发作阶段中的某些患者因BCR-Abl激酶中的突变而耐受STI-571。迄今为止已经报导了22种以上的突变，其中最常见的为G250E、E255V、T315I、F317L和M351T。
本发明的化合物抑制abl激酶，尤其是v-abl激酶。本发明的化合物还抑制野生型BCR-Abl激酶和BCR-Abl激酶突变，并且由此适合于治疗Bcr-abl-阳性癌症和肿瘤疾病，如白血病(尤其是慢性髓性白血病和急性成淋巴细胞性白血病，其中尤其是发现了编程性细胞死亡的作用机理)，并且还表现出对白血病干细胞亚群的作用，以及在除去所述细胞(例如骨髓移除)后在体外纯化这些细胞并且一旦其癌细胞被清除，再植入所述细胞(例如再植入纯化的骨髓细胞)的可能性。
PDGF(血小板衍生生长因子)为极为常见出现的生长因子，它在正常生长和病理性细胞增殖中起重要作用，如在癌形成和血管平滑肌细胞疾病、例如在动脉粥样硬化和血栓形成中所观察到的。本发明的化合物能够抑制PDGF受体(PDGFR)活性并且由此适合于治疗肿瘤疾病，如神经胶质瘤、肉瘤、前列腺肿瘤和结肠、乳腺和卵巢肿瘤。
本发明的化合物不仅可以用作肿瘤抑制物质，例如在小细胞肺癌中。而且可以用作治疗非恶性增殖性病症如动脉粥样硬化、血栓形成、银屑病、硬皮病和纤维化的活性剂，以及用于保护干细胞，例如对抗化疗剂如5-氟脲嘧啶和哮喘中的血毒素作用。本发明的化合物尤其可以用于治疗响应于PDGF受体激酶抑制的疾病。
本发明的化合物在治疗因移植、例如同种异体移植所致病症中表现出有用的作用，尤其是组织排斥，如尤其是闭塞性细支气管炎(OB)，即同种异体肺移植物的慢性排斥。与未患OB的患者相反，那些患有OB的患者通常表现出在支气管肺泡灌洗液中PDGF浓度升高。
本发明的化合物还对与血管平滑肌细胞迁移和增殖相关的疾病(其中PDGF和PDGF-R通常也起作用)有效，如再狭窄和动脉粥样硬化。这些在体外和体内对血管平滑肌细胞增殖或迁移的作用及其结果可以通过给予本发明的化合物而得到证实，并且还可以通过研究其对体内机械性损伤后血管内膜增厚的作用而得到证实。
本发明的化合物还抑制涉及干细胞因子(SCF也称作c-kit配体或青灰因子)细胞过程，如抑制SCF受体(kit)自磷酸化和SCF-刺激的MAPK激酶(促分裂原活化蛋白激酶)活化。MO7e细胞为人幼巨核细胞(promegalcaryocytic)白血病细胞系，它依赖于SCF进行增殖。本发明的化合物可以抑制SCF受体的自磷酸化。
Ras-Raf-MEK-ERK信号传导途径介导细胞对生长信号的反应。Ras在～15％的人癌中突变成致癌形式。Raf族属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶并且它包括三个成员A-Raf、B-Raf和c-Raf(或Raf-1)。对于作为药物靶的Raf，关注已经集中在Raf作为Ras下游效应物的相关性上。然而，近来的数据提示B-Raf可能在某些肿瘤的形成过程中具有显著的作用，而不需要活化的Ras等位基因(Nature 417，949-954(2002年7月1日)。特别地，已经在大百分比的恶性黑素瘤中检测到了B-Raf突变。
现存的黑素瘤医学疗法在其有效性方面受到局限，尤其是对晚期黑素瘤而言。本发明的化合物还抑制涉及b-Raf激酶的细胞过程，从而为人癌症、尤其是黑素瘤提供了的新的治疗机会。
本发明的化合物还对退行性淋巴瘤酶(ALK)和NPM-ALK融合蛋白的酪氨酸激酶活性表现出强力抑制。这种蛋白酪氨酸激酶由核仁磷酸蛋白(NPM)和退行性淋巴瘤酶(ALK)的基因融合而产生，由此表现出ALK配体-依赖性的蛋白酪氨酸激酶活性。NPM-ALK在大量造血和其它人体细胞的信号传递中起关键作用，导致血液学和肿瘤性疾病，例如在退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)中，特别是在ALK+NHL或Alkomas中、在炎性肌纤维母细胞瘤(IMT)和神经母细胞瘤(Duyster，J.等，2001，Oncogene 20，5623-5637)。除NPM-ALK外，在人血液学和肿瘤性疾病中已鉴定到其它基因融合体；主要是TPM3-ALK(一种非肌肉的原肌球蛋白与ALK的融合体)。使用公知方法，例如使用ALK重组激酶结构域、按照与J.Wood等在Cancer Res.60，2178-2189(2000)中所述VEGF-R激酶试验类似的方式，可以证实对ALK酪氨酸激酶活性的抑制。
Flt3为III型受体酪氨酸激酶(RTK)家族中的成员。Flt3(fms-样酪氨酸激酶)也称作FLk-2(胎肝激酶2)。已经在成年人和儿童白血病中证实了Flt3基因的异常表达，包括急性髓性白血病(AML)、具有三谱系脊髓发育不良的AML(AML/TMDS)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和骨髓增生异常综合征(MDS)。已经在约35％的急性髓母细胞性白血病(AML)患者中发现了Flt3受体的活化突变，并且与预后不良有关。最常见的突变包括近膜结构域内符合读框的复制，其中还有5-10％的患者在835位天冬酰胺上存在点突变。这些突变均与Flt3的酪氨酸激酶活性的组成型活化有关，在没有配体存在下产生增殖和存活力信号。已经证实表达该受体突变体形式的患者的治愈机会减少。因此，越来越多的证据表明过度活化的(突变的)Flt3激酶活性在人白血病和骨髓增生异常综合征中扮演角色。这就促使本申请人寻找Flt3受体的新抑制剂作为在这些患者中可能的治疗手段，对他们并且对这类以前用目前可利用药物疗法和/或干细胞移植疗法失败的患者而言，目前的药物疗法几乎无法提供可用性。
白血病一般因骨髓、淋巴结、脾或其它血液和免疫系统器官中未成熟造血细胞的DNA的获得性(非遗传性)基因损伤所致。效果为细胞成熟中的加速生长和阻滞，导致称作“白血病母细胞”的细胞蓄积，它们无法作为正常血细胞起作用；和无法生成正常髓细胞，导致红细胞(贫血)、血小板和正常白细胞缺乏。母细胞通常由骨髓产生且通常发育成成熟血细胞，占全部髓细胞的约1％。在白血病中，母细胞不会适当成熟并且蓄积在骨髓中。在急性髓性白血病(AML)中，它们称作成髓细胞，而在急性成淋巴细胞性白血病(ALL)中，它们称作原淋巴细胞。另一种白血病为混合谱系的白血病(MLL)。
术语“具有三谱系脊髓发育不良的AML(AML/TMDS)”指的是不常见形式的白血病，其特征在于伴随急性白血病的造血机能不全表现、对诱导化疗的反应弱，以及趋向于伴有纯粹骨髓增生异常综合征的复发。
术语“骨髓增生异常综合征(MDS)”指的是一组血液病，其中骨髓停止正常起作用，导致健康血细胞的数量缺乏。与其中一种类型的血小板大量产生的白血病相比，在MDS中任意且有时是所有类型的血细胞均受到影响。在美国每年至少出现10,000个新病例。达三分之一诊断为MDS的患者持续发展成急性髓性白血病。为此，该病有时称作白血病前期。骨髓增生异常综合征有时也称作脊髓发育不良性髓细胞生成障碍或成少突神经胶质细胞性白血病。在大量母细胞仍然遗留在骨髓中时，MDS也称作郁积型白血病(smoldering leukemia)。
骨髓增生异常综合征，如白血病一样，因骨髓中单细胞的DNA基因损伤所致。在MDS患者中存在染色体中的某些异常。这些异常称作易位，它们在一条染色体的部分断裂并且与不同染色体的断裂部分连接时发生。相同的缺陷通常在急性髓性白血病中发现。然而，MDS不同于白血病，因为所有患者的血细胞均异常并且它们均来源于相同受损的干细胞。在白血病患者中，骨髓含有患病和健康血细胞的混合物。
目前使用高剂量的细胞毒性化疗药如阿糖胞苷和柔红霉素治疗AML和晚期骨髓增生异常综合征。这种类型的治疗诱发约70％的患者发生血液学缓解。然而，尽管长期给予化疗，但是进入缓解的患者中超过一半随后复发。几乎所有最初未能缓解的患者或获得缓解后复发的患者最终均将死于白血病。骨髓移植可以治愈达50-60％经历手术的患者，但所有患有AML或MDS的患者中仅有约三分之一适合接受移植。迫切需要新的和有效的药物来治疗使用标准疗法未能进入缓解的患者、随后复发的患者和不适合于干细胞移植的患者。此外，可以将有效的新药物加入到标准疗法中，并合理预期它可以在所有患者中产生改善的诱导化疗。
按照上文所述，本发明进一步提供了在需要这类治疗的受试者中预防或治疗上述疾病或病症的方法，该方法包括对所述受试者给予治疗有效量的(参见下文中的“给药和药物组合物”部分)式I化合物或其药学上可接受的盐。对任意上述应用而言，所需的剂量随给药方式、所治疗的特定疾病和所需作用的不同而改变。
给药和药物组合物一般而言，本发明化合物以治疗有效量、经由本领域中已知的任意常用和可接受的方式单独或与一种或多种治疗剂组合给予。治疗有效量可以随疾病的严重程度、受试者年龄和相对健康情况、所用化合物的功效和其它因素而宽泛变化。一般而言，在约0.03-2.5mg/kg体重的每日剂量下获得令人满意的全身效果。在较大哺乳动物例如人中的适用每日剂量在约0.5mg-约100mg范围内，例如，以至多每日4次的分次剂量或以延缓形式便利地给药。用于口服给药的合适的单位剂型包含约1-50mg活性成分。
本发明的化合物可以通过任意常规的途径作为药物组合物给药，特别是通过肠，例如口服，例如为片剂或胶囊形式；或通过胃肠外，例如为可注射溶液或混悬液形式；局部，例如为洗剂、凝胶、软膏剂或霜剂形式或以鼻用或栓剂形式。包含游离形式或药学上可接受盐形式的本发明化合物与至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物可以通过常规方式、经混合、制粒或包衣方法制备。例如，口服组合物可以为片剂或明胶胶囊，它们包含活性组分以及a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙二醇；就片剂而言还包括c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要，还有d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐或泡腾混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和增甜剂。可注射组合物可以为水性等渗溶液或混悬液，且栓剂可以由脂肪乳剂或混悬液制备。这些组合物可以为无菌的和/或含有佐剂，如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以含有其它治疗上有价值的物质。用于透皮应用的合适的制剂包括有效量的本发明化合物与载体。载体可以包括可吸收的药学上可接受的溶剂以帮助通过宿主皮肤。例如，透皮装置为绷带形式，包括裱背部件(backingmember)、含有可选地混有载体的化合物的贮器、可选的速率控制屏障以在延长时间期限内以受控和预定速率将化合物递送至宿主皮肤和使装置与皮肤固定的用具。还可以使用基质透皮制剂。用于局部应用、例如施用在皮肤和眼部的合适的制剂优选为本领域众所周知的水溶液、软膏剂、霜剂或凝胶。这类制剂可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
本发明的化合物可以以治疗有效量与一种或多种治疗剂共同给药(药物组合)。例如，协同作用可以与其它免疫调节、抗炎或用于治疗上述疾病的任意物质一起发生，例如，当与下列药物联用时环孢素、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制剂类似物，例如环孢素A(CsA)、环孢素G、FK-506、雷帕霉素或相当的化合物、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、白瑞夸尔、来氟洛米、咪唑立宾、麦考酚酸、麦考酚酸吗乙酯、15-脱氧精胍菌素、免疫抑制剂抗体，尤其是白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或其配体或其它免疫调节化合物，如CTLA41g。如果将本发明的化合物与其它疗法共同给予，那么共同给予的化合物的剂量当然随共同使用的药物的类型、所用的具体药物、所治疗的疾病等的不同而异。
本发明还提供了药物组合，例如药盒，包括a)为本文披露的本发明化合物的第一种活性剂，它为游离形式或药学上可接受的盐形式；和b)至少一种共同使用的活性剂(co-agent)。该药盒包括其给药说明书。
本文所用的术语“共同给药”或“联合给药”等指的是对单一患者给予选择的治疗剂，并且预计包括其中活性剂不一定通过相同给药途径或同时给予的治疗方案。
本文所用的术语“药物组合”指的是混合或合并一种以上活性组分而得到的产品并且包括固定和非固定活性组分组合的产品。术语“固定组合”指的是以单一实体或剂量同时对患者给予活性成分，例如式I化合物和共同使用的活性剂。术语“非固定组合”指的是活性成分、例如式I化合物和共同使用的活性剂作为单独的实体同时、伴随或没有具体的时间限制依次对患者给予，其中这类给药在患者体内提供了治疗有效水平的2种化合物。后者还可应用于鸡尾酒疗法，例如给予3种或3种以上活性成分。
制备本发明化合物的方法本发明还包括制备本发明化合物的方法。在所述反应中，如果在终产物中需要，可能有必要保护反应性官能基，例如羟基、氨基、亚氨基、硫代或羧基，以便避免它们参与不需要的反应。可以按照标准实践使用常用的保护基，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts在“Protective Groupsin Organic Chemistry”，John Wiley和Sons，1991中所述。
其中W为-NR4-的式I化合物可以通过下列反应方案I中所述进程制备反应方案I 其中R1、R2、R3、R4和n如发明概述中对式I所定义且Y为离去基团，如卤素(例如氯等)。式Ia的化合物可以通过使式2化合物与式3化合物在合适的碱(例如叔丁醇钾和二异丙基乙胺等)存在下、于合适溶剂(例如1，4-二噁烷和丁醇等)中反应来制备。该反应在50-130℃进行并且可以持续达4小时至完全。类似地，使用合适的原料，与式3化合物的反应生成式Ib、Ic、Id和Ie的化合物。
其中W为-O-的式I化合物可以通过下列反应方案II的进程制备反应方案II 其中R1、R2、R3、R4和n如发明概述中对式I所定义。式Ia化合物可以通过使式4化合物与式5化合物在合适的溶剂(例如DMSO等)和合适的碱(例如叔丁醇钾等)存在下反应来制备。该反应在50-130℃进行并且可以持续达4小时至完全。
合成式I化合物的详细描述可见于下文的实施例。
制备本发明化合物的其它方法通过使化合物的游离碱形式与药学上可接受的无机酸或有机酸反应，可以将本发明的化合物制成药学上可接受的酸加成盐。或者，通过使化合物的游离酸形式与药学上可接受的无机碱或有机碱反应，可以制备本发明化合物的药学上可接受的碱加成盐。或者，本发明化合物的盐形式可以使用原料或中间体的盐制备。
本发明化合物的游离酸或游离碱形式可以分别由相应的碱加成盐或酸加成盐形式制备。例如，通过用合适的碱(例如氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)处理，可以将本发明化合物的酸加成盐形式转化成相应的游离碱。通过用合适的酸(例如盐酸等)处理，可以将本发明化合物的碱加成盐形式转化成相应的游离酸。
通过在0-80℃用还原剂(例如硫、二氧化硫、三苯膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化磷等)在合适的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二噁烷水溶液等)中处理，可以由本发明化合物的N-氧化物制备本发明化合物的未氧化形式。
通过本领域技术人员公知的方法可以制备本发明化合物的前体药物衍生物(例如进一步的详细描述参见Saulnier等，(1994)，Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters，Vol.4，p.1985)。例如，通过使本发明的未衍生的化合物与合适的氨基甲酰化试剂(例如1，1-酰氧基烷基carbanochloridate、碳酸对-硝基苯酯等)反应，可以制备合适的前体药物。
通过本领域技术人员公知的方式可以制备本发明化合物的被保护衍生物。适合于生成保护基及其除去技术的详细描述可见于T.W.Greene，“Protecting Groups in Organic Chemistry”，第3版，John Wiley和Sons，Inc.，1999中。
本发明的化合物可以在本发明的方法中便利地作为溶剂合物(例如水合物)制备或形成。通过使用有机溶剂如二氧芑、四氢呋喃或甲醇从水/有机溶剂混合物中重结晶，可以便利地制备本发明化合物的水合物。
本发明的化合物可以如下制成其各立体异构体通过使化合物的外消旋混合物与旋光活性拆分试剂反应，以便形成非对映体化合物对，分离非对映体并且回收光学纯的对映体。尽管使用本发明化合物的共价非对映体衍生物可以拆分对映体，但是优选可解离的复合物(例如结晶非对映体盐)。非对映体具有不同的物理特性(例如熔点、沸点、溶解度、反应性等)并且可利用这些差异容易地分离。非对映体可以通过色谱法或优选通过基于溶解度不同的分离/拆分技术分离。然后通过不会导致外消旋化的任意实用方式回收光学纯的对映体与拆分试剂。用于从外消旋混合物中拆分化合物的立体异构体的技术的更为详细的描述可见于Jean Jacques，Andre Collet，Samuel H.Wilen，“Enantiomers，Racemates and Resolutions”，John Wiley和Sons，Inc.，1981。
概括地说，可以通过一种方法制备式I化合物，该方法包括(a)反应方案I或II的方法；和(b)可选地将本发明的化合物转化成药学上可接受的盐；(c)可选地将本发明化合物的盐形式转化成非盐形式；
(d)可选地将本发明化合物的未氧化形式转化成药学上可接受的N-氧化物；(e)可选地将本发明化合物的N-氧化物形式转化成其未氧化形式；(f)可选地从异构体混合物中拆分本发明化合物的各异构体；(g)可选地将本发明化合物的未衍生形式转化成药学上可接受的前体药物衍生物；和(h)可选地将本发明化合物的前体药物衍生物转化成其非衍生形式。
如果原料的制备没有特别地描述，则这些化合物是已知的或可以按照与本领域公知方法类似的方式或下文实施例中披露的方式制备。
本领域技术人员可以理解上述转化仅是制备本发明化合物的代表方法，可以类似地使用其它众所周知的方法。
实施例通过下列实施例进一步举例说明本发明但不起限定作用，这些实施例阐述本发明式I化合物(实施例)和中间体(参考)的制备。
实施例1 A.KOtBu，THF三甲氧基苯胺 回流B.Pd2(dba)3，(tBu)2联苯基膦，三甲氧基苯胺，K3PO4，1，4-二噁烷 90-110℃5-溴-2-氯嘧啶-4-基胺(1)的合成用47mL氨(330mmol，7.0M甲醇中的溶液)处理5-溴-2，4-二氯嘧啶(25g，110mmol)在200mL THF中的溶液。搅伴15小时后，在减压下浓缩该溶液，通过短过滤纯化(SiO2，己烷∶乙酸乙酯/1∶1)，得到21g(92％)的1，为白色固体。
2-氯-5-(2-乙氧基乙烯基)-嘧啶-4-基胺(2)的合成在500mL圆底烧瓶中加入5-溴-2-氯嘧啶-4-基胺(1)(10g，48mmol)、四(三苯膦)钯(0)(2.8g，2.5mmol)和甲苯(200mL)。加入三丁基-(2-乙氧基乙烯基)-锡烷(22g，60mmol)，将该反应加热至110℃，同时搅拌约15小时。冷却至室温后，将该溶液用100mL乙酸乙酯蒸馏，用水和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机萃取液，过滤，在减压下浓缩。通过柱色谱法纯化(SiO2，己烷∶乙酸乙酯/5∶1)，得到2(4.4g，46％)，为黄色固体。
2-氯-7H-吡咯并-[2，3-d]嘧啶3的制备在500mL圆底烧瓶中加入2-氯-5-(2-乙氧基乙烯基)-嘧啶-4-基胺2(4.4g，20mmol)。加入异丙醇(200mL)，随后加入25mL浓盐酸。将该溶液加热至90℃，搅拌2小时。冷却至室温后，在减压下浓缩该溶液，然后用饱和NaHCO3水溶液碱化至pH 9。用乙酸乙酯萃取水层，合并有机萃取液，用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机萃取液，过滤，在减压下浓缩。通过短过滤纯化(SiO2，己烷∶乙酸乙酯/1∶1)，得到3(3.1g，92％)，为白色固体。
2-氯-7-吡啶-2-基-7H-吡咯并-[2，3-d]嘧啶4的合成将2-氯-7H-吡咯并-[2，3-d]嘧啶3(0.53g，3.5mmol)、2-溴吡啶(0.66mL，1.1g，6.9mmol)、碘化亚铜(I)(0.20g，1.0mmol)、反式-1，2-二氨基环己烷(0.12mL，0.11g，1.0mmol)和磷酸钾(2.2g，10mmol)在10mL 1，4-二噁烷中的混悬液加热至100℃，搅拌4小时。将该反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤。用MgSO4干燥有机萃取液，过滤并且在减压下浓缩。通过柱色谱法纯化(SiO2，己烷∶乙酸乙酯/5∶1)，得到4(0.69g，87％)，为白色固体。
(7-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基)-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺(5)的制备方法1.向2-氯-7-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在1，4-二噁烷中的溶液中加入3，4，5-三甲氧基苯胺(3当量)，随后滴加叔丁醇钾溶液(1.0M在四氢呋喃中的溶液，3当量)。添加后，将该反应混合物在80℃加热2小时。冷却至室温后除去溶剂。通过反相HPLC纯化，得到(7-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基)-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺，为白色固体。
方法2.向装有2-氯-7-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、0.1当量三(二亚苄基丙酮)二钯(0)、0.2当量联苯-2-基-二叔-丁基-phosphane、3当量磷酸钾和1.5当量3，4，5-三甲氧基苯胺的圆底烧瓶中快速通入氮气，随后添加1，4-二噁烷。将该混悬液在110℃加热18小时。通过硅藻土垫过滤除去固体。用乙酸乙酯稀释滤液，用水和盐水洗涤。用硫酸镁干燥后，浓缩产物，通过色谱法纯化(乙酸乙酯∶己烷 1∶1)，得到7-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺，为白色固体。
实施例23-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酸 将3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酸甲酯在1N氢氧化钠(甲醇∶水 1∶1)中的溶液在室温搅拌15小时。用1N盐酸酸化至pH 6，得到沉淀。过滤，用水洗涤，得到3-[2-(3，4，5-三甲氢基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酸，为白色固体。
实施例33-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰氯 向装有3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酸的干燥圆底烧瓶中充氮气，加入二氯甲烷和几滴N，N′-二甲基甲酰胺。滴加草酰氯溶液(2.0M在二氯甲烷中的溶液)。将该反应混合物在室温搅拌30分钟，得到3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰氯的溶液。
实施例4N-甲基-3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰胺 向3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰氯在二氯甲烷中的溶液中加入5当量甲胺溶液(2.0M在四氢呋喃中的溶液)。在室温搅拌1小时后，用水使反应猝灭。除去溶剂，随后用反相HPLC纯化，得到N-甲基-3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰胺，为白色固体。
通过重复上述实施例中所述操作步骤，使用合适的原料获得下列表1中鉴定的式I化合物。
表1
试验试验了本发明的化合物，以便测定其与亲代32D细胞相比选择性抑制表达BCR-Abl(32D-p210)的32D细胞增殖的能力。测试了选择性抑制这些BCR-Abl转化细胞增殖的化合物对表达Bcr-abl野生型或突变体形式的Ba/F3细胞的抗增殖活性。此外，对化合物进行试验，以便测定其抑制FAK、Flt-3、ALK和b-Raf的能力。
细胞BCR-Abl依赖性增殖的抑制(高通量法)所用的鼠细胞系为用BCR-AblcDNA转化的32D造血祖细胞系(32D-p210)。将这些细胞供养在补充了50μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素和200mM L-谷氨酰胺的RPMI/10％胎牛血清(RPMI/FCS)中。类似地供养未转化的32D细胞，同时添加15％的WEHI条件培养基作为IL3源。
将50μl 32D或32D-p210细胞混悬液以5000个细胞/孔的密度平板固定在Greiner 384孔微量平板(黑色)中。将50nl测试化合物(1mM在DMSO中的储备溶液)加入到各孔中(包括STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％ CO2下保温72小时。向各孔中加入10μl 60％ Alamar蓝溶液(Tekdiagnostics)，将细胞再孵育24小时。使用AcquestTM系统(Molecular Devices)对荧光强度进行定量(在530nm处激发，在580nm处发射)。
细胞BCR-Abl依赖性增殖的抑制将32D-p210细胞以15,000个细胞/孔的密度平板固定入96孔TC平板。向各孔中加入50μL 2倍系列稀释的测试化合物(Cmax为40μM)(包括STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％ CO2下孵育48小时后，向各孔中加入15μL MTT(Promega)，将细胞再孵育5小时。通过分光光度法对570nm下的光密度进行定量，根据剂量响应曲线确定IC50值，即50％抑制所需的化合物浓度。
对细胞周期分布的作用将32D和32D-p210细胞以2.5×106个细胞/孔的密度平板固定入6孔TC平板中的5ml培养基中，加入1或10μM的测试化合物(包括STI571作为对照)。然后将细胞在37℃、5％ CO2下孵育24或48小时。用PBS洗涤2ml细胞混悬液，在70％EtOH中固定1小时，用PBS/EDTA/RNaseA处理30分钟。加入碘化丙锭(Cf＝10μg/ml)，在FACScaliburTM系统(BDBiosciences)上通过流式细胞计量术对荧光强度进行定量。本发明的测试化合物表现出对32D-p210细胞的编程性细胞死亡作用，但不会在32D亲代细胞中诱导编程性细胞死亡。
对细胞BCR-Abl自磷酸化的作用使用俘获Elisa、应用c-abl特异性俘获抗体和抗磷酸酪氨酸抗体对BCR-Abl自磷酸化进行定量。将32D-p210细胞以2×105个细胞/孔的密度平板固定在96孔TC平板中的50μl培养基中。加入50μl 2倍系列稀释的测试化合物(Cmax为10μM)(包括STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％ CO2下孵育90分钟。然后用150μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4、150mM NaCl、5mM EDTA、1mM EGTA和1％ NP-40)将细胞在冰上处理1小时。将50μL细胞裂解液加入到预先用抗-abl特异性抗体包被的96孔optiplate中并封闭。将平板在4℃孵育4小时。用TBS-Tween 20缓冲液洗涤后，加入50μL碱性磷酸酶缀合的抗磷酸酪氨酸抗体，将该平板在4℃再孵育过夜。用TBS-Tween 20缓冲液洗涤后，加入90μL发光底物，使用AcquestTM系统(Molecular Devices)对发光进行定量。抑制表达BCR-Abl的细胞增殖的本发明测试化合物以剂量依赖性方式抑制细胞BCR-Abl自磷酸化。
对细胞BCR-Abl自磷酸化的作用对表达突变形Bcr-abl的细胞增殖的作用对本发明的化合物测试其对Ba/F3细胞的抗增殖作用，所述Ba/F3细胞表达野生型BCR-Abl或对STI571具抗性或敏感性降低的突变形BCR-Abl(G250E、E255V、T315I、F317L、M351T)。如上所述在10、3.3、1.1和0.37μM下测试这些化合物对表达突变型-BCR-Abl的细胞和对未转化细胞的抗增殖作用(在缺乏IL3的培养基中)。根据如上所述获得的剂量响应曲线确定缺乏毒性的化合物对未转化细胞的IC50值。
Flt-3抑制一般技术包括比较可能的抑制剂对依赖于突变Flt3增殖的细胞系的作用与对不依赖于突变Flt3增殖的细胞系的作用。选择具有差别活性(Flt3+细胞系与Flt3-细胞系之间敏感性差异大于或等于10倍)的化合物用于进一步研究。
用于初筛的细胞系为Ba/F3细胞亚系，其被改造成在用表达合适Flt3cDNAs的逆转录病毒感染后过量表达突变型或野生型(未突变的)Flt3。母细胞系Ba/F3依赖于白细胞介素-3进行增殖，当IL-3被除去时，细胞快速终止增殖并死亡。逆转录病毒表达来自逆转录病毒LTR的Flt3和来自IRES位点的neogene。在G418中选择Ba/F3并通过荧光活化的细胞分选(FACS)分析Flt3的表达。使用具有两种不同Flt3突变的细胞系。一种突变体表达在由外显子11编码的近膜结构域中具有14个氨基酸重复的Flt-3，具体重复为....VDFREYEYDLKWEF....(称作Ba/F3-Flt3-ITD)。第二种突变具有将835位天冬酰胺转化成酪氨酸的点突变(称作Ba/F3-Flt3-D835Y)。两种突变均导致Flt-3激酶活化并使得它不依赖于IL-3且表达的细胞在没有IL-3存在下生长。类似地生成表达野生型Flt3的Ba/F3细胞并用作“对照”细胞系。亲代(未感染的)细胞系和野生型“对照”细胞系保持依赖于IL-3进行增殖。
在30mL培养物中将Ba/F3细胞(-对照、-Flt3-ITD或-Flt3-D835Y)培养至500,000个细胞/mL，用含有10％胎牛血清的RPMI 1640作为培养基。用于对照细胞(并非突变-Flt3细胞)的培养基含有来自WEHI-3B细胞系的10％条件培养基作为IL-3源。在二甲亚砜(DMSO)中制备各化合物的10mM“储备”溶液。然后稀释在含有10％胎牛血清的RPMI 1640中，以使药物终浓度一般在1nM-10μM范围。类似的稀释液由DMSO制成，用作载体对照。添加化合物后48小时，检测细胞的增殖率和细胞毒性。
以在NaCl/柠檬酸钠缓冲液中的2.5μM终浓度将Yo-Pro-1碘化物(Molecular Probes)加入到细胞中。将细胞与Yo-Pro一起在室温下孵育10分钟，然后在荧光计上读取，测定细胞毒性。接下来用NP40/EDTA/EGTA缓冲液裂解细胞，在室温下孵育90分钟，读数以测定增殖。
将选择性地对Ba/F3-Flt3-ITD细胞比对野生型对照Ba/F3细胞更具有毒性的化合物用表达Flt3-D835Y的细胞进一步测试。
另外，在暴露于不同浓度的活性化合物之前和之后，使用α-Flt3抗体免疫沉淀Flt3蛋白。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离免疫沉淀的蛋白质，通过电泳转移至PVDF膜上，用α-磷酸591Y-Flt3抗体进行免疫印迹。本试验确定了化合物是否降低了突变形受体特征性的Flt3的“自磷酸化”水平。
本发明的化合物一般表现出对FIt3-ITD在纳摩尔范围内的抗增殖活性，而对对照Flt3在达10μM时也无毒性。
本发明的化合物还在纳摩尔范围内降低细胞Flt-3的自磷酸化活性。
粘着斑激酶(FAK)抑制测试本发明化合物抑制FAK活性的能力。使用基于时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的试验法在384-孔平板中测定FAK激酶活性。在大肠杆菌中表达全长人FAK，作为GST-标记的蛋白，并通过固定化谷胱甘肽柱纯化。将相当于人FAK自磷酸化位点序列的生物素化肽——生物素-SETDDYAEIID(由SynPep Corp.合成)用作本试验中的底物。将大肠杆菌表达的FAK激酶(2.4μg/ml)与FAK肽(133nM)在15μl试验缓冲液(20mMHepes，pH7.4、5mM MgCl2、2mM MnCl2、0.5mM Na3VO4、0.1％ BSA、0.1％ Triton X-100)中彼此混合。然后将本发明的化合物(0.5μl-溶于DMSO)加入到所述酶/肽溶液中。在室温下孵育10分钟后，加入5μl在试验缓冲液中的40μM ATP以引发反应。将该反应混合物在室温下孵育2小时。然后加入50μl检测试剂，该试剂在检测缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.4、6mMEDTA、0.1％ BSA、0.1％ Triton X-100)中含有0.15nM Eu-标记的抗磷酸酪氨酸抗体(PT66-Eu，PerkinElmer)和1.5μg/ml SA-APC(PerkinElmer)。将该混合物在室温下孵育30分钟，使用Acquest平板读出器(MolecularDevice)测定TR-FRET信号。
ALK抑制ALK酪氨酸激酶活性的抑制可以使用公知方法证实，例如使用ALK的重组激酶结构域，类似于J.Wood等在Cancer Res.60，2178-2189(2000)中所述VEGF-R激酶试验。在96-孔平板中，于20mM Tris HClpH＝7.5(3mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM DTT、0.1μCi/试验(＝30μl)[γ-33P]-ATP、2μM ATP、3μg/ml聚(Glu，Trr 4∶1)聚-EY(SigmaP-0275)、1％ DMSO、25ng ALK酶)中进行使用GST-ALK蛋白酪氨酸激酶的体外酶试验，作为滤膜结合试验。将该试验体系在环境温度下孵育10分钟。通过添加50μl 125mM EDTA终止反应，将该反应混合物转移至预先用甲醇湿润并用H2O再水化5分钟的MAIP Multiscreen平板(Millipore，Bedford，MA，USA)上。洗涤后(0.5％H3PO4)，在液体闪烁计数器上对平板计数。通过对抑制百分比进行线性回归分析计算IC50值。与不含抑制剂的对照组相比，式I化合物抑制酶活性达50％(IC50)，例如浓度在0.001-0.5μM，尤其是在0.01-0.1μM。
式I化合物有效地抑制了过量表达人NPM-ALK的鼠BaF3细胞的生长(DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Braunschweig，德国)。通过用编码NPM-ALK的表达载体pCIneoTM(Promega Corp.，Madison WI，USA)转染BaF3细胞系实现NPM-ALK的表达，随后选择G418抗性细胞。未转染的BaF3细胞依赖于IL-3进行细胞存活。相反，表达NPM-ALK的BaF3细胞(下文称作BaF3-NPM-ALK)可以在没有IL-3存在下增殖，因为它们通过NPM-ALK激酶获得增殖信号。NPM-ALK激酶的推定抑制剂由此消除了生长信号并且导致抗增殖活性。然而，NPM-ALK激酶的推定抑制剂的抗增殖活性可以通过添加通过不依赖NPM-ALK机制提供生长信号的IL-3而被抑制。[就使用FLT3激酶的类似细胞系统而言参见E Weisberg等，Cancer Cell；1，433-443(2002)]。简言之，式I化合物的抑制活性如下测定将BaF3-NPM-ALK细胞(15,000个/微量滴定板孔)转移至96-孔微量滴定板。加入一系列浓度的测试化合物[溶于二甲亚砜(DMSO)](系列稀释液)，加入的方式使DMSO的终浓度不超过1％(v/v)。在加入后，在平板孵育2天，在此期间不含测试化合物的对照培养物能够经历两次细胞分裂周期。借助YoproTM染色测定BaF3-NPM-ALK细胞的生长[Tidziorek等，J.Immunol.Methods；185249-258(1995)]将由20mM柠檬酸钠pH 4.0、26.8mM氯化钠、0.4％ NP40、20mM EDTA和20mM组成的25μl裂解缓冲液加入到各孔中。细胞裂解在室温于60分钟内完成，使用具有如下设定的CytofluorII 96-孔读出器(PerSeptive Biosystems)，通过测量确定与DNA结合的Yopro总量激发(nm)485/20和发射(nm)530/25。
使用如下公式、通过计算机辅助系统测定IC50值IC50＝[(ABS测试-ABS起始)/(ABS对照-ABS起始)]×100。(ABS＝吸收)将那些实验中的IC50值表示为使细胞计数较使用不含抑制剂的对照组获得的细胞计数低50％的所述测试化合物浓度。式I化合物表现出抑制活性，IC50为约0.01-1μM。
还可以使用与上述对BaF3-NPM-ALK细胞系所述相同的方法在人KARPAS-299淋巴瘤细胞系中(DSMZ Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，德国)[WGDirks等在Int.J.Cancer 100，49-56(2002)中所述]测定式I化合物的抗增殖作用。式I化合物表现出抑制活性，IC50为约0.01-1uM。
还可以借助免疫印迹，在人KARPAS-299淋巴瘤细胞系中测定式I化合物对ALK自磷酸化的作用，如WG Dirks等在Int.J.Cancer 100，49-56(2002)中所述。即式I化合物表现出约0.001-1μM的IC50。
Upstate KinaseProfilerTM-放射性酶过滤结合试验评价本发明化合物抑制一组激酶中各成员的能力(激酶的部分非限制性实例包括FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和c-Met。按照该一般性方案，以10μM的终浓度测试化合物，一式两份。注意激酶缓冲液组成和底物因“Upstate KinaseProfilerTM”组中包括的激酶不同而异。按照该一般性方案，以10μM的终浓度测试化合物，一式两份。注意激酶缓冲液组成和底物因“Upstate KinaseProfilerTM”组中包括的激酶不同而异。将激酶缓冲液(2.5μL，10x，如果需要含有MnCl2)、活性激酶(0.001-0.01单位；2.5μl)、在激酶缓冲液中的特异性或聚(Glu4-Tyr)肽(5-500μM或0.01mg/ml)和激酶缓冲液(50μM；5μL)在冰上的Eppendorf内混合。加入Mg/ATP混合物(10μl；67.5(或33.75)mM MgCl2，450(或225)μM ATP和1μCi/μl[γ-32P]ATP(3000Ci/mmol))，将该反应在约30℃孵育约10分钟。将该反应混合物点在(20μL)2cm×2cm P81(磷酸纤维素，用于带正电荷的肽底物)或Whatman No.1(用于聚(Glu4-Tyr)肽底物)方形纸上。用0.75％磷酸将该试验方形纸洗涤4次，每次5分钟，并且用丙酮洗涤一次，5分钟。将该试验方形纸转至闪烁瓶中，加入5ml闪烁合剂，使用Beckman闪烁计数器对掺入肽底物的32P定量(cpm)。对每次反应计算抑制百分比。10μM浓度的式I化合物对FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和/或c-Met激酶表现出的抑制百分比优选大于50％、优选大于60％、更优选大于70％。
游离形式或药学上可接受的盐形式的式I化合物表现出有价值的药理学特性，如通过本申请中所述体外试验所证实。例如，式I化合物对如下激酶中的至少一种优选表现出的IC50在1×10-10-1×10-5M范围，更优选低于500nMFAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和c-Met激酶。例如(i)N-(2-二甲氨基-乙基)-3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯甲酰胺(实施例73)对FAK的IC50为38nM。
(ii){3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯基}-乙腈(实施例104)分别对FLT3-ITD、FGFR3、JAK2、PDGFR-beta和Tel-TRKC的IC50为29nM、282nM、342nM、33nM和479nM。
(iii){7-[3-(1-甲基-1H-四唑-5-基甲基)-苯基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基}-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺(实施例120)对BaF3/PDGFR-β的IC50为29nM。
(iv)3-{3-[2-(3，4，5-三甲氧基-苯基氨基)-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基]-苯基}-丙腈(实施例85)对FLT3-ITD的IC50为16nM。
(v)(7-吡啶-2-基-6，7-二氢-5H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基)-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-胺(实施例61)对FGFR3的IC50为284nM。
(vi)[7-(2-氯-吡啶-4-基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基]-(4-甲氧基-2-甲基-苯基)-胺(实施例47)对BCR-Abl的IC50为408nM。
应理解本文所述的实施例和实施方案仅用于解释目的，本领域技术人员将可以想到依据其进行各种修改或改变，这些修改或改变也包括在本申请的实质和范围和所附权利要求的范围内。本文引述的所有公开文献、专利和专利申请为所有目的引入本文作为参考。
权利要求
1.选自式Ia、Ib、Ic、Id和Ie的化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、异构体和前体药物 其中n选自0、1和2；m选自0、1、2和3；W选自-NR4-、-S-、-O-、-S(O)-和-S(O)2-；其中R4选自氢和C1-6烷基；R1选自C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基-C0-4烷基和C3-8杂环烷基-C0-4烷基；其中R1的任意芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基烷基或杂环烷基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-12环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、卤素-取代的-C1-6烷氧基、-XNR5R5、-XNR5XNR5R5、-XNR5XOR5、-XOR5、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XC(O)NR5R5、-XOXR6和-XC(O)R6；其中X为键或C1-6亚烷基；R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；且R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；其中R1的任意芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基取代基进一步可选地被1-5个独立地选自C1-6烷基和C1-6烷氧基的基团取代；R2选自C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基-C0-4烷基和C3-8杂环烷基-C0-4烷基；其中R2的任意芳基烷基、杂芳基烷基、环烷基烷基或杂环烷基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、卤素-取代的-C1-6烷氧基、C3-8杂芳基C0-4烷基、-XNR5R5、XOR5、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XSNR5R5、-XS(O)NR5R5、-XS(O)2NR5R5、XC(O)OR5、-XOC(O)R5、-XC(O)R5、-XC(O)NR5XNR5R5、-XC(O)NR5R5、-XC(O)NR5XC(O)OR5、-XC(O)NR5XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5XNR5C(O)OR5、-XC(O)NR5XOR5、-XC(O)N(XOR5)2、-XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5R6、-XC(O)R6、-XR7、-XC(O)R7、-XR6和-XC(O)NR5XR7；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；且R7选自卤素和氰基；R3选自卤素、羟基、-XSR5、-XS(O)R5、-XS(O)2R5、-XC(O)R5和-XC(O)OR5；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基。
2.权利要求1的化合物，其中W选自-NR4-和-O-；其中R4选自氢和C1-6烷基；R1选自C6-10芳基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基；其中R1的任意芳基烷基和杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、C5-10杂芳基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、-XNR5R5、-XOR5、-XSR5、-XNR5XNR5R5、-XNR5XOR5、-XC(O)NR5R5、-XOXR6和-XC(O)R6；其中X为键或C1-6亚烷基；R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；且R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；其中R1的任意杂芳基取代基进一步可选地被1-5个C1-6烷基取代；R2选自C6-10芳基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6烷氧基、卤素-取代的-C1-6烷基、C3-8杂芳基-C0-4烷基、-XNR5R5、-XOR5、-XSR5、-XS(O)2NR5R5、-XC(O)OR5，-XOC(O)R5、-XC(O)NR5XNR5R5、-XC(O)NR5XC(O)OR5、-XC(O)NR5XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5XNR5C(O)OR5、-XC(O)NR5XOR5、-XC(O)N(XOR5)2、-XNR5C(O)R5、-XC(O)NR5R6、-XC(O)R6、-XR7、-XR6和-XC(O)NR5XR7；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；R6选自C3-8杂环烷基-C0-4烷基和C5-10杂芳基-C0-4烷基，可选地被1-3个选自C1-6烷基和-C(O)OH的基团取代；且R7为氰基；且R3选自卤素、羟基、-XC(O)R5和-XC(O)OR5；其中X为键或C1-6亚烷基；且R5选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基。
3.权利要求1的化合物，其中W选自-NH-和-O-；和R1选自苯基、苄基、5，6，7，8-四氢-萘基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基、1H-吲唑-7-基、茚满-4-基和1H-吲哚基；其中R1的任意芳基烷基和杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自甲氧基、甲基、氨基、卤素、羟甲基、羟基、喹喔啉基、乙基、吡啶基、甲氧基-苯基、哌嗪基-羰基、乙基-(2-羟基-乙基)-氨基、2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙氧基、氨基甲酰基、异丙基、甲基-硫基、三-氟-甲基、乙氧基、3-异丙基氨基-丙基氨基、二甲氨基、吗啉代、环丙基-甲氧基、丁氧基、环庚基-氧基和1，4，5，7-四甲基-吡咯并[3，4-d]哒嗪基。
4.权利要求1的化合物，其中R2选自吡啶基、苯基、噻唑基、吡啶基-甲基、吡啶基-乙基、噻吩基、苄基、喹啉基、7-氧代-5，6，7，8-四氢-萘基、萘基和嘧啶基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、甲基、丙基-氨磺酰基、甲基-氨磺酰基、甲氧基、甲基-羧基、2-二甲氨基-乙基-氨基甲酰基、羧基、氨基、氰基-乙基、氰基-甲基、乙烯基、三-氟-甲基、羟甲基、乙基、甲基-硫基、丁基、异丁基、羧基-甲基-甲酰胺基、1-羧基-乙基-甲酰胺基、羧基-乙基、氨基-乙基-甲酰胺基、氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-乙基-甲酰胺基、二甲氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基-甲基、2-(2-二甲氨基-乙基氨基甲酰基)-乙基、2-(2-二甲氨基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-乙基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-丙基-甲酰胺基)-乙基、2-(丙基-甲酰胺基)-乙基、氨基-丙基-甲酰胺基-甲基、2-(甲基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、2-(乙基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、吗啉代-乙基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-甲基、氨基-乙基-甲酰胺基甲基、环丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基-甲基、二甲基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基-甲基、羟基-丙基-甲酰胺基-甲基、N，N-双-(3-羟基丙基)-甲酰胺基、环戊基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基甲基、环戊基-甲酰胺基-甲基、氰基-乙基-甲酰胺基、氰基-甲基-甲酰胺基、吡咯烷基-乙基-甲酰胺基、2-(异丁基-甲酰胺基)-乙基、1H-四唑基、2-(1H-四唑-5-基)-乙基、2-(1H-四唑-5-基)-甲基、2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-甲基、乙酰基-氨基、环丙基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基、羟基-丙基-甲酰胺基、丙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基、1-甲基-哌啶-4-基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-乙基、甲氧基-羰基-甲基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基-甲基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-乙基、1-甲酰基-吡咯烷-2-基-甲酸、(1-羧基-3-甲基-丁基)-甲酰胺基、2-(甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基)-乙基、1-羧基-(2，2-二甲基-丙基)-甲酰胺基、3-叔丁氧基羰基-氨基-丙基-甲酰胺基、乙酰氧基-甲基和1-羧基-乙基-甲酰胺基。
5.权利要求1的化合物，其中n为0或1；m为0或1；且R3选自卤素、羟基、-C(O)OH和-C(O))CH3。
6.权利要求1的式Ig的化合物 其中R2选自吡啶基、苯基、噻唑基、吡啶基-甲基、吡啶基-乙基、噻吩基、苄基、喹啉基、7-氧代-5，6，7，8-四氢-萘基、萘基和嘧啶基；其中R2的任意芳基烷基或杂芳基烷基可选地被1-3个基团取代，所述基团独立地选自卤素、硝基、氰基、甲基、丙基-氨磺酰基、甲基氨磺酰基、甲氧基、甲基-羧基、2-二甲氨基-乙基-氨基甲酰基、羧基、氨基、氰基乙基、氰基-甲基、乙烯基、三-氟-甲基、羟甲基、乙基、甲基-硫基、丁基、异丁基、羧基-甲基-甲酰胺基、1-羧基-乙基-甲酰胺基、羧基-乙基、氨基-乙基甲酰胺基、氨基-丙基-甲酰胺基、二甲氨基-乙基-甲酰胺基、二甲氨基丙基-甲酰胺基、二甲氨基-丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基、乙基-甲酰胺基-甲基、2-(2-二甲氨基-乙基氨基甲酰基)-乙基、2-(2-二甲氨基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-乙基-甲酰胺基)-乙基、2-(氨基-丙基-甲酰胺基)-乙基、2-(丙基-甲酰胺基)-乙基、氨基-丙基-甲酰胺基-甲基、2-(甲基-氨基-氨基甲酰基)乙基、2-(乙基-氨基-氨基甲酰基)-乙基、吗啉代-乙基-甲酰胺基、吗啉代-羰基甲基、氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、环丁基-甲酰胺基、甲基-甲酰胺基-甲基、二甲基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基-甲基、羟基-丙基-甲酰胺基-甲基、N，N-双-(3-羟基-丙基)-甲酰胺基、环戊基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基、异丁基-甲酰胺基-甲基、环戊基-甲酰胺基-甲基、氰基-乙基-甲酰胺基、氰基-甲基-甲酰胺基、吡咯烷基-乙基-甲酰胺基、2-(异丁基-甲酰胺基)-乙基、1H-四唑基、2-(1H-四唑-5-基)-乙基、2-(1H-四唑-5-基)-甲基、2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-甲基、乙酰基-氨基、环丙基-甲酰胺基-甲基、羟基-乙基-甲酰胺基、羟基-丙基-甲酰胺基、丙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基、1-甲基-哌啶-4-基-甲酰胺基、吗啉代-羰基-乙基、甲氧基-羰基-甲基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基、甲氧基-羰基-乙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基、4-氨基-环己基-甲酰胺基-甲基、乙酰基-氨基-乙基-甲酰胺基-甲基、乙氧基-丙基-甲酰胺基-甲基、甲氧基-羰基-乙基、1-甲酰基-吡咯烷-2-基-甲酸、(1-羧基-3-甲基-丁基)-甲酰胺基、2-(甲氧基-羰基-甲基-甲酰胺基)-乙基、1-羧基-(2，2-二甲基-丙基)-甲酰胺基、3-叔丁氧基羰基-氨基-丙基-甲酰胺基、乙酰氧基-甲基和1-羧基-乙基-甲酰胺基。
7.药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1的化合物与药学上可接受的赋形剂。
8.治疗动物疾病的方法，其中抑制激酶活性可以预防、抑制或改善所述疾病的病理学和/或症状学，该方法包括对所述动物给予治疗有效量的权利要求1的化合物。
9.权利要求7的方法，其中所述激酶选自FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、c-Kit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和c-Met。
10.权利要求1的化合物在制备用于治疗动物疾病的药物中的用途，其中FAK、Abl、BCR-Abl、PDGF-R、cKit、NPM-ALK、Flt-3、JAK2和/或c-Met的激酶活性对所述疾病的病理学和/或症状学有作用。
全文摘要
本发明提供了一类新的化合物、包括这类化合物的药物组合物和使用这类化合物治疗或预防与异常或失调的激酶活性相关的疾病或病症的方法，所述疾病或病症特别是涉及FAK、Abl、BCR－Abl、PDGF－R、c－Kit、NPM－ALK、Flt－3、JAK2和c－Met激酶异常活化的疾病或病症。
文档编号A61K31/519GK1918158SQ200580004895
公开日2007年2月21日 申请日期2005年2月14日 优先权日2004年2月14日
发明者崔夏洵, 王志成, N·S·格雷, 顾祥巨, 贺晓晖, 贺耘, 江涛, 刘异, W·里希蒙德, 沈台辅, 杨鲲泳 申请人:Irm责任有限公司
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